Summary
Protokollen beskriver en enkel metode for reseksjon av en intakt muselever for metabolske studier gjennom portal veneperfusjon.
Abstract
Metabolske sykdommer som diabetes, pre-diabetes, alkoholfri fettleversykdom (NAFLD) og nonalcoholic steatohepatitis (NASH) blir stadig vanligere. Ex vivo leverperfusjoner tillater en omfattende analyse av levermetabolismen ved hjelp av kjernemagnetisk resonans (NMR), under ernæringsmessige forhold som kan kontrolleres nøye. Som i silico simuleringer forblir en primært teoretisk måte å vurdere hormon handlinger og effekten av farmasøytisk intervensjon, perfused leveren forblir en av de mest verdifulle test senger for å forstå lever metabolisme. Ettersom disse studiene veileder grunnleggende innsikt i leverfysiologi, må resultatene være nøyaktige og reproduserbare. Den største faktoren i reproduserbarheten av ex vivo leverperfusjon er kvaliteten på operasjonen. Derfor har vi introdusert en organisert og strømlinjeformet metode for å utføre ex vivo mus leverperfusjoner i sammenheng med in situ NMR-eksperimenter. Vi beskriver også en unik søknad og diskuterer vanlige problemstillinger i disse studiene. Det overordnede formålet er å gi en ukomplisert guide til en teknikk vi har raffinert over flere år som vi anser som den gylne standarden for å oppnå reproduserbare resultater i leverreksjoner og perfusjoner i sammenheng med in situ NMR-eksperimenter. Avstanden til midten av feltet for magneten samt utilgjengeligheten av vevet til intervensjon under NMR-eksperimentet gjør metodene våre nye.
Introduction
Ex vivo perfusjoner er avgjørende i studiet av levermetabolisme, og perfusjon gjennom portalvenen er standarden for disse studiene. For å studere levermetabolisme isolert, må leveren resected fra kroppen for å unngå komplikasjoner som oppstår fra metabolisme i andre organer (dvs. hele kroppen metabolisme) og å utøve kontroll over hormon tilgjengelighet (insulin, glukagon, etc.). Denne tilnærmingen kan være avgjørende for å forstå effekten av sykdommer som diabetes, NAFLD og NASH på levermetabolisme samt mekanismer for narkotikavirkning. Denne artikkelen fungerer som en guide til leveropprør og perfusjon. Vi har utviklet en strømlinjeformet prosedyre for å utføre disse metabolske leverstudiene med tilstrekkelig strenghet og reproduserbarhet. Hvis operasjonen ikke utføres riktig, er det uttalt variasjon i de metabolske dataene som er oppnådd. Vi beskriver en organisert metode for å utføre portal vene kateterisering og lever reseksjon i sammenheng med metabolske studier in situ i en kjernemagnetisk resonans (NMR) spektrometer, som beskrevet i litteraturen 1,2,3,4,5.
For tiden er det ingen litteratur som beskriver en eks vivo leverperfusjon ved hjelp av en glasssøyle i en NMR. Det er heller ikke en video- eller tekstpublikasjon som gir et klart eksempel på hvordan du utfører prosedyren med muselever, spesielt å demonstrere hvordan man kateteriserer portalvenen, resect en lever, overføre og henge leveren på en glasskolonne. Siden den genetisk modifiserte musen allestedsnærværende brukes til å studere levermetabolisme, er dette en viktig prosedyre som fortjener en fullstendig beskrivelse. Leverperfusjonsoperasjoner er ikke nye, men denne artikkelen er en gullstandardmetode ledsaget av en video som demonstrerer den tekniske fortreffeligheten som er beskrevet i dette dokumentet for å hjelpe alle som er interessert i denne prosedyren. Metoden som presenteres her vil best brukes på sanntidsmetabolisme for å oppdage funksjonen og omsetningen av metabolitter i sykdomsmodeller.
Denne metoden bruker en 100 cm vannjakket glasskolonne, som gjør at leveren kan henge på bunnen av kanylen innkapslet ved å perfusere inne i et NMR-rør. Oppvarmet vann i glassjakken brukes til å kontrollere perfusattemperatur. En tynn lag oksygenator er trykksatt med 95%/5% O2/CO2 for pH-kontroll. Ved å bruke tre separate pumper, er den perfusate kolonnehøyden satt, noe som gir konstant trykk til leveren. Strømningshastighetene styres ikke utover påføringen av konstant trykk (figur 1). For å bekrefte at leveren fungerer riktig, tas oksygenmålinger sammen med strømningshastigheter. I våre hender fører dette settet med forutsetninger til svært repeterbare NMR-eksperimenter for vurdering av levermetabolismens funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter med mus ble håndtert i samsvar med University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer #201909320). Musestammen som ble brukt var C57BL/6J; alle mus var menn. Denne metoden gjelder generelt for studier som også bruker andre standard musestammer. Denne operasjonen utføres optimalt av to personer som jobber sammen.
1. Første oppsett
- Perfuse lever med perfusat som inneholder Krebs-Henseleit elektrolytter6 (25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM hver av MgSO4, KH2PO4 og 0,5 mM natrium-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM natriumlaktat, 0,6 mM natriumpyuvatt, 0,2 mM [U-13C] natriumpropionat, 10% (v/v) D2O, O og 0,63 mM blandede fettsyrer (som inneholder palmesyre (22,1% av total), palmitoleinsyre (5,2%), stearinsyre (2,7 %), oljesyre (27 %), linolsyre (37,7 %), γ linolensyre (2,4 %), og decosahexanoic acid (2,8 %)) sammen med 2 % (w/v) bovint serumalbumin. Sett endelig pH perfusate til 7.3 ved hjelp av HCl (og NaOH, om nødvendig).
2. Oppsett før operasjonen
- Monter to 1 ml sprøyter med en 23G nål som er 19,05 mm lang. Fyll en sprøyte med 0,01 ml 1000 enheter/ml heparin og 0,19 ml saltvann (0,9 % (w/v) NaCl i vann; Tabell 1).
- Fyll den andre sprøyten med 0,2 ml 2 % lidokain og 0,6 ml 0,9 % saltvann (tabell 1). I en annen 1 ml sprøyte med en 27 G 38,1 mm nål, fyll med perfusate og vedlikehold ved 37 °C.
3. Perfusate kolonneoppsett
- Sett glassflasken som inneholder 500 ml perfusat, i vannbadet (figur 1B). Slå på vannbadet og sett temperaturen på ~42 °C. Den høyere temperaturen i vannbadet gjør det mulig å opprettholde 37 °C i perfusjonskolonnen.
- Når vannet varmes opp til 42 °C, slår du på de to pumpene for å sirkulere perfusatet fra flasken gjennom den tynne filmoksygenatoren og den vannjakkede 100 cm glasskolonnen (figur 1A-E).
- Slå på oksygengivende gass (95 % oksygen og 5 % karbondioksid) for å trykke oksygenatoren7 (figur 1C). Juster perfusate kolonnehøyden for å oppnå en strømningshastighet på 8 ml/min med kateteret festet (se trinn 9 for strømningshastighetsmåling)5,8,9.
MERK: Strømningshastigheten refererer til hvor raskt perfusat blir utvist av leveren.
4. Bedøvelse av musen
- Don PPE som kreves av IACUC-protokollen og andre passende sikkerhetsretningslinjer.
MERK: Følgende trinn er optimalisert for mus som er 9-13 uker gamle. - Plasser musen i isoflurankammeret. Snu leveringsgassen til 100 % oksygen, en strømningshastighet på 1 L/min og isofluranen til 2 %10. Vent til pusten bremser og er stabil.
MERK: For at musen skal nå et stabilt kirurgisk plan, som det fremgår av en langsom og jevn åndedrettsfrekvens og mangel på tåklemmerefleks, kan oksygenstrømmen justeres til ~ 1,5 l / min til ~ 3 l / min og isoflurankonsentrasjonen fra 1 - 3%. Leveringshastigheten for bærergass og isoflurankonsentrasjon avhenger av dyrets alder og vekt og faktorer som støy og lys. - Desinfiser magen med 70% alkohol. Administrer heparin gjennom en dyp subkutan injeksjon i magefettlaget (figur 2). Plasser musen tilbake i anestesikammeret i 10 min.
MERK: Barbering er ikke nødvendig, da denne prosedyren er terminal.
5. Celiotomy
- Overfør musen fra anestesikammeret til operasjonsplattformen og plasser den i liggende stilling (figur 3).
- Plasser musens nese i en nesekjegle og tape potene ned. Pass på at du ikke påfører noen belastning på nakken som kan føre til kvelning.
- Administrer lidokain gjennom en subkutan injeksjon bilateralt i den fremre iliac crest-regionen11 (figur 3). Utfør en tåklemmetest for å bekrefte fraværet av alle smerte reflekser.
- Utfør celiotomi for å eksponere indre organer (figur 4). Lag et 3 cm bredt snitt (bredden på hele magen på musen).
MERK: Bredden endres med musens alder og kosthold. - Utvid snittet ved å bruke en hemostat som trekker trekkraft ved å klemme på xiphoidprosessen (figur 4).
6. Kannulation av portal vene
- Bruk en bomullsspisset applikator for å fjerne tynn- og tykktarmen som dekker portalvenen. Plasser en silke sutur under buen på portalvenen proksimal til leveren (figur 4A).
- Avhengig av den anatomiske strukturen, plasser den andre silke sutur proksimal eller distal av den dårligere mesenteriske venen distal fra leveren (Figur 4A)12,13. Bruk en 2-0 sutur for begge suturene.
- Når suturene er på plass, kanyler portalvenen med et 22G-kateter14 (figur 4B). Når du setter inn kateteret, må du holde skråkanten spiss. Angi portalvenen i ikke mer enn 15° vinkel.
- Bind den første suturen forbi kateterets tapper. Etter at portalvenen er kanylert, forankrer du kateteret 2-3 mm distalt fra grenen av portalvenen med silke suturen (figur 4B).
MERK: Assistenten skal rulle skuldre og håndledd for å unngå å løsne kateteret eller rive portalvenen. Hver sutur krever to knuter. - Deretter fester du den nedre delen av kateteret med den andre suturen. Ved hjelp av den kirurgiske assistenten, knytte en knute med suturen for å sikre kateteret til den distale delen av portalvenen og det omkringliggende vevet.
7. Reseksjon av lever post portal vene kannulation
- Når kateteret er sikret, setter du inn en 1 ml sprøyte med en 27 G kanyle som er 38,1 mm lang inn i kateteret for å skylle blod og luftbobler.
MERK: Det er vanligvis en tilbakestrømning av blod ut av kateteret fra trykket. - Bruk et silikonrør på 1 mm I.D. x 5 mm O.D. med en fast stoppekran for å koble perfusjonskolonnen (figur 1A) til kateteret slik at bufferstrømmen inn i leveren markerer starten på perfusjonen. Start en tidtaker på dette tidspunktet for å markere starten på perfusjonen.
- Lindre økt vaskulært trykk ved å lage et snitt, ved hjelp av saks, inn i den dårligere vena cava.
- Bekreft strømmen av perfusat gjennom leveren ved å observere den homogene endringen i leverfarge fra rosa / rød til en blekgul. Når strømmen er bekreftet, utskiller magen, tynntarmen, tykktarmen og høyre nyre fra omkringliggende vev.
- Ved hjelp av den kirurgiske assistenten, manøvrer leveren rundt buken og thoracic hulrommet som kirurgen kutter gjennom parietal peritoneum og thoracic vev for å resect leveren
- Til slutt løfter du leveren oppover og kutter de resterende bindevevene som holder leveren på plass med saks. Manipuler leveren sakte for enkel visning. Fjern eventuell pels som fester seg til leveren ved å skylle av med perfusat før du innkapsler den i NMR-røret.
MERK: I denne prosedyren fjernes bare leveren. Alle andre organer er igjen i dyrets kropp. Gallekanalen kan fjernes basert på eksperimentets protokoll. Selv om det for dette eksperimentet ble igjen på plass.
8. Hengende leveren fra kolonnen
- Når kirurgen gir leveren og slangen til assistenten, kobler assistenten slangen fra kateteret og kolonnen.
- Fyll kateteret med perfusat til en menisk dannes på toppen av kateteret. Fest kateteret til kolonnen slik at leveren henger og parfymerer.
MERK: Perfusatperleraden på kateteret gir tilstrekkelig volum til at leveren fungerer til den er tilkoblet. Kateteret festet til leveren er presset montert på bunnen av kolonnen. - Skru et 20 mm NMR-rør på den 100 cm lange glasssøylen for å innkapsle leveren (figur 5). For å unngå torsjon av leveren og portalvenen, skru sakte på NMR-røret. Hvis torsjon oppstår og strømmen stoppes, skru av og skru av NMR-røret på nytt. Dette vil rette opp okklusjonen og strømmen vil komme tilbake.
- Perfuse leveren i 30-60 min basert på detaljene i studien.
MERK: Tiden er basert på perfusjonseksperimentet. For dette eksperimentet ble metabolsk omsetning målt innen 30 min. Leverperfusjonen kan ta opptil 10 minutter å nå en jevn tilstand. Tiden til steady-state starter når den dårligere vena cava er kuttet og leverstrømmen er etablert.
9. Strømningsmåling
- Plasser en veiebåt på en topplastebalanse og null balansen. Plasser slangen fra rullepumpen som trekker sprudlende perfusate fra NMR inn i veiebåten og start timeren.
- Vei massen av væske akkumulert over 1 min som gir leverens strømningshastighet. Sett røret tilbake i avfalls-/oppsamlingsbeholderen.
10. Oksygenmåling
MERK: Oksygenmålermålinger ble satt opp i henhold til produsentensanvisninger 15.
- Plasser elektroden som inneholder 20 μL 50% KCl mettet oppløsning på platinakuppelen og legg fem 10 μL dråper rundt elektrodens nedre platinaring.
- Fjern limet av sigarettpapiret. Legg et stykke polytetrafluoretylenmembran over sigarettpapiret.
- Plasser de to delene på toppen av elektroden. Monter en liten O-ring rundt toppen av elektroden. Trim papiret for å legge det flatt på den nedre platinaringen på elektroden.
MERK: Noe overheng er akseptabelt. Det er viktig å dekke elektrodens sølv. - Plasser den større O-ringen på elektroden. Koble elektroden til vannkammeret og stram basen for å holde elektroden på plass. Slå på vannbadet og la det varme opp til 37 °C.
- Programvare for åpen oksygenmåler. Klikk på Kalibrer > luftmettet vann. Sett rørehastigheten til 75 og temperaturen til 37 °C.
- Fyll et 50 ml hetteglass halvveis med vann og rist kraftig i 2 min. Dette er luftmettet vann, bruk det som 100% standard. Fyll oksygenmålerkammeret med ~2 ml vann og sett på todelt proppen.
- Klikk ok på skjermen og la signalet platå. Når signalet har nådd et platå, klikker du OK. Kast væske i kammeret og tørk med silkepapir.
- Gjenta trinn 10,6-10,7, men med 200 mM natriumsulfitt (0% standard). Klikk på Lagre kalibrering.
MERK: Ingen kraftig risting er nødvendig for 0% standarden. - Under perfusjon, bruk to 5 ml sprøyter. En sprøyte for sirkulerende perfusat (oksygen inn) og den andre for sprudlende perfusat fra NMR-røret (oksygen ut).
- Når du utarbeider perfusat for både inn- og utmålinger, tegner du 3-4 ml hver gang.
MERK: Denne kolonnen har glassrør for å gi tilgang til NMR-røret for å trekke ut perfusatet som har strømmet gjennom leveren. - Mål det sirkulerende perfusatet, først som vann i trinn 10.6 og kast i trinn 10.7. Gjenta de samme trinnene for det sprudlende perfusatet.
- Utfør oksygenmålinger hvert 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leverfunksjonen vurderes primært av oksygenforbruk og strømningshastighet. En strømningshastighet på 4-8 ml / min og oksygenforbruk på 1 μmol / min.g er typisk. Disse tiltakene vil variere avhengig av spesifikke eksperimentelle forhold og biologiske forskjeller.
Den nøyaktige mengden isofluran som brukes vil avhenge av hvilken type anestesisystem som brukes, samt miljøet og musens alder / vekt. Under operasjonen endres ikke isofluran- og leveringsgassen, selv om noen endringer kan være nødvendige avhengig av spesifikasjonene til det kirurgiske området (f.eks. bakgrunnsstøy)10. Når heparin injiseres dypt subkutant, kan utbruddet av handlingen bli forsinket med opptil 20-40 min. En 10 min ventetid post heparin administrasjon sikrer utbruddet av handling16. Lidokain har en 2 min utbrudd av handling11.
Når du setter inn kateteret, må du holde skråkanten pekende opp og gå inn i ikke mer enn 15° vinkel fra portalvenen. Begge suturene har to knop. Den første suturen må bindes forbi kateteret. Hvis kannasjonen av portalvenen er vellykket, blekes leveren fra flushen. Når kirurgen resecting leveren, assistenten rydder resected innholdet med en bomull-tipped applikator. For å forhindre kontaminering av leveren og forhindre hakk til lobes, ikke kutt gjennom magen. Ikke påfør for mye spenning på portalvenen eller leveren når du holder kateteret for å forhindre illodging eller riving av portalvenen.
Oppsettet av perfusjonsmaskinvaren krever stor oppmerksomhet på detaljer (figur 1). Heparininjeksjoner (figur 2) er avgjørende for eksperimentet. Hvis blod koagulerer, vil det okkludere kateteret som settes inn i portalvenen, og forhindrer strømning. Lidokaininjeksjonen (figur 3) skal bidra til å desensibilisere området for smertelindring. Tabell 1 gir et enkelt doseringskart for heparin og lidokain med saltvann. Celiotomy og suturing (figur 4) er avgjørende for en vellykket portal vene kateterisering, lever reseksjon, og vellykket overføring til perfusjon riggen. Strømningshastighet og oksygenforbruksmålinger er avgjørende for å overvåke leverens helse og funksjon (figur 6). Det er ofte en liten forskjell i O2-forbruket mellom matet og fastet lever, som vi tilskriver økte energibehov pålagt av glukoneogenese i fastende leveren.
Figur 1. Perfusjonskolonne og pumper. En. En 100 cm vannjakket glasskolonne der leveren henger på bunnen. B. Vannpumpen sirkulerer vann gjennom glasssøylen og oppvarmer perfusatet. C. Oksygenator i tynt lag i glass er trykksatt med 95% / 5% O2 / CO2 oksygenering av perfusatet. D. Den kulebærende pumpen sirkulerer perfusate fra vannbadet inn i det tynne laget oksygenator og glasssøylen. E. Den kulebærende pumpen sirkulerer perfusat som leveres inn i kolonnen fra leveringspumpen og holder perfusat oksygenert og opprettholder en strøm på 8 ml / min. F. F. Kulelagerpumpen fjerner sprudlende perfusat fra NMR-røret. G. Veievekt for å veie perfusat fra NMR-rør for å oppnå strømningshastighet i leveren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Heparin injeksjon. Dyp subkutan injeksjon av heparin er gitt i det nedre abdominale fettlaget av musen. Det er viktig når du plukker opp musen, for å trekke huden stramt slik at nålen enkelt kan trenge inn i huden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Lidokain injeksjon. Musen er plassert i liggende stilling på den kirurgiske plattformen med potene teipet ned og nesen i nesekjeglen. Lidokain administreres subkutant i iliac crest-regionen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Celiotomi og sutur. Celiotomy avslører de indre organene, og en hemostat trekker trekkraft gjennom xiphoid-prosessen for å bidra til å åpne snittet ytterligere. To suturer er plassert rundt portalvenen, kateteret settes inn, og suturene er bundet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. NMR-rør. Leveren fjernet fra kroppen sammen med kateteret som deretter festes til silisiumslangen festet til glasskolonnen. Leveren er hengt fra kolonnen og innkapslet av NMR-røret. Et 20 mm NMR-rør skrus deretter forsiktig fast på søylen som innkapsler leveren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6. Oksygenforbruk og strømningshastighet. Representative data fra sammenligning av leveroksygenforbruk og strømningshastighetsmålinger mellom matet og fastet lever. N = 3 og feilfelt er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Heparin 1000 enheter/ml | Saltvann 0,9 % | Total |
| 0,01 ml | 0,19 ml | 0,2 ml |
| Lidokain 2% | Saltvann 0,9 % | Total |
| 0,2 ml | 0,6 ml | 0,8 ml |
Tabell 1. Heparin- og lidokaindose med saltvann. Tabellen viser konsentrasjonen av heparin og lidokain og dosen av hvert legemiddel med saltvann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne kirurgiske prosedyren er utfordrende og krever omfattende praksis for å oppnå reproduserbare resultater. Isofluran og bærergass bør justeres etter behov for å opprettholde dyrets levedyktighet gjennom så mye av den kirurgiske prosedyren som mulig. Miljø, tid på dagen, alder, vekt og flere andre faktorer vil påvirke anestesi. Vekt, kosthold, stamme av mus og alder kan påvirke kirurgi som fett oppbygging kan forstyrre visualisering portalen venen. Ved taping av potene ned, må det tas hensyn til ikke å påføre noen belastning på nakken som kan føre til kvelning. Videre, jo fetere musen jo strammere suturen må være rundt kateteret for å motvirke den reduserte friksjonskoeffisienten mellom kateteret og venen indusert av lipidene. Utbruddet av virkningstid for heparin er avgjørende da overdreven eksponering for isofluran produserer artefakter i organ17. Administrering av heparin- og lidokainininjeksjoner krever en 23G nål 19,05 mm lengde, noe som sikrer ingen traumer for indre organer under injeksjonen. Suturløkken må være over kateterets kon, ellers vil den okkludere venen når den strammes. Når kateteret er satt inn, er det vanligvis en tilbakestrømning av blod ut av kateteret fra trykket, noe som er et positivt tegn på riktig plassering. Kateteret kan trekkes oppover for visuell bekreftelse på at kateterspissen er langt nok forbi den første suturen. Hvis du ruller håndleddene og skuldrene, sikrer du at suturen ikke glir av den koniske spissen når assistenten binder suturen. Ved overføring av leveren fra silikonperfusjonsslangen til kolonnen blir en perfusatperle igjen på toppen av kateteret. Den perfusate perle vil forhindre at noen luftbobler kommer inn i kateteret og går inn i leveren. Menisken av perfusat på toppen av kateteret gir tilstrekkelig volum for leveren til å fungere til den er tilkoblet. For å unngå torsjon av leveren og portalvenen, er NMR-røret sakte skrudd på. I tillegg krever perfusjonssystemet som brukes i dette eksperimentet ikke en trykkventil. Pumpens strømningshastigheter opprettholdes slik at glassperfusjonskolonnen inneholder perfusat i en høyde på ~ 12 cm. Leveren tar opp Krebs buffer ved tyngdekraften, og negerer eventuelle trykkforskjeller mellom de to pumpene uten effekt på leverens strømningshastighet. Siden leveren er parfymert gjennom tyngdekraften, er mengden perfusat tatt opp av leveren satt av leverens naturlige biologiske aktivitet. Ingen data ble samlet inn for perfusjonstrykk, da portalvenetrykket ikke er målbart i dette systemet.
Det første snittet av celiotomy er grunt for å skape en åpning, og påfølgende kutt er dypere for å unngå å nicking leverens lober. Den totale lengden på snittet for celiotomy er 3 cm for mus i denne alderen og størrelsen, men vil endres basert på belastning, alder og vekt. Selv om studien som er beskrevet, bruker mus 9-13 uker gamle, eldre eller yngre mus kan studeres så vel som rotter. Størrelsen på NMR-røret og portalveneteret må endres basert på den anatomiske størrelsen på leveren og portalvenen for å studere bekymring. Hvis portalvenen ikke er rett, kan en bomullsspisset applikator hjelpe til med å manipulere venen når du setter inn kateteret. Selv om gallekanalen ikke fjernes, kan kanalen fjernes med fine pinsett hvis det er et eksperimentelt behov for fravær. Overdreven manipulering av portalvenen ved plassering av suturer vil føre til innsnevring som gjør katetereplasseringen vanskeligere. Eventuell pels som fester seg til leveren skylles av med perfusat før du trykker på å montere kateteret i kolonnen og innkapsle det i NMR-røret. Tidsrammen på 30 min for perfusjon kan endres fra 20 min til 60 min, men alle pålitelige data vil bli samlet inn etter de første 10 min perfusjon.
En markør for vellykket levervevsreseksjon er etter perfusjonen leveren har ingen deformiteter eller andre integritetsproblemer. Det er homogent blekgult hele veien. Hvis vevet ble skadet under operasjonen, for eksempel en nick, ville det ha mørkegule flekker rundt seg. Også, hvis leveren ble skadet fra perfusjonen, ville den ikke parfyme. Hvis vevet opplevde dårlig perfusjon av Krebs-bufferen, ville det være mørkegule striper over hele orgelet som følge av sult som førte til vevsdød. En annen metode for å overvåke leverhelsen er oksygenforbruket i leveren (figur 6). Det har vist seg at muslever inneholder høyere lipid- og glykogenmengder, men har lignende totale proteinmengder, så det var forventet at leveroksygenforbruket når det normaliseres til levermasse ville ha en lignende verdi. En tredje metode er NMR-dataene for sanntidsdata om metabolsk omsetning.
Metodens hovedbegrensning er selve terminalkirurgien. Det er en betydelig kostnad hos mus, utstyr, tid og personell. Derfor må ytterste forsiktighet utvises når du utfører disse prosedyrene og samler inn data. Biologisk variasjon i musemodellen kan generere vanskeligheter med kirurgi. Videre er det viktig å unngå optiske forbedringer. Ingen optiske forbedringer er nødvendig, da all anatomi er synlig for det blotte øye. Optiske forbedringer øker potensialet for feil som oppstår som kirurgen og assistenten har et begrenset synsfelt, noe som fører til knicks i leveren eller utilsiktet spenning på portalvenen, forårsaker en feil hvis kateteret trekker ut. Riktig implementering av disse metodene vil resultere i > 95% kirurgi suksessrate i C57BL / 6J musen. En annen begrensning å vurdere er 10 min-perioden som kreves for at leveren skal nå en jevn tilstand. Det er ikke en begrensning for studien som er beskrevet her, heller ikke i mange andre, men for et eksperiment som garanterer de første 10 min med data, vil denne metoden ikke være tilstrekkelig. Mangelen på den komplekse hormonelle signaturen forbundet med hele kroppen metabolisme fungerer også som en begrensning, selv om glukagon, insulin, etc., og enhver kombinasjon derav, kan legges tilbake til perfusate.
Det er flere potensielle fremtidige applikasjoner for denne teknikken. Etter hvert som flere legemidler utvikles for behandling av NASH, kan standardmetoder for å vurdere leverenergimetabolisme finne bred anvendelse. Siden NASH er sterkt forbundet med leverkreft, er modeller av disse kreftformene også gjenstand for studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen av studien; i innsamling, analyser eller tolkning av data; i skrivingen av manuskriptet; eller i beslutningen om å publisere resultatene.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). En del av dette arbeidet ble utført i McKnight Brain Institute ved National High Magnetic Field Laboratorys Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, som støttes av National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 og delstaten Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
