Summary
O protocolo descreve um método simples de ressecção de um fígado de rato intacto para estudos metabólicos através da perfusão venosa portal.
Abstract
Doenças metabólicas como diabetes, pré-diabetes, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e esteatohepatite não alcoólica (NASH) estão se tornando cada vez mais comuns. Perfusões hepáticas ex vivo permitem uma análise abrangente do metabolismo hepático usando ressonância magnética nuclear (RMN), em condições nutricionais que podem ser rigorosamente controladas. Como nas simulações de silico permanecem um meio principalmente teórico de avaliar as ações hormonais e os efeitos da intervenção farmacêutica, o fígado perfumado continua sendo um dos leitos de teste mais valiosos para a compreensão do metabolismo hepático. Como esses estudos orientam insights básicos sobre fisiologia hepática, os resultados devem ser precisos e reprodutíveis. O maior fator na reprodutibilidade da perfusão hepática ex vivo é a qualidade da cirurgia. Por isso, introduzimos um método organizado e simplificado para realizar perfusões de fígado de camundongos ex vivo no contexto de experimentos in situ NMR. Descrevemos também uma aplicação única e discutimos questões comuns encontradas nesses estudos. O objetivo geral é fornecer um guia descomplicado para uma técnica que refinamos ao longo de vários anos que consideramos o padrão dourado para obter resultados reprodutíveis em ressecções hepáticas e perfusões no contexto de experimentos in situ NMR. A distância até o centro do campo para o ímã, bem como a inacessibilidade do tecido à intervenção durante o experimento NMR torna nossos métodos novos.
Introduction
Perfusões ex vivo são cruciais no estudo do metabolismo hepático, e a perfusão pela veia portal é o padrão para esses estudos. Para estudar o metabolismo hepático isoladamente, o fígado deve ser ressecado do corpo para evitar complicações decorrentes do metabolismo em outros órgãos (ou seja, metabolismo do corpo inteiro) e exercer controle sobre a disponibilidade hormonal (insulina, glucagon, etc.). Essa abordagem pode ser essencial para entender os efeitos de doenças como diabetes, NAFLD e NASH no metabolismo hepático, bem como mecanismos de ação medicamentosa. Este artigo serve como um guia para ressecção hepática e perfusão. Desenvolvemos um procedimento simplificado para realizar esses estudos hepáticos metabólicos com rigor e reprodutibilidade suficientes. Se a cirurgia não for realizada corretamente, há variabilidade pronunciada nos dados metabólicos obtidos. Descrevemos um método organizado para realizar cateterismo venoso portal e ressecção hepática no contexto de estudos metabólicos in situ em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN), conforme descrito na literatura 1,2,3,4,5.
Atualmente, não há literatura descrevendo uma perfusão ex vivo hepática usando uma coluna de vidro dentro de uma RMN. Também não há uma publicação de vídeo ou texto que forneça um exemplo claro de como realizar o procedimento com o fígado do rato, especificamente, demonstrando como cateterizar a veia do portal, ressecar um fígado, transferir e pendurar o fígado em uma coluna de vidro. Como o camundongo geneticamente modificado é onipresentemente usado para estudar o metabolismo hepático, este é um procedimento essencial que merece uma descrição completa. As cirurgias de perfusão hepática não são novas, mas este artigo é um método padrão-ouro acompanhado de um vídeo demonstrando a excelência técnica descrita neste artigo para ajudar todos os interessados neste procedimento. O método aqui apresentado seria melhor aplicado ao metabolismo em tempo real para detectar a função e a rotatividade de metabólitos em modelos de doenças.
Este método usa uma coluna de vidro de 100 cm com jaqueta de água, que permite que o fígado fique pendurado na parte inferior da cânula encapsulada por perfusato dentro de um tubo NMR. A água aquecida na jaqueta de vidro é usada para controlar a temperatura perfusada. Um oxigenador de camada fina é pressurizado com 95%/5% O2/CO2 para controle de pH. Usando três bombas separadas, a altura da coluna perfusada é definida, o que proporciona pressão constante ao fígado. As taxas de fluxo não são controladas além da aplicação de pressão constante (Figura 1). Para confirmar que o fígado está funcionando adequadamente, as medidas de oxigênio são tomadas juntamente com as taxas de fluxo. Em nossas mãos, este conjunto de pré-condições leva a experimentos de RMN altamente repetitivos para a avaliação da função metabólica hepática.
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Protocol
Experimentos envolvendo camundongos foram tratados em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida (número de protocolo #201909320). A cepa do mouse utilizada foi C57BL/6J; todos os ratos eram machos. Este método é geralmente aplicável para estudos usando outras cepas de rato padrão também. Esta cirurgia é realizada de forma ideal por dois indivíduos que trabalham juntos.
1. Configuração inicial
- Fígados perfusos com perfusato contendo eletrólitos Krebs-Henseleit6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM cada um de MgSO4, KH2PO4, e 0,5 mM de sódio-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM de lactato de sódio, 0,6 mM piruvato de sódio, 0,2 mM [U-13C] propionato de sódio, 10% (v/v) D2O, e ácidos graxos mistos de 0,63 mM (contendo ácido palmítico (22,1% do total), ácido palmitoleico (5,2%), ácido esteárico (2,7%), ácido oleico (27%), ácido linoleico (37,7%), ácido γ-linolenic (2,4%) e ácido decosahexanoico (2,8%)) juntamente com 2% (w/v) albumina de soro bovino. Defina o pH final de perfusato para 7,3 usando HCl (e NaOH, se necessário).
2. Configuração pré-cirurgia
- Monte duas seringas de 1 mL com uma agulha 23G de 19,05 mm de comprimento. Encha uma seringa com 0,01 mL de heparina de 1000 unidades/mL e 0,19 mL de soro fisiológico (0,9% (w/v) NaCl na água; Tabela 1).
- Encha a segunda seringa com 0,2 mL de lidocaína de 2% e 0,6 mL de soro fisiológico (Tabela 1). Em outra seringa de 1 mL com agulha de 27 G 38,1 mm, encha com o perfusado e mantenha a 37 °C.
3. Configuração da coluna perfusate
- Coloque a garrafa de vidro contendo 500 mL de perfusato no banho de água (Figura 1B). Ligue o banho de água e afina a temperatura para ~42 °C. A temperatura mais alta no banho de água permite manter 37 °C na coluna de perfusão.
- Uma vez que a água aqueça até 42 °C, ligue as duas bombas para circular o perfusato da garrafa ao longo do oxigenador de filme fino e da coluna de vidro de 100 cm coberta de água (Figura 1A-E).
- Ligue o gás oxigenante (95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono) para pressurizar o oxigenador7 (Figura 1C). Ajuste a altura da coluna perfusa para atingir uma taxa de fluxo de 8 mL/min com o cateter ligado (ver etapa 9 para medição da taxa de fluxo)5,8,9.
NOTA: A taxa de fluxo refere-se à taxa em que o perfusato está sendo expelido pelo fígado.
4. Anesthetização do mouse
- Don PPE conforme exigido pelo protocolo IACUC e outras diretrizes de segurança apropriadas.
NOTA: As seguintes etapas foram otimizadas para ratos com idades entre 9 e 13 semanas. - Coloque o rato na câmara isoflurane. Transforme o gás de entrega em 100% oxigênio, uma taxa de fluxo de 1 L/min, e o isoflurane para 2%10. Espere até que a respiração desacelere e esteja estável.
NOTA: Para que o camundongo atinja um plano cirúrgico estável, como evidenciado por uma taxa respiratória lenta e constante e falta de reflexo de beliscão do dedo do pé, a taxa de fluxo de oxigênio pode ser ajustada para ~1,5 L/min a ~3 L/min e a concentração de isoflurane de 1 a 3%. A taxa de entrega de gás transportador e concentração de isoflurane depende da idade e peso do animal e fatores como ruído e luz. - Desinfete o abdômen com 70% de álcool. Administre a heparina através de uma injeção subcutânea profunda na camada de gordura abdominal (Figura 2). Coloque o rato de volta na câmara de anestesia por 10 minutos.
NOTA: A depilação não é necessária, pois este procedimento é terminal.
5. Céliotomia
- Transfira o rato da câmara de anestesia para a plataforma de cirurgia e coloque-o na posição supina (Figura 3).
- Coloque o nariz do mouse em um cone de nariz e tape as patas para baixo. Tome cuidado para não aplicar qualquer tensão no pescoço que possa levar a sufocamento.
- Administrar lidocaína através de uma injeção subcutânea bilateralmente na região da crista ilíaca anterior11 (Figura 3). Realize um teste de beliscar o dedo do pé para confirmar a ausência de todos os reflexos da dor.
- Realizar céliotomia para expor os órgãos internos (Figura 4). Faça uma incisão de 3 cm de largura (a largura de todo o abdômen do mouse).
NOTA: A largura mudará com a idade e a dieta do mouse. - Expanda a incisão usando um hemostat que puxa a tração apertando o processo xifoide (Figura 4).
6. Cannulação da veia portal
- Use um aplicador de ponta de algodão para limpar os intestinos pequenos e grandes que cobrem a veia portal. Posicione uma sutura de seda sob o arco da veia portal proximal ao fígado (Figura 4A).
- Dependendo da estrutura anatômica, coloque a segunda sutura de seda proximal ou distal da veia mesentérica inferior distal do fígado (Figura 4A)12,13. Use uma sutura 2-0 para ambas as suturas.
- Uma vez que as suturas estejam no lugar, cannulate a veia portal com um cateter 22G14 (Figura 4B). Ao inserir o cateter, mantenha o bisel apontado para cima. Digite a veia do portal em não mais do que um ângulo de 15°.
- Amarre a primeira sutura após o batedor do cateter. Após a veia do portal ser cânulada, ancorra o cateter 2-3 mm distal do ramo da veia portal com a sutura de seda (Figura 4B).
NOTA: O assistente deve rolar ombros e pulsos para evitar desalojar o cateter ou rasgar a veia do portal. Cada sutura requer dois nós. - Em seguida, fixe a porção inferior do cateter com a segunda sutura. Com a ajuda do assistente cirúrgico, amarre um nó com a sutura para fixar o cateter à porção distal da veia portal e do tecido circundante.
7. Ressecção da cannulação venosa do porta-cabeça do porta-fígado
- Depois que o cateter estiver preso, insira uma seringa de 1 mL com uma agulha 27G que tem 38,1 mm de comprimento no cateter para lavar sangue e bolhas de ar.
NOTA: Geralmente há um fluxo de sangue fora do cateter da pressão. - Use um tubo de silicone O.D. de 1 mm x 5 mm com uma torneira fixa para acoplar a coluna de perfusão (Figura 1A) ao cateter permitindo o fluxo do tampão para o fígado marcando o início da perfusão. Inicie um temporizador neste momento para marcar o início da perfusão.
- Alivie o aumento da pressão vascular fazendo uma incisão, usando uma tesoura, na veia cava inferior.
- Confirme o fluxo de perfusato através do fígado observando a mudança homogênea na cor do fígado de rosa/vermelho para um amarelo pálido. Uma vez confirmado o fluxo, extir nosso estômago, intestino delgado, intestino grosso e o rim direito do tecido circundante.
- Com a ajuda do assistente cirúrgico, manole o fígado ao redor da cavidade abdominal e torácica enquanto o cirurgião corta o peritônio parietal e tecido torácico para ressecar o fígado
- Por último, levante o fígado para cima e corte os tecidos conjuntivos restantes segurando o fígado no lugar com uma tesoura. Manipular lentamente o fígado para facilitar a visão. Remova qualquer pele que grude no fígado enxaguando com perfusato antes de encapsá-lo dentro do tubo NMR.
NOTA: Neste procedimento, apenas o fígado é removido. Todos os outros órgãos são deixados no corpo do animal. O ducto biliar pode ser removido com base no protocolo do experimento. Embora para este experimento, foi deixado no lugar.
8. Pendurando o fígado da coluna
- Uma vez que o cirurgião entrega o fígado e a tubulação ao assistente, o assistente desconecta a tubulação do cateter e da coluna.
- Encha o cateter com perfusato até que um menisco seja formado na parte superior do cateter. Coloque o cateter na coluna para que o fígado fique pendurado e perusada.
NOTA: A conta de perfusato no cateter fornece volume suficiente para o fígado funcionar até que esteja conectado. O cateter ligado ao fígado é pressionado na parte inferior da coluna. - Enrosque um tubo de 20 mm de RMN na coluna de vidro de 100 cm para encapsular o fígado (Figura 5). Para evitar a torção do fígado e da veia portal, aparafusar lentamente o tubo NMR. Se a torção ocorrer e o fluxo for interrompido, desaparafusar e resempar o tubo NMR. Isso vai remediar a oclusão e o fluxo retornará.
- Perfunda o fígado por 30-60 min com base nos detalhes do estudo.
NOTA: O tempo é baseado no experimento de perfusão. Para este experimento, o volume de negócios metabólico foi medido dentro de 30 minutos. A perfusão hepática pode levar até 10 minutos para chegar a um estado estável. O tempo para o estado estável começa uma vez que a veia cava inferior foi cortada e o fluxo hepático é estabelecido.
9. Medição de fluxo
- Coloque um barco de pesagem em um equilíbrio de carga superior e zero o equilíbrio. Coloque a tubulação da bomba de rolo puxando perfusato eferente do NMR para o barco de pesagem e inicie o temporizador.
- Pesar a massa de líquido acumulada ao longo de 1 min, o que produz a vazão do fígado. Coloque o tubo de volta no recipiente de resíduos/coletas.
10. Medição de oxigênio
NOTA: As medições do medidor de oxigênio foram configuradas de acordo com as instruções do fabricante15.
- Coloque o eletrodo contendo 20 μL de solução saturada de 50% KCl na cúpula de platina e coloque cinco gotas de 10 μL ao redor do anel de platina inferior do eletrodo.
- Remova o adesivo do papel do cigarro. Coloque um pedaço de membrana de politetrafluoroetileno sobre o papel do cigarro.
- Coloque as duas peças em cima do eletrodo. Coloque um pequeno o-ring ao redor do topo do eletrodo. Corte o papel para colocar o anel de platina inferior no eletrodo.
NOTA: Alguma saliência é aceitável. É essencial cobrir a prata do eletrodo. - Coloque o o-ring maior no eletrodo. Junte o eletrodo à câmara de água e aperte a base para manter o eletrodo no lugar. Ligue o banho de água e deixe aquecer até 37 °C.
- Abra o software do medidor de oxigênio. Clique em Calibrar > água saturada de ar. Coloque a velocidade do agitador para 75 e a temperatura a 37 °C.
- Encha um frasco de 50 mL no meio do caminho com água e agite vigorosamente por 2 minutos. Esta é a água saturada de ar, use-a como 100% padrão. Encha a câmara do medidor de oxigênio com ~2 mL de água e coloque a rolha de duas peças.
- Clique em Ok na tela e deixe o sinal para planar. Uma vez que o sinal tenha atingido um platô, clique em Ok. Descarte o líquido na câmara e seque com papel de tecido.
- Repetição de passos 10.6-10.7 mas com sulfito de sódio de 200 mM (padrão de 0%). Clique em Salvar calibração.
NOTA: Não é necessário tremer vigorosamente para o padrão de 0%. - Durante a perfusão, use duas seringas de 5 mL. Uma seringa para circulação perfusada (oxigênio em) e a segunda para perfusato eferente do tubo NMR (saída de oxigênio).
- Ao elaborar o perfusato para as medidas de dentro e para fora, desenhe 3-4 mL cada vez.
NOTA: Esta coluna tem tubos de vidro para permitir o acesso ao tubo NMR para retirar o perfusato que fluiu através do fígado. - Meça o perfusato circulante, primeiro assim como a água na etapa 10.6 e descarte na etapa 10.7. Repita os mesmos passos para o perfusato eferente.
- Realize medições de oxigênio a cada 10 minutos.
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Representative Results
A função hepática é avaliada principalmente pelo consumo de oxigênio e taxa de fluxo. Uma taxa de fluxo de 4-8 mL/min e o consumo de oxigênio de 1 μmol/min.g é típico. Essas medidas variam dependendo de condições experimentais específicas e diferenças biológicas.
A quantidade exata de isoflurane utilizada dependerá do tipo de sistema de anestesia que está sendo usado, bem como do ambiente e idade/peso do camundongo. Durante a cirurgia, o isoflurane e o gás de parto não mudam, embora algumas alterações possam ser necessárias dependendo das especificidades da área cirúrgica (por exemplo, ruído de fundo)10. Quando a heparina é injetada profundamente subcutânea, o início da ação pode ser adiado em até 20-40 min. Um período de espera de 10 min da administração heparina garante o início da ação16. Lidocaína tem um início de 2 minutos de ação11.
Ao inserir o cateter, mantenha o bisel apontado para cima e entre no ângulo de 15° da veia do portal. Ambas as suturas têm dois nós. A primeira sutura deve ser amarrada além do batedor de cateter. Se a canulação da veia portal for bem sucedida, o fígado branqueia da descarga. Como o cirurgião está resseculando o fígado, o assistente limpa o conteúdo ressecado com um aplicador de ponta de algodão. Para evitar contaminar o fígado e evitar cortes nos lóbulos, não corte o estômago. Não aplique muita tensão na veia do portal ou fígado ao segurar o cateter para evitar desalojar ou rasgar a veia do portal.
A configuração de hardware de perfusão requer muita atenção aos detalhes (Figura 1). As injeções de heparina (Figura 2) são essenciais para o experimento. Se o sangue coagular, ele occlude o cateter que está inserido na veia portal, impedindo o fluxo. A injeção de lidocaína (Figura 3) é para ajudar na dessensibilização da área para alívio da dor. A Tabela 1 fornece um gráfico de dosagem simples para heparina e lidocaína com soro fisiológico. A céliotomia e a sutura (Figura 4) são essenciais para um cateterismo venoso portal bem sucedido, ressecção hepática e transferência bem sucedida para a plataforma de perfusão. A taxa de fluxo e as medições de consumo de oxigênio são vitais para monitorar a saúde e a função do fígado (Figura 6). Muitas vezes há uma pequena diferença no consumo de O2 entre fígados alimentados e em jejum, que atribuímos ao aumento das demandas energéticas impostas pela gliconeogênese no fígado em jejum.
Figura 1. Coluna de perfusão e bombas. Um. Uma coluna de vidro de 100 cm com capa d'água em que o fígado fica pendurado na parte inferior. B. A bomba de água circula água através da coluna de vidro e aquece o perfusado. C. O oxigenador de camada fina de vidro é pressurizado com 95%/5% O2/CO2 oxigenando o perfusato. D. A bomba de rolamento de esferas circula perfusada do banho de água para o oxigenador de camada fina e a coluna de vidro. E. A bomba de rolamento de esferas circula perfusada sendo entregue na coluna a partir da bomba de entrega mantendo a perfusa oxigenada e mantendo um fluxo de 8 mL/min. F. A bomba de rolamento de esferas remove o perfusato eferente do tubo NMR. G. Balança de pesagem para pesar perfusado a partir do tubo NMR para obter a taxa de fluxo do fígado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Injeção de heparina. A injeção subcutânea profunda de heparina é dada na camada de gordura abdominal inferior do camundongo. É importante ao pegar o rato, puxar a pele bem apertada para permitir que a agulha penetre a pele com facilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Injeção de lidocaína. O mouse é colocado na posição supina na plataforma cirúrgica com as patas coladas e o nariz no cone do nariz. A lidocaína é administrada subcutâneamente na região da crista ilíaca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Céliotomia e sutura. A céliotomia expõe os órgãos internos, e um hemostat puxa a tração através do processo xifoide para ajudar a abrir ainda mais a incisão. Duas suturas são colocadas ao redor da veia portal, o cateter é inserido, e as suturas estão amarradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Tubo NMR. O fígado removido do corpo junto com o cateter que é então anexado ao tubo de silício ligado à coluna de vidro. O fígado está pendurado na coluna e encapsulado pelo tubo NMR. Um tubo NMR de 20 mm é então cuidadosamente aparafusado na coluna encapsulando o fígado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Consumo de oxigênio e vazão. Dados representativos da comparação do consumo hepático de oxigênio e das medições da taxa de fluxo entre fígados alimentados e em jejum. N = 3 e as barras de erro são desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Heparina 1000 unidades/mL | Soro fisiológico 0,9% | Total |
| 0,01 mL | 0,19 mL | 0,2 mL |
| Lidocaína 2% | Soro fisiológico 0,9% | Total |
| 0,2 mL | 0,6 mL | 0,8 mL |
Mesa 1. Heparina e dose de lidocaína com soro fisiológico. A tabela apresenta a concentração de heparina e lidocaína e a dose de cada fármaco com soro fisiológico.
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Discussion
Este procedimento cirúrgico é desafiador e requer uma prática extensiva para alcançar resultados reprodutíveis. O gás isoflurane e portador deve ser ajustado conforme necessário para manter a viabilidade do animal através da maior parte do procedimento cirúrgico possível. Ambiente, hora do dia, idade, peso e vários outros fatores afetarão a anestesia. Peso, dieta, variedade de camundongos e idade podem afetar a cirurgia, pois o acúmulo de gordura pode interferir na visualização da veia portal. Ao bater as patas para baixo, deve-se tomar cuidado para não aplicar qualquer tensão no pescoço que possa resultar em sufocamento. Além disso, quanto mais gordo o camundongo mais apertado, mais apertado a sutura precisará estar ao redor do cateter para neutralizar o coeficiente de atrito reduzido entre o cateter e a veia induzida pelos lipídios. O início do tempo de ação para heparina é essencial, pois a exposição excessiva à isoflurano produz artefatos nos órgãos17. A administração de injeções de heparina e lidocaína requerem uma agulha 23G de 19,05 mm de comprimento, garantindo nenhum trauma aos órgãos internos durante a injeção. O laço de sutura deve estar sobre o taper do cateter, ou ele vai ocluir a veia quando apertado. Uma vez que o cateter é inserido, geralmente há um fluxo de sangue para fora do cateter da pressão, o que é um sinal positivo de colocação correta. O cateter pode ser puxado para cima para confirmar que a ponta do cateter está longe o suficiente para passar da primeira sutura. Rolar os pulsos e ombros garantirá que a sutura não deslize da ponta afilada quando o assistente amarrar a sutura. Ao transferir o fígado da tubulação de perfusão de silicone para a coluna, uma conta de perfusato é deixada em cima do cateter. A conta perfusada evitará que quaisquer bolhas de ar entrem no cateter e entrem no fígado. O menisco do perfusato em cima do cateter fornece volume suficiente para o fígado funcionar até que esteja conectado. Para evitar a torção do fígado e da veia portal, o tubo NMR é lentamente aparafusado. Além disso, o sistema de perfusão utilizado neste experimento não requer uma válvula de pressão. As taxas de fluxo das bombas são mantidas de tal forma que a coluna de perfusões de vidro contém perfusato a uma altura de ~12 cm. O fígado toma tampão krebs pela gravidade, negando qualquer diferença de pressão entre as duas bombas sem efeito na taxa de fluxo do fígado. Uma vez que o fígado é perfundido através da gravidade a quantidade de perfusato tomado pelo fígado é definida pela atividade biológica natural do fígado. Nenhum dado foi coletado para pressão de perfusão, pois a pressão venosa do portal não é mensurável neste sistema.
A primeira incisão da céliotomia é rasa para criar uma abertura, e cortes subsequentes são mais profundos para evitar cortar os lóbulos do fígado. O comprimento total da incisão para a céliotomia é de 3 cm para camundongos desta idade e tamanho, mas mudará com base na tensão, idade e peso. Embora o estudo descrito use camundongos de 9 a 13 semanas, camundongos mais velhos ou mais jovens podem ser estudados, bem como ratos. O tamanho do tubo de RMN e do cateter venoso portal precisaria ser alterado com base no tamanho anatômico do fígado e da veia portal para o estudo da preocupação. Se a veia do portal não estiver reta, um aplicador com ponta de algodão pode ajudar na manipulação da veia ao inserir o cateter. Embora o ducto biliar não seja removido, se houver uma necessidade experimental de sua ausência, o duto pode ser removido com pinças finas. A manipulação excessiva da veia portal ao colocar suturas causará constrição dificultando a colocação do cateter. Qualquer pele que grude no fígado é enxaguada com perfusato antes de pressionar a montagem do cateter na coluna e encapsulando-o dentro do tubo NMR. O prazo de 30 minutos para perfusão pode ser alterado de 20 min para 60 min, mas todos os dados confiáveis serão coletados após os 10 minutos iniciais de perfusão.
Um marcador de ressecção de tecido hepático bem sucedida é que após a perfusão o fígado não tem deformidades ou quaisquer outros problemas de integridade. É homogêneo amarelo pálido por toda parte. Se o tecido foi ferido durante a cirurgia, como um corte, teria manchas amarelas escuras ao redor dele. Além disso, se o fígado foi danificado pela perfusão, ele não perfusia. Se o tecido experimentasse má perfusão do tampão krebs, haveria listras amarelas escuras em todo o órgão como resultado da fome que levou à morte do tecido. Outro método de monitoramento da saúde hepática é o consumo hepático de oxigênio (Figura 6). Foi demonstrado que os fígados de camundongos contêm maiores quantidades lipídicas e glicogênio, mas têm quantidades totais de proteína semelhantes, por isso era esperado que o consumo hepático de oxigênio quando normalizado para a massa hepática teria um valor semelhante. Um terceiro método são os dados de RMN dos dados em tempo real do volume de negócios metabólicos.
A principal limitação do método é a própria cirurgia terminal. Há um custo substancial em ratos, equipamentos, tempo e pessoal. Portanto, deve-se ter o máximo cuidado ao realizar esses procedimentos e coletar dados. A variação biológica dentro do modelo do camundongo pode gerar dificuldade na cirurgia. Além disso, é imprescindível evitar melhorias ópticas. Não são necessários aprimoramentos ópticos, pois toda anatomia é visível a olho nu. Melhorias ópticas aumentam o potencial de erros para ocorrer, pois o cirurgião e o assistente têm um campo de visão limitado, levando a knicks no fígado ou tensão não intencional na veia do portal, causando uma falha se o cateter sair. A implementação adequada desses métodos resultará em > taxa de sucesso da cirurgia de 95% no mouse C57BL/6J. Outra limitação a considerar é o período de 10 minutos necessário para que o fígado atinja um estado estável. Não é uma limitação para o estudo descrito aqui, nem em muitos outros, mas para qualquer experimento que justifique os 10 minutos iniciais de dados este método não será suficiente. A falta da complexa assinatura hormonal associada ao metabolismo do corpo inteiro também serve como uma limitação, embora glucagon, insulina, etc., e qualquer combinação dela, pode ser adicionada de volta ao perfusado.
Existem várias aplicações futuras potenciais para esta técnica. À medida que mais medicamentos são desenvolvidos para o tratamento de NASH, métodos padrão para avaliar o metabolismo da energia hepática podem encontrar ampla aplicação. Como nash é fortemente associado ao câncer de fígado, modelos desses cânceres também são sujeitos para estudo.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo; na coleta, análises ou interpretação de dados; na escrita do manuscrito; ou na decisão de publicar os resultados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Uma parte deste trabalho foi realizada no McKnight Brain Institute no National High Magnetic Laboratory's Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy Facility (AMRIS), que é apoiado pelo National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 e o Estado da Flórida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
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