Summary
Protokollen beskriver en ligetil metode til resektionering af en intakt muselever til metaboliske undersøgelser gennem portalveneperfusion.
Abstract
Metaboliske sygdomme som diabetes, prædiabetes, ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) og ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) bliver mere og mere almindelige. Ex vivo leverperfusioner giver mulighed for en omfattende analyse af levermetabolisme ved hjælp af nuklear magnetisk resonans (NMR) under ernæringsmæssige forhold, der kan kontrolleres strengt. Da silicosimuleringer fortsat primært er et teoretisk middel til at vurdere hormonvirkninger og virkningerne af farmaceutisk intervention, er den perfusionerede lever fortsat et af de mest værdifulde testsenge til forståelse af levermetabolisme. Da disse undersøgelser styrer grundlæggende indsigt i leverfysiologi, skal resultaterne være nøjagtige og reproducerbare. Den største faktor i reproducerbarheden af ex vivo leverperfusion er kvaliteten af operationen. Derfor har vi introduceret en organiseret og strømlinet metode til at udføre ex vivo museleverperfusioner i forbindelse med in situ NMR-eksperimenter. Vi beskriver også en unik applikation og diskuterer almindelige problemer, der opstår i disse undersøgelser. Det overordnede formål er at give en ukompliceret guide til en teknik, vi har forfinet gennem flere år, som vi anser for den gyldne standard for at opnå reproducerbare resultater i leverresektioner og perfusioner i forbindelse med in situ NMR-eksperimenter. Afstanden til midten af feltet for magneten samt vævets utilgængelighed til intervention under NMR-eksperimentet gør vores metoder nye.
Introduction
Ex vivo-perfusioner er afgørende i undersøgelsen af levermetabolisme, og perfusion gennem portalvenen er standarden for disse undersøgelser. For at studere levermetabolisme isoleret skal leveren resekteres fra kroppen for at undgå komplikationer som følge af metabolisme i andre organer (dvs. helkropsmetabolisme) og for at udøve kontrol over hormontilgængeligheden (insulin, glukagon osv.). Denne tilgang kan være afgørende for at forstå virkningerne af sygdomme som diabetes, NAFLD og NASH på levermetabolisme samt mekanismer for lægemiddelvirkning. Denne artikel tjener som en guide til leverresektion og perfusion. Vi har udviklet en strømlinet procedure til at udføre disse metaboliske leverundersøgelser med tilstrækkelig stringens og reproducerbarhed. Hvis operationen ikke udføres korrekt, er der udtalt variabilitet i de opnåede metaboliske data. Vi beskriver en organiseret metode til at udføre portalvenekateterisering og leverresektion i forbindelse med metaboliske undersøgelser in situ i et nuklear magnetisk resonans (NMR) spektrometer, som beskrevet i litteraturen 1,2,3,4,5.
I øjeblikket er der ingen litteratur, der beskriver en ex vivo leverperfusion ved hjælp af en glassøjle inden for en NMR. Der er heller ikke en video- eller tekstpublikation, der giver et klart eksempel på, hvordan man udfører proceduren med museleveren, specifikt demonstrerer, hvordan man kateteriserer portalvenen, resekterer en lever, overfører og hænger leveren på en glassøjle. Da den genetisk modificerede mus allestedsnærværende bruges til at studere levermetabolisme, er dette en vigtig procedure, der fortjener en komplet beskrivelse. Leverperfusionsoperationer er ikke nye, men denne artikel er en guldstandardmetode ledsaget af en video, der demonstrerer den tekniske ekspertise, der er beskrevet i dette papir for at hjælpe alle, der er interesseret i denne procedure. Den metode, der præsenteres her, vil bedst kunne anvendes på realtidsmetabolisme til at detektere funktionen og omsætningen af metabolitter i sygdomsmodeller.
Denne metode bruger en 100 cm vandkappet glassøjle, som gør det muligt for leveren at hænge i bunden af kanylen indkapslet af perfusat inde i et NMR-rør. Opvarmet vand i glaskappen bruges til at kontrollere perfusattemperaturen. En tyndlags oxygenator er under tryk med 95% / 5%O2 / CO2 til pH-kontrol. Ved hjælp af tre separate pumper indstilles perfusatsøjlehøjden, hvilket giver konstant tryk til leveren. Strømningshastigheder styres ikke ud over anvendelsen af konstant tryk (figur 1). For at bekræfte, at leveren fungerer korrekt, foretages iltmålinger sammen med strømningshastigheder. I vores hænder fører dette sæt forudsætninger til meget repeterbare NMR-eksperimenter til vurdering af levermetabolisk funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøg med mus blev håndteret i overensstemmelse med University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (protokolnummer #201909320). Den anvendte musestamme var C57BL/6J; alle mus var hanner. Denne metode er generelt anvendelig til undersøgelser, der også bruger andre standard musestammer. Denne operation udføres optimalt af to personer, der arbejder sammen.
1. Indledende opsætning
- Perfuselever med perfusat indeholdende Krebs-Henseleit elektrolytter6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM hver af MgSO4, KH2PO4 og 0,5 mM natrium-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM natriumlactat, 0,6 mM natriumpyruvat, 0,2 mM [U-13C] natriumpropionat, 10% (v/v) D2O, og 0,63 mM blandede fedtsyrer (indeholdende palmitinsyre (22,1% af det samlede antal), palmitolsyre (5,2%), stearinsyre (2,7%), oliesyre (27%), linolsyre (37,7%), γ-linolensyre (2,4%) og decosahexansyre (2,8%)) sammen med 2% (w/v) bovin serumalbumin. Indstil den endelige pH i perfusat til 7,3 ved hjælp af HCI (og NaOH, hvis det er nødvendigt).
2. Opsætning før operationen
- Saml to 1 ml sprøjter med en 23G nål, som er 19,05 mm lang. Fyld en sprøjte med 0,01 ml 1000 enheder/ml heparin og 0,19 ml saltvand (0,9 % NaCl) i vand; Tabel 1).
- Fyld den anden sprøjte med 0,2 ml 2% lidokain og 0,6 ml 0,9% saltvand (tabel 1). I en anden 1 ml sprøjte med en 27 G 38,1 mm nål fyldes perfusatet og holdes ved 37 °C.
3. Opsætning af perfusatkolonne
- Sæt glasflasken indeholdende 500 ml perfusat i vandbadet (figur 1B). Tænd for vandbadet, og indstil temperaturen til ~42 °C. Den højere temperatur i vandbadet gør det muligt at opretholde 37 °C i perfusionskolonnen.
- Når vandet opvarmes til 42 °C, tændes de to pumper for at cirkulere perfusatet fra flasken gennem tyndfilmsiltatoren og den vandkappede 100 cm glassøjle (figur 1A-E).
- Tænd for iltningsgassen (95% ilt og 5% kuldioxid) for at holde iltatorenunder tryk 7 (figur 1C). Juster perfusatsøjlens højde for at opnå en strømningshastighed på 8 ml/min med kateteret fastgjort (se trin 9 for måling af strømningshastighed)5,8,9.
BEMÆRK: Strømningshastighed refererer til den hastighed, hvormed perfusat udvises af leveren.
4. Anæstesi af musen
- Don PPE som krævet i IACUC-protokollen og andre relevante sikkerhedsretningslinjer.
BEMÆRK: Følgende trin er optimeret til mus, der er 9 - 13 uger gamle. - Placer musen i isoflurankammeret. Drej leveringsgassen til 100% ilt, en strømningshastighed på 1 L / min og isofluranen til 2% 10. Vent, indtil vejrtrækningen sænkes og er stabil.
BEMÆRK: For at musen kan nå et stabilt kirurgisk plan, som det fremgår af en langsom og stabil respirationshastighed og mangel på tåklemmerefleks, kan iltstrømningshastigheden justeres til ~ 1,5 l / min til ~ 3 L / min og isoflurankoncentrationen fra 1 - 3%. Leveringshastigheden for bærergas- og isoflurankoncentration afhænger af dyrets alder og vægt og faktorer som støj og lys. - Desinficere maven med 70% alkohol. Administrer heparin gennem en dyb subkutan injektion i abdominal fedtlaget (figur 2). Placer musen tilbage i anæstesikammeret i 10 minutter.
BEMÆRK: Barbering er ikke påkrævet, da denne procedure er terminal.
5. Celiotomi
- Overfør musen fra anæstesikammeret til operationsplatformen og læg den i liggende stilling (figur 3).
- Placer musens næse i en næsekegle og tape poterne ned. Pas på ikke at påføre nogen belastning på nakken, der kan føre til kvælning.
- Administrer lidokain gennem en subkutan injektion bilateralt i det forreste iliac crest-område11 (figur 3). Udfør en tåklemmetest for at bekræfte fraværet af alle smertereflekser.
- Udfør cøliotomi for at udsætte de indre organer (figur 4). Lav et 3 cm bredt snit (bredden af hele musens underliv).
BEMÆRK: Bredden ændres med musens alder og kost. - Udvid snittet ved hjælp af en hæmostat, der trækker trækkraft ved at klemme på xiphoid-processen (figur 4).
6. Kanylering af portalvene
- Brug en applikator med bomuldsspids til at rydde de små og tyktarmen, der dækker portalvenen. Placer en silkesutur under buen af portalvenen proksimal til leveren (figur 4A).
- Afhængigt af den anatomiske struktur skal du placere den anden silkesutur proksimal eller distal af den ringere mesenteriske venedistal fra leveren (figur 4A) 12,13. Brug en 2-0 sutur til begge suturer.
- Når suturerne er på plads, kan du kanuere portalvenen med et 22G-kateter14 (figur 4B). Når du indsætter kateteret, skal du holde skråningen spids op. Indtast portalvenen i højst en 15 ° vinkel.
- Bind den første sutur forbi katetertapperen. Når portalvenen er kanylet, forankres kateteret 2-3 mm distalt fra portalvenens gren med silkesuturen (figur 4B).
BEMÆRK: Assistenten skal rulle skuldre og håndled for at forhindre, at kateteret løsnes eller rives i portalvenen. Hver sutur kræver to knuder. - Fastgør derefter den nederste del af kateteret med den anden sutur. Ved hjælp af den kirurgiske assistent skal du binde en knude med suturen for at fastgøre kateteret til den distale del af portalvenen og det omgivende væv.
7. Resektion af leverpostportal vene kanylering
- Når kateteret er sikret, indsættes en 1 ml sprøjte med en 27G nål, som er 38,1 mm lang i kateteret for at skylle blod- og luftbobler.
BEMÆRK: Der er normalt en tilbagestrømning af blod ud af kateteret fra trykket. - Brug et 1 mm I.D. x 5 mm O.D. silikonerør med en fast stophane til at koble perfusionskolonnen (figur 1A) til kateteret, så bufferen kan strømme ind i leveren, hvilket markerer starten på perfusionen. Start en timer på dette tidspunkt for at markere starten på perfusionen.
- Lindre øget vaskulært tryk ved at lave et snit ved hjælp af en saks i den ringere vena cava.
- Bekræft strømmen af perfusat gennem leveren ved at observere den homogene ændring i leverfarve fra lyserød / rød til en lysegul. Når strømmen er bekræftet, skal du skære maven, tyndtarmen, tyktarmen og den højre nyre fra omgivende væv.
- Ved hjælp af den kirurgiske assistent manøvrerer leveren rundt om mave- og brysthulen, da kirurgen skærer gennem parietal peritoneum og thoraxvæv for at resektere leveren
- Til sidst skal du løfte leveren opad og skære det resterende bindevæv, der holder leveren på plads med en saks. Manipuler langsomt leveren for at lette synet. Fjern enhver pels, der klæber til leveren ved at skylle af med perfusat, før den indkapsles i NMR-røret.
BEMÆRK: I denne procedure fjernes kun leveren. Alle andre organer er tilbage i dyrets krop. Galdegangen kan fjernes baseret på eksperimentets protokol. Selvom det for dette eksperiment blev efterladt på plads.
8. Hænge leveren fra søjlen
- Når kirurgen afleverer leveren og slangen til assistenten, afbryder assistenten slangen fra kateteret og søjlen.
- Fyld kateteret med perfusat, indtil der dannes en menisk på toppen af kateteret. Fastgør kateteret til søjlen, så leveren kan hænge og perfuse.
BEMÆRK: Perfusatperlen på kateteret giver tilstrækkelig volumen til, at leveren kan fungere, indtil den er tilsluttet. Kateteret, der er fastgjort til leveren, presses monteret i bunden af søjlen. - Skru et 20 mm NMR-rør på 100 cm glassøjlen for at indkapsle leveren (figur 5). For at undgå torsion af leveren og portalvenen skal du langsomt skrue NMR-røret på. Hvis der opstår torsion, og strømmen stoppes, skrues NMR-røret af og skrues igen. Dette vil afhjælpe okklusionen, og strømmen vender tilbage.
- Perfuse leveren i 30-60 minutter baseret på detaljerne i undersøgelsen.
BEMÆRK: Tiden er baseret på perfusionseksperimentet. Til dette forsøg blev metabolisk omsætning målt inden for 30 minutter. Leverperfusionen kan tage op til 10 minutter at nå en stabil tilstand. Tiden til steady-state starter, når den ringere vena cava er blevet skåret, og leverstrømmen er etableret.
9. Flowmåling
- Placer en vejebåd på en toplastningsvægt, og nuls vægt. Anbring slangen fra rullepumpen, der trækker efferent perfusat fra NMR ind i vejebåden, og start timeren.
- Væg massen af væske akkumuleret over 1 minut, hvilket giver leverens strømningshastighed. Anbring røret tilbage i affalds-/opsamlingsbeholderen.
10. Iltmåling
BEMÆRK: Iltmålermålinger blev sat op i henhold til producentens anvisninger15.
- Anbring elektroden indeholdende 20 μL 50% KCl mættet opløsning på platinkuplen og læg fem 10 μL dråber omkring elektrodens nedre platinring.
- Fjern klæbemidlet fra cigaretpapiret. Læg et stykke polytetrafluorethylenmembran over cigaretpapiret.
- Placer de to stykker oven på elektroden. Monter en lille O-ring rundt om toppen af elektroden. Trim papiret for at lægge det fladt på den nederste platinring på elektroden.
BEMÆRK: Noget udhæng er acceptabelt. Det er vigtigt at dække elektrodens sølv. - Placer den større O-ring på elektroden. Sæt elektroden i vandkammeret, og stram bunden for at holde elektroden på plads. Tænd for vandbadet, og lad det varme op til 37 °C.
- Åbn iltmålersoftware. Klik på Kalibrer > luftmættet vand. Indstil omrørerhastigheden til 75 og temperaturen til 37 °C.
- Fyld et hætteglas på 50 ml halvvejs med vand og ryst kraftigt i 2 minutter. Dette er luftmættet vand, brug det som 100% standard. Fyld iltmålerkammeret med ~2 ml vand og anbring den todelte prop på.
- Klik på Okay på skærmen, og lad signalet plateau. Når signalet har nået et plateau, skal du klikke på Okay. Bortskaf væske i kammeret og tør med silkepapir.
- Gentag trin 10,6-10,7, men med 200 mM natriumsulfit (0% standard). Klik på Gem kalibrering.
BEMÆRK: Ingen kraftig omrystning er nødvendig for 0% standarden. - Under perfusion skal du bruge to 5 ml sprøjter. Den ene sprøjte til cirkulerende perfusat (ilt ind) og den anden til efferent perfusat fra NMR-røret (ilt ud).
- Når du udarbejder perfusat til både ind- og udmålinger, skal du tegne 3-4 ml hver gang.
BEMÆRK: Denne kolonne har glasrør for at give adgang til NMR-røret for at trække perfusatet, der er strømmet gennem leveren, tilbage. - Mål det cirkulerende perfusat, først ligesom vand i trin 10.6 og bortskaf i trin 10.7. Gentag de samme trin for det efferente perfusat.
- Udfør iltmålinger hvert 10. minut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leverfunktionen vurderes primært ud fra iltforbrug og strømningshastighed. En strømningshastighed på 4-8 ml/min og et iltforbrug på 1 μmol/min.g er typisk. Disse foranstaltninger vil variere afhængigt af specifikke eksperimentelle forhold og biologiske forskelle.
Den nøjagtige mængde isofluran, der anvendes, afhænger af den type anæstesisystem, der anvendes, samt musens miljø og alder / vægt. Under operationen ændres isofluran og leveringsgassen ikke, selv om nogle ændringer kan være nødvendige afhængigt af det kirurgiske områdes specifikationer (f.eks. Baggrundsstøj)10. Når heparin injiceres dybt subkutant, kan virkningsbegyndelsen forsinkes med op til 20-40 minutter. En 10 minutters ventetid efter heparin administration sikrer påbegyndelse af handling16. Lidokain har en 2 minutters begyndelse af handling11.
Når du indsætter kateteret, skal du holde skråningen spids op og gå ind i højst 15 ° vinkel fra portalvenen. Begge suturer har to knuder. Den første sutur skal bindes forbi katetertapperen. Hvis kanylering af portalvenen er vellykket, bleger leveren fra flushen. Da kirurgen resekterer leveren, rydder assistenten det resekteret indhold med en applikator med bomuldsspids. For at forhindre forurening af leveren og forhindre nicks til loberne, må du ikke skære gennem maven. Påfør ikke for meget spænding på portalvenen eller leveren, når du holder kateteret for at forhindre, at portalvenen løsnes eller rives.
Perfusionshardwareopsætningen kræver omfattende opmærksomhed på detaljer (figur 1). Heparininjektioner (figur 2) er afgørende for eksperimentet. Hvis blodet koagulerer, vil det okkludere kateteret, der indsættes i portalvenen, hvilket forhindrer strømning. Lidokaininjektionen (figur 3) er at hjælpe med at desensitisere området til smertelindring. Tabel 1 giver et simpelt doseringsskema for heparin og lidokain med saltvand. Cøliotomi og suturering (figur 4) er afgørende for en vellykket portalvenekateterisering, leverresektion og vellykket overførsel til perfusionsriggen. Målinger af strømningshastighed og iltforbrug er afgørende for at overvåge leverens sundhed og funktion (figur 6). Der er ofte en lille forskel iO2-forbruget mellem fodrede og fastede lever, hvilket vi tilskriver øgede energibehov pålagt af glukoneogenese i den fastende lever.
Figur 1. Perfusionssøjle og pumper. En. En 100 cm vandkappen glassøjle, hvor leveren hænger i bunden. B. Vandpumpen cirkulerer vand gennem glassøjlen og opvarmer perfusatet. C. Glas tyndt lag oxygenator er under tryk med 95% / 5% O2 / CO2 iltning af perfusatet. D. Kuglelejepumpen cirkulerer perfusat fra vandbadet ind i det tynde lag oxygenator og glassøjlen. E. Kuglelejepumpen cirkulerer perfusat, der leveres ind i søjlen fra leveringspumpen, der holder perfusat iltet og opretholder et flow på 8 ml / min. F. Kuglelejepumpen fjerner efferent perfusat fra NMR-røret. G. Vejevægt til vejning af perfusat fra NMR-rør for at opnå gennemstrømningshastighed i leveren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2. Heparin injektion. Dyb subkutan injektion af heparin gives i musens nedre abdominale fedtlag. Det er vigtigt, når du tager musen op, at trække huden tæt for at give nålen mulighed for let at trænge ind i huden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Lidokain injektion. Musen placeres i liggende stilling på den kirurgiske platform med poterne tapet ned og næsen i næsekeglen. Lidokain administreres subkutant i iliac crest regionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Celiotomi og sutur. Cøliotomien udsætter de indre organer, og en hæmostat trækker trækkraft gennem xiphoidprocessen for at hjælpe med at åbne snittet yderligere. To suturer placeres omkring portalvenen, kateteret indsættes, og suturerne er bundet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. NMR rør. Leveren fjernes fra kroppen sammen med kateteret, som derefter fastgøres til siliciumslangen fastgjort til glassøjlen. Leveren hænges fra søjlen og indkapsles af NMR-røret. Et 20 mm NMR-rør skrues derefter forsigtigt på søjlen, der indkapsler leveren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6. Iltforbrug og strømningshastighed. Repræsentative data fra sammenligning af leveriltforbrug og strømningshastighedsmålinger mellem fodrede og fastede lever. N = 3 og fejllinjer er standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Heparin 1000 enheder/ml | Saltvand 0,9% | Total |
| 0,01 ml | 0,19 ml | 0,2 ml |
| Lidokain 2% | Saltvand 0,9% | Total |
| 0,2 ml | 0,6 ml | 0,8 ml |
Tabel 1. Heparin og lidokain dosis med saltvand. Tabellen viser koncentrationen af heparin og lidokain og dosis af hvert lægemiddel med saltvand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne kirurgiske procedure er udfordrende og kræver omfattende praksis for at opnå reproducerbare resultater. Isofluran og bærergas bør justeres efter behov for at opretholde dyrets levedygtighed gennem så meget af det kirurgiske indgreb som muligt. Miljø, tidspunkt på dagen, alder, vægt og flere andre faktorer vil påvirke anæstesi. Vægt, kost, belastning af mus og alder kan påvirke operationen, da fedtopbygning kan forstyrre visualiseringen af portalvenen. Når du taper poterne ned, skal du sørge for ikke at påføre nogen belastning på nakken, der kan resultere i kvælning. Desuden, jo federe musen er, jo strammere skal suturen være omkring kateteret for at modvirke den nedsatte friktionskoefficient mellem kateteret og venen induceret af lipiderne. Begyndelsen af virkningstiden for heparin er afgørende, da overdreven eksponering for isofluran producerer artefakter i organer17. Administration af heparin- og lidokaininjektioner kræver en 23G-nål med en længde på 19,05 mm, hvilket sikrer, at der ikke er traumer i indre organer under injektionen. Sutursløjfen skal være over kateterets konus, ellers vil den okkludere venen, når den strammes. Når kateteret er indsat, er der normalt en tilbagestrømning af blod ud af kateteret fra trykket, hvilket er et positivt tegn på korrekt placering. Kateteret kan trækkes opad for visuel bekræftelse af, at kateterspidsen er langt nok forbi den første sutur. Rulning af håndled og skuldre sikrer, at suturen ikke glider af den koniske spids, når assistenten binder suturen. Ved overførsel af leveren fra silikoneperfusionsslangen til søjlen efterlades en perle af perfusat oven på kateteret. Perfusatperlen forhindrer luftbobler i at komme ind i kateteret og gå ind i leveren. Perfusatets meniskus oven på kateteret giver tilstrækkelig volumen til, at leveren kan fungere, indtil den er tilsluttet. For at undgå torsion af leveren og portalvenen skrues NMR-røret langsomt på. Derudover kræver perfusionssystemet, der anvendes i dette eksperiment, ikke en trykventil. Pumpernes strømningshastigheder opretholdes således, at glasperfusionssøjlen indeholder perfusat i en højde på ~12 cm. Leveren optager Krebs buffer ved tyngdekraften og negerer enhver trykforskel mellem de to pumper uden effekt på leverens strømningshastighed. Da leveren perfuseres gennem tyngdekraften, indstilles mængden af perfusat, der tages op af leveren, af leverens naturlige biologiske aktivitet. Der blev ikke indsamlet data for perfusionstryk, da portalvenetrykket ikke kan måles i dette system.
Det første snit af cliotomien er lavt for at skabe en åbning, og efterfølgende nedskæringer er dybere for at undgå at nikke leverens lapper. Den samlede længde af snittet til cliotomi er 3 cm for mus af denne alder og størrelse, men vil ændre sig baseret på belastning, alder og vægt. Selvom den beskrevne undersøgelse bruger mus 9-13 uger gamle, ældre eller yngre mus kan studeres såvel som rotter. Størrelsen af NMR-røret og portalvenekateteret skal ændres baseret på den anatomiske størrelse af leveren og portalvenen til undersøgelsen af bekymring. Hvis portalvenen ikke er lige, kan en applikator med bomuldsspids hjælpe med at manipulere venen, når kateteret indsættes. Selvom galdekanalen ikke fjernes, kan kanalen fjernes med en fin pincet, hvis der er et eksperimentelt behov for fravær. Overdreven manipulation af portalvenen ved placering af suturer vil forårsage indsnævring, hvilket gør kateterplacering vanskeligere. Enhver pels, der klæber til leveren, skylles af med perfusat, før trykmontering af kateteret på søjlen og indkapsling af det i NMR-røret. Tidsrammen på 30 min for perfusion kan ændres fra 20 min til 60 min, men alle pålidelige data vil blive indsamlet efter de første 10 min perfusion.
En markør for vellykket levervævsresektion er efter perfusionen leveren har ingen deformiteter eller andre integritetsproblemer. Det er homogent lysegult hele vejen igennem. Hvis vævet blev skadet under operationen, såsom et nick, ville det have mørkegule pletter omkring det. Også, hvis leveren blev beskadiget af perfusionen, ville den ikke perfuse. Hvis vævet oplevede dårlig perfusion af Krebs-bufferen, ville der være mørkegule striber i hele organet som følge af sult, der førte til vævsdød. En anden metode til overvågning af leverens sundhed er leveriltforbrug (figur 6). Det har vist sig, at muselever indeholder højere lipid- og glykogenmængder, men har lignende samlede proteinmængder, så det forventedes, at det hepatiske iltforbrug, når det normaliseres til levermasse, ville have en lignende værdi. En tredje metode er NMR-dataene for realtidsdata for metabolisk omsætning.
Metodens største begrænsning er selve terminal kirurgien. Der er en betydelig omkostning i mus, udstyr, tid og personale. Derfor skal der udvises den største omhu, når disse procedurer udføres og indsamles data. Biologisk variation inden for musemodellen kan skabe vanskeligheder ved kirurgi. Desuden er det bydende nødvendigt at undgå optiske forbedringer. Ingen optiske forbedringer er nødvendige, da al anatomi er synlig for det blotte øje. Optiske forbedringer øger potentialet for, at der opstår fejl, da kirurgen og assistenten har et begrænset synsfelt, hvilket fører til knicks i leveren eller utilsigtet spænding på portalvenen, hvilket forårsager en fejl, hvis kateteret trækker sig ud. Korrekt implementering af disse metoder vil resultere i > succesrate på 95% kirurgi i C57BL / 6J-musen. En anden begrænsning at overveje er den 10 minutters periode, der kræves for leveren at nå en stabil tilstand. Det er ikke en begrænsning for den undersøgelse, der er beskrevet her, heller ikke i mange andre, men for ethvert eksperiment, der berettiger de første 10 minutters data, er denne metode ikke tilstrækkelig. Manglen på den komplekse hormonelle signatur forbundet med helkropsmetabolisme tjener også som en begrænsning, selvom glukagon, insulin osv. Og enhver kombination heraf kan tilsættes tilbage til perfusatet.
Der er flere potentielle fremtidige anvendelser for denne teknik. Efterhånden som der udvikles flere lægemidler til behandling af NASH, kan standardmetoder til vurdering af leverenergimetabolisme finde bred anvendelse. Da NASH er stærkt forbundet med leverkræft, er modeller af disse kræftformer også emner til undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansiererne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen; i indsamling, analyse eller fortolkning af data i skrivningen af manuskriptet eller i beslutningen om at offentliggøre resultaterne.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra Statens Institut for Sundhed (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). En del af dette arbejde blev udført i McKnight Brain Institute på National High Magnetic Field Laboratory's Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, som støttes af National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 og staten Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
