Summary
Il protocollo descrive un metodo semplice di resezione di un fegato di topo intatto per studi metabolici attraverso la perfusione della vena porta.
Abstract
Le malattie metaboliche come il diabete, il pre-diabete, la steatosi epatica non alcolica (NAFLD) e la steatoepatite non alcolica (NASH) stanno diventando sempre più comuni. Le perfusioni epatiche ex vivo consentono un'analisi completa del metabolismo epatico utilizzando la risonanza magnetica nucleare (NMR), in condizioni nutrizionali che possono essere rigorosamente controllate. Poiché le simulazioni in silico rimangono un mezzo principalmente teorico per valutare le azioni ormonali e gli effetti dell'intervento farmaceutico, il fegato perfuso rimane uno dei banchi di prova più preziosi per comprendere il metabolismo epatico. Poiché questi studi guidano le intuizioni di base sulla fisiologia epatica, i risultati devono essere accurati e riproducibili. Il più grande fattore nella riproducibilità della perfusione epatica ex vivo è la qualità della chirurgia. Pertanto, abbiamo introdotto un metodo organizzato e semplificato per eseguire perfusioni epatiche di topo ex vivo nel contesto di esperimenti NMR in situ . Descriviamo anche un'applicazione unica e discutiamo i problemi comuni riscontrati in questi studi. Lo scopo generale è quello di fornire una guida semplice a una tecnica che abbiamo perfezionato nel corso di diversi anni che riteniamo il golden standard per ottenere risultati riproducibili in resezioni epatiche e perfusioni nel contesto di esperimenti NMR in situ . La distanza dal centro del campo per il magnete e l'inaccessibilità del tessuto all'intervento durante l'esperimento NMR rende i nostri metodi nuovi.
Introduction
Le perfusioni ex vivo sono cruciali nello studio del metabolismo epatico e la perfusione attraverso la vena porta è lo standard per questi studi. Per studiare il metabolismo epatico in isolamento, il fegato deve essere resecato dal corpo per evitare complicazioni derivanti dal metabolismo in altri organi (cioè il metabolismo di tutto il corpo) e per esercitare il controllo sulla disponibilità ormonale (insulina, glucagone, ecc.). Questo approccio può essere essenziale per comprendere gli effetti di malattie come il diabete, la NAFLD e la NASH sul metabolismo epatico e sui meccanismi di azione dei farmaci. Questo articolo serve come guida per la resezione epatica e la perfusione. Abbiamo sviluppato una procedura semplificata per eseguire questi studi metabolici sul fegato con sufficiente rigore e riproducibilità. Se l'intervento chirurgico non viene eseguito correttamente, vi è una pronunciata variabilità nei dati metabolici ottenuti. Descriviamo un metodo organizzato per eseguire il cateterismo della vena porta e la resezione epatica nel contesto di studi metabolici in situ in uno spettrometro a risonanza magnetica nucleare (NMR), come descritto nella letteratura 1,2,3,4,5.
Attualmente, non esiste letteratura che descriva una perfusione epatica ex vivo utilizzando una colonna di vetro all'interno di una NMR. Né esiste una pubblicazione video o testuale che fornisca un chiaro esempio di come eseguire la procedura con il fegato di topo, in particolare, dimostrando come cateterizzare la vena porta, resecare un fegato, trasferire e appendere il fegato su una colonna di vetro. Poiché il topo geneticamente modificato è onnipresente per studiare il metabolismo epatico, questa è una procedura essenziale che merita una descrizione completa. Gli interventi chirurgici di perfusione epatica non sono nuovi, ma questo articolo è un metodo gold standard accompagnato da un video che dimostra l'eccellenza tecnica descritta in questo documento per aiutare tutti coloro che sono interessati a questa procedura. Il metodo qui presentato sarebbe meglio applicato al metabolismo in tempo reale per rilevare la funzione e il turnover dei metaboliti nei modelli di malattia.
Questo metodo utilizza una colonna di vetro rivestita d'acqua di 100 cm, che consente al fegato di appendersi sul fondo della cannula incapsulata da perfusate all'interno di un tubo NMR. L'acqua riscaldata nella camicia di vetro viene utilizzata per controllare la temperatura di perfusazione. Un ossigenatore a strato sottile viene pressurizzato con 95%/5% O2/CO2 per il controllo del pH. Utilizzando tre pompe separate, viene impostata l'altezza della colonna di perfusato, che fornisce una pressione costante al fegato. Le portate non sono controllate oltre l'applicazione della pressione costante (Figura 1). Per confermare che il fegato funzioni in modo appropriato, vengono effettuate misurazioni dell'ossigeno insieme alle portate. Nelle nostre mani, questo insieme di precondizioni porta a esperimenti NMR altamente ripetibili per la valutazione della funzione metabolica epatica.
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Protocol
Gli esperimenti che hanno coinvolto topi sono stati gestiti in conformità con il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Florida (numero di protocollo n. 201909320). Il ceppo di topo utilizzato era C57BL/6J; tutti i topi erano maschi. Questo metodo è generalmente applicabile anche per gli studi che utilizzano altri ceppi di topo standard. Questo intervento chirurgico viene eseguito in modo ottimale da due individui che lavorano insieme.
1. Configurazione iniziale
- Perfusare fegati con perfusato contenente elettroliti Krebs-Henseleit6 (25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM ciascuno di MgSO4, KH2PO4 e 0,5 mM sodio-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM lattato di sodio, 0,6 mM piruvato di sodio, 0,2 mM [U-13C] propionato di sodio, 10% (v/v) D2O, e 0,63 mM di acidi grassi misti (contenenti acido palmitico (22,1% del totale), acido palmitoleico (5,2%), acido stearico (2,7%), acido oleico (27%), acido linoleico (37,7%), acido γ-linolenico (2,4%) e acido decosaesanoico (2,8%)) insieme al 2% (p/v) di albumina sierica bovina. Impostare il pH finale del perfusato a 7,3 utilizzando HCl (e NaOH, se necessario).
2. Configurazione pre-operatoria
- Assemblare due siringhe da 1 mL con un ago da 23G lunghe 19,05 mm. Riempire una siringa con 0,01 mL di 1000 unità/mL di eparina e 0,19 mL di soluzione salina (0,9% (p/v) di NaCl in acqua; Tabella 1).
- Riempire la seconda siringa con 0,2 mL di lidocaina al 2% e 0,6 ml di soluzione salina allo 0,9% (Tabella 1). In un'altra siringa da 1 mL con un ago da 27 G e 38,1 mm, riempire con il perfusato e mantenere a 37 °C.
3. Impostazione della colonna perfusare
- Introdurre la bottiglia di vetro contenente 500 ml di perfusato nel bagno d'acqua (Figura 1B). Accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura a ~42 °C. La temperatura più elevata nel bagno d'acqua consente di mantenere 37 °C nella colonna di perfusione.
- Una volta che l'acqua si riscalda fino a 42 °C, accendere le due pompe per far circolare il perfusato dalla bottiglia attraverso l'ossigenatore a film sottile e la colonna di vetro da 100 cm rivestita d'acqua (Figura 1A-E).
- Accendere il gas ossigenante (95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica) per pressurizzare l'ossigenatore7 (Figura 1C). Regolare l'altezza della colonna perfusare per ottenere una portata di 8 mL/min con il catetere collegato (vedere il passaggio 9 per la misurazione della portata)5,8,9.
NOTA: La portata si riferisce alla velocità con cui il perfusato viene espulso dal fegato.
4. Anestesia del mouse
- Indossare DPI come richiesto dal protocollo IACUC e da altre linee guida di sicurezza appropriate.
NOTA: i seguenti passaggi sono stati ottimizzati per i mouse di età compresa tra 9 e 13 settimane. - Posizionare il mouse nella camera isoflurano. Portare il gas di mandata al 100% di ossigeno, una portata di 1 L/min e l'isoflurano al 2%10. Aspetta che la respirazione rallenti e sia costante.
NOTA: Affinché il topo raggiunga un piano chirurgico stabile, come evidenziato da una frequenza respiratoria lenta e costante e dalla mancanza di riflesso del pizzico della punta, la portata di ossigeno può essere regolata a ~ 1,5 L / min a ~ 3 L / min e la concentrazione di isoflurano dall'1 al 3%. Il tasso di consegna del gas di trasporto e della concentrazione di isoflurano dipende dall'età e dal peso dell'animale e da fattori quali il rumore e la luce. - Disinfettare l'addome con alcol al 70%. Somministrare eparina attraverso un'iniezione sottocutanea profonda nello strato di grasso addominale (Figura 2). Riposizionare il mouse nella camera di anestesia per 10 minuti.
NOTA: la rasatura non è necessaria in quanto questa procedura è terminale.
5. Celiotomia
- Trasferire il topo dalla camera di anestesia alla piattaforma chirurgica e posizionarlo in posizione supina (Figura 3).
- Metti il naso del topo in un cono nasale e fissa le zampe verso il basso. Fare attenzione a non applicare alcuna tensione sul collo che possa portare al soffocamento.
- Somministrare lidocaina attraverso un'iniezione sottocutanea bilateralmente nella regione11 della cresta iliaca anteriore (Figura 3). Eseguire un test di pizzicamento della punta per confermare l'assenza di tutti i riflessi del dolore.
- Eseguire la celiotomia per esporre gli organi interni (Figura 4). Fai un'incisione larga 3 cm (la larghezza dell'intero addome del mouse).
NOTA: la larghezza cambierà con l'età e la dieta del mouse. - Espandere l'incisione utilizzando un emostato che tira la trazione bloccando il processo xifoide (Figura 4).
6. Cannulazione della vena porta
- Utilizzare un applicatore con punta di cotone per eliminare l'intestino tenue e crasso che copre la vena porta. Posizionare una sutura di seta sotto l'arco della vena porta prossimale al fegato (Figura 4A).
- A seconda della struttura anatomica, posizionare la seconda sutura di seta prossimale o distale della vena mesenterica inferiore distale dal fegato (Figura 4A)12,13. Utilizzare una sutura 2-0 per entrambe le suture.
- Una volta che le suture sono in posizione, cannulare la vena porta con un catetere 22G14 (Figura 4B). Quando si inserisce il catetere, tenere la smussatura puntata verso l'alto. Inserire la vena porta con un angolo non superiore a 15°.
- Legare la prima sutura oltre il tapper del catetere. Dopo che la vena porta è stata cannulata, ancorare il catetere 2-3 mm distale dal ramo della vena porta con la sutura di seta (Figura 4B).
NOTA: L'assistente deve rotolare spalle e polsi per evitare lo spostamento del catetere o la lacerazione della vena porta. Ogni sutura richiede due nodi. - Quindi, fissare la parte inferiore del catetere con la seconda sutura. Con l'aiuto dell'assistente chirurgico, legare un nodo con la sutura per fissare il catetere alla porzione distale della vena porta e del tessuto circostante.
7. Resezione della cannulazione della vena porta post-epatica
- Dopo aver fissato il catetere, inserire una siringa da 1 mL con un ago da 27 G lungo 38,1 mm nel catetere per lavare il sangue e le bolle d'aria.
NOTA: Di solito c'è un riflusso di sangue dal catetere dalla pressione. - Utilizzare un tubo in silicone ID x 5 mm O.D. con un rubinetto fisso per accoppiare la colonna di perfusione (Figura 1A) al catetere consentendo il flusso del tampone nel fegato che segna l'inizio della perfusione. Avviare un timer a questo punto per contrassegnare l'inizio della perfusione.
- Alleviare l'aumento della pressione vascolare facendo un'incisione, usando le forbici, nella vena cava inferiore.
- Confermare il flusso di perfusate attraverso il fegato osservando il cambiamento omogeneo nel colore del fegato da rosa / rosso a un giallo pallido. Una volta confermato il flusso, asportare lo stomaco, l'intestino tenue, l'intestino crasso e il rene destro dal tessuto circostante.
- Con l'aiuto dell'assistente chirurgico, manovrare il fegato intorno alla cavità addominale e toracica mentre il chirurgo taglia il peritoneo parietale e il tessuto toracico per resecare il fegato
- Infine, sollevare il fegato verso l'alto e tagliare i tessuti connettivi rimanenti che tengono il fegato in posizione con le forbici. Manipolare lentamente il fegato per facilità di visione. Rimuovere qualsiasi pelliccia che si attacca al fegato risciacquando con perfusato prima di incapsularlo all'interno del tubo NMR.
NOTA: In questa procedura, viene rimosso solo il fegato. Tutti gli altri organi sono lasciati nel corpo dell'animale. Il dotto biliare può essere rimosso in base al protocollo dell'esperimento. Anche se per questo esperimento, è stato lasciato sul posto.
8. Appendere il fegato alla colonna
- Una volta che il chirurgo consegna il fegato e il tubo all'assistente, l'assistente scollega il tubo dal catetere e dalla colonna.
- Riempire il catetere con perfusato fino a formare un menisco sulla parte superiore del catetere. Attaccare il catetere alla colonna affinché il fegato si appenda e si perfonda.
NOTA: Il tallone di perfusato sul catetere fornisce un volume sufficiente per il fegato per funzionare fino a quando non è collegato. Il catetere attaccato al fegato viene premuto montato sul fondo della colonna. - Avvitare un tubo NMR da 20 mm sulla colonna di vetro da 100 cm per incapsulare il fegato (Figura 5). Per evitare la torsione del fegato e della vena porta, avvitare lentamente il tubo NMR. Se si verifica una torsione e il flusso viene interrotto, svitare e risevitare il tubo NMR. Questo rimedierà all'occlusione e il flusso tornerà.
- Perfondere il fegato per 30-60 minuti in base ai dettagli dello studio.
NOTA: il tempo si basa sull'esperimento di perfusione. Per questo esperimento, il turnover metabolico è stato misurato entro 30 minuti. La perfusione epatica può richiedere fino a 10 minuti per raggiungere uno stato stazionario. Il tempo allo stato stazionario inizia una volta che la vena cava inferiore è stata tagliata e il flusso epatico è stato stabilito.
9. Misurazione del flusso
- Posizionare una barca pesata su una bilancia a carico dall'alto e azzerare la bilancia. Posizionare il tubo dalla pompa a rulli che tira il perfusato efferente dalla NMR nella barca di pesatura e avviare il timer.
- Pesare la massa di liquido accumulato in 1 minuto che produce la portata del fegato. Riposizionare il tubo nel contenitore dei rifiuti/raccolta.
10. Misurazione dell'ossigeno
NOTA: le misurazioni del misuratore di ossigeno sono state impostate secondo le istruzioni del produttore15.
- Posizionare l'elettrodo contenente 20 μL di soluzione satura al 50% di KCl sulla cupola di platino e posizionare cinque gocce da 10 μL attorno all'anello di platino inferiore dell'elettrodo.
- Rimuovere l'adesivo dalla carta da sigarette. Posare un pezzo di membrana di politetrafluoroetilene sulla carta da sigarette.
- Posizionare i due pezzi sopra l'elettrodo. Montare un piccolo O-ring attorno alla parte superiore dell'elettrodo. Tagliare la carta per appoggiarla sull'anello di platino inferiore sull'elettrodo.
NOTA: alcune sporgenze sono accettabili. È essenziale coprire l'argento dell'elettrodo. - Posizionare l'O-ring più grande sull'elettrodo. Accoppiare l'elettrodo alla camera dell'acqua e stringere la base per mantenere l'elettrodo in posizione. Accendere il bagno d'acqua e lasciare riscaldare fino a 37 °C.
- Apri il software del misuratore di ossigeno. Fare clic su Calibra > acqua satura d'aria. Impostare la velocità dell'agitatore a 75 e la temperatura a 37 °C.
- Riempire un flaconcino da 50 ml a metà con acqua e agitare vigorosamente per 2 minuti. Questa è acqua satura d'aria, usala come standard al 100%. Riempire la camera del misuratore di ossigeno con ~ 2 ml di acqua e posizionare il tappo a due pezzi.
- Fare clic su OK sullo schermo e consentire al segnale di stabilizzarsi. Una volta che il segnale ha raggiunto un plateau, fare clic su OK. Smaltire il liquido nella camera e asciugare con carta velina.
- Ripetere i passaggi 10,6-10,7 ma con 200 mM di solfito di sodio (0% standard). Fare clic su Salva calibrazione.
NOTA: non è necessario un vigoroso scuotimento per lo standard 0%. - Durante la perfusione, utilizzare due siringhe da 5 ml. Una siringa per il perfusato circolante (ossigeno in entrata) e la seconda per il perfusato efferente dal tubo NMR (ossigeno in uscita).
- Durante la stesura del perfusare sia per le misurazioni in entrata che in uscita, disegnare 3-4 ml ogni volta.
NOTA: questa colonna ha un tubo di vetro per consentire l'accesso al tubo NMR per prelevare il perfusato che è fluito attraverso il fegato. - Misurare il perfusato circolante, prima proprio come acqua nel passaggio 10.6 e smaltire nel passaggio 10.7. Ripeti gli stessi passaggi per il perfusato efferente.
- Eseguire misurazioni dell'ossigeno ogni 10 minuti.
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Representative Results
La funzionalità epatica è valutata principalmente dal consumo di ossigeno e dalla portata. Una portata di 4-8 ml/min e un consumo di ossigeno di 1 μmol/min.g sono tipici. Queste misure varieranno a seconda delle specifiche condizioni sperimentali e delle differenze biologiche.
La quantità esatta di isoflurano utilizzata dipenderà dal tipo di sistema di anestesia utilizzato, nonché dall'ambiente e dall'età/peso del mouse. Durante l'intervento chirurgico, l'isoflurano e il gas di mandata non cambiano, anche se alcuni cambiamenti possono essere necessari a seconda delle specifiche dell'area chirurgica (ad esempio, rumore di fondo)10. Quando l'eparina viene iniettata in profondità per via sottocutanea, l'inizio dell'azione potrebbe essere ritardato fino a 20-40 minuti. Un periodo di attesa di 10 minuti dopo la somministrazione di eparina garantisce l'inizio dell'azione16. La lidocaina ha un inizio di azione di 2 minuti11.
Quando si inserisce il catetere, tenere la smussatura puntata verso l'alto ed entrare con un angolo non superiore a 15 ° dalla vena porta. Entrambe le suture hanno due nodi. La prima sutura deve essere legata oltre la spillatrice del catetere. Se la cannulazione della vena porta ha successo, il fegato sbianca dal rossore. Mentre il chirurgo sta resecando il fegato, l'assistente cancella il contenuto resecato con un applicatore con punta di cotone. Per evitare di contaminare il fegato e prevenire i graffi ai lobi, non tagliare lo stomaco. Non applicare troppa tensione alla vena porta o al fegato quando si tiene il catetere per evitare di spostare o strappare la vena porta.
La configurazione dell'hardware di perfusione richiede un'ampia attenzione ai dettagli (Figura 1). Le iniezioni di eparina (Figura 2) sono essenziali per l'esperimento. Se il sangue coagula, occluderà il catetere che viene inserito nella vena porta, impedendo il flusso. L'iniezione di lidocaina (Figura 3) è per aiutare a desensibilizzare l'area per alleviare il dolore. La Tabella 1 fornisce un semplice diagramma di dosaggio per eparina e lidocaina con soluzione salina. La celiotomia e la sutura (Figura 4) sono essenziali per un successo del cateterismo della vena porta, della resezione epatica e del trasferimento di successo al carro di perfusione. Le misurazioni della portata e del consumo di ossigeno sono vitali per monitorare la salute e la funzione del fegato (Figura 6). C'è spesso una leggera differenza nel consumo di O2 tra fegati nutriti e a digiuno, che attribuiamo all'aumento delle richieste energetiche imposte dalla gluconeogenesi nel fegato a digiuno.
Figura 1. Colonna di perfusione e pompe. Un. Una colonna di vetro con camicia d'acqua di 100 cm in cui il fegato è appeso sul fondo. B. La pompa dell'acqua fa circolare l'acqua attraverso la colonna di vetro e riscalda il perfusato. C. L'ossigenatore a strato sottile di vetro è pressurizzato con 95% / 5% O2 / CO2 che ossigena il perfusato. D. La pompa a sfere circola perfusa dal bagno d'acqua nell'ossigenatore a strato sottile e nella colonna di vetro. E. La pompa a sfere circola perfusato che viene immesso nella colonna dalla pompa di mandata mantenendo il perfusato ossigenato e mantenendo un flusso di 8 mL/min. La pompa a sfere rimuove il perfusato efferente dal tubo NMR. G. Bilancia per pesare il perfusato dal tubo NMR per ottenere la portata del fegato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Iniezione di eparina. L'iniezione sottocutanea profonda di eparina viene somministrata nello strato inferiore di grasso addominale del topo. È importante quando si prende il mouse, tirare la pelle tesa per consentire all'ago di penetrare nella pelle con facilità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Iniezione di lidocaina. Il topo viene posto in posizione supina sulla piattaforma chirurgica con le zampe fissate verso il basso e il naso nel cono del naso. La lidocaina viene somministrata per via sottocutanea nella regione della cresta iliaca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Celiotomia e sutura. La celiotomia espone gli organi interni e un emostato tira la trazione attraverso il processo xifoide per aiutare ad aprire ulteriormente l'incisione. Due suture sono posizionate attorno alla vena porta, il catetere viene inserito e le suture sono legate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Tubo NMR. Il fegato rimosso dal corpo insieme al catetere che viene quindi attaccato al tubo di silicio attaccato alla colonna di vetro. Il fegato è appeso alla colonna e incapsulato dal tubo NMR. Un tubo NMR da 20 mm viene quindi accuratamente avvitato sulla colonna che incapsula il fegato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Consumo di ossigeno e portata. Dati rappresentativi derivanti dal confronto del consumo epatico di ossigeno e delle misurazioni della portata tra fegati alimentati e a digiuno. N = 3 e le barre di errore sono deviazione standard. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Eparina 1000 unità/mL | Salina 0,9% | Totale |
| 0,01 ml | 0,19 ml | 0,2 ml |
| Lidocaina 2% | Salina 0,9% | Totale |
| 0,2 ml | 0,6 ml | 0,8 ml |
Tabella 1. Eparina e lidocaina dose con soluzione salina. La tabella mostra la concentrazione di eparina e lidocaina e la dose di ciascun farmaco con soluzione salina.
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Discussion
Questa procedura chirurgica è impegnativa e richiede una pratica approfondita per ottenere risultati riproducibili. L'isoflurano e il gas di trasporto devono essere regolati secondo necessità per mantenere la vitalità dell'animale attraverso la maggior parte della procedura chirurgica possibile. L'ambiente, l'ora del giorno, l'età, il peso e molti altri fattori influenzeranno l'anestesia. Il peso, la dieta, il ceppo dei topi e l'età potrebbero influenzare la chirurgia poiché l'accumulo di grasso può interferire con la visualizzazione della vena porta. Quando si fissano le zampe, è necessario prestare attenzione a non applicare alcuna tensione sul collo che possa causare soffocamento. Inoltre, più il topo è grasso, più stretta sarà la sutura intorno al catetere per contrastare il diminuito coefficiente di attrito tra il catetere e la vena indotta dai lipidi. L'inizio del tempo di azione per l'eparina è essenziale in quanto l'eccessiva esposizione all'isoflurano produce artefatti negli organi17. La somministrazione di iniezioni di eparina e lidocaina richiede un ago 23G lungo 19,05 mm, assicurando nessun trauma agli organi interni durante l'iniezione. L'anello di sutura deve essere sopra il cono del catetere, o occluderà la vena quando stretto. Una volta inserito il catetere di solito c'è un riflusso di sangue fuori dal catetere dalla pressione, che è un segno positivo del corretto posizionamento. Il catetere può essere tirato verso l'alto per la conferma visiva che la punta del catetere è abbastanza lontana oltre la prima sutura. Arrotolare i polsi e le spalle assicurerà che la sutura non scivoli via dalla punta affusolata quando l'assistente lega la sutura. Quando si trasferisce il fegato dal tubo di perfusione in silicone alla colonna, una perla di perfusato viene lasciata sulla parte superiore del catetere. Il tallone perfusato impedirà a qualsiasi bolla d'aria di entrare nel catetere e di entrare nel fegato. Il menisco del perfusato sulla parte superiore del catetere fornisce un volume sufficiente per il fegato per funzionare fino a quando non è collegato. Per evitare la torsione del fegato e della vena porta, il tubo NMR viene lentamente avvitato. Inoltre, il sistema di perfusione utilizzato in questo esperimento non richiede una valvola di pressione. Le portate delle pompe sono mantenute in modo tale che la colonna di perfusioni di vetro contenga perfusato ad un'altezza di ~ 12 cm. Il fegato assorbe il tampone di Krebs per gravità, annullando qualsiasi differenza di pressione tra le due pompe senza alcun effetto sulla portata del fegato. Poiché il fegato viene perfuso attraverso la gravità, la quantità di perfusato assorbita dal fegato è impostata dalla naturale attività biologica del fegato. Non sono stati raccolti dati per la pressione di perfusione poiché la pressione della vena porta non è misurabile in questo sistema.
La prima incisione della celiotomia è poco profonda per creare un'apertura, e i tagli successivi sono più profondi per evitare di graffiare i lobi del fegato. La lunghezza complessiva dell'incisione per la celiotomia è di 3 cm per i topi di questa età e dimensione, ma cambierà in base allo sforzo, all'età e al peso. Sebbene lo studio descritto utilizzi topi di 9-13 settimane, i topi più vecchi o più giovani possono essere studiati così come i ratti. La dimensione del tubo NMR e del catetere della vena porta dovrebbe essere modificata in base alle dimensioni anatomiche del fegato e della vena porta per lo studio della preoccupazione. Se la vena porta non è diritta, un applicatore con punta di cotone può aiutare a manipolare la vena quando si inserisce il catetere. Sebbene il dotto biliare non venga rimosso, se vi è una necessità sperimentale per la sua assenza il dotto può essere rimosso con una pinzetta fine. L'eccessiva manipolazione della vena porta durante il posizionamento delle suture causerà la costrizione rendendo più difficile il posizionamento del catetere. Qualsiasi pelliccia che si attacca al fegato viene risciacquata con perfusato prima di premere il catetere sulla colonna e incapsularlo all'interno del tubo NMR. L'intervallo di tempo di 30 minuti per la perfusione può essere modificato da 20 minuti a 60 minuti, ma tutti i dati affidabili verranno raccolti dopo i 10 minuti iniziali di perfusione.
Un marker di successo della resezione del tessuto epatico è dopo la perfusione il fegato non ha deformità o altri problemi di integrità. È omogeneamente giallo pallido in tutto. Se il tessuto è stato ferito durante un intervento chirurgico come un nick avrebbe macchie giallo scuro intorno ad esso. Inoltre, se il fegato fosse danneggiato dalla perfusione, non si perfonderebbe. Se il tessuto sperimentasse una scarsa perfusione del tampone di Krebs, ci sarebbero striature giallo scuro in tutto l'organo a causa della fame che porta alla morte dei tessuti. Un altro metodo di monitoraggio della salute del fegato è il consumo di ossigeno epatico (Figura 6). È stato dimostrato che i fegati dei topi contengono quantità più elevate di lipidi e glicogeno ma hanno quantità di proteine totali simili, quindi ci si aspettava che il consumo di ossigeno epatico una volta normalizzato alla massa epatica avrebbe avuto un valore simile. Un terzo metodo sono i dati NMR dei dati in tempo reale del turnover metabolico.
Il limite principale del metodo è la chirurgia terminale stessa. C'è un costo sostanziale in topi, attrezzature, tempo e personale. Pertanto, è necessario prestare la massima attenzione durante l'esecuzione di queste procedure e la raccolta dei dati. La variazione biologica all'interno del modello murino può generare difficoltà in chirurgia. Inoltre, è imperativo evitare miglioramenti ottici. Non sono necessari miglioramenti ottici poiché tutta l'anatomia è visibile ad occhio nudo. I miglioramenti ottici aumentano il potenziale di errori in quanto il chirurgo e l'assistente hanno un campo visivo limitato, portando a soprammobili nel fegato o tensione involontaria sulla vena porta, causando un fallimento se il catetere si estrae. La corretta implementazione di questi metodi si tradurrà in > tasso di successo chirurgico del 95% nel topo C57BL / 6J. Un'altra limitazione da considerare è il periodo di 10 minuti necessario affinché il fegato raggiunga uno stato stazionario. Non è una limitazione per lo studio descritto qui, né in molti altri, ma per qualsiasi esperimento che giustifichi i 10 minuti iniziali di dati questo metodo non sarà sufficiente. La mancanza della complessa firma ormonale associata al metabolismo di tutto il corpo serve anche come limitazione, anche se glucagone, insulina, ecc., E qualsiasi combinazione di questi, possono essere aggiunti di nuovo al perfusato.
Ci sono diverse potenziali applicazioni future per questa tecnica. Man mano che vengono sviluppati più farmaci per il trattamento della NASH, i metodi standard per valutare il metabolismo energetico del fegato potrebbero trovare ampia applicazione. Poiché la NASH è fortemente associata al cancro al fegato, i modelli di questi tumori sono anche soggetti a studio.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto; o nella decisione di pubblicare i risultati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Una parte di questo lavoro è stata eseguita nel McKnight Brain Institute presso la National High Magnetic Field Laboratory's Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, che è supportata dal National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 e lo Stato della Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
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