Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Summary

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Abstract

Antigeen-presenterende cellen (APC's) presenteren drie activerende signalen aan T-cellen die betrokken zijn bij fysiek contact: 1) antigeen, 2) costimulatie / corepressie en 3) oplosbare cytokines. T-cellen geven twee soorten effectordeeltjes af als reactie op activering: trans-synaptische blaasjes (tSV's) en supramoleculaire aanvalsdeeltjes, die respectievelijk intercellulaire boodschappers overbrengen en cytotoxiciteit bemiddelen. Deze entiteiten worden snel geïnternaliseerd door APC's die fysiek contact hebben met T-cellen, waardoor hun karakterisering ontmoedigend is. Dit artikel presenteert het protocol om Bead-Supported Lipid Bilayers (BSLBs) te fabriceren en te gebruiken als antigeen-presenterende cel (APC) mimetica om deze trans-synaptische deeltjes te vangen en te analyseren. Ook worden de protocollen beschreven voor de absolute metingen van eiwitdichtheden op celoppervlakken, de reconstitutie van BSLBs met dergelijke fysiologische niveaus en de flowcytometrieprocedure voor het volgen van de afgifte van synaptische deeltjes door T-cellen. Dit protocol kan worden aangepast om de effecten van individuele eiwitten, complexe ligandmengsels, pathogene virulentiedeterminanten en geneesmiddelen op de effectoroutput van T-cellen te bestuderen, waaronder helper T-cellen, cytotoxische T-lymfocyten, regulerende T-cellen en chimere antigeenreceptor-expresserende T-cellen (CART).

Introduction

De immunologische synaps (IS) is een cruciale moleculaire structuur gevormd op het grensvlak van cellen die betrokken zijn bij fysiek contact dat de gereguleerde uitwisseling van juxtracrine-informatie vergemakkelijkt. Verschillende ES'en zijn beschreven in de literatuur, en een groeiend aantal bewijzen suggereert dat deze moleculaire hubs een geconserveerd kenmerk zijn van cellulaire netwerken. Verschillende immuuncellen, waaronder B-cellen, natural killer-cellen, dendritische cellen, macrofagen en T-cellen, wisselen informatie uit via de assemblage van kortstondige ^contacten1. Multiomische studies bevorderen het begrip van nieuwe subsets van leukocyten en stromale cellen die pathogene cellulaire netwerken aandrijven en oppervlakte-eiwitten met onbekende functies tot expressie brengen. Als synthetische APC's maken BSLBs het mogelijk om direct onderzoek te doen naar de functionele rol van individuele eiwitten bij de integratie van activerende signalen, namelijk antigenen en costimulatie/corepressie, door T-cellen en de resulterende afgifte van effectordeeltjes die signaal vier worden genoemd.

Dit artikel beschrijft de protocollen en kritieke technische punten waarmee rekening moet worden gehouden bij het gebruik van BSLBs om de oppervlaktesamenstelling van model-APC's na te bootsen. De protocollen voor de kwantitatieve meting van immuunreceptoren en andere oppervlakte-eiwitten op APC's worden gepresenteerd samen met het protocol voor de reconstitutie van synthetische APC's die deze gemeten hoeveelheden bevatten. Vervolgens worden de stappen die nodig zijn voor het cocultureren van T-cellen en BSLB gepresenteerd, samen met het protocol voor de kwantitatieve meting van trans-synaptische deeltjesoverdracht met behulp van flowcytometrie. Het meest opmerkelijke is dat BSLBs het bestuderen van een plasmamembraan-afgeleide populatie van tSV's genaamd synaptische ectosomen (SE's) vergemakkelijken. T-cel antigeenreceptorverrijkte (TCR⁺) SE's worden afgestoten als reactie op TCR-triggering2 en efficiënt opgevangen door BSLBs3, wat een uitstekende uitlezing vertegenwoordigt om de agonistische eigenschappen van antigenen en de gemodelleerde membraansamenstelling te beoordelen. CD63⁺ exosomen en supramoleculaire aanvalsdeeltjes (SMAPs) worden ook vrijgegeven door gestimuleerde T-cellen en opgevangen door BSLBs. Ze kunnen worden gebruikt als extra uitlezingen van activering en de resulterende exocytische en lytische korrelsecretie door T-cellen. De mobilisatie van exocytische blaasjes naar de interagerende pool van de T-cel vergemakkelijkt ook de directionele afgifte van cytokines, zoals IL-2, IFN-γ en IL-10 als reactie op activering4,5,6,7,8. Hoewel T-cel vrijgegeven cytokines ook kunnen worden gedetecteerd op BSLBs, is er momenteel een meer toegewijde studie in ontwikkeling om de kwantitatieve analyse van cytokine-afgifte bij de immunologische synaps te valideren.

Om te onderzoeken hoe specifieke membraansamenstellingen de synaptische output van T-cellen beïnvloeden, moet de fysiologische dichtheid van de doelmembraancomponent worden gedefinieerd. Op flowcytometrie gebaseerde kwantificeringen van celoppervlakeiwitten zijn een essentiële stap in dit protocol en vereisen: 1) het gebruik van antilichamen met bekende aantallen fluorochchromen per antilichaam (F / P), en 2) benchmarkparels die een standaardreferentie bieden voor het interpoleren van fluorochroommoleculen uit gemeten gemiddelde fluorescentie-intensiteiten (MFI's).

Deze benchmarkstandaarden bestaan uit vijf kralenpopulaties, die elk een toenemend aantal equivalent oplosbare fluorochchromen (MESF's) bevatten, die het dynamische bereik van willekeurige fluorescentiedetectie overspannen. Deze standaardpopulaties leveren discrete fluorescentiepieken op, waardoor de omzetting van willekeurige fluorescentie-eenheden in MESF's door eenvoudige lineaire regressie wordt vergemakkelijkt. De resulterende MESF's worden vervolgens gebruikt naast antilichaam F / P-waarden om het gemiddelde aantal gebonden moleculen per cel (of BSLB in latere stappen) te berekenen. De toepassing van geschatte celoppervlakken op het gemiddelde aantal gedetecteerde moleculen maakt vervolgens de berekening van fysiologische dichtheden als moleculen/^{μm2 mogelijk}. Dit kwantificeringsprotocol kan ook worden aangepast aan de meting van eiwitdichtheden op T-cellen en de biochemische reconstitutie van membraansamenstellingen die de vorming van homotypische T-cel synapsen (d.w.z. T-T-synapsen9) bemiddelen. Indien nodig kan de valentie van antilichaambinding verder worden geschat door recombinante doelen te gebruiken die zijn gelabeld met bekende aantallen fluorochromen per molecuul. Vervolgens kan de antilichaambindende valentie voor dezelfde BSLB-populatie worden berekend door tegelijkertijd het aantal gebonden fluorescerende eiwitten en kwantificeringsantistoffen te vergelijken (met behulp van twee verschillende kwantificeringsfluorocchromen en MESF-normen).

De reconstitutie van APC-membranen vereist de assemblage van ondersteunde lipide bilayers (SLBs) op ^{silicakorrels1}. Liposoomvoorraden die verschillende fosfolipidesoorten bevatten, kunnen worden gebruikt om een veelzijdige lipide-dubbellaagsmatrix te vormen, waardoor recombinante eiwitten met verschillende bindingschemie kunnen worden verankerd (de bereiding van liposomen wordt beschreven in ¹⁰). Zodra de fysiologische dichtheid (of dichtheden) van het relevante ligand "op cellen" is gedefinieerd, wordt hetzelfde flowcytometrieprotocol aangepast om de concentratie van recombinant eiwit te schatten die nodig is om BSLBs te coaten met de beoogde fysiologische dichtheid. Twee verschillende verankeringssystemen kunnen in combinatie of afzonderlijk worden gebruikt.

Ten eerste is SLB met een laatste 12,5 mol% ^Ni2+-bevattende fosfolipiden voldoende om ongeveer 10.000 His-tag bindingsplaatsen per vierkante ^micron10 te leveren en werkt het goed om BSLBs te versieren met de meeste in de handel verkrijgbare eiwitten waarvan de fysiologische dichtheden deze maximale laadcapaciteit niet overschrijden. Het tweede laadsysteem maakt gebruik van biotinebevattende fosfolipiden (als mol%) om gebiotinyleerde anti-CD3e Fab (of HLA/MHC-monomeren) te laden via streptavidinbruggen. De combinatie van deze twee BSLB-decoratiemethoden maakt vervolgens de flexibele afstemming van BSLBs als synthetische APC's mogelijk. Voor zeer complexe APC-oppervlaktesamenstellingen kan de mol% van fosfolipiden en eiwitten worden verhoogd om zoveel eiwitten te laden als de vraag vereist. Zodra de werkconcentraties van eiwitten en mol% van gebiotinyleerde fosfolipiden zijn gedefinieerd, kunnen BSLBs worden geassembleerd om de synaptische output van T-cellen te ondervragen met multiparametrische flowcytometrie.

Protocol

1. Meting van de eiwitdichtheden van het celoppervlak met kwantitatieve flowcytometrie

1. Bereid 0,22 μm-gefilterde humane flowcytometriebuffer (hFCB) door EDTA (tot een uiteindelijke 2 mM-concentratie) en humaan AB-serum (tot een laatste 10%) toe te voegen aan steriele fosfaatbuffered saline (PBS), pH 7,4 (zie tabel 1). Filtreer de oplossing met behulp van een poriënfiltereenheid van 0,22 μm om serumverontreinigingen te verwijderen en bewaar bij 4 °C.
2. Herstel de cellen en bezink ze door centrifugering bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
3. Was de cellen tweemaal met PBS. Breng bij elke wasstap de cellen in PBS opnieuw uit tot het oorspronkelijke volume (vóór centrifugeren) en draai gedurende 5 minuten bij RT bij 300 × g .
4. Tel trypan blauwgekleurde celsuspensies in een ^{hemocytometer11}. U kunt ook cellen tellen met behulp van elektrische stroomuitsluiting. Volg voor dit laatste de instructies van de CASY-TT-fabrikant (zie de tabel met materialen).
   OPMERKING: Met de CASY-TT-celteller kunnen het percentage levensvatbare cellen, celgrootte en celvolume worden bepaald.
5. Bereken het volume PBS met 1:1.000 verdunning van Fixable Viability Dye eFluor 780 of vergelijkbaar (zie de tabel met materialen) dat nodig is om de cellen opnieuw te suspenderen tot een kleuringsconcentratie van 107 cellen/ml.
6. Resuspend de cellen met behulp van de levensvatbaarheid kleurstof-PBS-oplossing en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
7. Verwijder de levensvatbaarheidskleurstof door één volume ijskoude hFCB toe te voegen. Draai gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g .
   OPMERKING: Houd vanaf nu de koudeketen ongebroken.
8. Was de cellen met hfkb met 1:50 verdunning van Fc Receptor Blocking Solution (zie de tabel met materialen). Breng het volume naar een eindconcentratie van ¹⁰⁷ cellen/ml en incubeer nog eens 15 minuten om een efficiënte FcgR-blokkering te bereiken.
9. Verdeel 100 μL van de celsuspensie (d.w.z. ¹⁰⁶ cellen) per put van een U-bodem of V-bodem 96-putplaat. Houd de cellen op ijs en beschermd tegen licht (bedek met aluminiumfolie).
10. Bereid een antilichaammastermix voor in hFCB door de optimale antilichaamconcentraties te definiëren voor elk fluorochroom-geconjugeerd antilichaam, en vooral voor die antilichamen die worden gebruikt om oppervlakte-eiwitdichtheden te bepalen. Bereid bijvoorbeeld voor de kwantificering van ICAM-1-expressie op tonsillaire celpopulaties, zoals weergegeven in figuur 1, een mix met 1:200 verdunningen van anti-CD4, anti-CD19 en anti-CXCR5 samen met verzadigingsconcentraties van een anti-ICAM-1-antilichaam met bekende AF647-fluorochaten per antilichaam (d.w.z. 10 μg / ml, dat werd gedefinieerd door onafhankelijke antilichaamtitratie-experimenten).
11. Bereid als aanvullende controles een antilichaammastermix voor die de relevante antilichaamisotypecontroles bevat (bij dezelfde effectieve concentraties als hun tegenhangers geconjugeerd met dezelfde fluorochaten voor achtergrondaftrek), d.w.z. gebruik 10 μg/ml van een relevante AF647-isotypecontrole.
    OPMERKING: In het bovenstaande voorbeeld wordt een dergelijke isotypecontrole gebruikt om achtergrondfluorescentie af te trekken van het echte ICAM-1-signaal op cellen.
12. Bij het kwantificeren van eiwitdichtheden op celsubsets die op lage frequenties in weefsels aanwezig zijn, bereidt u fluorescentie minus één (FMO) controles voor die alle kleuringsantistoffen bevatten, behalve de markers van belang (zie verdere details in ¹²).
13. Draai de 96-putplaat met de cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 × g , gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 50 μL van de kwantificeringsantilichaammastermix of de isotype antilichaammastermix.
14. Incubeer de cellen gedurende ten minste 30 minuten bij 4 °C en 400 tpm met behulp van een platenschudder. Bescherm de platen tegen licht (afdekken met aluminiumfolie).
15. Was de cellen driemaal met hFCB en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
16. Resuspend de celkorrel met behulp van 200 μL PBS (d.w.z. tot een eindconcentratie van 5 × ¹⁰⁶ cellen /ml).
17. Voor acquisitie:
    1. Als u een standaard BD FACS-lader gebruikt, breng de monsters dan over naar 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem (zie de tabel met materialen).
    2. Als u high-throughput samplers (HTS, ook wel plaatlezers genoemd) gebruikt, gaat u onmiddellijk verder met stap 1.19.
18. Voordat u doorgaat met de gegevensverzameling voor de MESF-normen, controleert u het maximale maximum voor fluorescentie-intensiteit lineariteit en minimumlimieten voor de kwantificeringskanalen.
19. Verwerf vóór compensatie gegevens voor de MESF-normen, zodat zowel de zwakste als de helderste populaties in het lineaire meetbereik vallen.
20. Verkrijg de compensatiemonsters. Houd de spanningswaarden van de fotomultiplicatorbuis (PMT) voor de kwantificeringskanalen ongewijzigd om het dynamische detectiebereik te behouden. Voer kleine aanpassingen uit in de PMT-spanning van andere kanalen voordat u de compensatiematrixen berekent.
21. Bereken en pas een vergoeding toe.
22. Verkrijg en bewaar minimaal 2 × ¹⁰⁴ totale MESF-kralen voor elk van de kwantificeringskanalen.
23. Selecteer de populatie van afzonderlijke cellen op basis van hun zij- en voorwaartse lichtverstrooiingsgebieden (respectievelijk SSC-A en FSC-A, zoals weergegeven in figuur 1A (i)), gevolgd door de selectie van gebeurtenissen binnen het tijdcontinuüm (figuur 1A (ii)) en laag voor vliegtijd (W) in zowel FSC als SSC in vergelijking met hun hoogten (d.w.z. FSC-W/FSC-H, gevolgd door SSC-W/SSC-H gating zoals weergegeven in respectievelijk figuur 1A (iii) en (iv). Definieer een laatste single-event gate met gebeurtenissen met proportionele FSC-A versus FSC-H verdeling (Figuur 1A (v)).
24. Verkrijg controlemonsters (Isotype-gelabelde en FMO-besturingselementen).
25. Verkrijg monsters en neem op totdat er minimaal 10.000 doelcellen zijn verkregen.
    OPMERKING: de robuuste bepaling van de gemiddelde moleculaire dichtheden vereist de analyse van verschillende donoren in onafhankelijke experimenten. Dit is cruciaal bij het analyseren van celsubsets die in verminderde frequenties worden aangetroffen of zijn afgeleid van schaars biologisch materiaal (bijvoorbeeld van biopten van menselijk weefsel).
26. Was de cytometer gedurende 5 minuten met een FACS-reinigingsoplossing gevolgd door 5 minuten ultrapuur water voordat u het instrument afsluit. Als u de HTS gebruikt, volgt u de opties onder het tabblad HTS en Clean Plate-programma.
    OPMERKING: Om de overdracht van monster naar monster te verminderen, activeert u sit (sampler) flush of high-throughput sampler wash-opties , die de cytometer automatisch tussen buizen of putten wassen. Voordat u met de acquisitie begint, laat u ultrapuur water gedurende 10 minuten met een hoog debiet lopen om ongewassen biologische verontreinigingen uit de monsterleiding van de cytometer te verwijderen.
27. Exporteer de FCS-bestanden (Flow Cytometry Standard).

2. MESF overgecorrigeerde gemiddelde (of mediane) fluorescentie-intensiteit (MFI) regressieanalyses

1. Open de flowcytometrie-analysesoftware en laad de FCS-bestanden van het experiment. Selecteer de populatie kralen op basis van hun zij- en voorwaartse lichtverstrooiingsgebieden (SSC-A versus FSC-A), zoals weergegeven in figuur 1A (i).
2. Controleer de gegevenskwaliteit door de verdeling van afzonderlijke gebeurtenissen in de tijd te controleren, zoals aangegeven in stap 1.24.
   OPMERKING: Bubbels creëren gaten in de verdeling van gebeurtenissen in de tijd; dit verschijnt meestal aan het begin van de acquisitie met behulp van de HTS. Vermijd het selecteren van gebeurtenissen die gaten in de acquisitietijd flankeren, omdat deze meetfouten toevoegen als gevolg van optische aberraties.
3. Focus op de afzonderlijke gebeurtenissen.
   1. Cellen
      1. Identificeer afzonderlijke cellen eerst op basis van hun SSC-A- en FSC-A-verdeling (figuur 1A (i)), gevolgd door gebeurtenissen laag voor W in de sequentiële poorten FSC-W/FSC-H (singlets-1, figuur 1A-paneel (iii)) en SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figuur 1A paneel (iv)). Definieer een extra singlets-3 gate door gebeurtenissen te selecteren met proportionele FSC-A en FSC-H (Figuur 1A, paneel (v)). Identificeer ten slotte levende cellen als die negatief zijn voor de fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof.
   2. MESF kralen
      1. Volg dezelfde singlets-1 tot singlets-3 discriminatie als in stap 2.3.1.1 (Figuur 1B, panelen (i) tot en met (v)). Identificeer elk van de MESF-populaties (blanco, 1, 2, 3 en 4) op basis van hun fluorescentie-intensiteitsniveaus (zie figuur 1B, paneel (vi)).
4. Extraheer de MFI van MESF-fracties blanco en 1 tot 4.
5. Genereer gecorrigeerde MFI-waarden (cMFI) voor MESF-fracties 1 tot en met 4 door de MFI's van de blancokraalpopulatie van elke fractie af te trekken.
6. Bereken de regel die het beste past bij de relatie tussen cMFIs en de MESF-waarden die door de leverancier zijn verstrekt (onafhankelijke variabele, zijnde breuk leeg gelijk aan nul).
7. Extraheer de helling (b in de onderstaande vergelijking) van de lineaire regressie van MESF over cMFI (figuur 1B paneel (viii) toont een regressie waarin y = a + bx; met a = 0).
8. Extraheer de mediane (voor bimodale fluorescentieverdelingen) of gemiddelde (voor normale of log-normale fluorescentieverdelingen) fluorescentie-intensiteiten uit de populaties van belang (TFH- en B-cellen in figuur 1A-paneel (vii)).
9. Net als in stap 2.5-2.7 extraheert u de MFI-waarden uit isotype-gelabelde controlecellen.
10. Als de F/P van isotypecontroles hetzelfde is als de kwantificeringsantistoffen, corrigeer dan de MFI's van gekleurde cellen door de MFI's af te trekken van isotype-gelabelde cellen.
11. Als de F/P van de isotypen verschilt van die van kwantificeringsantistoffen, extraheert u de MESF uit de isotypen door de MFI's van isotype-gelabelde cellen te delen met de helling berekend in stap 2.7. Trek isotype MESF af van kwantificering MESF voordat gebonden kwantificeringsantistoffen worden geschat.
12. Deel de MESF door de F/P van de kwantificeringsantistoffen om het aantal gebonden moleculen per cel te schatten (Molec. _cel zoals weergegeven in het stroomdiagram van figuur 1C).
13. Deel het aantal gebonden moleculen met het geschatte celoppervlak (CSA (^μm2)) om de dichtheid van eiwitten te extraheren als molec./^μm2 (figuur 1C). Raadpleeg de sectie representatieve resultaten voor meer informatie.

3. Functionele fosfolipidesoorten voor gebruik bij de kalibratie van eiwitten die BSLBs coaten

1. Gebruik 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) als de belangrijkste component van de lipidematrix die de ondersteunde lipide bilayer vormt. Verdun alle andere lipidensoorten in deze DOPC-oplossing.
2. Gebruik tussen 0,2 en 1 mol% van 0,4 mM DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine) geconjugeerd aan kleurstoffen, waaronder ATTO 390, 488 of 565 (zie de tabel met materialen), om BSLBs met intrinsieke fluorescentie te genereren.
   OPMERKING: De intrinsieke fluorescentie van BSLBs vergemakkelijkt de identificatie van enkele BSLBs en enkele cellen in synaptische overdrachtsexperimenten.
3. Gebruik 12,5 mol% van 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid) succinyl]) om His-tagged eiwitten te verankeren. Houd de mol% van DGS-NTA(Ni) constant en voer 2-voudige titraties uit van de His-tagged eiwitten, beginnend met 100 nM als hoogste concentratie. Laat één voorwaarde zonder eiwit als negatieve controle voor absolute kwantificeringen.
   OPMERKING: Accessoiresignalen en adhesiemoleculen, zoals ICAM-1, zijn ontworpen met een 12-His-tag om de affiniteit van het eiwit voor DGS-NTA (Ni) te vergroten.
4. Gebruik Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(cap biotinyl)) om gebiotinyleerde eiwitten te verankeren via biotine-streptavidin-biotinebruggen. Gebruik een 5-voudige seriële titratie van 0,4 mM Biotinyl Cap PE die tussen 10 mol% en 0 mol% bedekt (als negatieve controle). Houd de concentratie van streptavidin en gebiotinyleerde eiwitten constant (200 nM) in zowel kalibratie-experimenten als de reconstitutie van synthetische APC's voor synaptische overdrachtsexperimenten.
   OPMERKING: De regressieanalyses van empirische dichtheden van gebiotinyleerde eiwitten over de uiteindelijke mol% van Biotinyl Cap PE in de lipidematrix (die ook DGS-NTA(Ni) bevat om His-tagged eiwitten te verankeren) zullen de mol% definiëren die moet worden gebruikt om doeldichtheden van antigeen te reconstitueren.

4. Bereiding van aangevulde HEPES gebufferde zoutoplossing met 1% serumalbumine

OPMERKING: Aangevulde HEPES-gebufferde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine (HBS/HSA) of 1% runderserumalbumine (HBS/BSA) is vereist in de was- en eiwitbelastingsstappen van BSLBs (tabel 1). Bereid een 10x HBS-stamoplossing en de werkbuffer zo vers mogelijk; gekoeld bewaren en binnen een maand gebruiken. Hoewel BSA een goedkoper alternatief is voor HSA, biedt het een efficiënte blokkering van Ni-chelaat ^lipiden13 en wordt het aanbevolen voor experimenten met een hoge doorvoer.

1. Bereid een 10x voorraadbufferoplossing van aangevuld HBS met 200 mM HEPES, 7 mM _Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glucose, 10 mM _CaCl2 en 20 mM _MgCl2.
   OPMERKING: Het oplossen van _MgCl2 is zeer exotherm en brandgevaarlijk. Voeg dit zout langzaam en op een grote hoeveelheid oplosmiddel toe. Vermijd het bereiden van geconcentreerde oplossingen (d.w.z. 1 M) van deze zouten, omdat ze de neiging hebben om na verloop van tijd neer te slaan, waardoor hun precieze toevoeging aan de werkbuffer moeilijk wordt.
2. Filtreer de 10x-oplossing met een filtereenheid van 0,22 μm en houd deze steriel bij 4 °C.
3. Neem voor 500 ml HBS/heeft 50 ml van de aangevulde 10x HBS-oplossing, stel de pH indien nodig in op 7,4 en vul het volume aan tot 483,4 ml met ultrapuur water.
4. Voeg 16,6 ml 30% HSA-oplossing toe aan de 483,4 ml HBS, pH 7,4.
5. Los gedurende 500 ml HBS/BSA 5 g BSA op in HBS en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten. Meng vervolgens voorzichtig bij RT door de fles periodiek om te keren totdat er geen zichtbare eiwitkristallen of klonten zijn.
6. Filtreer de resulterende oplossing uit stap 4.5 met behulp van een filtereenheid van 0,22 μm (zie de materiaaltabel) en bewaar deze bij 4 °C.

5. Kalibraties van de eiwitdichtheid op BSLBs

1. Voordat u de niet-gefunctionaliseerde silicakorrels met een diameter van 5,00 ±0,05 μm inneemt, mengt u de stamoplossing goed en resuspendeert u eventuele grote klonten kralen die op de bodem van de kolven zijn bezinkt.
   OPMERKING: Silicaparels hebben de neiging om snel te bezinken, wat kan leiden tot telfouten. Meng krachtig door de helft van het maximale volume van een P1000 micropipette op en neer te pipetteren.
2. Verdun 1 μL kraaloplossing in 1.000 μL PBS, tel de kralen met behulp van een hemocytometerkamer en bereken hun concentratie per ml.
   OPMERKING: Trypan blauwe kleuring is niet nodig voor het visualiseren van silica kralen.
3. Bereken het volume silicaparels dat nodig is voor 5 × ¹⁰⁵ uiteindelijke BSLBs per punt van de titratie.
4. Breng het vereiste volume silicaparels over in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.
5. Was de silicakorrels driemaal met 1 ml steriel PBS, centrifugeer de kralen gedurende 15 s op een benchtop microcentrifuge bij RT (bij vast toerental).
   OPMERKING: Vermijd bij het verwijderen van de wasoplossing het verstoren van de kraalkorrel. Een kleine bufferkolom heeft geen invloed op de verspreiding van de liposomen waaruit de liposoommastermix bestaat, omdat deze ook in PBS zitten.
6. Bereid drie volumes van de liposoommastermix om de BSLB op de gewassen silicaparels te monteren (bijvoorbeeld, als het initiële totale volume silicaparels 20 μL is, bereid dan minimaal 60 μL van de liposoommastermix).
7. Voor Biotinyl Cap PE mol% titraties
   1. Bereid de lipide master mixen met 5-voudige verdunningen van Biotinyl Cap PE.
      1. Verdun de 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% in een 100% DOPC matrix.
      2. Meng elk Biotinyl Cap PE mol% titratiepunt in een verhouding van 1:1 (vol:vol) met een oplossing van 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) zodat een laatste 12,5 mol% Ni-bevattende lipiden aanwezig is in alle titraties.
         OPMERKING: De 12,5 mol% (vol:vol%) van Ni-bevattende lipiden vertegenwoordigen de gemengde lipidesamenstelling van BSLBs waarop His-tagged eiwitten ook kunnen worden getest in parallelle kalibraties. Bijvoorbeeld, aangezien alle liposoomvoorraden worden bereid met dezelfde molaire concentratie, om het beoogde mol% mengsel in 200 μL uiteindelijke liposoommix te bereiken, mengt u eenvoudig 100 μL van 25 mol% Ni-bevattende DGS-NTA met 100 μL van 100 mol% DOPC.
   2. Breng 5 × ¹⁰⁵ gewassen silicakorrels over op microcentrifugebuizen van 1,5 ml, zodat één Biotinyl Cap PE mol% titratiepunt per buis wordt geassembleerd.
   3. Voeg de Biotinyl Cap PE mol% titratiemastermixen toe aan de gewassen silicakorrels en meng voorzichtig door de helft van het totale volume op en neer te pipetteren. Vermijd het vormen van bubbels, die in overmaat de lipide dubbellaag vernietigen.
   4. Voeg argongas (of stikstof) toe aan de buis met de nu vormende BSLBs om lucht te verplaatsen en de lipiden te beschermen tegen oxidatie tijdens het mengen.
   5. Voeg Argon toe aan de lipidenvoorraden van 0,4 mM voor opslag en manipuleer met behulp van een steriele techniek.
      OPMERKING: Sluit een kleine buis aan op de Argon/Stikstof gasfles. Voordat u gas aan de buizen toevoegt, stelt u de gasflesregelaar zo in dat de druk niet hoger is dan 2 psi. Sluit een steriele pipetpunt aan op de uitlaatslang om de gasstroom gedurende 5 s in de liposoombouillon te leiden en sluit het deksel snel. In het geval van lipidenvoorraden, sluit u het deksel van de buis af met paraffinefilm voordat u deze bij 4 °C bewaart.
   6. Verplaats de BSLBs naar een verticale laboratoriummenger met variabele hoek (zie de tabel met materialen) en meng gedurende 30 minuten bij RT met behulp van een orbitale menging van 10 rpm.
      OPMERKING: Deze stap voorkomt de sedimentatie van kralen tijdens de vorming van de ondersteunde lipide dubbellaag.
   7. Draai de kralen naar beneden door 15 s te centrifugeren bij RT op een minicentrifuge op een bank en was vervolgens drie keer met 1 ml HBS / HSA (BSA) om overtollige liposomen te verwijderen.
   8. Blokkeer de gevormde BSLBs door 1 ml 5% caseïne of 5% BSA met 100 μM _NiSO4 toe te voegen om NTA-locaties te verzadigen en 200 nM streptavidin om alle biotine-verankeringsplaatsen op de BSLBs uniform te coaten. Meng voorzichtig door de helft van het totale volume op en neer te pipetteren en incubeer in de verticale mixer gedurende niet langer dan 20 minuten bij RT en 10 rpm.
   9. Draai de BSLBs naar beneden door 15 s te centrifugeren bij RT op een minicentrifuge op een bank en was vervolgens drie keer met 1 ml HBS / HSA (BSA) buffer.
      OPMERKING: Houd gewassen kralen verticaal met een klein volume wasbuffer die de BSLBs bedekt. Vermijd de uitdroging van de BSLBs, omdat lucht de lipide bilayer zal vernietigen.
8. Voor de titratie van His-tagged eiwitten op 12,5 mol% van DGS-(Ni) NTA-bevattende BSLBs
   1. Bereid drie volumes liposoommastermix met een laatste 12,5 mol% DGS-NTA(Ni).
   2. Gebruik de liposoommastermix om de gewassen silicakorrels opnieuw te suspenderen en meng voorzichtig door de helft van het totale volume op en neer te pipetteren. Vermijd het vormen van bubbels, die in overmaat de lipide dubbellaag beschadigen.
   3. Voeg argongas (of stikstof) toe aan de buis met de nu vormende BSLBs om lucht te verplaatsen en de lipiden te beschermen tegen oxidatie tijdens het mengen.
   4. Voeg Argon toe aan de lipidenvoorraden van 0,4 mM voor opslag en manipuleer met behulp van een steriele techniek.
   5. Verplaats de BSLBs naar de verticale mixer en mix gedurende 30 minuten bij RT met behulp van orbitaal mengen bij 10 rpm.
   6. Draai de kralen naar beneden door 15 s te centrifugeren bij RT op een minicentrifuge op een bank en was vervolgens drie keer met 1 ml HBS / HSA (BSA) om overtollige liposomen te verwijderen.
   7. Blokkeer de gevormde BSLBs door 1 ml 5% caseïne (of 5% BSA) met 100 μM _NiSO4 toe te voegen om NTA-locaties op de BSLBs te verzadigen. Meng voorzichtig en incubeer in de verticale mixer gedurende niet langer dan 20 minuten bij RT en 10 rpm.
   8. Was drie keer met HBS/HSA (BSA) om de overtollige blokkerende oplossing te verwijderen.
   9. Bereid in een nieuwe U-bottom 96-well plaat 2-voudige seriële verdunningen van de eiwitten voor.
      1. Bereid een startconcentratie van 100 nM voor het eiwit van belang voor in een totaal volume van 200 μL HBS/HSA (BSA) buffer, verdeel 100 μL van deze oplossing in de eerste kolom en de resterende 100 μL bovenop kolom #2 met 100 μL HBS/HSA (BSA) buffer.
      2. Ga verder door 100 μL serieel over te brengen van kolom #2 naar kolom #3 en herhaal dit indien nodig om alle titratiepunten te dekken. Laat de laatste kolom van de reeks zonder eiwit, omdat dit zal worden gebruikt als de lege referentie voor kwantificering.
   10. Resuspend de bereide BSLBs in een zodanig volume dat 5 × ¹⁰⁵ BSLB in 100 μL HBS/HSA (BSA) buffer zitten.
   11. Breng 100 μL van de BSLB-suspensie over naar putten van een tweede U-bodem 96-putplaat, zodat elke put 5 × ¹⁰⁵ BSLBs ontvangt.
   12. Draai de tweede plaat met BSLBs gedurende 2 minuten op 300 × g en RT en gooi het supernatant weg.
   13. Breng de volumes van 100 μL over van de eiwittitratieplaat naar de plaat met de bezinkte BSLBs. Meng voorzichtig, vermijd overtollige bubbelvorming tijdens het pipetteren en incubeer gedurende 30 minuten bij RT en 1.000 tpm met behulp van een platenschudder. Bescherm tegen licht met aluminiumfolie.
   14. Was de plaat driemaal met HBS/HSA (BSA) buffer met sedimentatiestappen van 300 × g gedurende 2 minuten bij RT.
   15. Als het bij de kalibratie gebruikte recombinante eiwit direct is geconjugeerd met fluorochromen en bekende F/P-waarden heeft, gaat u verder met stap 5.8.20.
   16. Als het recombinante eiwit dat bij de kalibratie wordt gebruikt niet is gelabeld of geconjugeerd is met fluorochroom of als er geen MESF-kraalstandaard beschikbaar is, gebruik dan Alexa Fluor 488 of 647-geconjugeerde antilichamen met bekende F / P-waarden om de met eiwitten gecoate BSLB te kleuren.
   17. Kleuring met verzadigingsconcentraties van kwantificeringsantistoffen.
       OPMERKING: Afhankelijk van het doelexpressieniveau variëren deze tussen 5 en 10 μg/ml.
   18. Beits gedurende 30 min bij RT en 1.000 rpm met behulp van een platenschudder. Bescherm tegen licht met aluminiumfolie.
   19. Was tweemaal met HBS/HSA (BSA) buffer en eenmaal met PBS met sedimentatiestappen van 300 × g gedurende 2 min bij RT.
       OPMERKING: Gebruik PBS, pH 7,4 om de gewassen BSLBs opnieuw te suspenderen voordat u deze aanschaft. Gebruik geen buffers die eiwit bevatten, omdat dit leidt tot de vorming van bubbels tijdens het automatisch mengen van monsters met samplers met hoge doorvoer.
   20. Verkrijg de MESF-normen en zorg ervoor dat de helderste pieken in het lineaire detectiebereik voor de kwantificeringsdetector (kanaal) blijven, zoals weergegeven in figuur 1B (vii).
   21. Verkrijg de monsters handmatig of met behulp van HTS. Bij gebruik van dit laatste resuspendeert u BSLBs in 100 μL PBS en verkrijgt u 80 μL met behulp van een debiet tussen 2,5 en 3,0 μL/s, een mengvolume van 100 μL (of 50% van het totale volume als het resuspensievolume kleiner is), een mengsnelheid van 150 μL/s en vijf mengsels om ervoor te zorgen dat BSLBs monodispersed zijn.
   22. Exporteer de FCS-bestanden.
   23. Focus op enkele gebeurtenissen voor de analyses (figuur 2A), omdat doubletten of drielingen fouten in de bepaling zullen introduceren. Gebruik geneste identificatie van afzonderlijke gebeurtenissen zoals aangegeven in protocolstap 1.2.3.
   24. Meet de MFI van elke MESF-fractie (1-4) en trek de MFI van lege kralen af om gecorrigeerde MFI's (cMFI) te extraheren.
   25. Voer een lineaire regressieanalyse uit om de helling (b) van MESF te extraheren over de cMFI berekend voor MESF-normen, die zal worden gebruikt in stap 5.33.
   26. Extraheer de MFI van elk titratiepunt en trek de MFI van kralen zonder eiwit af om cFI's te verkrijgen.
   27. Deel de cMFI's met de helling berekend in stap 5.31 om de MESF te extraheren die is gebonden aan BSLBs voor elk titratiepunt.
   28. Deel MESF gebonden aan BSLBs door de F/P-waarde van het kwantificeringsantilichaam om het gemiddelde aantal moleculen gebonden per BSLB te extraheren.
   29. Gebruik de diameter van de BSLBs (5,00 ± 0,05 μm) om het oppervlak van de kraal (SA = ^4pr2) te extraheren om de uiteindelijke dichtheden van eiwit (molec./^μm2) per titratiepunt (eiwitconcentratie) te berekenen.
   30. Voer een nieuwe regressieanalyse uit van de eiwitconcentratie over de eiwitdichtheid om de helling (b) van de lijn van de beste pasvorm te berekenen.
       OPMERKING: De concentratie van 12,5 mol% van DGS-NTA(Ni) verleent een maximale verankeringscapaciteit van ongeveer 10.000 molc./^μm210 zonder de niet-specifieke activering van T-cellen te induceren of de laterale mobiliteit van de SLBs te beïnvloeden.

6. Uitvoeren van synaptische overdrachtsexperimenten tussen T-cellen en BSLBs

1. Voordat u het synaptische overdrachtsexperiment uitvoert
   1. Verkrijg niet-fluorescerende BSLBs, BSLBs met fluorescerende lipiden, niet-gekleurde cellen (of compensatieparels; zie de tabel met materialen) en cellen met één kleur (of compensatieparels) om de fluorescentiespectruminteracties van het instrument te identificeren. Focus op die detectoren met een hoge spillover-verspreiding om het polychromatische paneel opnieuw te ontwerpen, de gevoeligheid te verhogen en de meetfout op kritieke detectoren te verminderen (zie ¹⁴).
   2. Titreer de detectieantistoffen om de optimale concentratie te vinden, waardoor detectie van positieve gebeurtenissen mogelijk is zonder de detectie van negatieven in gevaar te brengen.
      OPMERKING: Herhaal deze stap wanneer er een antilichaampartij verandert, omdat de F / P-waarden en helderheid van batch tot batch variëren.
   3. Optioneel: Optimaliseer de PMT-spanningen door het monster op verschillende spanningsbereiken te verkrijgen (d.w.z. een spanning loopt) om de PMT's te vinden die leiden tot een optimaal signaal over ruis (d.w.z. scheiding van negatieven en positieven, terwijl ervoor wordt gezorgd dat het signaal van de helderste populatie in het lineaire bereik blijft).
2. Meting van T-cel output overdracht naar BSLBs
   1. Bereid aangevulde RPMI 1640 (hierin R10-medium) met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 100 μM niet-essentiële aminozuren, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 E / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine. Gebruik R10-medium om T-cellen te kweken en uit te breiden.
   2. Isoleer op dag 1 T-cellen uit perifere bloed- of leukoreductiesysteem (LRS) kamers. Gebruik immunodensiteitscelisolatie- en scheidingskits (zie de tabel met materialen) voor verrijking van menselijke CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen.
   3. Zaai de cellen in een eindconcentratie variërend tussen 1,5 en 2,0 × ¹⁰⁶ cellen / ml, met behulp van 6-well platen met niet meer dan 5 ml totaal per put.
   4. Activeer T-cellen met behulp van een 1:1-verhouding van menselijke T-celactivatie (anti-CD3 / anti-CD28) magnetische kralen (zie de tabel met materialen) en voeg 100 IE recombinant humaan IL-2 toe om celproliferatie en overleving te ondersteunen.
   5. Verwijder op dag 3 de activerende magnetische kralen met behulp van magnetische kolommen (zie de tabel met materialen). Zorg ervoor dat magnetische kralen aan de zijkanten van de buis blijven zitten voordat u de cellen herstelt voor extra wasstappen.
   6. Was de magnetische kralen nogmaals met 5 ml vers R10-medium, meng goed en plaats ze terug in de magneet. Herstel dit volume en meng met de cellen die in stap 6.2.5 zijn hersteld.
   7. Resuspend de cellen tot 1,5-2 × ¹⁰⁶ cellen / ml in verse R10 met 100 E / ml IL-2. Vul het medium na 48 uur aan en zorg ervoor dat de laatste toevoeging van IL-2 48 uur vóór de dag van experimenteren is (dag 7 tot 14 van de cultuur).
   8. Bereid op de dag van het synaptische transferexperiment het Synaptic Transfer Assay medium (zie tabel 1) door fenol roodvrij RPMI 1640 medium aan te vullen met 10% FBS, 100 μM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. Neem geen recombinant humaan IL-2 op.
   9. Tel cellen met behulp van trypan blauwe kleuring of elektrische stroomuitsluiting en resuspendatie tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 × ¹⁰⁶ cellen / ml in medium. Als overmatige celdood wordt waargenomen (>10%), verwijder dan dode/stervende cellen met behulp van een mengsel van polysaccharide en natriumdiatrizoaat (zie de tabel met materialen) als volgt:
      1. Laag 15 ml celcultuur bovenop 13 ml van de polysaccharide-natriumdiatrizoaatoplossing.
      2. Centrifugeer gedurende 1.250 × g gedurende 20 minuten bij RT met minimale versnelling en vertraging. Verzamel de cellaag (wolk) in het raakvlak tussen het medium en de polysaccharide-natriumdiatrizoaatoplossing.
      3. Was de cellen ten minste tweemaal met voorverwarmd Synaptic Transfer Assay medium (bereid in stap 6.2.7).
      4. Tel en resuspend de cellen tot een eindconcentratie van 2,5 × ¹⁰⁶/ml met behulp van synaptisch transfertestmedium. Kweek 100 μL van deze celsuspensie met BSLBs (zie stap 6.2.15).
   10. Bereken het aantal BSLBs dat nodig is voor het experiment; overweeg alle verschillende eiwitmastermixen en antigeentitraties die moeten worden getest (ofwel gebiotinyleerde HLA / MHC-peptidemonomeren of monobiotinylated anti-CD3ε Fab).
   11. Stel de BSLBs samen door dezelfde stappen uit protocolsectie 5 te volgen, maar combineer deze keer alle titraties van eiwitten en lipiden die nodig zijn om een complex APC-membraan te reconstitueren (figuur 3A). Houd dezelfde vol: vol-relaties tussen het initiële silicakraalvolume en het volume eiwitmengsel dat tijdens kalibraties wordt gebruikt, evenals tijden en temperaturen die worden gebruikt bij het laden van BSLBs. Als bijvoorbeeld 0,5 μL silicakorrels/put en 100 μL/put eiwitmengsel werden gebruikt voor de initiële kalibratie, handhaaf dan 5:1.000 vol:vol:vol ratio's om de BSLBs voor te bereiden om te worden gecocultureerd met T-cellen.
   12. Zodra BSLBs zijn geladen met de eiwitmix van belang, wast u de BSLBs tweemaal met HBS / HSA (BSA) om overtollige ongebonden eiwitten te verwijderen. Gebruik sedimentatiesnelheden van 300 × g gedurende 2 minuten bij RT in elke wasstap en gooi de supernatanten weg.
   13. Resuspend de 5 × ¹⁰⁵ BSLBs per put in 200 μL.
   14. Breng 100 μL per put over naar een nieuwe U-bottom 96-well plaat om een duplicaat te maken, zodat de uiteindelijke hoeveelheid BSLB per put 2,5 × ¹⁰⁵ is.
   15. Draai de BSLBs op 300 × g gedurende 2 minuten en RT en gooi het supernatant weg.
   16. Resuspend de BSLBs met behulp van 100 μL T-celsuspensie; meng voorzichtig om de vorming van bubbels te voorkomen.
   17. Incubeer de coculturen gedurende 90 min bij 37 °C.
       OPMERKING: Als alternatief kunnen cellen en kralen worden geresuspendeerd in HBS / HSA (BSA) buffer in plaats van fenol-rode vrije RPMI voor de cocultuur. In dit geval moet de incubatie worden uitgevoerd in een _{niet-CO2-incubator} , omdat dit gas de buffer snel zal verzuren in afwezigheid van bicarbonaat.
   18. Koel de BSLB-T celcoculturen af door de cellen eerst minimaal 15 minuten bij RT te incuberen. Bescherm ze tegen licht.
   19. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 500 × g en RT; gooi het supernatant weg.
   20. Resuspend de cellen in RT 2% BSA-PBS (^Ca2+ en ^Mg2+-vrij) voor blokkering. Plaats de cellen gedurende 45 minuten op ijs. Bescherm tegen licht.
   21. Bereid tijdens het incuberen van de cellen de antilichaammastermix voor met ijskoude 0,22 μm-gefilterde 2% BSA in PBS als een kleurbuffer, die extra blokkering zal bieden.
       OPMERKING: Sommige partijen antilichamen geconjugeerd aan Brilliant Violet kleurstoffen hebben de neiging om niet specifiek aan BSLBs te binden. Blokkeren met 5% BSA-PBS helpt om dit geluid te verminderen. Zorg er vanaf nu voor dat de koudeketen ongebroken blijft.
   22. Draai de coculturen op 500 × g gedurende 5 min en 4 °C. Voordat u de supernatanten weggooit, moet u er kort voor zorgen dat de pellet aanwezig is door de bodem van de 96-well plaat te inspecteren met behulp van een achtergrondverlichting.
   23. Gebruik een meerkanaalspionele pipet om de cellen in de kleuringsmastermix met geoptimaliseerde antilichaamconcentraties opnieuw te schorsen.
       OPMERKING: Gebruik pipetpunten zonder filter om het ontstaan van bubbels en fouten in de verdeling van kleurvolumes te voorkomen.
   24. Inclusief isotype-gelabelde cellen en BSLBs, fluorescerende en niet-fluorescerende BSLBs, en cellen en BSLBs alleen gekleurd. Respecteer het totale aantal gebeurtenissen per put voor alle controles (d.w.z. alleen BSLBs met 5 × ¹⁰⁵ BSLB / put, en alleen celcontroles met 5 × ¹⁰⁵ cellen / put om een relatieve toename van antilichamen per gekleurde gebeurtenis te voorkomen).
   25. Meng voorzichtig door de helft van het volume op en neer te pipetteren en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Bescherm tegen licht.
   26. Was de cellen en BSLBs tweemaal met ijskoude 2% BSA-PBS, pH 7,4 en sedimentatiestappen van 500 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Resuspend de gewassen coculturen in 100 μL PBS en onmiddellijk aanschaffen.
   27. Als fixatie nodig is, repareer dan met 0,5% w / v PFA in PBS gedurende 10 minuten, was eenmaal en bewaar pbs tot de overname. Bescherm tegen licht.
   28. Koop vóór compensatie MESF-normen, zodat zowel de zwakste als de helderste populaties in het lineaire meetbereik vallen.
   29. Verkrijg compensatiemonsters, bereken compensatie en pas de compensatiematrix (link) toe op het experiment.
   30. Verkrijg en bewaar minimaal 2 × ¹⁰⁴ totale MESF-standaarden voor elk van de kwantificeringskanalen.
   31. Voor acquisitie met behulp van high-throughput samplers stelt u de instrumentacquisitie standaard in, stelt u de monsteracquisitie in op 80 μL (of 80% van het totale volume), sampledebiet tussen 2,0 en 3,0 μL/s, samplemengvolume van 50 μL (of 50% van het totale volume om bellenvorming tijdens het mengen te voorkomen), monstermenging van 150 μL/s en mengen per put tussen 3 en 5.
   32. Verkrijg minimaal 1 × ¹⁰⁴ afzonderlijke BSLBs per monster (zie figuur 3B-panelen (i) -(vi) voor de referentiegatingstrategie).
   33. Was de cytometer gedurende 5 minuten een reinigingsoplossing gevolgd door 5 minuten ultrapuur water voordat u het instrument uitschakelt. Als u de HTS gebruikt, volgt u de opties onder het tabblad HTS en de optie Opschonen .
   34. FCS-bestanden exporteren.

7. Meten van de synaptische overdracht van deeltjes naar BSLB

1. Open de FCS-bestanden van het experiment. Selecteer de populatie van cellen en BSLBs op basis van hun zij- en voorwaartse lichtverstrooiingsgebieden (SSC-A versus FSC-A), zoals weergegeven in figuur 3B (i).
2. Selecteer de gebeurtenissen in het venster voor continue acquisitie (figuur 3B (ii)).
3. Focus op de afzonderlijke gebeurtenissen van zowel cellen als BSLB; identificeer afzonderlijke cellen eerst op basis van lage W in de sequentiële poorten FSC-W/FSC-H (singlets-1, figuur 3B-paneel (iii)) en SSC-W/SSC-H (singlets-2; Figuur 3B paneel (iv)). Definieer een extra singlets-3 gate door gebeurtenissen te selecteren met proportionele FSC-A en FSC-H (Figuur 3B, paneel (v)).
4. Extraheer de MFI van MESF-fracties blanco en 1 tot 4 en uit afzonderlijke cellen en MESF voor elk experimentmonster.
5. Genereer gecorrigeerde MFI-waarden (cMFI) voor MESF-fracties 1 tot en met 4 door de MFI van de blancokraalpopulatie van elke fractie af te trekken.
6. Genereer cFI's voor afzonderlijke BSLBs en cellen (zie figuur 3C paneel (i)).
7. Gebruik het signaal van BSLB gekleurd met isotype controle antilichamen om de MFI van BSLB gekleurd met antilichamen tegen de relevante T-cel markers te corrigeren. Gebruik cMFI om het genormaliseerde synaptische overdrachtspercentage (NST%) te berekenen met behulp van de vergelijking in het deelvenster Figuur 3C (ii).
8. Als u in plaats daarvan geïnteresseerd bent in de deeltjes die specifiek worden overgedragen als reactie op TCR-triggering, trekt u het signaal van nul-BSLBs af van de MFI van agonistische BSLBs. Gebruik deze cMFI om de TCR-gestuurde NST% te berekenen met behulp van de vergelijking in figuur 3C-paneel (ii).
9. Als u geïnteresseerd bent in het bepalen van het totale aantal moleculen dat als deeltjeslading over de T-cel-BSLB-interface wordt overgebracht, verwerf dan MESF-benchmarkkralen met behulp van dezelfde instrumentinstellingen en acquisitiesessie voor T-cel-BSLB-coculturen.
10. Analyseer MESF-kralenpopulaties en extraheer hun cFI's zoals aangegeven in protocolstappen 5.8.15 tot 5.8.17. Bereken de helling van de lijn die het beste geschikt is voor de regressieanalyse van MESF over cMFI.
11. Gebruik de berekende helling om het aantal MESF te extraheren dat op BSLBs is gedeponeerd. Gebruik cMFIs berekend met behulp van isotypecontroles of null BSLB als blanco's om het aantal MESF te extraheren dat specifiek is overgedragen aan stimulerende BSLBs.
12. Bereken het aantal moleculen van markers dat wordt overgedragen aan BSLBs door de berekende (gemiddelde) MESF's per BSLB te delen door de F/P-waarde van het kwantificeringsantilichaam.

Representative Results

FCM voor absolute eiwitkwantificering op het celoppervlak
De reconstitutie van BSLBs met fysiologische dichtheden van liganden vereist de schatting van de totale eiwitdichtheden op de gemodelleerde celsubset. Om BSLBs te reconstitueren, moet u alle relevante ligand opnemen die naar verwachting een rol zal spelen in de signaalas van belang naast eiwitten die de adhesie en functionele interactie tussen BSLB en cellen ondersteunen, zoals ICAM-1 en kostenimulatorische moleculen, bijvoorbeeld CD40-, CD58- en B7-receptoren (CD80 en CD86). Afhankelijk van de vraag kunnen extra eiwitten worden toegevoegd, waaronder kostenimulatorische moleculen zoals ^ICOSL3, PD-L1 en PD-L215. Voor alle andere moleculen reconstitueer BSLBs met behulp van moleculaire dichtheden die worden bepaald door cellen rechtstreeks te analyseren met kwantitatieve flowcytometrie. Voor direct geconjugeerde antilichamen levert BioLegend F/P-waarden voor elk antilichaampartijnummer. Antilichamen kunnen ook intern worden gelabeld en de F / P-verhoudingen worden bepaald door spectrofotometrie, wat een alternatief biedt wanneer er geen commerciële antilichamen zijn geconjugeerd aan het gewenste fluorochroom. Omdat we dezelfde antilichamen gebruiken om het aantal recombinante eiwitten op het oppervlak van cellen en BSLBs te kalibreren, is het niet nodig om de antilichaambindende valentie te corrigeren, omdat dit constant blijft. Als de antilichaambindende valentie vereist is, gebruik dan zowel recombinante eiwitten als antilichamen met bekende F/P om BSLBs te versieren en vergelijk moleculen van geladen recombinante eiwitten met het aantal gebonden antilichamen na kleuring onder verzadigingsomstandigheden.

De gebonden antilichaammoleculen per cel kunnen worden geschat met behulp van een speciale monochromatische flowcytometrische meting of een polychromatisch panel van antilichamen bedoeld om absolute eiwitdichtheden te schatten op een relatief zeldzame subset van cellen in een weefsel van belang, zoals palatinale amandelen. Figuur 1 toont representatieve metingen van dichtheden van ICAM-1 in CXCR5+ B-cellen en folliculaire T-cellen (TFH) als voorbeeld. Hetzelfde kleuringsprotocol en de flowcytometrie-analyseprincipes in figuur 1A kunnen worden gebruikt om eiwitdichtheden te meten op epitheelcellen, stromale cellen, monocyten, van monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) of op B- en T-lymfocyten in andere menselijke en muizenweefsels. Voor weefsels die verschillen van bloed en amandelen, moet voorzichtigheid worden betracht bij het isoleren van cellen met behulp van proteasecocktails, omdat de langdurige blootstelling van cellen aan verterende enzymen de expressieniveaus van het celoppervlak vermindert.

Richt de acquisitie en analyses op enkele, levende cellen binnen het continue acquisitievenster (figuur 1A ii), omdat gebeurtenissen buiten het tijdscontinuüm het licht afwijkend verstrooien, waardoor de kwantificering in gevaar komt. Om de nauwkeurigheid van de bepalingen te vergroten, vermindert u de niet-specifieke kleuring van APC's door efficiënte blokkering van FcγRs. Het menselijke serum en EDTA aanwezig in hFCB maken efficiënte FcγR-blokkering mogelijk terwijl chelaatvrije ^{Ca2 +} de spontane aggregatie van cellen tijdens hun manipulatie en kleuring vermindert (zwarte pijlen in figuur 1A (iii) en (iv) tonen resterende doubletten in suspensies van tonsillaire cellen).

Het bijhouden van de prestaties van het instrument met behulp van de installatie- en volgparels en de software (of iets dergelijks; zie de tabel met materialen) is van cruciaal belang voor de reproduceerbaarheid van kwantificeringen in de loop van de tijd, vooral in latere stappen wanneer de synaptische overdracht van deeltjes naar BSLB wordt gemeten met alleen MFI's (d.w.z. voor fluorochchromen waarvoor geen MESF-normen bestaan). Controleer op dezelfde manier het lineaire bereik (d.w.z. lineariteitsminimum en lineariteitsmaximum) van willekeurige fluorescentie-eenheden voor de kwantificeringsdetector die naast de MESF-normen moet worden gebruikt, zodat elk kalibratiepunt de lineaire relatie tussen fluorescentie en het aantal fluorochchromen behoudt.

De voorbereiding van monsters "blanco" voor fluorescentie, of monsters die een idee geven van de achtergrondkleuringsruis, zijn essentieel om het niet-specifieke fluorescerende signaal af te trekken. Isotypecontroles en/of biologisch nulmonsters (bijv. knock-outs) zijn essentieel om te corrigeren voor het achtergrondsignaal van cellen en om het ware signaal te extraheren dat is afgeleid van de kwantificeringsantistoffen (figuur 1A-paneel (viii)). Evenzo gebruiken standaard MESF-kralen een speciale lege populatie om het achtergrondsignaal van elke echt positieve kralenpopulatie af te trekken (figuur 1B-panelen (vii) en (viii)). Zodra de regressieanalyses zijn uitgevoerd en de helling die de relatie tussen MESF en gecorrigeerde MFI's definieert, is geëxtraheerd, volgt de conversie naar absolute moleculaire dichtheden eenvoudige wiskundige bewerkingen (figuur 1C).

Om CSA in figuur 1C te schatten, werd elektrische stroomuitsluiting (CASY-TT) gebruikt om metingen van celvolume en diameter uit duizenden cellen te extraheren. De resulterende CSA geschat op basis van de berekening van het oppervlak voor bollen (^4pr2) varieert met de activeringstoestand van de cellen, met waargenomen waarden van 170,37 ± 4,91 ^μm2 voor niet-geactiveerde B-cellen en 234,52 ± respectievelijk 1,53 ^μm2 en 318 ± 24,45 ^μm2 voor niet-geactiveerde en geactiveerde T-cellen. Deze CSA's zijn vergelijkbaar met die geschat door beeldvormingstechnieken zoals driedimensionale refractieve indextomografie van niet-geactiveerde ^lymfocyten16.

Zodra het bereik van fysiologische dichtheden is gedefinieerd (bijvoorbeeld door oppervlaktedichtheden te vergelijken op cellen die verschillende activeringsprogramma's ondergaan), kunnen BSLBs worden gebruikt om die oppervlakken te modelleren. Een titratie van gebiotinyleerde antigene HLA-peptidemonomeren geleverd door de NIH tetramer faciliteit (of monobiotinylated monomeric anti-CD3ε-Fab) kan naast ICAM-1 12-His worden gebruikt om een canoniek APC-membraan te reconstitueren. Commerciële eiwitten gelabeld met 6, 9, 12 en 14 His kunnen worden gebruikt om het oppervlak van BSLB te versieren (zie figuur 2A voor voorbeelden met ICAM-1 12-His). Eiwittitraties samen met kwantitatieve FCM-analyses bieden een robuuste methodologie om fysiologische APC-oppervlakken te reconstitueren en hun effect op de synaptische output van verschillende T-celsubsets te testen.

Gebruik voor het bestuderen van de output van T-cel synapsen een 1:1 BSLB-to-T celverhouding om ervoor te zorgen dat gemiddeld één cel gedurende de bestudeerde periode met één BSLB zal interageren. We hebben waargenomen dat de materiaaloverdracht evenredig is met de incubatietijd, wat een veelzijdig platform biedt voor het detecteren van moleculen die in kleine hoeveelheden over de cel: BSLB-interface worden overgedragen. Een geschikt paneelontwerp is dus van cruciaal belang voor het verhogen van de gevoeligheid en betrouwbaarheid van de detectie van transsyptisch materiaal, aangezien in het geval van tSV's de output varieert tussen 25 en 36 blaasjes / cel / 20 ^min2,3. Test eerst de spectrale spillover van elk fluorochroom-gelabeld antilichaam en lipide. Wanneer een hoge spillover wordt waargenomen, raden we de titratie aan van kleuringsantistoffen en het percentage fluorescerende lipiden waaruit de BSLB bestaat, evenals PMT-spanningswandelingen om de verspreidingsfout op gecompenseerde monsters te verminderen en de signaal-over-ruisverhouding te verbeteren (zie respectievelijk 12,14,17 voor een speciale inleiding tot het onderwerp).

Het gebruik van kwantificeringscontroles, waaronder nul BSLBs (zonder antigeen of anti-CD3 Fab) en knock-outcellen of isotype-gelabelde ^monsters18, is essentieel om de overdracht van effector tSV, zoals SE's, evenals supramoleculaire aanvalsdeeltjes die vrijkomen in de synaptische spleet nauwkeurig te meten. Gebruik zeer overvloedige celoppervlakeiwitten zoals CD4, CD2 of CD45 naast synthetische fluorescerende lipiden (DOPE Atto-conjugaten) om de populatie van afzonderlijke cellen en BSLB te identificeren bij koude dissociatie van conjugaten. Richt de analyses op het geometrisch gemiddelde of de mediaan van fluorescentie-intensiteiten in enkele BSLB en cellen (CD4 wordt gebruikt in figuur 3B). SE's zijn een gespecialiseerd type tSV afgeleid van het plasmamembraan (PM), en hun overdracht naar BSLB wordt aangetoond door de versterking van het markersignaal op BSLBs met het consistente verlies van signaal op het oppervlak van de interagerende cellen (zie TCR op BSLBs zoals weergegeven in Figuur 2B, violette pijlen). Nul BSLBs zonder antigeen of anti-CD3 zijn een uitstekende referentie om de specifieke winst van TCR (en andere T-celmarkers) op BSLB bij te houden als gevolg van het stimuleren van interagerende cellen via hun TCR-complex.

Figuur 1: Absolute kwantificering van eiwitten op het oppervlak van APC's. (A) Voorbeeld van kwantitatieve flowcytometriemetingen van ICAM-1 op het oppervlak van tonsillaire B-cellen (Foll. Bc) en helper T cellen (TFH). (i-vii) Gating strategie voor het analyseren van enkele CXCR5 ⁺ Bc en TFH geïsoleerd uit menselijke palatine amandelen. Getoond wordt de sequentiële gating-strategie voor het identificeren van enkele, live gebeurtenissen die zich in het continue acquisitievenster bevinden. (iii-iv) zwarte pijlen geven doubletten aan. viii) over histogrammen die de expressie van het celoppervlak van ICAM-1 (groenblauwe histogrammen) weergeven in vergelijking met FMO-controles (grijze histogrammen) en FMO-controles gelabeld met relevante isotypen (zwarte histogrammen, die overlappen met de grijze histogrammen) van de onder vii) vermelde populaties. Pijlen geven de richting aan voor de geneste gating-strategie die wordt gebruikt om CXCR5⁺ B-cellen (Bc; CD19⁺) en TFH (CD4⁺). (B) Extractie van absolute moleculen op het oppervlak van tonsillaire cellen uit MFI vereist regressieanalyses van MESF-benchmarkparels die zijn verkregen met dezelfde instrumentinstelling als de cellen in A. (i-v) Getoond wordt de sequentiële gating-strategie voor het identificeren van enkele, live gebeurtenissen die zich in het continue acquisitievenster bevinden. (vi) Gating en meting van MFI's uit verschillende standaard MESF-populaties. vii) de getoonde histogrammen van de mesf-populaties die onder vi) zijn geïdentificeerd, zijn bedekt. De waarden die rechtsboven worden weergegeven, vertegenwoordigen de MFI's voor elk van de 5 MESF-populaties (blanco, 1, 2, 3 en 4). viii) Lineaire regressie van MESF ten opzichte van cMFI voor de MESF-populaties weergegeven in (vii). Getoond wordt de helling (b) voor het extraheren van MESF gebonden aan cellen uit gegevens in A. (C) Volg bij de extractie van het aantal moleculen eenvoudige wiskundige bewerkingen, te beginnen met de toepassing van de helling berekend in (viii) van gemeten MESF cMFI (cMFIM) en referentie MESF-waarden (_MESFR). Om de MESF gebonden aan cellen (_MESF-cellen) te extraheren, deelt u de gecorrigeerde MFI van cellen (_cMFI-cellen) door de berekende helling. Vervolgens, om het aantal moleculen gebonden aan cellen te berekenen (Molec. _cellen), deel _MESF-cellen door de F/P van het detectie (kwantificerings)antilichaam. Ten slotte, om de moleculaire dichtheid op het oppervlak van cellen (_Dcells) te berekenen, deel Molec. _cellen op basis van het geschatte celoppervlak (_CSAE). Afkortingen: X = onafhankelijke variabele; Y = afhankelijke variabele (gemeten fluorescentie), cMFIM = gemeten gecorrigeerde MFI; _MESFR = referentie MESF-waarden; _MESFcells = geschatte MESF per cel; _cMFI-cellen = gecorrigeerde MFI-cellen; Molec. _cellen = geschatte moleculen per cel. _Dcells = geschatte dichtheid op cellen; _CSAE = geschat celoppervlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Reconstitutie van BSLB met recombinant ICAM-1 en de meting van deeltjesoverdracht naar BSLBs. (A, i-vi) Flowcytometrie-analyse van BSLBs gereconstitueerd met verhoogde dichtheden van recombinant monomeer ICAM-1 12-His (rICAM-1). (i-v) Richt, net als in figuur 1, de gating-strategie op afzonderlijke BSLBs binnen het continue venster van acquisitie. Let op de opening vlak voor de tijd continuümpoort, die werd uitgesloten om meetfouten te voorkomen. (vi) Een goede eiwitkwaliteit resulteert vaak in de homogene coating van BSLB bij hoge concentraties, met de observatie van smalle fluorescentieverdelingen (lage variatiecoëfficiënt, zie histogrammen in vi). (B) Regressieanalyses van ICAM-1 referentieconcentratie (_CR) over gemeten dichtheid (_DM). Gebruik de helling om doelconcentraties van eiwit (_CT) te berekenen om de dichtheid van cellen (_Dcells) te bereiken die in de experimenten in figuur 1 zijn gemeten. Afkortingen: 12-His = 12-histidines tag; _DM = gemeten moleculaire dichtheden; _CR = referentieconcentraties van de rICAM-1; _CT = streefconcentratie (te interpoleren); _Dcells = dichtheden gemeten in cellen (zie ook Fig. 1C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Meting van T-cel synaptische deeltjes overgebracht naar BSLBs. (A; i-v) Stroomdiagram met de kritische stappen voor de co-culturing van T-cellen met BSLBs die modelmembranen reconstitueren en de daaropvolgende meting van deeltjesoverdracht met flowcytometrie. (iv) Blauwe en donkergele diagrammen tonen de relatieve verdeling en locatie van cellen en BSLBs in biparametrische flowcytometrieplotdiagrammen. v) Fluorescentieverdelingshistogrammen die de relatieve winst van fluorescentie van agonistische BSLBs (donkergeel) weergeven in vergelijking met nul BSLBs (grijs). (B) Voorbeeldig synaptisch overdrachtsexperiment. (i-vi) Getoond wordt de gating-strategie getoond om afzonderlijke BSLBs en cellen te identificeren binnen het continue acquisitievenster. Violette pijlen geven de richting van de analyse aan, die wordt voortgezet in C. (C) (i) Focus de analyses op de MFI van enkele cellen (blauw) en enkele BSLBs (geel). (ii) Vergelijkingen om de genormaliseerde synaptische overdracht (NST%, boven) en _Tmax% (onder) te berekenen uit de cMFI berekend voor BSLB en cellen. iii-vi) Overlayed histogrammen die de verandering van fluorescentie-intensiteitsverdelingen voor cellen (blauwe tinten) en BSLBs (gele tinten) over verschillende dichtheden van de T-cel activerende anti-CD3ε-Fab, inclusief niet-activerend (grijs) en activerend met 250 (zachte kleurwaarde) of 1.000 (hoge kleurwaarde) molec./^μm2. Getallen in verschillende kleurwaarden vertegenwoordigen de NST% gemeten voor de BSLB-histogrammen die in geel worden weergegeven. De overlay histogrammen tonen de overkoepelende hiërarchie in de synaptische overdracht van T-celblaasjes positief voor verschillende markers. Voor deze samenstelling van BSLBs (200 molec./^μm2 ICAM-1 en toenemende dichtheden van anti-CD3ε-Fab) worden tSV's overgebracht naar BSLB met TCR⁺(iii) > CD81⁺(iv) > CD4⁺(v) > CD28⁺(vi). Zoals in eerdere artikelen is aangetoond, zijn TCR en CD81 componenten van SE's en worden ze met relatief hogere efficiënties overgebracht naar CD4, ondanks dat de laatste wordt uitgedrukt op relatief hogere oppervlakteniveaus. SE-afstoting resulteert in het verlies van celoppervlak CD81 en TCR en de versterking van deze signalen op BSLBs (open paarse pijlen voor 250 molec./^μm2, en gesloten paarse pijlen voor 1.000 molec./^μm2 in gele histogrammen). D) Onjuiste afkoeling van conjugaten leidt ertoe dat cellen de SLB van silicaparels afscheuren, zoals blijkt uit vergelijking van inputparels (linker biparametrische plot) en conjugaten die worden onderworpen aan snelle afkoeling tot 4 °C van 37 °C (rechter biparametrische waarnemingspunt). Vergelijk ook met figuur 3B paneel (vi). Afkortingen: PRF1 = perforin 1; NST% = genormaliseerde synaptische overdracht; _Tmax% = percentage van de maximaal waargenomen overdracht (in controle- of referentietoestand); tSV's: trans-synaptische blaasjes; SE's: synaptische ectosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Buffers die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

BSLBs zijn veelzijdige hulpmiddelen voor het bestuderen van de deeltjesoutput van T-cellen gestimuleerd met model APC-membranen. De flexibiliteit van de methode maakt de reconstitutie van complexe en reductionistische membraansamenstellingen mogelijk om de effecten van liganden en hun signalen op de secretie van tSV's en supramoleculaire aanvalsdeeltjes en hun componenten te bestuderen. We hebben deze technologie getest op verschillende T-cellen, waaronder gepreactiveerde TH, CTL, Tregs en ^CART15. Dit protocol werkt ook voor de meting van synaptische deeltjesafgifte van vers geïsoleerde en rustige T-cellen. Een beperking van het gebruik van vers geïsoleerde T-cellen is dat deze rustige populaties een ander profiel van trans-synaptische deeltjes produceren, dat correleert met hun celoppervlaksamenstelling (zie ¹⁵ voor meer details).

Als een eenvoudig flowcytometriepaneel raden we het gebruik aan van anti-TCR-kloon IP26, anti-CD81-kloon 5A6, anti-perforine (PRF1) kloon B-D48 of anti-CD40L-kloon 24-31 en ATTO 390 of ATTO 565-bevattende lipiden (om BSLBs een intrinsieke fluorescentie te verlenen). Om afzonderlijke cellen te helpen onderscheiden van afzonderlijke BSLBs en conjugaten, raden we het gebruik aan van anti-CD4-kloon OKT4 en /of anti-CD45-kloon HI30, die op beperkte niveaus worden overgedragen aan BSLBs ondanks dat ze op zeer hoge niveaus aan het celoppervlak tot expressie worden gebracht (zie Tabel met materialen voor meer informatie over fluorochromen en andere gevalideerde antilichamen). Panelen met een hoger aantal fluorochchromen kunnen worden ontworpen, maar vereisen een systematische evaluatie van de fluorescentiespectrumoverloop van elk geanalyseerd fluorochroom. Om de gevoeligheid te verhogen, probeert u verschillende titraties van kwantificeringsantistoffen, variërend van 0,5 μg tot 20 μg / ml definitief, en herhaalt u wanneer nieuwe voorraden antilichamen worden gebruikt. Om de reproduceerbaarheid van de absolute en relatieve metingen van deeltjesoverdracht te waarborgen, titreert en berekent u de bindingscapaciteit van elke nieuwe partij gebiotinyleerde en Ni-bevattende fosfolipiden, aangezien deze van partij tot partij aanzienlijk kunnen verschillen. De geleidelijke afkoeling van T-cel-BSLB-conjugaten is van cruciaal belang voor het verhogen van de gevoeligheid van detectie van deeltjes met een lage abundantie. De snelle afkoeling van coculturen leidt tot de vernietiging van BSLBs, zoals blijkt uit het aanzienlijke verlies van lipidefluorescentie (figuur 3D).

Verschillende metrieken kunnen worden gebruikt om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te meten, afhankelijk van de experimentele vraag die zich voordoet. Wanneer bijvoorbeeld kleine verschillen worden verwacht in de basisexpressieniveaus van oppervlakte-eiwitten gesorteerd in ontluikende SE's, kan een genormaliseerde synaptische overdracht (NST%) metriek worden gebruikt (Figuur 3C paneel (ii) bovenste vergelijking). De laatste kwantificeert het percentage MFI-signaal op BSLBs als functie van de totale, gecombineerde MFI van cellen en kralen. Een kanttekening bij deze benadering is de analyse van overgedragen markers die niet op de PM worden uitgedrukt, zoals componenten van supramoleculaire ^{aanvalsdeeltjes19}. Aangezien deze elementen BSLBs bereiken via routes die onafhankelijk zijn van PM-transit, zoals intracellulaire opslagexocytose, wordt de berekening van NST% niet aanbevolen omdat het resultaat zal worden opgeblazen omdat de teller zal worden gedeeld door een relatief kleine noemer (expressieniveau celoppervlak). Gebruik in plaats daarvan gecorrigeerde MFI's om de afzetting van perforine en granzymen tussen nul BSLBs en BSLBs te vergelijken met toenemende dichtheden van antigeen of anti-CD3 Fab. Als alternatief, om intracellulaire elementen te volgen die zijn overgedragen aan BSLBs, gebruikt u voor vergelijking ofwel de geschatte absolute moleculen die worden overgedragen of het percentage signaal met betrekking tot het maximale signaal dat wordt overgedragen aan BSLBs (_Tmax%) (Figuur 3C panel (ii) bodemvergelijking). Gebruik voor _Tmax% cMFI of moleculen gemeten op het BSLB-monster (of de toestand) met de hoogste antigeendichtheid als referentie-Tmax. Gebruik bij het analyseren van verschillende donoren donorspecifieke _Tmax voor vergelijkingen. Bij het bestuderen van het materiaal dat wordt overgedragen als reactie op de specifieke triggering van de TCR, kunnen MFI's ook worden gecorrigeerd tot het niveau van achtergrondoverdracht dat wordt waargenomen op antigeennegatieve (nul) BSLBs.

Het schatten van het absolute aantal moleculen dat wordt overgedragen aan BSLBs is een robuustere methode, omdat dit MESF-kalibratie omvat met de meting van moleculen als eindpunt en een betere vergelijking van onafhankelijke experimenten. _Tmax% biedt een vergelijkbare normalisatie voor onafhankelijke experimenten en is vooral nuttig bij het gebruik van polychromatische FCM voor intracellulaire markers, zoals perforine en granzymen, of voor markers waarvoor geen MESF-standaard beschikbaar is. _Tmax% is eenvoudigweg het percentage signaal in een bepaalde toestand naar de toestand met de hoogste overdracht in de controleconditie (bijv. Voertuig / onbehandelde controles voor geneesmiddelenstudies, controlegids RNA's voor CRISPR / Cas9-bibliotheken). Verder kan _Tmax% worden gebruikt voor zowel cMFIs als een absoluut aantal moleculen en is het bijzonder nuttig geweest voor de side-by-side vergelijkingen van de effecten van gendeleties op de synaptische output van T-cellen. Dit laatste is duidelijk wanneer genbewerking leidt tot een hoge variabiliteit in het dynamische bereik van immuunreceptorexpressie bij onafhankelijke donoren en experimenten, wat van invloed kan zijn op absolute en NST%-metingen.

BSLBs hebben de vastlegging en karakterisering van de synaptische output van verschillende T-celtypen vergemakkelijkt, die anders moeilijk te isoleren zijn vanwege hun snelle internalisatie door APC's2. De fysieke stabiliteit van BSLBs biedt ook een platform voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering van BSLBs die zijn onderzocht door T-cellen, waardoor de biochemische karakterisering van zeer zuivere deeltjespreparaten door massaspectrometrie en nucleïnezuursequencingtechnologieën mogelijk wordt. Dit laatste vergemakkelijkt de gedetailleerde karakterisering van intercellulaire boodschappers die door T-cellen worden afgeworpen onder een breed scala aan experimentele omstandigheden. Verschillende vragen kunnen worden beantwoord, waaronder hoe deze deeltjesboodschappen veranderen tussen verschillende T-celtypen en activeringstoestanden, hoe canonieke en niet-canonieke antigeenreceptoren (d.w.z. chimere antigeenreceptoren) en hoe agonistische en antagonistische membraansignalen de samenstelling van deeltjes beïnvloeden. We ontwikkelen deze technologie momenteel verder voor de kwantitatieve karakterisering van cytokines die worden uitgescheiden bij de immuunsynaps van gestimuleerde T-cellen. Dit laatste vereist de zorgvuldige studie van combinaties van recombinante cytokinereceptoren en antilichamen, die efficiënte vangst van interleukines, interferonen en chemokines op BSLBs bieden na activering van T-cellen. BSLBs kunnen worden aangepast om de oppervlaktesamenstelling te modelleren van andere APC's waarvan wordt vermoed dat ze tSV-afgifte door T-cellen veroorzaken, zoals stromale en aangeboren immuuncellen. BSLBs kunnen ook worden aangepast om nieuwe farmacologische verbindingen te screenen op zoek naar de positieve en negatieve modulatie van de exocytische en tSV-secretiemachinerie voor de behandeling van kanker en andere pathologieën. Ten slotte kunnen BSLBs ook worden gebruikt om virulentiedeterminanten te ontdekken die de T-celfunctie moduleren bij ^{infectieziekten20}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids	790404C-25mg	18:1 DGS-NTA(Ni) in chloroform
PIPETMAN L Multichannel P8x200L, 20-200 µL	Gilson	FA10011
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850375C-25mg	18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) in chloroform
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 390	ATTO-TEC	AD 390-165	DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 488	ATTO-TEC	AD 488-165	DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565	ATTO-TEC	AD 565-165	DOPE ATTO 565
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	870273C-25mg	18:1 Biotinyl Cap PE in chloroform
200 µL yellow tips 10 x 96 Tips, Stack	Starlab	S1111-0206
5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon®	352052
5.00 ± 0.05 µm non-functionalized silica beads	Bangs Laboratories Inc.	SS05003
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3799	For FCM staining and co-culture of BSLB and cells.
96 Well Cell Cultture Plate V-bottom with Lid, Tissue culture treated, non-pyrogenic.	Costar®	3894	For FCM staining of cells or beads in suspension.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 and A20006
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter		For normal in tube staining of biological samples for FCM
Aluminum Foil	Any brand		For protecting cells and BSLBs from light
anti-human CD154 (CD40L), clone 24-31	BioLegend	310815 and 310818	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4	BioLegend	356934	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19	BioLegend	302234	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD2, clone RPA-2.10	BioLegend	300202	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD2, clone TS1/8	BioLegend	309218	Brilliant Violet 421 conjugate.
anti-human CD252 (OX40L), clone 11C3.1	BioLegend		Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD28, clone CD28.2	eBioscience	16-0289-85	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD317 (BST2, PDCA-1), clone 26F8	ThermoFisher Scientific, invitrogen	53-3179-42	Alexa Fluor 488 conjugate, we found this clone to be cleaner than clone RS38E.
anti-human CD38, clone HB-7	BioLegend	356624	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD38, clone HIT2	BioLegend	303514	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD39, clone A1	BioLegend		Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4	BioLegend	317436	For quantitative FCM analysis of tonsillar cells as shown in Fig. 1E
anti-human CD4, clone A161A1	BioLegend	357414 and 357421	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD4, clone OKT4	BioLegend	317414 and 317422	PE/Cy7 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD40, clone 5C3	BioLegend	334304	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD40, clone G28.5	BioLegend		Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD45, clone HI30	BioLegend	304056 and 368516	Alexa Fluor 647 and APC/Cy7 conjugates
anti-human CD47, clone CC2C6	BioLegend	323118	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD54 (ICAM-1), clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD63 (LAMP-3), clone H5C6	BioLegend	353020 and 353015	PerCP/Cyanine5.5 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively
anti-human CD73, clone AD2	BioLegend	344002	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human CD80, clone 2D10	BioLegend	305216	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD81, clone 5A6	BioLegend	349512 and 349502	PE/Cy7 conjugate and labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), respectively.
anti-human CD82, clone ASL-24	BioLegend	342108	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD86, clone IT2.2	BioLegend	305416	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human CD8a, clone HIT8a	BioLegend	300920	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human CD8a, clone SK1	BioLegend	344724	Alexa Fluor 700 conjugate
anti-human HLA-A/B/C/E, clone w6/32	BioLegend	311414 and 311402	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human HLA-DR, clone L243	BioLegend	307656 and 307622	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
anti-human ICAM-1, clone HCD54	BioLegend	322702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human ICOS, clone C398.4A	BioLegend	313516	Armenian Hamster IgG
anti-human ICOSL, clone MIH12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human ICOSL, clone MIH12	eBioscience	16-5889-82	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human LFA-1, clone TS1/22	BioLegend	Produced in house	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)	BioLegend	350018	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-1 , clone EH12.2H7	BioLegend	135230 and 329902	Alexa Fluor 647 conjugate and Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L1, clone 29E.2A3	BioLegend	329702	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human PD-L2, clone 24F.10C12	BioLegend	329611	Alexa Fluor 647 conjugate
anti-human PD-L2, clone MIH18	BioLegend	345502	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
anti-human TCRab, clone IP26	BioLegend	306712 and 306714	Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 647 conjugates, respectively.
antti-human CD156c (ADAM10), clone SHM14	BioLegend	352702
antti-human CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E	BioLegend	348404	Alexa Fluor 647 conjugate
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 Isotype control, clone HTK888	BioLegend	400902	Labelled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
BD Cytometer Setup and Tracking beads	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Performance track of instruments before quantitative FCM
BD FACSDiva	Becton Dickinson & Company (BD)	23-14523-00	Acquisition software
Bovine Seum Albumin	Merck, Sigma-Aldrich	A3294
CaCl2, Calcium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	C5670	anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
Casein from bovine milk, suitable for substrate for protein kinase (after dephosphorylation), purified powder	Merck, Sigma-Aldrich	C5890
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12321D	For the removal of Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 2 mL
DynaMag™-15	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	12301D	For the removal of Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 in volumes less than 15 mL
Fetal Bovine Serum Qualified, One Shot	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Needs heat inactivation for 30 min at 56 oC
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva, GE Healthcare	GE17-1440-02	Sterile solution of polysaccharide and sodium diatrizoate for lymphocyte isolation
Fixable Viability Dye eFluor 780	eBiosciences	65-0865-14	For the exclusion of dead cells during analyses
FlowJo	Becton Dickinson & Company (BD)	Version 10.7.1	Analysis software
Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker	Keison Products	MPS-1	For the mixing of either cells during stainings or BSLBs during staning or protein loading (as an alternative to orbital agitation)
HEPES Buffer Solution (1 M)	ThermoFisher Scientific, Gibco	15630-056
HEPES, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid.	Merck, Sigma-Aldrich	H4034	For preparation of HBS/HAS or HBS/BSA buffer. BioPerformance Certified, ≥99.5% (titration), suitable for cell culture
HERACell 150i CO2 incubator, 150 L, Electropolished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	51026282	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Hula Mixer® Sample Mixer	ThermoFisher Scientific, Life Technologies	15920D	Vertical, variable-angle laboratory mixer used for the mixing of BSLBs and lipid master mix, blocking solutions, protein master mix and small scale antibody stainings.
Human Serum Albumin, 30% aqueous solution	Merck, Sigma-Aldrich	12667-M
Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking Solution	BioLegend	422302	Fc Receptor Blocking Solution for blocking of Fc Receptors from biologically relevant samples
Innovatis CASY cell counter and analyzer TT	Biovendis Products GmbH		For the counting of cells and the determination of cell size and volume based on the exclusion of electric current.
KCl, Potassium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	P5405	Powder, BioReagent, suitable for cell culture
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher Scientific, Gibco	25030-024
MgCl2, Magessium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	M2393	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
Microtube Insert for 24 x 1.5/2.0 mL tubes	Keison Products	P-2-24	Microtube insert for Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker
Mini Incubator	Labnet International	I5110A-230V	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2
Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher Scientific, Gibco	11140-035
Mouse IgG polyclonal antibody control	Merck, Sigma-Aldrich	PP54	Used as positive control for the measurement of antibodies bound to mouse IgG capture bead standards
Mouse IgG1, k Isotype, clone MOPC-21	BioLegend	400129, 400112, 400130, 400144, 400128 and 400170	Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 and Brilliant Violet 785  conjugates, respectively.
Mouse IgG1, k Isotype, clone X40	Becton Dickinson & Company (BD), Horizon	562438	Brilliant Violet 421 conjugate.
Mouse IgG1, κ Isotype control, clone P3.6.2.8.1	eBioscience	14-4714-82	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Mouse IgG2a, k Isotype, clone MOPC-173	BioLegend	400240	Alexa Fluor 647 conjugate
Mouse IgG2b, k Isotype, clone MPC-11	BioLegend	400330 and 400355	Alexa Fluor 647 and Brilliant Violet 785 conjugates, respectively
Multiwell 6 well Tissue culture treated with vacuum gas plasma	Falcon	353046	For culturing and expanding purified CD4+ and CD8+ T cells.
Na2HPO4, Disodium Phosphate	Merck, Sigma-Aldrich	S7907
NaCl, Sodium chloride	Merck, Sigma-Aldrich	S5886	BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99%
NiSO4, Nickel(II) sulfate	Merck, Sigma-Aldrich	656895	For saturating NTA sites; added during the blocking process
Penicillin Streptomycin [+]10,000 units Penicillin; [+] 10,000 µg/mL Streptomycin	ThermoFisher Scientific, Gibco	15140-122
Phosphate Buffered Saline pH 7.4, sterile	ThermoFisher Scientific, Gibco	10010	No Ca2+ or Mg2+ added
Polyethersulfone (PES) Filter unit	Thermo Scientific Nalgene	UY-06730-43	Hydrophilic PES membrane with low protein binding facilitates the filtering of solutions with high protein content
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar	BOC Ltd.	11-Y	For the protection of lipid stocks stored at +4 ºC.
Purified Streptavidin	BioLegend	280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	488	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 488 molecules bound to cells and/or BSLB
Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads	Bangs Laboratories Inc.	647	Benchmark beads for the interpolation of Alexa Fluor 647 molecules bound to cells and/or BSLB
Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20	ThermoFisher Scientific, invitrogen	SA1-25258	Labeled in house with Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Recombinant human IL-2	Peprotech	200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamine	ThermoFisher Scientific, Gibco	31870-025
Rosette Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15064	Isolation of B cells for measuring densities of proteins in purified cell populations
Rosette Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15022C.1
Rosette Human CD4+CD127low T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15361	Pre-enrichment of CD4+ CD127Low T cells for the downstream isolation of Tregs by FACS.
Rosette Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL Technologies	15063
RPMI Medium 1640 (1x); [-] Phenol Red	ThermoFisher Scientific, Gibco	11835-063	For the incubation (co-culturing) of BSLB and cells in the absence of CO2. Phenol red-free media reduces the autofluorescence of cells in flow cytometry and microscopy based measurements.
Sodium Pyruvate (100 mM)	ThermoFisher Scientific, Gibco	11360-070
Sprout mini centrifuge	FisherScientific, Heathrow Scientific LLC	120301	Benchtop microcentrifuge used to wash silica beads and BSLB in 1.5 mL Eppendorf tubes.
Sterile cappeed 5 mL polystyrene round-bottom tubes	Falcon	352058
UltraComp eBeads Compensation Beads	ThermoFisher Scientific, invitrogen	01-2222-42
Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	89882