Summary
Het protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het resectie van een intacte muizenlever voor metabolische studies door middel van poortaderperfusie.
Abstract
Metabole ziekten zoals diabetes, pre-diabetes, niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) en niet-alcoholische steatohepatitis (NASH) komen steeds vaker voor. Ex vivo leverperfusies maken een uitgebreide analyse van het levermetabolisme mogelijk met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR), in voedingsomstandigheden die rigoureus kunnen worden gecontroleerd. Omdat silico-simulaties een voornamelijk theoretisch middel blijven om hormoonwerkingen en de effecten van farmaceutische interventie te beoordelen, blijft de geperfuseerde lever een van de meest waardevolle testbanken voor het begrijpen van het levermetabolisme. Omdat deze studies basisinzichten in de leverfysiologie begeleiden, moeten de resultaten nauwkeurig en reproduceerbaar zijn. De grootste factor in de reproduceerbaarheid van ex vivo leverperfusie is de kwaliteit van de chirurgie. Daarom hebben we een georganiseerde en gestroomlijnde methode geïntroduceerd om ex vivo leverperfusies van muizen uit te voeren in de context van in situ NMR-experimenten . We beschrijven ook een unieke toepassing en bespreken veelvoorkomende problemen die in deze onderzoeken worden aangetroffen. Het algemene doel is om een ongecompliceerde gids te bieden voor een techniek die we in de loop van meerdere jaren hebben verfijnd en die we beschouwen als de gouden standaard voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten in hepatische resecties en perfusies in de context van in situ NMR-experimenten. De afstand tot het midden van het veld voor de magneet en de ontoegankelijkheid van het weefsel voor interventie tijdens het NMR-experiment maakt onze methoden nieuw.
Introduction
Ex vivo perfusies zijn cruciaal in de studie van het levermetabolisme en perfusie via de poortader is de standaard voor deze studies. Om het levermetabolisme afzonderlijk te bestuderen, moet de lever uit het lichaam worden gereseceerd om complicaties als gevolg van het metabolisme in andere organen (d.w.z. het metabolisme van het hele lichaam) te voorkomen en om controle uit te oefenen over de beschikbaarheid van hormonen (insuline, glucagon, enz.). Deze aanpak kan essentieel zijn voor het begrijpen van de effecten van ziekten zoals diabetes, NAFLD en NASH op het levermetabolisme, evenals mechanismen voor de werking van geneesmiddelen. Dit artikel dient als een gids voor hepatische resectie en perfusie. We hebben een gestroomlijnde procedure ontwikkeld om deze metabole leverstudies met voldoende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid uit te voeren. Als de operatie niet correct wordt uitgevoerd, is er een uitgesproken variabiliteit in de verkregen metabole gegevens. We beschrijven een georganiseerde methode om portaladerkatheterisatie en leverresectie uit te voeren in de context van metabole studies in situ in een kernspinresonantie (NMR) spectrometer, zoals beschreven in de literatuur 1,2,3,4,5.
Momenteel is er geen literatuur die een ex vivo leverperfusie beschrijft met behulp van een glazen kolom binnen een NMR. Evenmin is er een video- of tekstpublicatie die een duidelijk voorbeeld geeft van hoe de procedure met de lever van de muis moet worden uitgevoerd, met name door te demonstreren hoe de poortader moet worden gekatheteriseerd, een lever kan worden gereseceerd, overgedragen en de lever aan een glazen kolom kan worden opgehangen. Omdat de genetisch gemodificeerde muis alomtegenwoordig wordt gebruikt voor het bestuderen van het levermetabolisme, is dit een essentiële procedure die een volledige beschrijving verdient. Leverperfusieoperaties zijn niet nieuw, maar dit artikel is een gouden standaardmethode vergezeld van een video die de technische uitmuntendheid demonstreert die in dit artikel wordt beschreven om iedereen die geïnteresseerd is in deze procedure te helpen. De hier gepresenteerde methode zou het beste kunnen worden toegepast op real-time metabolisme om de functie en omzet van metabolieten in ziektemodellen te detecteren.
Deze methode maakt gebruik van een 100 cm wateromhulde glazen kolom, waardoor de lever aan de onderkant van de canule kan hangen, ingekapseld door perfusaat in een NMR-buis. Verwarmd water in de glazen mantel wordt gebruikt om de perfusaattemperatuur te regelen. Een dunne laag oxygenator wordt onder druk gezet met 95%/5% O2/CO2 voor pH-controle. Door gebruik te maken van drie afzonderlijke pompen wordt de perfusaatkolomhoogte ingesteld, die zorgt voor een constante druk op de lever. De stroomsnelheden worden niet geregeld na de toepassing van constante druk (figuur 1). Om te bevestigen dat de lever naar behoren functioneert, worden zuurstofmetingen uitgevoerd samen met stroomsnelheden. In onze handen leidt deze set van randvoorwaarden tot zeer herhaalbare NMR-experimenten voor de beoordeling van de leverstofwisselingsfunctie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten met muizen werden behandeld in overeenstemming met de University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer # 201909320). De gebruikte muizenstam was C57BL/6J; alle muizen waren mannelijk. Deze methode is over het algemeen ook toepasbaar voor studies met andere standaard muizenstammen. Deze operatie wordt optimaal uitgevoerd door twee personen die samenwerken.
1. Initiële set-up
- Perfuseer levers met perfusaat dat Krebs-Henseleit-elektrolytenbevat 6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM elk van MgSO4, KH2PO4 en 0,5 mM natrium-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM natriumlactaat, 0,6 mM natriumpyruvaat, 0,2 mM [U-13C] natriumpropionaat, 10% (v/v) D2O, en 0,63 mM gemengde vetzuren (met palmitinezuur (22,1% van het totaal), palmitoleïnezuur (5,2%), stearinezuur (2,7%), oliezuur (27%), linolzuur (37,7%), γ-linoleenzuur (2,4%) en decosahexanoïnezuur (2,8%)) samen met 2% (w / v) runderserumalbumine. Stel de uiteindelijke pH van perfusaat in op 7,3 met behulp van HCl (en NaOH, indien nodig).
2. Pre-operatieve opstelling
- Monteer twee spuiten van 1 ml met een naald van 23 G die 19,05 mm lang zijn. Vul één spuit met 0,01 ml van 1000 eenheden/ml heparine en 0,19 ml zoutoplossing (0,9% (w/v) NaCl in water; Tabel 1).
- Vul de tweede spuit met 0,2 ml 2% lidocaïne en 0,6 ml 0,9% zoutoplossing (tabel 1). Vul in een andere spuit van 1 ml met een naald van 27 G 38,1 mm met het perfusaat en houd het op 37 °C.
3. Perfusate kolom set-up
- Plaats de glazen fles met 500 ml perfusaat in het waterbad (figuur 1B). Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op ~42 °C. De hogere temperatuur in het waterbad maakt het mogelijk om 37 °C in de perfusiekolom te behouden.
- Zodra het water is opgewarmd tot 42 °C, schakelt u de twee pompen in om het perfusaat uit de fles door de dunne film oxygenator en de met water omhulde glazen kolom van 100 cm te laten circuleren (figuur 1A-E).
- Schakel het zuurstofhoudende gas (95% zuurstof en 5% koolstofdioxide) in om de oxygenator7 onder druk te zetten (figuur 1C). Pas de hoogte van de perfusaatkolom aan om een debiet van 8 ml/min te bereiken met de katheter bevestigd (zie stap 9 voor het meten van het debiet)5,8,9.
OPMERKING: Stroomsnelheid verwijst naar de snelheid waarmee perfusaat door de lever wordt verdreven.
4. Verdoving van de muis
- Draag PBM's zoals vereist door het IACUC-protocol en andere toepasselijke veiligheidsrichtlijnen.
OPMERKING: De volgende stappen zijn geoptimaliseerd voor muizen die 9 - 13 weken oud zijn. - Plaats de muis in de isofluraankamer. Draai het afgiftegas naar 100% zuurstof, een debiet van 1 l/min en het isofluraan naar 2%10. Wacht tot de ademhaling vertraagt en stabiel is.
OPMERKING: Om de muis een stabiel chirurgisch vlak te laten bereiken, zoals blijkt uit een langzame en gestage ademhalingsfrequentie en een gebrek aan teenknijpersreflex, kan de zuurstofstroomsnelheid worden aangepast tot ~ 1,5 l / min tot ~ 3 l / min en de isofluraanconcentratie van 1 - 3%. De afgiftesnelheid van de concentratie van dragergas en isofluraan is afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van het dier en factoren zoals geluid en licht. - Desinfecteer de buik met 70% alcohol. Dien heparine toe via een diepe subcutane injectie in de buikvetlaag (figuur 2). Plaats de muis gedurende 10 minuten terug in de anesthesiekamer.
OPMERKING: Scheren is niet vereist omdat deze procedure terminaal is.
5. Celiotomie
- Breng de muis over van de anesthesiekamer naar het operatieplatform en plaats deze in rugligging (figuur 3).
- Plaats de neus van de muis in een neuskegel en plak de poten naar beneden. Zorg ervoor dat u de nek niet belast die tot verstikking kan leiden.
- Dien lidocaïne toe via een subcutane injectie bilateraal in het voorste iliacale kamgebied11 (figuur 3). Voer een teenknijptest uit om de afwezigheid van alle pijnreflexen te bevestigen.
- Voer celiotomie uit om de inwendige organen bloot te leggen (figuur 4). Maak een 3 cm brede incisie (de breedte van de hele buik van de muis).
OPMERKING: De breedte verandert met de leeftijd en het dieet van de muis. - Breid de incisie uit met behulp van een hemostaat die tractie trekt door op het xiphoid-proces te klemmen (figuur 4).
6. Cannulatie van poortader
- Gebruik een applicator met katoenpunt om de dunne en dikke darm die de poortader bedekken, te verwijderen. Plaats een zijden hechting onder de boog van de poortader proximaal van de lever (figuur 4A).
- Plaats, afhankelijk van de anatomische structuur, de tweede zijdenaad proximaal of distale van de inferieure mesenteriale aderdistale van de lever (figuur 4A)12,13. Gebruik een 2-0 hechting voor beide hechtingen.
- Zodra de hechtingen op hun plaats zijn, cannuleer de poortader met een 22G-katheter14 (figuur 4B). Houd bij het inbrengen van de katheter de schuine kant omhoog gericht. Betreed de poortader in een hoek van niet meer dan 15°.
- Bind de eerste hechting langs de kathetertapper. Nadat de poortader is gecannuleerd, verankert u de katheter 2-3 mm distal van de tak van de poortader met de zijdenaad (figuur 4B).
OPMERKING: De assistent moet schouders en polsen rollen om te voorkomen dat de katheter losraakt of de poortader scheurt. Elke hechting vereist twee knopen. - Zet vervolgens het onderste deel van de katheter vast met de tweede hechting. Bind met behulp van de chirurgische assistent een knoop met de hechtdraad om de katheter vast te zetten aan het distale deel van de poortader en het omliggende weefsel.
7. Resectie van leverpostportaal ader cannulatie
- Nadat de katheter is vastgezet, plaatst u een spuit van 1 ml met een naald van 27 G die 38,1 mm lang is in de katheter om bloed en luchtbellen te spoelen.
OPMERKING: Er is meestal een terugstroom van bloed uit de katheter van de druk. - Gebruik een 1 mm I.D. x 5 mm O.D. siliconenbuis met een vaste stopkraan om de perfusiekolom (figuur 1A) aan de katheter te koppelen, waardoor de buffer in de lever kan stromen en het begin van de perfusie markeert. Start op dit punt een timer om het begin van de perfusie te markeren.
- Verlicht de verhoogde vasculaire druk door met behulp van een schaar een incisie te maken in de inferieure vena cava.
- Bevestig de stroom van perfusaat door de lever door de homogene verandering in leverkleur van roze / rood naar lichtgeel te observeren. Zodra de stroom is bevestigd, snijdt u de maag, dunne darm, dikke darm en de rechternier uit het omliggende weefsel.
- Manoeuvreer met behulp van de chirurgische assistent de lever rond de buik- en borstholte terwijl de chirurg door het pariëtale peritoneum en thoracale weefsel snijdt om de lever te reseceren
- Til ten slotte de lever naar boven en knip de resterende bindweefsels die de lever op zijn plaats houden met een schaar. Manipuleer langzaam de lever voor het gemak van het zicht. Verwijder alle vacht die aan de lever kleeft door af te spoelen met perfusaat voordat u het inkapselt in de NMR-buis.
OPMERKING: Bij deze procedure wordt alleen de lever verwijderd. Alle andere organen blijven achter in het lichaam van het dier. De galwegen kunnen worden verwijderd op basis van het protocol van het experiment. Hoewel het voor dit experiment op zijn plaats werd gelaten.
8. De lever aan de kolom hangen
- Zodra de chirurg de lever en slang aan de assistent overhandigt, maakt de assistent de slang los van de katheter en kolom.
- Vul de katheter met perfusaat totdat er een meniscus is gevormd aan de bovenkant van de katheter. Bevestig de katheter aan de kolom zodat de lever kan hangen en perfuseren.
OPMERKING: De parel van perfusaat op de katheter biedt voldoende volume om de lever te laten functioneren totdat deze is aangesloten. De katheter die aan de lever is bevestigd, wordt aan de onderkant van de kolom ingedrukt. - Schroef een NMR-buis van 20 mm op de glazen kolom van 100 cm om de lever in te kapselen (figuur 5). Om torsie van de lever en de poortader te voorkomen, schroeft u langzaam de NMR-buis vast. Als torsie optreedt en de stroom wordt gestopt, schroeft u de NMR-buis los en schroeft u deze opnieuw. Dit zal de occlusie verhelpen en de stroom zal terugkeren.
- Perfuseer de lever gedurende 30-60 minuten op basis van de details van het onderzoek.
OPMERKING: De tijd is gebaseerd op het perfusie-experiment. Voor dit experiment werd de metabole omzet binnen 30 minuten gemeten. De leverperfusie kan tot 10 minuten duren om een stabiele toestand te bereiken. De tijd tot steady-state begint zodra de inferieure vena cava is gesneden en de leverstroom is vastgesteld.
9. Flow meting
- Plaats een weegboot op een bovenste laadbalans en nul de balans. Plaats de slang van de rolpomp die efferente perfusaat uit de NMR trekt in de weegboot en start de timer.
- Weeg de massa vloeistof die zich gedurende 1 minuut heeft opgehoopt en die de stroomsnelheid van de lever oplevert. Plaats de buis terug in de afval-/opvangcontainer.
10. Zuurstofmeting
OPMERKING: De metingen van de zuurstofmeter zijn ingesteld volgens de instructies van de fabrikant15.
- Plaats de elektrode met 20 μL 50% KCl verzadigde oplossing op de platina koepel en plaats vijf druppels van 10 μL rond de onderste platina ring van de elektrode.
- Verwijder de lijm van het sigarettenpapier. Leg een stuk polytetrafluorethyleenmembraan over het sigarettenpapier.
- Plaats de twee stukken bovenop de elektrode. Plaats een kleine O-ring rond de bovenkant van de elektrode. Snijd het papier bij om plat op de onderste platina ring op de elektrode te liggen.
OPMERKING: Enige overhang is acceptabel. Het is essentieel om het zilver van de elektrode te bedekken. - Plaats de grotere O-ring op de elektrode. Koppel de elektrode aan de waterkamer en draai de basis vast om de elektrode op zijn plaats te houden. Zet het waterbad aan en laat opwarmen tot 37 °C.
- Open zuurstofmeter software. Klik op Kalibreer > luchtverzadigd water. Stel de roersnelheid in op 75 en de temperatuur op 37 °C.
- Vul een injectieflacon van 50 ml halverwege met water en schud krachtig gedurende 2 minuten. Dit is luchtverzadigd water, gebruik het als 100% standaard. Vul de zuurstofmeterkamer met ~ 2 ml water en plaats de tweedelige stop erop.
- Klik op OK op het scherm en laat het signaal plateau. Zodra het signaal een plateau heeft bereikt, klikt u op OK. Gooi vloeistof in de kamer en droog met tissuepapier.
- Herhaal stap 10,6-10,7, maar met 200 mM natriumsulfiet (0% standaard). Klik op Kalibratie opslaan.
OPMERKING: Er is geen krachtig schudden nodig voor de 0%-norm. - Gebruik tijdens de perfusie twee spuiten van 5 ml. Eén spuit voor circulerend perfusaat (zuurstof in) en de tweede voor efferente perfusaat uit de NMR-buis (zuurstof uit).
- Trek bij het opstellen van perfusaat voor zowel in- als uitmetingen telkens 3-4 ml.
OPMERKING: Deze kolom heeft glazen buizen om toegang tot de NMR-buis mogelijk te maken om het perfusaat dat door de lever is gestroomd, op te zuigen. - Meet het circulerende perfusaat, eerst net als water in stap 10.6 en weggooien in stap 10.7. Herhaal dezelfde stappen voor het efferente perfusaat.
- Voer elke 10 minuten zuurstofmetingen uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De leverfunctie wordt voornamelijk beoordeeld aan de hand van het zuurstofverbruik en de stroomsnelheid. Een debiet van 4-8 ml/min en zuurstofverbruik van 1 μmol/min.g is typisch. Deze maatregelen zullen variëren afhankelijk van specifieke experimentele omstandigheden en biologische verschillen.
De exacte hoeveelheid isofluraan die wordt gebruikt, is afhankelijk van het type anesthesiesysteem dat wordt gebruikt, evenals de omgeving en leeftijd / gewicht van de muis. Tijdens de operatie veranderen het isofluraan en het toedieningsgas niet, hoewel sommige veranderingen nodig kunnen zijn, afhankelijk van de specifieke kenmerken van het operatiegebied (bijv. Achtergrondgeluid)10. Wanneer heparine diep subcutaan wordt geïnjecteerd, kan het begin van de actie tot 20-40 minuten worden vertraagd. Een wachttijd van 10 minuten na toediening van heparine zorgt voor het begin van actie16. Lidocaïne heeft een begin van 2 minuten van actie11.
Houd bij het inbrengen van de katheter de schuine kant omhoog gericht en ga in een hoek van niet meer dan 15° van de poortader naar binnen. Beide hechtingen hebben twee knopen. De eerste hechting moet langs de kathetertapper worden gebonden. Als cannulatie van de poortader succesvol is, bleekt de lever uit de spoeling. Terwijl de chirurg de lever reseceert, ruimt de assistent de gereseceerde inhoud op met een applicator met katoenen punt. Om besmetting van de lever te voorkomen en inkepingen aan de lobben te voorkomen, snijdt u niet door de maag. Breng niet te veel spanning aan op de poortader of lever bij het vasthouden van de katheter om te voorkomen dat de poortader ontwricht of scheurt.
De perfusion hardware setup vereist uitgebreide aandacht voor detail (Figuur 1). Heparine-injecties (figuur 2) zijn essentieel voor het experiment. Als bloed stolt, zal het de katheter afsluiten die in de poortader wordt ingebracht, waardoor de stroom wordt voorkomen. De lidocaïne-injectie (figuur 3) moet helpen bij het desensibiliseren van het gebied voor pijnverlichting. Tabel 1 geeft een eenvoudige doseringsgrafiek voor heparine en lidocaïne met zoutoplossing. De celiotomie en hechting (figuur 4) zijn essentieel voor een succesvolle poortaderkatheterisatie, leverresectie en succesvolle overdracht naar de perfusie-rig. Metingen van de stroomsnelheid en het zuurstofverbruik zijn van vitaal belang voor het bewaken van de gezondheid en functie van de lever (figuur 6). Er is vaak een klein verschil in O2-consumptie tussen gevoede en nuchtere levers, die we toeschrijven aan de verhoogde energiebehoefte die wordt opgelegd door gluconeogenese in de nuchtere lever.
Figuur 1. Perfusiekolom en pompen. Een. Een 100 cm wateromhulde glazen kolom waarin de lever aan de onderkant hangt. B. De waterpomp circuleert water door de glazen kolom en verwarmt het perfusaat. C. Glazen dunne laag oxygenator wordt onder druk gezet met 95% / 5% O2 / CO2 oxygenatie van het perfusaat. D. De kogellagerpomp circuleert perfusaat uit het waterbad in de dunne laag oxygenator en de glazen kolom. E. De kogellagerpomp circuleert perfusaat dat vanuit de afgiftepomp in de kolom wordt afgeleverd en houdt perfusaat zuurstofrijk en handhaaft een stroom van 8 ml / min. F. De kogellagerpomp verwijdert efferente perfusaat uit de NMR-buis. G. Weegschaal om perfusaat uit NMR-buis te wegen om de stroomsnelheid van de lever te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Heparine injectie. Diepe subcutane injectie van heparine wordt gegeven in de onderste buikvetlaag van de muis. Het is belangrijk om bij het oppakken van de muis de huid strak te trekken zodat de naald gemakkelijk in de huid kan doordringen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Lidocaïne injectie. De muis wordt in rugligging op het chirurgische platform geplaatst met zijn poten naar beneden geplakt en de neus in de neuskegel. Lidocaïne wordt subcutaan toegediend in het iliacale kamgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Celiotomie en hechting. De celiotomie legt de inwendige organen bloot en een hemostat trekt tractie door het xiphoid-proces om de incisie verder te openen. Twee hechtingen worden rond de poortader geplaatst, de katheter wordt ingebracht en de hechtingen worden vastgebonden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. NMR buis. De lever wordt uit het lichaam verwijderd samen met de katheter die vervolgens wordt bevestigd aan de siliconenbuis die aan de glazen kolom is bevestigd. De lever wordt aan de kolom gehangen en ingekapseld door de NMR-buis. Een NMR-buis van 20 mm wordt vervolgens voorzichtig op de kolom geschroefd die de lever inkapselt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Zuurstofverbruik en debiet. Representatieve gegevens van het vergelijken van leverzuurstofverbruik en stroomsnelheidsmetingen tussen gevoede en nuchtere levers. N = 3 en foutbalken zijn standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Heparine 1000 eenheden/ml | Zoutoplossing 0,9% | Totaal |
| 0,01 ml | 0,19 ml | 0,2 ml |
| Lidocaïne 2% | Zoutoplossing 0,9% | Totaal |
| 0,2 ml | 0,6 ml | 0,8 ml |
Tabel 1. Heparine en lidocaïne dosis met zoutoplossing. De tabel toont de concentratie van heparine en lidocaïne en de dosis van elk geneesmiddel met zoutoplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze chirurgische ingreep is een uitdaging en vereist uitgebreide oefening om reproduceerbare resultaten te bereiken. Isofluraan en dragergas moeten indien nodig worden aangepast om de levensvatbaarheid van het dier te behouden gedurende zoveel mogelijk van de chirurgische ingreep. Omgeving, tijd van de dag, leeftijd, gewicht en verschillende andere factoren zullen de anesthesie beïnvloeden. Gewicht, dieet, muizenstam en leeftijd kunnen van invloed zijn op de operatie, omdat vetopbouw het visualiseren van de poortader kan verstoren. Bij het afplakken van de poten moet ervoor worden gezorgd dat er geen spanning op de nek wordt uitgeoefend die kan leiden tot verstikking. Bovendien, hoe dikker de muis, hoe strakker de hechting rond de katheter moet zijn om de verminderde wrijvingscoëfficiënt tussen de katheter en de ader veroorzaakt door de lipiden tegen te gaan. Het begin van de actietijd voor heparine is essentieel omdat overmatige blootstelling aan isofluraan artefacten in organen produceert17. Toediening van heparine- en lidocaïne-injecties vereist een 23G-naald van 19,05 mm lengte, waardoor er tijdens de injectie geen trauma aan inwendige organen ontstaat. De hechtlus moet zich over de conus van de katheter bevinden, anders wordt de ader afgesloten wanneer deze wordt aangespannen. Zodra de katheter is ingebracht, is er meestal een terugstroom van bloed uit de katheter van de druk, wat een positief teken is van de juiste plaatsing. De katheter kan naar boven worden getrokken voor visuele bevestiging dat de katheterpunt ver genoeg voorbij de eerste hechting is. Het rollen van de polsen en schouders zorgt ervoor dat de hechting niet van de taps toelopende punt glijdt wanneer de assistent de hechtdraad vastbindt. Bij het overbrengen van de lever van de siliconenperfusieslang naar de kolom wordt een kraal perfusaat bovenop de katheter achtergelaten. De perfusaatkraal voorkomt dat luchtbellen de katheter binnendringen en in de lever terechtkomen. De meniscus van perfusaat bovenop de katheter biedt voldoende volume om de lever te laten functioneren totdat deze is aangesloten. Om torsie van de lever en de poortader te voorkomen, wordt de NMR-buis langzaam vastgeschroefd. Bovendien heeft het perfusiesysteem dat in dit experiment wordt gebruikt geen drukventiel nodig. De debieten van de pompen worden zodanig gehandhaafd dat de glasperfusiekolom perfusie bevat op een hoogte van ~ 12 cm. De lever neemt krebsbuffer op door de zwaartekracht, waardoor elk drukverschil tussen de twee pompen teniet wordt gedaan zonder effect op het debiet van de lever. Omdat de lever wordt doordrenkt door de zwaartekracht, wordt de hoeveelheid perfusaat die door de lever wordt opgenomen, bepaald door de natuurlijke biologische activiteit van de lever. Er werden geen gegevens verzameld voor de perfusiedruk, omdat de poortaderdruk niet meetbaar is in dit systeem.
De eerste incisie van de celiotomie is ondiep om een opening te creëren en de daaropvolgende sneden zijn dieper om te voorkomen dat de lobben van de lever worden geknepen. De totale lengte van de incisie voor de celiotomie is 3 cm voor muizen van deze leeftijd en grootte, maar zal veranderen op basis van stam, leeftijd en gewicht. Hoewel de beschreven studie muizen van 9-13 weken oud gebruikt, kunnen oudere of jongere muizen worden bestudeerd, evenals ratten. De grootte van de NMR-buis en de poortaderkatheter zou moeten worden gewijzigd op basis van de anatomische grootte van de lever en de poortader voor het onderzoek van zorg. Als de poortader niet recht is, kan een applicator met katoenen punt helpen bij het manipuleren van de ader bij het inbrengen van de katheter. Hoewel het galkanaal niet wordt verwijderd, kan het kanaal worden verwijderd met een fijn pincet als er een experimentele behoefte is aan afwezigheid ervan. Overmatige manipulatie van de poortader bij het plaatsen van hechtingen zal vernauwing veroorzaken waardoor het plaatsen van de katheter moeilijker wordt. Elke vacht die aan de lever kleeft, wordt afgespoeld met perfusaat voordat de katheter op de kolom wordt gedrukt en in de NMR-buis wordt ingekapseld. Het tijdsbestek van 30 minuten voor perfusie kan worden gewijzigd van 20 min naar 60 min, maar alle betrouwbare gegevens worden verzameld na de eerste 10 minuten perfusie.
Een marker van succesvolle hepatische weefselresectie is dat de lever na de perfusie geen misvormingen of andere integriteitsproblemen heeft. Het is overal homogeen lichtgeel. Als het weefsel tijdens een operatie gewond raakte, zoals een inkeping, zou het donkergele vlekken eromheen hebben. Ook als de lever werd beschadigd door de perfusie, zou het niet perfuseren. Als het weefsel een slechte perfusie van de Krebs-buffer zou ervaren, zouden er donkergele strepen door het hele orgaan zijn als gevolg van uithongering die leidt tot weefseldood. Een andere methode om de gezondheid van de lever te controleren is het zuurstofverbruik in de lever (figuur 6). Het is aangetoond dat muizenlevers hogere lipide- en glycogeenhoeveelheden bevatten, maar vergelijkbare totale eiwithoeveelheden hebben, dus er werd verwacht dat het leverzuurzuurverbruik bij normalisatie naar levermassa een vergelijkbare waarde zou hebben. Een derde methode zijn de NMR-gegevens van de real-time gegevens van metabole omzet.
De belangrijkste beperking van de methode is terminale chirurgie zelf. Er zijn aanzienlijke kosten verbonden aan muizen, apparatuur, tijd en personeel. Daarom moet de grootst mogelijke zorgvuldigheid worden betracht bij het uitvoeren van deze procedures en het verzamelen van gegevens. Biologische variatie binnen het muismodel kan problemen veroorzaken bij de operatie. Bovendien is het noodzakelijk om optische verbeteringen te vermijden. Er zijn geen optische verbeteringen nodig omdat alle anatomie met het blote oog zichtbaar is. Optische verbeteringen verhogen de kans op fouten omdat de chirurg en assistent een beperkt gezichtsveld hebben, wat leidt tot prullaria in de lever of onbedoelde spanning op de poortader, waardoor een storing ontstaat als de katheter eruit trekt. Een goede implementatie van deze methoden zal resulteren in > 95% operatie succespercentage in de C57BL / 6J muis. Een andere beperking om te overwegen is de periode van 10 minuten die nodig is voor de lever om een stabiele toestand te bereiken. Het is geen beperking voor de hier beschreven studie, noch in vele andere, maar voor elk experiment dat de eerste 10 minuten aan gegevens rechtvaardigt, zal deze methode niet volstaan. Het ontbreken van de complexe hormonale signatuur geassocieerd met het metabolisme van het hele lichaam dient ook als een beperking, hoewel glucagon, insuline, enz., En elke combinatie daarvan, kan worden toegevoegd aan het perfusaat.
Er zijn verschillende potentiële toekomstige toepassingen voor deze techniek. Naarmate er meer geneesmiddelen worden ontwikkeld voor de behandeling van NASH, kunnen standaardmethoden voor het beoordelen van het leverenergiemetabolisme een brede toepassing vinden. Omdat NASH sterk geassocieerd is met leverkanker, zijn modellen van deze kankers ook onderwerpen voor studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of in de beslissing om de resultaten te publiceren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Een deel van dit werk werd uitgevoerd in het McKnight Brain Institute in de Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility van het National High Magnetic Field Laboratory, die wordt ondersteund door de National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 en de staat Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
