Summary
Протокол описывает простой метод резекции интактной печени мыши для метаболических исследований посредством перфузии воротных вен.
Abstract
Метаболические заболевания, такие как диабет, преддиабет, неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) и неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), становятся все более распространенными. Перфузии печени ex vivo позволяют проводить комплексный анализ метаболизма печени с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в условиях питания, которые можно строго контролировать. Поскольку в silico моделирование остается в первую очередь теоретическим средством оценки гормональных действий и эффектов фармацевтического вмешательства, перфузированная печень остается одним из самых ценных испытательных стендов для понимания печеночного метаболизма. Поскольку эти исследования направляют базовое понимание физиологии печени, результаты должны быть точными и воспроизводимыми. Наибольшим фактором воспроизводимости печеночной перфузии ex vivo является качество хирургического вмешательства. Поэтому мы ввели организованный и оптимизированный метод выполнения перфузий печени мышей ex vivo в контексте экспериментов с ЯМР in situ . Мы также описываем уникальное приложение и обсуждаем общие проблемы, возникающие в этих исследованиях. Общая цель состоит в том, чтобы предоставить несложное руководство по технике, которую мы усовершенствовали в течение нескольких лет, которую мы считаем золотым стандартом для получения воспроизводимых результатов в печеночных резекциях и перфузиях в контексте экспериментов in situ ЯМР. Расстояние до центра поля для магнита, а также недоступность ткани для вмешательства во время эксперимента ЯМР делает наши методы новыми.
Introduction
Перфузии ex vivo имеют решающее значение в изучении печеночного метаболизма, и перфузия через воротную вену является стандартом для этих исследований. Чтобы изучать печеночный обмен в изоляции, печень должна быть резецирована из организма, чтобы избежать осложнений, возникающих в результате метаболизма в других органах (т. Е. Метаболизм всего тела) и осуществлять контроль над доступностью гормонов (инсулин, глюкагон и т. Д.). Этот подход может иметь важное значение для понимания влияния таких заболеваний, как диабет, НАЖБП и НАСГ, на печеночный метаболизм, а также механизмов действия лекарств. Эта статья служит руководством по печеночной резекции и перфузии. Мы разработали упрощенную процедуру для выполнения этих метаболических исследований печени с достаточной строгостью и воспроизводимостью. Если операция выполнена неправильно, наблюдается выраженная вариабельность полученных метаболических данных. Описан организованный метод выполнения портальной катетеризации вен и резекции печени в контексте метаболических исследований in situ в спектрометре ядерного магнитного резонанса (ЯМР), описанный в литературе 1,2,3,4,5.
В настоящее время нет литературы, описывающей перфузию печени ex vivo с использованием стеклянной колонки в ЯМР. Также нет видео или текстовой публикации, предоставляющей четкий пример того, как выполнять процедуру с печенью мыши, в частности, демонстрирующей, как катетеризировать воротную вену, резецировать печень, переносить и вешать печень на стеклянную колонку. Поскольку генетически модифицированная мышь повсеместно используется для изучения метаболизма печени, это важная процедура, которая заслуживает полного описания. Операции по перфузии печени не новы, но эта статья является методом золотого стандарта, сопровождаемым видео, демонстрирующим техническое совершенство, описанное в этой статье, чтобы помочь всем, кто заинтересован в этой процедуре. Метод, представленный здесь, лучше всего применять к метаболизму в режиме реального времени для обнаружения функции и оборота метаболитов в моделях заболеваний.
Этот метод использует стеклянную колонку с водяной рубашкой длиной 100 см, которая позволяет печени висеть на дне канюли, инкапсулированной перфусатом внутри ЯМР-трубки. Нагретая вода в стеклянной рубашке используется для контроля температуры перфусата. Тонкослойный оксигенатор находится под давлением с 95%/5% O2/CO2 для контроля pH. С помощью трех отдельных насосов устанавливается высота колонны перфусата, которая обеспечивает постоянное давление на печень. Расход не контролируется сверх приложения постоянного давления (рисунок 1). Чтобы подтвердить, что печень функционирует надлежащим образом, измерения кислорода проводятся вместе со скоростью потока. В наших руках этот набор предварительных условий приводит к высоковоспроизводимым экспериментам ЯМР для оценки метаболической функции печени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты с участием мышей проводились в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Флориды (протокол No 201909320). Используемый штамм мыши был C57BL/6J; все мыши были самцами. Этот метод обычно применим и для исследований с использованием других стандартных штаммов мышей. Эта операция оптимально выполняется двумя людьми, работающими вместе.
1. Первоначальная настройка
- Перфузировать печень перфусатом, содержащим электролиты Krebs-Henseleit6 (25 мМ NaHCO3, 112 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ каждый из MgSO4, KH2PO4 и 0,5 мМ натрия-ЭДТА, 1,25 мМ CaCl2), 6 мМ лактата натрия, 0,6 мМ пирувата натрия, 0,2 мМ [U-13C] пропионата натрия, 10% (v/v) D2O, и 0,63 мМ смешанных жирных кислот (содержащих пальмитиновую кислоту (22,1% от общего числа), пальмитолеиновую кислоту (5,2%), стеариновую кислоту (2,7%), олеиновую кислоту (27%), линолевую кислоту (37,7%), γ-линоленовую кислоту (2,4%) и декозагексановую кислоту (2,8%)) вместе с 2% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином. Установите конечный рН перфусата на 7,3 с использованием HCl (и NaOH, если это необходимо).
2. Предоперационная настройка
- Соберите два шприца по 1 мл с иглой 23G длиной 19,05 мм. Наполните один шприц 0,01 мл 1000 ед/мл гепарина и 0,19 мл физиологического раствора (0,9% (мас./об.) NaCl в воде; Таблица 1).
- Наполните второй шприц 0,2 мл 2% лидокаина и 0,6 мл 0,9% физиологического раствора (таблица 1). Еще в 1 мл шприц с иглой 27 г 38,1 мм заполняют перфусатом и выдерживают при 37 °C.
3. Установка перфузатной колонны
- Поместите стеклянную бутылку, содержащую 500 мл перфусата, на водяную баню (рисунок 1B). Включите водяную баню и установите температуру ~42 °C. Более высокая температура на водяной бане позволяет поддерживать 37 °C в перфузионной колонне.
- Как только вода нагреется до 42 °C, включите два насоса, чтобы циркулировать перфусат из бутылки по всему тонкопленочному оксигенатору и стеклянной колонне с водяной рубашкой 100 см (рисунок 1A-E).
- Включите оксигенирующий газ (95% кислорода и 5% углекислого газа) для создания давления в оксигенаторе7 (рисунок 1С). Отрегулируйте высоту перфузатной колонны для достижения скорости потока 8 мл/мин с прикрепленным катетером (см. шаг 9 для измерения расхода)5,8,9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока относится к скорости, с которой перфусат выводится печенью.
4. Обезболивание мыши
- Надевайте СИЗ в соответствии с требованиями протокола IACUC и других соответствующих руководящих принципов безопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были оптимизированы для мышей в возрасте от 9 до 13 недель. - Поместите мышь в изофлурановую камеру. Превратите подаваемый газ в 100% кислород, скорость потока 1 л/мин, а изофлуран до 2%10. Подождите, пока дыхание не замедлится и не станет устойчивым.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы мышь достигла стабильной хирургической плоскости, о чем свидетельствует медленная и устойчивая частота дыхания и отсутствие рефлекса защемления пальцев ног, скорость потока кислорода может быть скорректирована до ~1,5 л/мин до ~3 л/мин, а концентрация изофлунана от 1 до 3%. Скорость подачи газа-носителя и концентрации изофлурана зависит от возраста и веса животного, а также от таких факторов, как шум и свет. - Продезинфицируйте живот 70% спиртом. Вводят гепарин через глубокую подкожную инъекцию в брюшной жировой слой (рисунок 2). Поместите мышь обратно в анестезиологическую камеру на 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бритье не требуется, так как эта процедура является терминальной.
5. Целиотомия
- Перенесите мышь из анестезиологической камеры на хирургическую платформу и поместите ее в положение лежа на спине (рисунок 3).
- Поместите нос мыши в носовой конус и засуньте лапы вниз. Позаботьтесь о том, чтобы не оказывать никакого напряжения на шею, которое может привести к удушью.
- Вводят лидокаин через подкожную инъекцию двусторонне в область11 переднего подвздошного гребня (фиг.3). Выполните тест на защемление пальца ноги, чтобы подтвердить отсутствие всех болевых рефлексов.
- Выполняют целиотомию для обнажения внутренних органов (рисунок 4). Сделайте разрез шириной 3 см (ширина всего брюшка мыши).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ширина будет меняться в зависимости от возраста и рациона мыши. - Расширьте разрез с помощью гемостата, который тянет тягу путем зажима на мечевидном отростке (рисунок 4).
6. Каннуляция воротной вены
- Используйте аппликатор с хлопковым наконечником, чтобы очистить тонкий и толстый кишечник, покрывающий воротную вену. Расположите шелковый шов под дугой воротной вены проксимально к печени (рисунок 4А).
- В зависимости от анатомического строения накладывают второй шелковый шов проксимальным или дистальным отделом нижней брыжеечной вены дистально от печени (Рисунок 4А)12,13. Используйте шов 2-0 для обоих швов.
- Как только швы будут на месте, каннулируйте воротную вену катетером 22G14 (рисунок 4B). При введении катетера держите скос направленным вверх. Введите в воротную вену под углом не более 15°.
- Завяжите первый шов мимо крана катетера. После канюляции воротной вены закрепите катетер на 2-3 мм дистально от ветви воротной вены шелковым швом (рисунок 4В).
ПРИМЕЧАНИЕ: Помощник должен свернуть плечи и запястья, чтобы предотвратить смещение катетера или разрыв воротной вены. Для каждого шва требуется два узла. - Далее закрепите нижнюю часть катетера вторым швом. С помощью ассистента хирурга завяжите узел шовом, чтобы закрепить катетер на дистальной части воротной вены и окружающих тканях.
7. Резекция печени после портальной канюляции вен
- После того, как катетер закреплен, вставьте шприц 1 мл с иглой 27G длиной 38,1 мм в катетер для промывки пузырьков крови и воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно наблюдается обратный поток крови из катетера от давления. - Используйте силиконовую трубку 1 мм I.D. x 5 мм O.D. с фиксированным запорным краном, чтобы соединить перфузионную колонну (рисунок 1A) с катетером, позволяющим потоку буфера в печень отмечать начало перфузии. Запустите таймер на этом этапе, чтобы отметить начало перфузии.
- Снять повышенное сосудистое давление, сделав разрез, используя ножницы, в нижнюю полую вену.
- Подтверждают поступление перфусата через печень, наблюдая однородное изменение цвета печени от розового/красного до бледно-желтого. Как только поток подтвердится, иссекните желудок, тонкую кишку, толстую кишку и правую почку из окружающих тканей.
- С помощью ассистента хирурга маневрируйте печенью вокруг брюшной и грудной полости, поскольку хирург разрезает теменную брюшину и грудную ткань, чтобы резецировать печень
- Наконец, поднимите печень вверх и отрежьте оставшиеся соединительные ткани, удерживающие печень на месте, ножницами. Медленно манипулируйте печенью для удобства зрения. Удалите любую шерсть, которая прилипает к печени, смыв перфусатом, прежде чем инкапсулировать его в трубку ЯМР.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре удаляется только печень. Все остальные органы остаются в теле животного. Желчный проток может быть удален на основании протокола эксперимента. Хотя для этого эксперимента его оставили на месте.
8. Подвешивание печени к колонке
- Как только хирург передает печень и трубку помощнику, помощник отсоединяет трубку от катетера и колонки.
- Заполните катетер перфусатом до тех пор, пока на верхней части катетера не образуется мениск. Прикрепите катетер к колонке, чтобы печень зависла и перфузировала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шарик перфузата на катетере обеспечивает достаточный объем для функционирования печени до момента ее соединения. Катетер, прикрепленный к печени, прижимается к нижней части колонки. - Прикрутите 20-миллиметровую ЯМР-трубку к стеклянной колонне диаметром 100 см, чтобы инкапсулировать печень (рисунок 5). Чтобы избежать перекрута печени и воротной вены, медленно вкрутите трубку ЯМР. Если кручение все-таки происходит и поток прекращается, открутите и открутите ЯМР-трубку. Это устранит окклюзию, и поток вернется.
- Перфузируйте печень в течение 30-60 мин на основе деталей исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время основано на эксперименте с перфузией. Для этого эксперимента метаболический оборот измеряли в течение 30 мин. Перфузия печени может занять до 10 минут, чтобы достичь устойчивого состояния. Время до устойчивого состояния начинается после того, как нижняя полая вена была разрезана и печеночный поток установлен.
9. Измерение расхода
- Поместите весовую лодку на верхние весы и обнулите весы. Поместите трубку из роликового насоса, вытягивающего эфферентный перфусат из ЯМР, в весовую лодку и запустите таймер.
- Взвесьте массу жидкости, накопленной за 1 мин, что дает скорость потока печени. Поместите трубку обратно в контейнер для сбора/сбора отходов.
10. Измерение кислорода
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения кислородного измерителя были установлены в соответствии с инструкциями завода-изготовителя15.
- Поместите электрод, содержащий 20 мкл 50% насыщенного раствора KCl, на платиновый купол и поместите пять капель по 10 мкл вокруг нижнего платинового кольца электрода.
- Снимите клей с сигаретной бумаги. Положите кусочек политетрафторэтиленовой мембраны поверх сигаретной бумаги.
- Поместите две части поверх электрода. Установите небольшое уплотнительное кольцо вокруг верхней части электрода. Обрежьте бумагу, чтобы положить ее на нижнее платиновое кольцо на электроде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторый навес приемлем. Важно покрыть серебро электрода. - Поместите уплотнительное кольцо большего размера на электрод. Подключите электрод к водяной камере и затяните основание, чтобы удерживать электрод на месте. Включите водяную баню и дайте нагреться до 37 °C.
- Открытое программное обеспечение кислородного измерителя. Нажмите « Откалибровать > насыщенной воздухом воды. Установите скорость мешалки на 75, а температуру на 37 °C.
- Наполните флакон объемом 50 мл наполовину водой и энергично встряхните в течение 2 минут. Это насыщенная воздухом вода, используйте ее как 100% стандартную. Заполните камеру кислородного измерителя ~2 мл воды и поместите двухсекционную пробку.
- Нажмите Ok на экране и позвольте сигналу выйти на плато. Как только сигнал достигнет плато, нажмите Ok. Утилизируйте жидкость в камере и высушите папиросной бумагой.
- Повторите шаги 10,6-10,7, но с 200 мМ сульфита натрия (0% стандартно). Нажмите Сохранить калибровку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для стандарта 0% не требуется сильного встряхивания. - Во время перфузии используйте два шприца по 5 мл. Один шприц для циркулирующего перфузата (кислород внутри) и второй для эфферентного перфузата из ЯМР-трубки (кислород наружу).
- При составлении перфузата как для входного, так и для наружного измерения каждый раз вытягивайте по 3-4 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта колонна имеет стеклянную трубку, чтобы обеспечить доступ в ЯМР-трубку для извлечения перфузата, который протекал через печень. - Измерьте циркулирующий перфусат, сначала так же, как воду на этапе 10.6, и утилизируйте на этапе 10.7. Повторите те же шаги для эфферентного перфусата.
- Выполняйте измерения кислорода каждые 10 минут.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Функция печени в первую очередь оценивается по потреблению кислорода и скорости потока. Типичны скорость потока 4-8 мл/мин и потребление кислорода 1 мкмоль/мин.г. Эти меры будут варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных условий и биологических различий.
Точное количество используемого изофлурана будет зависеть от типа используемой анестезиологической системы, а также от окружающей среды и возраста / веса мыши. Во время операции изофлуран и газ доставки не изменяются, хотя некоторые изменения могут потребоваться в зависимости от специфики хирургической области (например, фоновый шум)10. Когда гепарин вводится глубоко подкожно, начало действия может быть отложено до 20-40 мин. 10-минутный период ожидания после введения гепарина обеспечивает начало действия16. Лидокаин имеет 2 минное начало действия11.
При введении катетера держите скос заостренным вверх и входите под углом не более 15° от воротной вены. Оба шва имеют два узла. Первый шов необходимо завязать мимо катетерного постукивателя. Если канюляция воротной вены проходит успешно, печень отбеливается от прилива. Когда хирург резецирует печень, помощник очищает резецированное содержимое с помощью аппликатора с хлопковым наконечником. Чтобы предотвратить загрязнение печени и предотвратить попадание в доли, не перерезайте желудок. Не прикладывайте слишком большое напряжение к воротной вене или печени при удержании катетера, чтобы предотвратить смещение или разрыв воротной вены.
Настройка перфузионного оборудования требует значительного внимания к деталям (рисунок 1). Инъекции гепарина (рисунок 2) необходимы для эксперимента. Если кровь свертывается, она закупоривает катетер, который вводится в воротную вену, предотвращая поток. Инъекция лидокаина (рисунок 3) должна помочь в десенсибилизации области для облегчения боли. В таблице 1 приведена простая схема дозирования гепарина и лидокаина с физиологическим раствором. Целиотомия и шов (рисунок 4) необходимы для успешной катетеризации воротной вены, резекции печени и успешного перевода на перфузионную установку. Измерения скорости потока и потребления кислорода имеют жизненно важное значение для мониторинга здоровья и функции печени (рисунок 6). Часто существует небольшая разница в потребленииО2 между питаемой и голодающей печенью, которую мы приписываем повышенным энергетическим потребностям, вызванным глюконеогенезом в печени натощак.
Рисунок 1. Перфузионная колонна и насосы. A. Стеклянная колонна с водяной рубашкой длиной 100 см, в которой печень висит внизу. B. Водяной насос циркулирует воду через стеклянную колонку и нагревает перфусат. C. Стеклянный тонкослойный оксигенатор находится под давлением с 95%/5% O2/CO2, насыщающим перфусат кислородом. D. Шарикоподшипниковый насос циркулирует перфусат из водяной бани в тонкослойный оксигенатор и стеклянную колонну. E. Шарикоподшипниковый насос циркулирует перфусат, подаваемый в колонну из подающего насоса, поддерживая перфусат кислородом и поддерживая поток 8 мл /мин. F. Шарикоподшипниковый насос удаляет эфферентный перфусат из ЯМР-трубки. G. Весы для взвешивания перфусата из ЯМР-трубки для получения расхода печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Гепарин для инъекций. Глубокая подкожная инъекция гепарина производится в нижний слой брюшного жира мыши. Важно при взятии в руки мыши плотно потянуть кожу, чтобы игла с легкостью проникла в кожу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Лидокаин инъекционный. Мышь помещается в лежачее положение на хирургической платформе с заклеенными лапами и носом в носовом конусе. Лидокаин вводят подкожно в область подвздошного гребня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Целиотомия и шов. Целиотомия обнажает внутренние органы, а гемостат тянет вытяжение через мечевидный процесс, чтобы помочь открыть разрез дальше. Вокруг воротной вены накладывают два шва, вставляют катетер и завязывают швы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. ЯМР-трубка. Печень удаляется из организма вместе с катетером, который затем прикрепляется к кремниевой трубке, прикрепленной к стеклянной колонке. Печень подвешивается к столбу и инкапсулируется ЯМР-трубкой. Затем 20-миллиметровая ЯМР-трубка осторожно привинчивается к колонне, инкапсулирующей печень. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Потребление кислорода и расход. Репрезентативные данные сравнения потребления кислорода в печени и измерений скорости потока между питающейся и голодающей печенью. N = 3 и полосы погрешностей являются стандартным отклонением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Гепарин 1000 ед/мл | Физиологический раствор 0,9% | Итог |
| 0.01 мл | 0.19 мл | 0.2 мл |
| Лидокаин 2% | Физиологический раствор 0,9% | Итог |
| 0.2 мл | 0,6 мл | 0.8 мл |
Таблица 1. Гепарин и лидокаин в дозе с физиологическим раствором. В таблице приведена концентрация гепарина и лидокаина и доза каждого лекарственного препарата с физиологическим раствором.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта хирургическая процедура является сложной и требует обширной практики для достижения воспроизводимых результатов. Изофлуран и газ-носитель должны быть отрегулированы по мере необходимости, чтобы поддерживать жизнеспособность животного на протяжении большей части хирургической процедуры. Окружающая среда, время суток, возраст, вес и ряд других факторов будут влиять на анестезию. Вес, диета, штамм мышей и возраст могут повлиять на операцию, поскольку накопление жира может помешать визуализации воротной вены. При заклеивании лап вниз необходимо соблюдать осторожность, чтобы не оказывать никакой нагрузки на шею, которая может привести к удушью. Кроме того, чем жирнее мышь, тем плотнее шов должен быть вокруг катетера, чтобы противодействовать снижению коэффициента трения между катетером и веной, вызванного липидами. Время начала действия гепарина имеет важное значение, поскольку чрезмерное воздействие изофлурана приводит к образованию артефактов в органах17. Для введения инъекций гепарина и лидокаина требуется игла 23G длиной 19,05 мм, обеспечивающая отсутствие травм внутренних органов во время инъекции. Шовная петля должна быть над конусом катетера, иначе она закроет вену при затягивании. После того, как катетер вставлен, обычно происходит обратный поток крови из катетера от давления, что является положительным признаком правильного размещения. Катетер может быть потянут вверх для визуального подтверждения того, что наконечник катетера находится достаточно далеко от первого шва. Сворачивание запястий и плеч гарантирует, что шов не соскользнет с конического кончика, когда помощник завязывает шов. При переносе печени из силиконовой перфузионной трубки в колонку сверху катетера оставляют шарик перфузата. Шарик перфусата предотвратит попадание пузырьков воздуха в катетер и попадание в печень. Мениск перфусата поверх катетера обеспечивает достаточный объем для функционирования печени до момента ее соединения. Чтобы избежать перекрута печени и воротной вены, трубку ЯМР медленно вкручивают. Кроме того, перфузионная система, используемая в этом эксперименте, не требует клапана давления. Расход насосов поддерживается таким образом, что стеклянная перфузионная колонна содержит перфусат на высоте ~12 см. Печень поглощает буфер Кребса под действием силы тяжести, сводя на нет любую разницу давлений между двумя насосами без влияния на скорость потока печени. Поскольку печень перфузируется под действием силы тяжести, количество перфусата, поглощаемого печенью, определяется естественной биологической активностью печени. Не было собрано данных о давлении перфузии, поскольку давление в портальных венах не измеряется в этой системе.
Первый разрез целиотомии неглубокий, чтобы создать отверстие, а последующие разрезы глубже, чтобы избежать защемления долей печени. Общая длина разреза для целиотомии составляет 3 см для мышей этого возраста и размера, но будет меняться в зависимости от напряжения, возраста и веса. Хотя в описанном исследовании используются мыши в возрасте 9-13 недель, мыши старше или моложе могут быть изучены так же, как и крысы. Размер ЯМР-трубки и портального венозного катетера необходимо будет изменить в зависимости от анатомического размера печени и воротной вены для исследования, вызывающего озабоченность. Если воротная вена не прямая, аппликатор с хлопковым наконечником может помочь в манипулировании веной при введении катетера. Хотя желчный проток не удаляется, если есть экспериментальная необходимость в его отсутствии, проток можно удалить тонким пинцетом. Чрезмерные манипуляции с воротной веной при наложении швов вызовут сужение, что затруднит установку катетера. Любой мех, который прилипает к печени, смывается перфусатом перед нажатием, прикрепляя катетер к колонке и инкапсулируя его в трубку ЯМР. Временные рамки 30 мин для перфузии могут быть изменены с 20 мин до 60 мин, но все достоверные данные будут собраны после начальных 10 мин перфузии.
Маркером успешной резекции печеночной ткани является то, что после перфузии печень не имеет деформаций или каких-либо других проблем с целостностью. Он однородно бледно-желтый во всем. Если ткань была повреждена во время операции, такой как ник, вокруг нее будут темно-желтые пятна. Кроме того, если печень была повреждена от перфузии, она не будет перфузировать. Если бы ткань испытывала плохую перфузию буфера Кребса, по всему органу были бы темно-желтые полосы в результате голодания, приводящего к гибели тканей. Другим методом мониторинга здоровья печени является потребление кислорода в печени (рисунок 6). Было показано, что печень мышей содержит более высокие количества липидов и гликогена, но имеет аналогичные общие количества белка, поэтому ожидалось, что потребление кислорода в печени при нормализации массы печени будет иметь аналогичное значение. Третьим методом являются данные ЯМР данных метаболического оборота в режиме реального времени.
Основным ограничением метода является сама терминальная хирургия. Существует значительная стоимость мышей, оборудования, времени и персонала. Поэтому при выполнении этих процедур и сборе данных необходимо проявлять максимальную осторожность. Биологические вариации в мышиной модели могут создавать трудности в хирургии. Кроме того, крайне важно избегать оптических улучшений. Никаких оптических улучшений не требуется, так как вся анатомия видна невооруженным глазом. Оптические усовершенствования увеличивают вероятность возникновения ошибок, поскольку хирург и помощник имеют ограниченное поле зрения, что приводит к появлению трещин в печени или непреднамеренному напряжению на воротной вене, вызывая сбой, если катетер вытягивается. Правильное применение этих методов приведет к > 95% успеха операции у мыши C57BL/6J. Другим ограничением, которое следует учитывать, является 10-минутный период, необходимый для того, чтобы печень достигла устойчивого состояния. Это не является ограничением ни для исследования, описанного здесь, ни для многих других, но для любого эксперимента, требующего начальных 10 минут данных, этого метода будет недостаточно. Отсутствие сложной гормональной сигнатуры, связанной с метаболизмом всего тела, также служит ограничением, хотя глюкагон, инсулин и т. Д. И любая их комбинация могут быть добавлены обратно к перфусату.
Существует несколько потенциальных будущих применений этой техники. Поскольку для лечения НАСГ разрабатывается все больше фармацевтических препаратов, стандартные методы оценки энергетического метаболизма печени могут найти широкое применение. Поскольку НАСГ тесно связан с раком печени, модели этих видов рака также являются предметом изучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; в сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи; или в решении опубликовать результаты.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием Национальных институтов здравоохранения (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Часть этой работы была выполнена в Институте мозга Макнайта в Центре передовой магнитно-резонансной томографии и спектроскопии (AMRIS) Национальной лаборатории магнитного поля, который поддерживается Соглашением о сотрудничестве Национального научного фонда No. DMR-1644779 и штат Флорида.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
