Summary
Protokollet beskriver en enkel metod för att resektionera en intakt muslever för metaboliska studier genom portalvenperfusion.
Abstract
Metabola sjukdomar som diabetes, pre-diabetes, alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) och alkoholfri steatohepatit (NASH) blir allt vanligare. Ex vivo leverperfusioner möjliggör en omfattande analys av levermetabolism med hjälp av kärnmagnetisk resonans (NMR), under näringsförhållanden som kan kontrolleras noggrant. Eftersom silico-simuleringar förblir ett primärt teoretiskt sätt att bedöma hormonåtgärder och effekterna av farmaceutisk intervention, är den perfuserade levern fortfarande en av de mest värdefulla testbäddarna för att förstå levermetabolism. Eftersom dessa studier vägleder grundläggande insikter i leverfysiologi måste resultaten vara korrekta och reproducerbara. Den största faktorn i reproducerbarheten av ex vivo leverperfusion är kvaliteten på operationen. Därför har vi introducerat en organiserad och strömlinjeformad metod för att utföra ex vivo musleverperfusioner i samband med in situ NMR-experiment. Vi beskriver också en unik tillämpning och diskuterar vanliga problem som uppstår i dessa studier. Det övergripande syftet är att ge en okomplicerad guide till en teknik som vi har förfinat under flera år som vi anser vara den gyllene standarden för att erhålla reproducerbara resultat i leverresektioner och perfusioner i samband med in situ NMR-experiment. Avståndet till mitten av fältet för magneten samt vävnadens otillgänglighet för intervention under NMR-experimentet gör våra metoder nya.
Introduction
Ex vivo-perfusioner är avgörande för studier av levermetabolism, och perfusion genom portalvenen är standarden för dessa studier. För att studera levermetabolismen isolerat måste levern resekteras från kroppen för att undvika komplikationer som uppstår vid metabolism i andra organ (dvs. hela kroppens metabolism) och för att utöva kontroll över hormontillgängligheten (insulin, glukagon, etc.). Detta tillvägagångssätt kan vara viktigt för att förstå effekterna av sjukdomar som diabetes, NAFLD och NASH på levermetabolism samt mekanismer för läkemedelsverkan. Denna artikel fungerar som en guide till leverresektion och perfusion. Vi har utvecklat ett strömlinjeformat förfarande för att utföra dessa metaboliska leverstudier med tillräcklig noggrannhet och reproducerbarhet. Om operationen inte utförs korrekt finns det uttalad variation i de erhållna metaboliska data. Vi beskriver en organiserad metod för att utföra portalvenskateterisering och leverresektion i samband med metaboliska studier in situ i en kärnmagnetisk resonansspektrometer (NMR), som beskrivs i litteraturen 1,2,3,4,5.
För närvarande finns det ingen litteratur som beskriver en ex vivo leverperfusion med användning av en glaskolonn i en NMR. Det finns inte heller en video- eller textpublikation som ger ett tydligt exempel på hur man utför proceduren med muslevern, specifikt, som visar hur man kateteriserar portalvenen, resekterar en lever, överför och hänger levern på en glaskolonn. Eftersom den genetiskt modifierade musen används allestädes närvarande för att studera levermetabolism är detta ett viktigt förfarande som förtjänar en fullständig beskrivning. Leverperfusionsoperationer är inte nya, men den här artikeln är en guldstandardmetod åtföljd av en video som visar den tekniska excellensen som beskrivs i detta dokument för att hjälpa alla som är intresserade av denna procedur. Metoden som presenteras här skulle bäst tillämpas på realtidsmetabolism för att detektera funktionen och omsättningen av metaboliter i sjukdomsmodeller.
Denna metod använder en 100 cm vattenmantlad glaskolonn, som gör att levern kan hänga i botten av kanylen inkapslad genom att perfusera inuti ett NMR-rör. Uppvärmt vatten i glasjackan används för att kontrollera perfusattemperaturen. En tunnskikts oxygenator trycksätts med 95% / 5% O2 / CO2 för pH-kontroll. Genom att använda tre separata pumpar ställs perfusatkolonnhöjden in, vilket ger konstant tryck på levern. Flödeshastigheterna kontrolleras inte utöver tillämpningen av konstant tryck (figur 1). För att bekräfta att levern fungerar korrekt tas syremätningar tillsammans med flödeshastigheter. I våra händer leder denna uppsättning förutsättningar till mycket repeterbara NMR-experiment för bedömning av leverns metaboliska funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment med möss hanterades i enlighet med University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer #201909320). Musstammen som användes var C57BL/6J; alla möss var hanar. Denna metod är allmänt tillämplig för studier med andra vanliga musstammar också. Denna operation utförs optimalt av två individer som arbetar tillsammans.
1. Inledande installation
- Perfusera lever med perfusat innehållande Krebs-Henseleit elektrolyter6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM vardera avMgSO4, KH2PO4 och 0,5 mM natrium-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM natriumlaktat, 0,6 mM natriumpyruvat, 0,2 mM [U-13C] natriumpropionat, 10% (v/v)D2O, och 0,63 mM blandade fettsyror (innehållande palmitinsyra (22,1% av det totala), palmitolsyra (5,2%), stearinsyra (2,7%), oljesyra (27%), linolsyra (37,7%), γ-linolensyra (2,4%) och dekosahexansyra (2,8%)) tillsammans med 2% (w / v) bovint serumalbumin. Ställ in det slutliga pH-värdet för perfusat till 7,3 med HCl (och NaOH, om det behövs).
2. Upplägg före operationen
- Montera två 1 ml sprutor med en 23G nål som är 19,05 mm långa. Fyll en spruta med 0,01 ml 1000 enheter/ml heparin och 0,19 ml saltlösning (0,9 % (w/v) NaCl i vatten; Tabell 1).
- Fyll den andra sprutan med 0,2 ml 2% lidokain och 0,6 ml 0,9% saltlösning (tabell 1). I en annan 1 ml spruta med en 27 G 38,1 mm nål, fyll med perfusatet och håll vid 37 °C.
3. Inställning av perfusate-kolumn
- Ställ in glasflaskan som innehåller 500 ml perfusat i vattenbadet (figur 1B). Slå på vattenbadet och ställ in temperaturen på ~42 °C. Den högre temperaturen i vattenbadet gör det möjligt att hålla 37 °C i perfusionskolonnen.
- När vattnet värms upp till 42 °C, slå på de två pumparna för att cirkulera perfusatet från flaskan genom tunnfilmssyresonatorn och den vattenmantlade 100 cm glaskolonnen (figur 1A-E).
- Slå på syrgasen (95% syre och 5% koldioxid) för att trycksätta oxygenatorn7 (figur 1C). Justera perfusatkolonnens höjd för att uppnå en flödeshastighet på 8 ml/min med katetern monterad (se steg 9 för flödesmätning)5,8,9.
OBS: Flödeshastighet avser den hastighet med vilken perfusat utvisas av levern.
4. Bedövning av musen
- Don PPE enligt kraven i IACUC-protokollet och andra lämpliga säkerhetsriktlinjer.
OBS: Följande steg har optimerats för möss som är 9 - 13 veckor gamla. - Placera musen i isoflurankammaren. Vrid leveransgasen till 100% syre, en flödeshastighet på 1 l / min och isofluran till 2% 10. Vänta tills andningen saktar ner och är stadig.
OBS: För att musen ska nå ett stabilt kirurgiskt plan, vilket framgår av en långsam och stadig andningsfrekvens och brist på tånypreflex, kan syreflödeshastigheten justeras till ~ 1,5 l / min till ~ 3 l / min och isoflurankoncentrationen från 1 - 3%. Leveranshastigheten för bärgas och isoflurankoncentration beror på djurets ålder och vikt och faktorer som buller och ljus. - Desinficera buken med 70% alkohol. Administrera heparin genom en djup subkutan injektion i bukfettlagret (figur 2). Placera musen tillbaka i anestesikammaren i 10 min.
OBS: Rakning krävs inte eftersom denna procedur är terminal.
5. Celiotomi
- Överför musen från anestesikammaren till operationsplattformen och placera den i ryggläge (figur 3).
- Placera musens näsa i en näskotte och tejpa tassarna ner. Var försiktig så att du inte belastar nacken som kan leda till kvävning.
- Administrera lidokain genom en subkutan injektion bilateralt i den främre iliac crest region11 (Figur 3). Utför ett tånyptest för att bekräfta frånvaron av alla smärtreflexer.
- Utför celiotomi för att exponera de inre organen (Figur 4). Gör ett 3 cm brett snitt (bredden på hela musens buk).
OBS: Bredden kommer att förändras med musens ålder och kost. - Expandera snittet med hjälp av en hemostat som drar dragkraft genom att klämma fast xiphoidprocessen (figur 4).
6. Kannulering av portalvenen
- Använd en bomullsapplikator för att rensa de små och stora tarmarna som täcker portalvenen. Placera en silkesutur under portalvenens båge proximal mot levern (figur 4A).
- Beroende på den anatomiska strukturen, placera den andra silkesuturen proximal eller distal av den underlägsna mesenteriska venen distal från levern (figur 4A)12,13. Använd en 2-0 sutur för båda suturerna.
- När suturerna är på plats kannulerar du portalvenen med en 22G kateter14 (figur 4B). När du sätter in katetern, håll avfasningen uppåt. Gå in i portalvenen i högst 15 ° vinkel.
- Knyt den första suturen förbi kateterkranen. När portalvenen är kannulerad, förankra katetern 2-3 mm distal från portalvenens gren med silkesuturen (figur 4B).
OBS: Assistenten ska rulla axlar och handleder för att förhindra att katetern lossnar eller slits i portalvenen. Varje sutur kräver två knop. - Säkra sedan den nedre delen av katetern med den andra suturen. Med hjälp av den kirurgiska assistenten knyter du en knut med suturen för att säkra katetern till den distala delen av portalvenen och den omgivande vävnaden.
7. Resektion av lever efter portalvenkannulering
- När katetern är säkrad, sätt in en 1 ml spruta med en 27G nål som är 38,1 mm lång i katetern för att spola blod och luftbubblor.
OBS: Det finns vanligtvis ett återflöde av blod ur katetern från trycket. - Använd ett 1 mm I.D. x 5 mm O.D. silikonrör med en fast stoppkran för att koppla perfusionskolonnen (figur 1A) till katetern så att buffertflödet kan strömma in i levern och markera början av perfusionen. Starta en timer vid denna tidpunkt för att markera starten på perfusionen.
- Lindra ökat vaskulärt tryck genom att göra ett snitt, med sax, i den underlägsna vena cava.
- Bekräfta flödet av perfusat genom levern genom att observera den homogena förändringen i leverfärg från rosa / röd till en ljusgul. När flödet har bekräftats, skär ut magen, tunntarmen, tjocktarmen och den högra njuren från omgivande vävnad.
- Med hjälp av den kirurgiska assistenten manövrerar du levern runt buk- och brösthålan när kirurgen skär genom parietal bukhinnan och bröstvävnaden för att resektera levern
- Slutligen lyft levern uppåt och skär de återstående bindväven som håller levern på plats med sax. Manipulera långsamt levern för att underlätta synen. Ta bort eventuell päls som fastnar i levern genom att skölja av med perfusat innan du kapslar in den i NMR-röret.
OBS: I denna procedur avlägsnas endast levern. Alla andra organ finns kvar i djurets kropp. Gallgången kan avlägsnas baserat på experimentets protokoll. Även för detta experiment lämnades det på plats.
8. Hänga levern från kolonnen
- När kirurgen överlämnar levern och slangen till assistenten kopplar assistenten bort slangen från katetern och kolonnen.
- Fyll katetern med perfusat tills en menisk bildas på toppen av katetern. Fäst katetern i kolonnen så att levern hänger och svettas.
OBS: Pärlan av perfusat på katetern ger tillräcklig volym för att levern ska fungera tills den är ansluten. Katetern som är fäst vid levern är tryckmonterad på botten av kolonnen. - Skruva fast ett 20 mm NMR-rör på 100 cm glaspelaren för att kapsla in levern (figur 5). För att undvika vridning av levern och portalvenen, skruva långsamt på NMR-röret. Om vridning uppstår och flödet stoppas, skruva loss och rescrewa NMR-röret. Detta kommer att avhjälpa ocklusionen och flödet kommer tillbaka.
- Perfuse levern i 30-60 min baserat på detaljerna i studien.
OBS: Tiden är baserad på perfusionsexperimentet. För detta experiment mättes metabolisk omsättning inom 30 min. Leverperfusionen kan ta upp till 10 minuter att nå ett stabilt tillstånd. Tiden till steady-state börjar när den underlägsna vena cava har skurits och leverflödet har etablerats.
9. Flödesmätning
- Placera en vägbåt på en topplastbalans och nollställ balansen. Placera slangen från rullpumpen som drar efferent perfusate från NMR in i vägbåten och starta timern.
- Väg massan av vätska som ackumuleras under 1 min vilket ger leverns flödeshastighet. Placera tillbaka röret i avfalls-/uppsamlingsbehållaren.
10. Syremätning
OBS: Syremätarmätningar ställdes in enligt tillverkarens instruktioner15.
- Placera elektroden som innehåller 20 μl 50% KCl mättad lösning på platinakupolen och placera fem 10 μL droppar runt elektrodens nedre platinaring.
- Ta bort limet från cigarettpappret. Lägg en bit polytetrafluoretylenmembran över cigarettpappret.
- Placera de två bitarna ovanpå elektroden. Montera en liten O-ring runt toppen av elektroden. Trimma papperet så att det läggs platt på den nedre platinaringen på elektroden.
OBS: Ett visst överhäng är acceptabelt. Det är viktigt att täcka elektrodens silver. - Placera den större O-ringen på elektroden. Koppla elektroden till vattenkammaren och dra åt basen för att hålla elektroden på plats. Slå på vattenbadet och låt värma upp till 37 °C.
- Öppna programvara för syremätare. Klicka på Kalibrera > luftmättat vatten. Ställ in omrörarhastigheten på 75 och temperaturen på 37 °C.
- Fyll en 50 ml injektionsflaska halvvägs med vatten och skaka kraftigt i 2 minuter. Detta är luftmättat vatten, använd det som 100% standard. Fyll syremätarkammaren med ~ 2 ml vatten och placera den tvådelade proppen på.
- Klicka på Okej på skärmen och låt signalen platå. När signalen har nått en platå klickar du på Okej. Kassera vätska i kammaren och torka med silkespapper.
- Upprepa steg 10,6-10,7 men med 200 mM natriumsulfit (0% standard). Klicka på Spara kalibrering.
OBS: Ingen kraftig skakning behövs för 0% -standarden. - Använd två 5 ml sprutor under perfusion. En spruta för cirkulerande perfusat (syre in) och den andra för efferent perfusat från NMR-röret (syre ut).
- När du utarbetar perfusat för både in- och utmätningar, rita 3-4 ml varje gång.
OBS: Denna kolumn har glasrör för att möjliggöra åtkomst till NMR-röret för att dra tillbaka perfusatet som har flödat genom levern. - Mät det cirkulerande perfusatet, först precis som vatten i steg 10.6 och kassera i steg 10.7. Upprepa samma steg för efferent perfusate.
- Utför syremätningar var 10: e minut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leverfunktionen bedöms främst av syreförbrukning och flödeshastighet. En flödeshastighet på 4-8 ml / min och syreförbrukning på 1 μmol / min.g är typisk. Dessa åtgärder kommer att variera beroende på specifika experimentella förhållanden och biologiska skillnader.
Den exakta mängden isofluran som används beror på vilken typ av anestesisystem som används samt musens miljö och ålder/vikt. Under operationen förändras inte isofluran och leveransgas, även om vissa förändringar kan vara nödvändiga beroende på det kirurgiska områdets särdrag (t.ex. bakgrundsbrus)10. När heparin injiceras djupt subkutant kan verkan fördröjas med upp till 20-40 min. En väntetid på 10 minuter efter heparinadministration säkerställer att åtgärden börjar16. Lidokain har en 2 min verkan11.
När du sätter i katetern, håll avfasningen riktad uppåt och gå in i högst 15 ° vinkel från portalvenen. Båda suturerna har två knutar. Den första suturen måste knytas förbi katetertapparen. Om kannulering av portalvenen lyckas bleks levern från spolningen. När kirurgen resekterar levern rensar assistenten det resekterade innehållet med en bomullsspetsapplikator. För att förhindra att levern förorenas och förhindra nicks till loberna, skär inte genom magen. Applicera inte för mycket spänning på portalvenen eller levern när du håller katetern för att förhindra att portalvenen lossnar eller rivs.
Installationen av perfusionsmaskinvara kräver omfattande uppmärksamhet på detaljer (bild 1). Heparininjektioner (figur 2) är viktiga för experimentet. Om blod koagulerar kommer det att ockludera katetern som sätts in i portalvenen, vilket förhindrar flöde. Lidokainjektionen (figur 3) är till för att hjälpa till att desensibilisera området för smärtlindring. Tabell 1 ger ett enkelt doseringsdiagram för heparin och lidokain med saltlösning. Celiotomin och suturering (figur 4) är avgörande för en framgångsrik portalvenkateterisering, leverresektion och framgångsrik överföring till perfusionsriggen. Flödeshastighet och syreförbrukningsmätningar är avgörande för att övervaka leverns hälsa och funktion (figur 6). Det finns ofta en liten skillnad i O2-konsumtion mellan matade och fastande lever, vilket vi tillskriver ökade energibehov som orsakas av glukoneogenes i den fasta levern.
Figur 1. Perfusionskolonn och pumpar. A. En 100 cm vattenmantlad glaspelare där levern hänger i botten. B. Vattenpumpen cirkulerar vatten genom glaskolonnen och värmer perfusatet. C. Syresättaren med tunt glasskikt trycksätts med 95% / 5% O2 / CO2 som syresätter perfusatet. D. Kullagerpumpen cirkulerar perfusat från vattenbadet till den tunna skikts oxygenatorn och glaskolonnen. E. Kullagerpumpen cirkulerar perfusat som levereras in i kolonnen från leveranspumpen och håller perfusate syresatt och upprätthåller ett flöde på 8 ml / min. Kullagerpumpen tar bort efferent perfusat från NMR-röret. G. Våg för att väga perfusat från NMR-röret för att erhålla flödeshastighet i levern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Heparin injektion. Djup subkutan injektion av heparin ges i musens nedre bukfettlager. Det är viktigt när du tar upp musen, att dra huden hårt så att nålen lätt kan tränga in i huden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Lidokain injektion. Musen placeras i ryggläge på den kirurgiska plattformen med tassarna tejpade och näsan i näskonen. Lidokain administreras subkutant i iliac crest-regionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Celiotomi och sutur. Celiotomin exponerar de inre organen, och en hemostat drar dragkraft genom xiphoidprocessen för att hjälpa till att öppna snittet ytterligare. Två suturer placeras runt portalvenen, katetern sätts in och suturerna är bundna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. NMR-rör. Levern avlägsnas från kroppen tillsammans med katetern som sedan fästs på kiselslangen fäst vid glaskolonnen. Levern hängs från kolonnen och kapslas in av NMR-röret. Ett 20 mm NMR-rör skruvas sedan försiktigt fast på kolonnen som kapslar in levern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Syreförbrukning och flödeshastighet. Representativa data från jämförelse av leversyreförbrukning och flödeshastighetsmätningar mellan matad och fastande lever. N = 3 och felstaplar är standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Heparin 1000 enheter/ml | Saltlösning 0,9% | Total |
| 0,01 ml | 0,19 ml | 0,2 ml |
| Lidokain 2% | Saltlösning 0,9% | Total |
| 0,2 ml | 0,6 ml | 0,8 ml |
Tabell 1. Heparin och lidokaindos med saltlösning. Tabellen visar koncentrationen av heparin och lidokain och dosen av varje läkemedel med saltlösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta kirurgiska ingrepp är utmanande och kräver omfattande övning för att uppnå reproducerbara resultat. Isofluran och bärgas bör justeras efter behov för att bibehålla djurets livskraft genom så mycket av det kirurgiska ingreppet som möjligt. Miljö, tid på dagen, ålder, vikt och flera andra faktorer kommer att påverka anestesi. Vikt, kost, stam av möss och ålder kan påverka kirurgi eftersom fettuppbyggnad kan störa visualiseringen av portalvenen. Vid tejpning av tassarna måste man se till att inte belasta nacken som kan leda till kvävning. Dessutom, ju fetare musen desto hårdare suturen måste vara runt katetern för att motverka den minskade friktionskoefficienten mellan katetern och venen som induceras av lipiderna. Uppkomsten av åtgärdstid för heparin är avgörande eftersom överdriven exponering för isofluran producerar artefakter i organ17. Administrering av heparin- och lidokainjektioner kräver en 23G nål 19,05 mm längd, vilket säkerställer inget trauma mot inre organ under injektionen. Suturslingan måste vara över kateterns avsmalnande, annars kommer den att täppa till venen när den dras åt. När katetern sätts in finns det vanligtvis ett återflöde av blod ur katetern från trycket, vilket är ett positivt tecken på korrekt placering. Katetern kan dras uppåt för visuell bekräftelse på att kateterspetsen är tillräckligt långt förbi den första suturen. Att rulla handlederna och axlarna säkerställer att suturen inte glider av den avsmalnande spetsen när assistenten knyter suturen. Vid överföring av levern från silikonperfusionsslangen till kolonnen lämnas en pärla av perfusat ovanpå katetern. Perfusatpärlan förhindrar att luftbubblor kommer in i katetern och går in i levern. Menisken av perfusat ovanpå katetern ger tillräcklig volym för att levern ska fungera tills den är ansluten. För att undvika vridning av levern och portalvenen skruvas NMR-röret långsamt på. Dessutom kräver perfusionssystemet som används i detta experiment inte en tryckventil. Pumparnas flödeshastigheter bibehålls så att glasperfusionskolonnen innehåller perfusat i en höjd av ~ 12 cm. Levern tar upp Krebs buffert genom tyngdkraften, vilket förnekar någon tryckskillnad mellan de två pumparna utan effekt på leverns flödeshastighet. Eftersom levern perfuseras genom tyngdkraften bestäms mängden perfusat som tas upp av levern av leverns naturliga biologiska aktivitet. Inga data samlades in för perfusionstryck eftersom portalventrycket inte är mätbart i detta system.
Det första snittet av celiotomin är grunt för att skapa en öppning, och efterföljande nedskärningar är djupare för att undvika att nicka leverns lober. Den totala längden på snittet för celiotomin är 3 cm för möss av denna ålder och storlek men kommer att förändras baserat på belastning, ålder och vikt. Även om den beskrivna studien använder möss 9-13 veckor gamla, äldre eller yngre möss kan studeras såväl som råttor. Storleken på NMR-röret och portalvenskatetern skulle behöva ändras baserat på den anatomiska storleken på levern och portalvenen för att studera oro. Om portalvenen inte är rak kan en bomullsspetsapplikator hjälpa till att manipulera venen när katetern sätts in. Även om gallgången inte avlägsnas, om det finns ett experimentellt behov av dess frånvaro kan kanalen avlägsnas med fin pincett. Överdriven manipulation av portalvenen vid placering av suturer kommer att orsaka förträngning som gör kateterplaceringen svårare. All päls som fastnar på levern sköljs av med perfusat innan katetern monteras på kolonnen och kapslar in den i NMR-röret. Tidsramen på 30 min för perfusion kan ändras från 20 min till 60 min, men alla tillförlitliga data kommer att samlas in efter de första 10 minuterna av perfusion.
En markör för framgångsrik levervävnadsresektion är efter perfusionen att levern inte har några deformiteter eller andra integritetsproblem. Det är homogent blekgult hela tiden. Om vävnaden skadades under operationen, till exempel ett nick, skulle den ha mörkgula fläckar runt den. Om levern skadades av perfusionen skulle den inte perfusera. Om vävnaden upplevde dålig perfusion av Krebs-bufferten skulle det finnas mörkgula streck i hela organet som ett resultat av svält som leder till vävnadsdöd. En annan metod för att övervaka leverhälsan är syreförbrukning i levern (figur 6). Det har visat sig att mösslever innehåller högre lipid- och glykogenmängder men har liknande totala proteinmängder, så det förväntades att syreförbrukningen i levern när den normaliserades till levermassa skulle ha ett liknande värde. En tredje metod är NMR-data för realtidsdata för metabolisk omsättning.
Metodens huvudsakliga begränsning är själva terminalkirurgin. Det finns en betydande kostnad i möss, utrustning, tid och personal. Därför måste största försiktighet iakttas när dessa procedurer utförs och data samlas in. Biologisk variation inom musmodellen kan skapa svårigheter vid operation. Dessutom är det absolut nödvändigt att undvika optiska förbättringar. Inga optiska förbättringar behövs eftersom all anatomi är synlig för blotta ögat. Optiska förbättringar ökar risken för att fel uppstår eftersom kirurgen och assistenten har ett begränsat synfält, vilket leder till knicks i levern eller oavsiktlig spänning på portalvenen, vilket orsakar ett misslyckande om katetern drar ut. Korrekt implementering av dessa metoder kommer att resultera i > 95% kirurgi framgångsgrad i C57BL / 6J mus. En annan begränsning att tänka på är den 10 min period som krävs för att levern ska nå ett stabilt tillstånd. Det är inte en begränsning för studien som beskrivs här, inte heller i många andra, men för alla experiment som motiverar de första 10 minuterna av data kommer denna metod inte att räcka. Bristen på den komplexa hormonella signaturen associerad med helkroppsmetabolism fungerar också som en begränsning, även om glukagon, insulin etc., och vilken kombination som helst därav, kan läggas tillbaka till perfusatet.
Det finns flera potentiella framtida tillämpningar för denna teknik. Eftersom fler läkemedel utvecklas för behandling av NASH kan standardmetoder för att bedöma leverenergimetabolism hitta bred tillämpning. Eftersom NASH är starkt associerat med levercancer är modeller av dessa cancerformer också ämnen för studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analys eller tolkning av data; i skrivandet av manuskriptet; eller i beslutet att offentliggöra resultaten.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). En del av detta arbete utfördes i McKnight Brain Institute vid National High Magnetic Field Laboratory's Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, som stöds av National Science Foundation Samarbetsavtal nr. DMR-1644779 och delstaten Florida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| 100 cm Water Jacketed Glass Column | N/A | N/A | Custom Made |
| 2-0 Silk Suture | Braintree Scientific | N/A | |
| 22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety | Terumo | SRFF2225 | |
| 23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26407 | |
| 27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles | Exel International | 26426 | |
| 4x4 in. Surgical Platform | N/A | N/A | Custom Made |
| 70% Alcohol Wipe | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Circulating Water Bath | MS Lauda | N/A | Model no longer manufactured |
| Cotton Tip Applicator | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 " | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Scientific Tools | 11251-35 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Scientific Tools | 11274-20 | |
| Hemostats | Fine Scientific Tools | 13015-14 | |
| Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL | RX Generics | 71288-0402-02 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-0704-06 | |
| Lidocaine HCl 2% | VEDCO Inc. | 50989-0417-12 | |
| Membrane-Thin-Layer Oxygenator | Radnoti | N/A | |
| Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 " | Roboz | RS-6013 | |
| Oxygen Meter System | Hanstech Instruments Ltd. | N/A | |
| Saline 0.9% Solution | N/A | N/A | Saline is made in lab |
| Scale | N/A | N/A | Non-specific Brand |
| Variable Speed Analog Console Pump Systems | Cole Palmer | N/A | Models are custom per application |
| Weigh boats | N/A | N/A | Non-specific Brand |
References
- Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State. Metabolites. 11 (7), 441 (2021).
- Lumata, L. Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs. Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).
- Moreno, K. X., et al. Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone. The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).
- Moreno, K. X., et al. Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway. NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R., Burgess, S. C. Flux through hepatic pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase detected by hyperpolarized 13C magnetic resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (47), 19084-19089 (2011).
- Bailey, L. E., Ong, S. D. Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations. Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).
- Kolwicz, S. C. Jr, Tian, R. Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).
- Hwang, G. H., et al. Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).
- Bessems, M., et al. The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model. Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).
- Beal, E. W., et al. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).
- Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine. The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).
- Medical Dictionary. , Merriam-Webster. Available from: https://www.merriam-webster.com/medical (2022).
- Thorpe, D. R. A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , National Press Books. Palo Alto, CA. (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
- Operations Manual Setup, Installation and Maintenance. , Hansatech Instruments. Available from: https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf (2006).
- Heparin. , DrugBank Online. Available from: https://go.drugbank.com/drugs/DB01109 (2022).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).
