Summary
Une plate-forme améliorée pour la culture d’embryons entiers permet un développement ex utero continu et robuste d’embryons de souris post-implantation jusqu’à six jours, des stades de prégestulation jusqu’à l’organogenèse avancée. Dans ce protocole, nous détaillons la procédure standard pour une culture d’embryon réussie en utilisant des plaques statiques et des systèmes de bouteilles rotatives.
Abstract
Les méthodes de culture d’embryons de mammifères postimplantatoires ont été généralement inefficaces et limitées à de brèves périodes après la dissection hors de l’utérus. Des plates-formes ont récemment été développées pour la culture ex utero très robuste et prolongée d’embryons de souris à partir des stades de cylindre d’œuf jusqu’à l’organogenèse avancée. Ces plates-formes permettent un développement approprié et fidèle des embryons prégaztrulés (E5.5) jusqu’au stade de formation des membres postérieurs (E11). Les embryons à gastrulation tardive (E7.5) sont cultivés dans des bouteilles tournantes dans ces contextes, tandis que la culture prolongée à partir des stades de prégestrulation (E5.5 ou E6.5) nécessite une combinaison de cultures en bouteille statiques et rotatives. En outre, la régulation sensible de la concentration d’O2 et de CO2, de la pression des gaz, des niveaux de glucose et de l’utilisation d’un milieu de culture ex utero spécifique est essentielle au bon développement de l’embryon. Ici, un protocole détaillé étape par étape pour la culture étendue d’embryons de souris ex utero est fourni. La capacité de cultiver des embryons de souris normaux ex utero de la gastrulation à l’organogenèse représente un outil précieux pour caractériser l’effet de différentes perturbations expérimentales au cours du développement embryonnaire.
Introduction
Le développement intra-utérin de l’embryon de mammifère a limité l’étude des premiers stades du développement postimplantatoire1,2. L’inaccessibilité de l’embryon en développement entrave la compréhension des processus de développement clés qui se produisent après l’implantation de l’embryon dans l’utérus, tels que l’établissement du plan corporel de l’animal, la spécification des couches germinales ou la formation de tissus et d’organes. De plus, la très petite taille de l’embryon postimplanté précoce le rend difficile à observer par imagerie intravitale in utero avant E103. L’incapacité d’observer et de manipuler des embryons vivants à ces stades a limité l’étude de l’embryogenèse post-implantaire précoce à des instantanés au cours du développement.
Les protocoles de culture in vitro d’embryons de mammifères préimplantatoires sont bien établis, fiables et régulièrement utilisés4. Néanmoins, les tentatives visant à établir des systèmes de culture ex utero capables de soutenir la croissance appropriée des embryons de mammifères après la mise en œuvre ont eu un succès limité5. Diverses techniques de culture sont proposées depuis plus d’un siècle, principalement en cultivant les embryons dans des plaques statiques conventionnelles6,7,8 ou des bouteilles rotatives (cultures à rouleaux)5,9,10. Ces plates-formes se sont avérées utiles pour élargir les connaissances sur le développement des mammifères après l’implantation11,12, bien qu’elles soient très inefficaces pour la survie normale des embryons et limitées à de courtes périodes. Les embryons ont commencé à présenter un retard de développement et des anomalies morphologiques dès 24 à 48 heures après le début de la culture.
Cette étude fournit une description détaillée de la mise en place du système de culture embryonnaire ex utero qui permet un développement continu de la prégestrulation aux stades avancés de l’organogenèse sur une période allant jusqu’à six jours de développement post-implantation13. Cet article décrit le protocole de culture à rouleaux amélioré qui soutient la croissance des embryons E7.5 (plaque neurale et étage de pliage de la tête) jusqu’au stade de formation des membres postérieurs (~ E11) et la culture étendue de E5.5 / E6.5 en combinant la culture sur des plaques statiques et des plates-formes de culture à rouleaux.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de protection des animaux de l’Institut Weizmann des sciences et approuvées par l’Institut Weizmann IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Les femmes enceintes en bonne santé ont été invitées à donner leur consentement éclairé pour prélever du sang dans leur cordon ombilical, tel qu’approuvé par le Comité Helsinki du Centre médical Rambam (#RMB-0452-15). On a demandé aux adultes en bonne santé leur consentement éclairé pour que du sang soit prélevé conformément aux directives du Comité Helsinki de l’Institut Weizmann des sciences (#1566-3).
1. Préparation des médias
- Préparer le milieu de dissection à l’aide de 500 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco sans rouge phénol ni L-glutamine, complété par 10 % de sérum fœtal bovin, 5 mL de pénicilline/streptomycine, et filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
REMARQUE: Conserver le milieu de dissection à 4 °C jusqu’à 1 mois. - Préparez un milieu de culture embryonnaire ex utero (EUCM) fraîchement chaque jour de culture à l’intérieur d’une hotte biologique en utilisant 25% du milieu embryonnaire plus 50% de sérum de rat et 25% de sérum de sang de cordon ombilical humain (HCS) ou de sérum de sang adulte humain (HBS).
- Pour préparer le milieu embryonnaire, ajouter 5 mL de glutamine, 5 mL de HEPES et 5 mL de pénicilline/streptomycine dans 500 mL de DMEM sans rouge phénol et L-glutamine. Préparer 10 à 15 mL d’aliquotes et les conserver à 4 °C pendant deux mois.
REMARQUE: Doublez la concentration d’antibiotiques en cas de contamination. - Inactiver thermiquement le sérum de rat à 56 °C pendant 30 à 45 min et filtrer à travers un filtre à difluorure de polyvinylidène de 0,22 μm. Utilisez le sérum pour la culture le même jour d’inactivation. Décongelez HCS ou HBS et utilisez-le immédiatement pour des expériences.
REMARQUE: Le sérum de rat commercial fournit des résultats cohérents (un minimum de 4 lots ont été testés sans variation évidente). Alternativement, le sérum de rat de haute qualité peut être obtenu en interne comme décrit précédemment8,14. Si hcs n’est pas disponible, remplacez-le par un HBS collecté en interne. Le sérum de rat, le HCS et le HBS peuvent être recongelés une fois et conservés à -20 °C pour une utilisation un autre jour. Décongeler et combiner le sérum recongelé avec un plus grand volume de sérum fraîchement décongelé et ne pas le recongeler.
2. Collecte de sérum de sang de cordon ombilical humain et de sérum de sang humain adulte
- Pour isoler hcs, prélever du sang de cordon ombilical chez les femmes enceintes en bonne santé le jour de l’accouchement par césarienne prévu.
- Serrez deux fois le cordon ombilical à 5-7 cm de l’ombilic et transectez entre les pinces immédiatement après l’accouchement du nourrisson.
- Prélever manuellement le sang à l’aide d’une aiguille de 14 G de gros calibre et d’une seringue de 50 mL directement de la veine ombilicale pendant que le placenta reste in situ pour éviter toute trace d’hémolyse.
REMARQUE: Prélever du sang après que le nourrisson a été retiré du champ de chirurgie et que du sang ombilical a été prélevé pour des tests cliniques.
- Distribuer le sang prélevé dans des tubes à essai stériles de 5 mL de procoagulant et les transférer immédiatement à 4 °C pendant 15 min pour permettre une coagulation complète. Centrifuger les tubes à essai coagulés à 2 500 × g pendant 10 min à 4 °C.
- Jetez les tubes présentant des signes d’hémolyse (sérum rose-rouge). Recueillir le sérum (de couleur jaune) à l’aide d’une pipette de 5 mL et le filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Inactiver le sérum immédiatement dans un bain-marie à 56 °C pendant 45 min.
- Préparer 1 à 1,5 mL d’aliquotes du sérum inactivé et les conserver à -80 °C pendant six mois. Si nécessaire, expédiez à -70 °C en utilisant de la glace carbonique.
- Pour la collecte de sérum sanguin humain adulte, prélever du sang sur des adultes en bonne santé et isoler immédiatement le sérum en suivant le même protocole décrit pour le sérum de sang de cordon ombilical. Conservez le HBS sous forme d’aliquotes inactivées et filtrées à la chaleur à -80 °C pendant six mois.
REMARQUE: Le sérum de cordon ombilical humain et le sérum humain adulte préparés fraîchement à l’interne ont donné des résultats supérieurs au sérum disponible dans le commerce. Recueillir hcS auprès de femmes en bonne santé, âgées de plus de 18 ans et de moins de 40 ans, prévues pour l’accouchement par césarienne. Exclure les femmes qui ont accouché par voie vaginale et les femmes atteintes d’une maladie chronique ou d’affections médicales actives, y compris le diabète gestationnel ou l’hypertension.
3. Culture ex utero à rouleaux d’embryons de E7.5 à E11
- Mise en place de l’incubateur de culture à rouleaux et du régulateur de gaz
- Culture d’embryons E7.5 ou plus avancés à l’aide du système d’incubateur de culture à rouleaux. Allumez le rotateur et l’unité de chauffage à 37 °C pendant au moins 1 h avant la dissection de l’embryon. Ajouter de l’eau autoclavée à la bouteille d’entrée de gaz et au tube à essai de sortie.
REMARQUE: Placez un thermomètre à côté du tambour rotatif et vérifiez fréquemment la stabilité de la température à l’intérieur de l’incubateur. Ouvrez l’incubateur le plus rapidement possible car un temps d’ouverture prolongé augmentera la température et affectera le développement de l’embryon. Si nécessaire, ajoutez plus d’eau autoclavée à la bouteille d’entrée de gaz et au tube à essai de sortie pour les maintenir à un minimum de moitié de capacité pendant la culture. Protégez les embryons à l’intérieur de l’incubateur de la lumière en recouvrant l’incubateur d’un chiffon. - Allumez le module régulateur de gaz en appuyant sur l’interrupteur principal, puis en allumant les régulateurs d’oxygène/azote et de CO2 (Figure 1A). Réglez les valeurs d’oxygène et de CO2 à 5% à l’aide des contrôleurs respectifs. Ouvrez le régulateur de gaz et réglez la pression du gaz sur environ 6,5 à 7 livres par pouce carré (psi) en déplaçant l’interrupteur de tension dans le transmetteur de pression (Figure 1B). Confirmez la valeur de la pression du gaz à l’aide d’un manomètre numérique.
- Surveillez le débit de gaz en vérifiant le taux de bulles créées à l’intérieur du tube à essai rempli d’eau de sortie alloué à l’intérieur de l’incubateur de précision. Réglez le taux de bulles approprié en fermant / ouvrant la vanne de débit de gaz sur le couvercle de la bouteille d’eau. Assurez-vous que le flux de gaz permet la formation de bulles à raison de 2 à 4 bulles par seconde ou réglez le flux de bulles au premier point où le bouillonnement sort dans le tube de sortie rempli d’eau.
- Remplissez les bouteilles de culture avec 2 mL de milieu de culture et branchez-les dans le tambour rotatif évidé pour la prééquilibration pendant 1 h. Utilisez les bouchons de silicium évidés pour sceller les bouteilles au tambour. Gardez scellés les espaces vides dans le tambour rotatif à l’aide des bondes solides.
REMARQUE: L’absence de bulles dans le tube de sortie (pas de gaz traversant le système) ou un débit de gaz exceptionnellement élevé peut affecter le développement de l’embryon. En cas de manque d’écoulement de bulles vers le tube à essai de sortie, vérifiez que toutes les bouchons en silicium sont correctement positionnées dans le tambour rotatif et scellent le système, et vérifiez que la bouteille d’eau est correctement fermée et que tous les tubes sont correctement connectés. Un manque de bouillonnement entrant dans la bouteille d’eau peut indiquer un dysfonctionnement du régulateur de gaz.
- Culture d’embryons E7.5 ou plus avancés à l’aide du système d’incubateur de culture à rouleaux. Allumez le rotateur et l’unité de chauffage à 37 °C pendant au moins 1 h avant la dissection de l’embryon. Ajouter de l’eau autoclavée à la bouteille d’entrée de gaz et au tube à essai de sortie.
- Dissection d’embryons de souris de souris de souris gravides
- Prééquilibrer le milieu de dissection à l’intérieur d’un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 1 h. Laissez le couvercle légèrement ouvert pour permettre l’échange de gaz.
- Sacrifiez la femelle enceinte par luxation cervicale, nettoyez l’abdomen de la femelle avec 70% d’éthanol et coupez la peau et la paroi abdominale avec des ciseaux. Localisez une extrémité de l’utérus et coupez à l’intersection entre l’ovaire et l’utérus. Ensuite, coupez le long de l’utérus jusqu’à l’autre extrémité et transférez-le dans une boîte de Petri de 100 mm remplie de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco à température ambiante.
REMARQUE: L’utilisation de femelles non hormonales et naturellement accouplées est recommandée. - Lavez rapidement les conceptus en DPBS et coupez-les par paires pour faciliter la manipulation des embryons. Déplacez toutes les paires de conceptus sur un support de dissection prééquilibré dans une boîte de Petri de 60 mm et coupez-les en conceptus individuels.
- Enlevez la paroi utérine des conceptus en déchirant le tissu utérin à l’aide d’une paire de pinces grossières. Utilisez de fines pinces microchirurgicales pour couper l’extrémité de la feuille de décidue en forme de poire. Insérez la pince à côté de l’embryon parallèlement à son long axe et ouvrez la pince pour diviser la décidua en deux.
- Enfin, laissez le cône ectoplacentaire intact attaché au cylindre d’œuf en saisissant l’embryon de la décidua et en pelant le sac vitellin pariétal de l’embryon à l’aide d’une pince fine.
REMARQUE: Pour éviter d’affecter l’embryon, effectuez des dissections sur un microscope équipé d’une plaque chauffante à 37 ° C dans un délai maximum de 30 à 40 minutes. Disséquez une portée d’embryons à la fois. - Immédiatement après la dissection, transférer les embryons dans une nouvelle plaque remplie de milieu de dissection équilibré à l’aide d’une pipette Pasteur en verre pour empêcher les embryons de coller aux débris tissulaires.
- Sélectionnez les embryons dans la plaque neurale / au stade précoce du repliement de la tête ne montrant aucun dommage dans l’épiblaste et transférez 5 à 6 embryons par bouteille dans les bouteilles de culture en verre prééquilibrées.
REMARQUE: Pour préparer la pipette Pasteur en verre, coupez l’ouverture de la pipette à une taille adéquate pour s’adapter aux embryons à l’aide d’un coupe-verre et conservez-la dans de l’éthanol pour éviter toute contamination. Lavez la pipette en verre avec du PBS avant de transférer des embryons. Lors du transfert des embryons dans le flacon de culture, assurez-vous de reporter le moins de volume possible du milieu de dissection pour éviter de diluer l’EUCM. - Placer les bouteilles dans le système de culture rotatif à 37 °C, dans une atmosphère de 5% o2 et 5% de CO2.
- Chaque jour de culture, retirez les bouteilles une par une de l’incubateur pour évaluer le développement de l’embryon sous un stéréomicroscope. Assurez-vous de fermer le trou vide dans le tambour avec une bonde solide lorsque vous retirez une bouteille. Coupez l’extrémité d’une pipette Pasteur en plastique stérile pour l’adapter à la taille de l’embryon et déplacez les embryons dans une boîte de Pétri pour faciliter l’observation. Assurez-vous que les embryons sont toujours recouverts de milieu.
REMARQUE: Minimisez le temps pendant lequel les embryons sont à l’extérieur de l’incubateur pour éviter les effets néfastes sur les embryons dus à une diminution de la température corporelle. Manipulez les embryons avec précaution pour éviter la rupture des vaisseaux sanguins du sac vitellin, affectant la survie des embryons. - Au jour de culture 1 (équivalent à E8.5), transférer des groupes de 3 embryons dans un nouveau flacon contenant 2 mL d’EUCM frais et prééquilibré contenant 3 mg/mL supplémentaires de D-glucose et un mélange gazeux de 13% O2, 5% co2.
- Après 48 h (équivalent à E9.5), transférer des groupes de deux embryons dans un nouveau flacon avec de l’EUCM fraîchement préchauffé plus 3,5 mg/mL de glucose dans une atmosphère gazeuse de 18% O2 et 5% de CO2.
- À 72 h de culture (équivalent à E10,5), déplacer chaque embryon dans un flacon individuel contenant 1,5 à 2 mL de milieu frais complété par 4 mg/mL de glucose et un apport en gaz de 21 % o2 et 5 % de CO2.
REMARQUE: Les embryons atteignent leur croissance maximale vers minuit du jour de culture 4. - Utilisez une pince fine pour enlever le sac vitellin et l’amnion, et détachez le cordon ombilical pour une observation correcte de la morphologie de l’embryon. Éteignez le module de régulation de gaz et l’incubateur de précision.
REMARQUE: Prééquilibrer le milieu de culture pendant 1 heure par incubation à l’intérieur d’une bouteille en verre dans la culture à rouleaux avec une atmosphère gazeuse adéquate en fonction du stade embryonnaire. Nettoyez les bouteilles de culture et toute la verrerie de l’incubateur après chaque utilisation en effectuant trois lavages à l’eau distillée courante suivis d’un lavage de nuit immergé dans de l’éthanol à 70%. Lavez à nouveau trois fois avec de l’eau distillée courante, laissez les bouteilles sécher pendant la nuit et stérilisez par autoclave. De même, autoclavez les bouchons en silicium régulièrement. Nettoyez soigneusement tous les outils de dissection avec de l’éthanol à 70% et stérilisez-les à sec.
4. Culture embryonnaire étendue de E5.5/E6.5 à E11
- Prégastrulation de culture (E5.5) et gastrulation précoce (E6.5) embryons jusqu’au stade précoce de la somite (E8.5) dans des plaques statiques.
- Prééquilibrer le milieu de dissection pendant 1 h dans un incubateur contenant 5 % de CO2 à 37 °C.
REMARQUE: Pour permettre l’échange de gaz, ne fermez pas complètement le couvercle du tube. - Préparer les plaques de culture en ajoutant 250 μL d’EUCM fraîchement préparée à chaque puits. Placez les plaques à l’intérieur d’un incubateur à CO2 à 37 °C pour le prééquilibrage.
REMARQUE: Bien que les plaques à 8 puits soient bien adaptées à la croissance embryonnaire, la culture peut être effectuée dans n’importe quelle autre plaque en ajustant le volume du milieu en fonction de la taille de la plaque. - Disséquer les embryons de cylindre d’ovule hors de l’utérus en suivant la technique décrite pour E7.5. Retirez le sac vitellin pariétal de l’embryon et laissez le cône ectoplacentaire intact attaché au cylindre d’œuf.
- Transférer des embryons individuels dans chaque puits de la plaque de 8 puits à l’aide d’une micropipette et placer la plaque à l’intérieur de l’incubateur avec 5% de CO2 à 37 ° C.
- Imagez les embryons sous un stéréomicroscope et sélectionnez pour la culture uniquement ceux avec une cavité amniotique bien formée, sans dommages évidents et sans la membrane de Reichert.
REMARQUE: Utilisez des embouts de pipette de 20 μL pour transférer des embryons E5.5 et des embouts de 200 μL pour transférer des embryons E6.5. Dans le cas de cultures commençant à E6.5, hcs peuvent être remplacés par des HBS fraîchement collectés. - Retirer la moitié du milieu et ajouter 250 μL d’EUCM préavertis fraîchement préparé après 24 h de culture, en veillant à ce que les embryons soient toujours immergés dans le milieu de culture. Dans le cas des cultures commençant à E5.5, après deux jours de culture (équivalent à E7.5), retirer 200 μL et ajouter 250 μL de nouvelle EUCM.
REMARQUE: Pendant la culture statique, les embryons peuvent se fixer à la plaque (principalement lors de l’utilisation de plaques en plastique), ce qui compromettra gravement le développement de l’embryon. La fixation de l’embryon à la plaque est plus fréquente le premier jour de la culture des embryons E5.5. Pour éviter la fixation, éloignez soigneusement les embryons de la surface de la plaque à l’aide de pinces fines et stériles. Vérifiez que seul le cône ectoplacentaire reste attaché à la surface de la plaque. - Transférer les embryons dans la culture à rouleaux au stade précoce de la somite (4-7 somites; après trois jours de culture pour les embryons explantés à E5.5 et deux jours pour les cultures commencées à E6.5), en suivant les mêmes indications décrites précédemment pour les embryons au stade E8.5.
REMARQUE: Le transfert des embryons à la culture à rouleaux à des stades de somite différents de ceux indiqués ci-dessus entraîne l’échec du développement ultérieur. Contrairement aux cultures ex utero E7.5, il est possible de maintenir les embryons dans une atmosphère constante de 21% d’oxygène et 5% de CO2, offrant une efficacité légèrement supérieure au développement embryonnaire que les atmosphères à concentration dynamique d’oxygène.
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Representative Results
Les conditions de culture sur rouleau décrites pour les embryons E7.5 (stade de gastrulation tardive) favorisent une croissance constante et normale des embryons avec une efficacité moyenne proche de 75 % après 4 jours de culture (figure 2 et tableau 1). L’efficacité du développement embryonnaire peut varier selon divers antécédents génétiques de souris, mais elle est toujours robuste (Figure 2C). La supplémentation en HBS au lieu de HCS donne une efficacité d’environ 68% après 4 jours de culture ex utero , en fonction du fond génétique des souris (Figure 2D et Tableau 2). Les embryons développés ex utero récapitulent le bon développement jusqu’au stade de la 44-somite. Par la suite, les embryons présentent des anomalies embryonnaires dues à l’absence du placenta allantoïque, ce qui entraîne une oxygénation et un apport en nutriments insuffisants compte tenu de l’augmentation de la taille du corps à ce stade.
Le développement d’embryons E6.5 (série précoce) dans des plaques statiques est correctement récapitulé avec une efficacité de >90% jusqu’au stade précoce de somite E8.5, en utilisant EUCM avec HCS et HBS (Figure 3, Tableau 3 et Tableau 4) (voir8,13 pour une description détaillée de la stadification embryonnaire entre E5.5 et E8.5). La culture ex utero de la gastrulation à l’organogenèse avancée en combinant des cultures sur des plaques statiques suivies de la culture au rouleau dans une atmosphère d’oxygène constante de 21% donne une efficacité estimée du développement approprié de 55% et 26% au stade 44-somite, en utilisant HCS et HBS, respectivement (Figure 3A, Tableau 3 et Tableau 4). Il y a un retard de 1-2 paires de somite dans ces embryons par rapport aux embryons développés in utero. La plus grande baisse d’efficacité se produit lors de la transition de E8.5 à E9.5 en raison de l’échec de la rotation axiale et de la fermeture du tube neural.
Les cultures à partir d’embryons prégazergués E5.5 montrent une efficacité d’environ 46 % du développement approprié jusqu’au stade précoce de la somite (E8.5), et près de 17 % des embryons termineront leur développement approprié après six jours de culture après avoir été transférés dans la culture à rouleaux (figure 4 et tableau 5). La culture ex utero prolongée prolonge le retard de développement des embryons, les embryons explantés à E5.5 montrant un retard de 2 à 4 paires de somites par rapport aux embryons in vivo . Néanmoins, la morphogenèse et le développement tissulaire se déroulent correctement jusqu’au stade de la 42-somite.
Les défauts les plus courants observés dans les embryons pour les cultures initiées à partir de E7.5, E6.5 et E5.5 sont illustrés à la figure 5A-C. Au moment de la dissection, les embryons présentant des dommages même mineurs à l’épiblaste ou à la région extraembryonnaire, ainsi que les embryons conservant la membrane de Reichert, doivent être jetés. De même, les embryons précoces ne se développeront pas correctement (voir la figure 5B pour les embryons morts) ou présenteront de graves retards de développement (voir la figure 5B pour un embryon retardé). La fixation de l’épiblaste embryonnaire à la surface de la plaque affectera le développement en fonction de la position et du degré d’attachement. La fixation d’une partie de l’épiblaste ou de l’embryon entier entraînera l’échec du développement ultérieur (voir la figure 5B pour un embryon attaché).
Les principales anomalies observées dans le pourcentage d’embryons défectueux à E8,5 (stade précoce de la somite) sont le développement de la région postérieure à l’extérieur du sac vitellin ou des défauts dans la croissance des plis neuronaux (Figure 5A,B). Dans le cas des cultures commencées à E5.5, un défaut de développement fréquemment observé est la présence d’un petit épiblaste sous-développé (Figure 5C). À l’époque équivalente à E9.5, les défauts de fermeture des plis neuronaux, l’échec du virage axial ou une déficience de la croissance cérébrale représentent les anomalies les plus fréquemment observées (Figure 5). Les anomalies de développement les plus fréquemment observées à E10,5/E11 sont des anomalies dans la région de la tête, une perturbation de la circulation sanguine normale dans le sac vitellin et un épanchement péricardique (Figure 5). La rupture d’un vaisseau sanguin principal et l’écoulement sanguin peuvent entraîner la mort ultérieure de l’embryon. Notamment, la croissance correcte de l’embryon lui-même pourrait être atteinte même en l’absence de circulation évidente du sac vitellin. Les embryons conservés en culture au-delà du stade équivalent à E11 présentent un rétrécissement du corps et une mort après quelques heures en raison d’un manque d’oxygénation appropriée des tissus.
Figure 1: Système de régulation du gaz et de la pression adapté à un incubateur de culture à rouleaux. (A) Vue de dessus du module de régulation de gaz connecté à l’incubateur de culture à rouleaux. Le N2 et le CO2 pénètrent dans le régulateur de gaz pour permettre un contrôle précis des concentrations d’oxygène/CO2 et de la pression du gaz. Les gaz sont dirigés vers la boîte de mélange, dans laquelle ils sont mélangés par un ventilateur centrifuge et injectés dans l’incubateur par une pompe qui génère une pression positive. Le gaz circule à travers l’entrée dans une bouteille d’eau et plus tard dans les bouteilles scellées. B) Configuration interne du module électronique pour la régulation du gaz et de la pression. La valeur de tension définie sur le transmetteur de pression régule la pression générée par la pompe à l’intérieur de la boîte de mélange de gaz (5-6 V pour atteindre une pression de 6-7 psi dans ce modèle spécifique). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La plateforme de culture ex utero soutient la croissance des embryons E7.5 jusqu’à l’organogenèse avancée. (A) Diagramme illustrant le protocole de culture embryonnaire ex utero E7.5. (B) Images représentatives en champ lumineux de groupes d’embryons en culture se développant ex utero sur 4 jours, de la gastrulation tardive (E7.5) au stade 44-somite (E11). La variation typique du nombre de somites évaluée toutes les 24 heures est indiquée. Barres d’échelle = 500 μm. (C, D) Pourcentage d’embryons normalement développés à 1-4 jours de culture à partir de E7.5 divisé par les souches parentales de souris et la supplémentation sérique (C, sérum de sang de cordon ombilical humain; D, sérum sanguin humain adulte). Le panneau A a été modifié à partir de 13. Abréviations: EUCM = milieu de culture embryonnaire ex utero; HCS = sérum de sang de cordon ombilical humain; HBS = sérum sanguin humain adulte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Protocole de culture ex utero étendu pour la croissance d’embryons de souris E6.5 à gastrulation précoce jusqu’à l’organogenèse tardive. (A) Illustration schématique du protocole de culture ex utero étendu combinant des plaques statiques et des systèmes de bouteilles rotatives. (B) Images en champ lumineux d’embryons cultivés ex utero pendant cinq jours, de E6.5 au stade de 44 somites. La variation typique du nombre de somites évaluée toutes les 24 heures est indiquée. Barres d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4 : Culture ex utero continue d’embryons de souris avant la prégastrulation à partir de E5.5 jusqu’aux stades avancés de l’organogenèse. (A) Représentation schématique de la culture ex utero le protocole pour les embryons E5.5. (B) Images représentatives en champ lumineux d’embryons cultivés ex utero pendant six jours, de E5.5 jusqu’au stade de la 42 somite. La variation typique du nombre de somites évaluée toutes les 24 heures est indiquée. Barres d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Anomalies représentatives du développement observées chez les embryons cultivés ex utero. (A-C) Images microscopiques en champ lumineux d’embryons de souris anormaux cultivés ex utero à partir de E7.5 (A), E6.5 (B) ou E5.5 (C). Une description générale du défaut est fournie sur chaque image. Barres d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1 : Efficacité du bon développement des embryons isolés à E7,5 jours après le coitum. Les embryons ont été cultivés ex utero pendant 4 jours dans de l’EUCM (25% de sérum de sang de cordon ombilical humain). [-] indique que les cultures n’ont pas continué en raison d’exigences expérimentales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Efficacité du bon développement des embryons isolés à E7.5, cultivés ex utero pendant 4 jours, remplaçant le sérum de sang de cordon ombilical humain par du sérum sanguin humain adulte fraîchement isolé. [-] indique que les cultures n’ont pas continué en raison d’exigences expérimentales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Efficacité du bon développement des embryons (B6D2F1/ICR) isolés à E6.5 et cultivés ex utero pendant 5 jours à l’aide d’EUCM (25% de sérum de sang de cordon ombilical humain). La culture ex utero a été réalisée en culture statique pendant deux jours (21% O2) suivie de trois jours dans des bouteilles rotatives à 21% O2. [-] indique que les cultures n’ont pas continué en raison d’exigences expérimentales. Abréviation : NA = non acquis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Efficacité du bon développement des embryons (B6D2F1/ICR) isolés à E6.5 et cultivés ex utero pendant 5 jours à l’aide de l’EUCM (remplacement du sérum de sang de cordon ombilical humain par du sérum de sang humain adulte fraîchement isolé). Les embryons ont été développés en culture statique pendant deux jours (21% O2) suivis de trois jours dans des flacons rotatifs à 21% O2. [-] indique que les cultures n’ont pas continué en raison d’exigences expérimentales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 5 : Efficacité du bon développement des embryons (B6D2F1/ICR) isolés à E5.5 et cultivés ex utero pendant 6 jours à l’aide d’EUCM (sérum de sang de cordon ombilical humain à 25 %). Les embryons ont été développés en culture statique pendant trois jours (21% O2) suivis de trois jours dans des flacons rotatifs à 21% O2. [-] indique que les cultures n’ont pas continué en raison d’exigences expérimentales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Le protocole de culture présenté ici peut soutenir le développement approprié et continu de l’embryon de souris ex utero jusqu’à six jours, de E5.5 à E11. Auparavant, les embryons à ces stades de développement ne pouvaient se développer normalement en culture que pendant de courtes périodes (jusqu’à 48 h)15. Le couplage du module de régulation des gaz à l’incubateur de culture à rouleaux pour un contrôle précis de la concentration en oxygène et de la pression hyperbare des gaz est essentiel pour la culture appropriée d’embryons de souris décrite ici. L’augmentation de la pression du gaz à 7 psi améliore la diffusion de l’oxygène, permettant le développement de l’embryon jusqu’à E11 dans une atmosphère allant jusqu’à 21% O2 / 5% CO2, contrairement aux conditions précédemment utilisées de 95% O216, qui peuvent être nocives pour l’embryon à long terme. En outre, la concentration en oxygène est connue pour jouer un rôle essentiel dans le développement embryonnaire, car l’embryogenèse post-implantaire précoce a lieu dans des conditions hypoxiques17. En conséquence, la culture réussie d’embryons à gastrulation tardive nécessite une atmosphère initiale de 5% d’O2, avec une augmentation dynamique de la concentration en oxygène à mesure que l’embryon se développe. Remarquablement, la culture d’embryons pré/précoces en culture statique à 5% o2 a considérablement diminué l’efficacité du développement embryonnaire approprié par rapport à 21% o2, et ils n’ont pas pu se développer davantage à E9.5. Ce dernier pourrait s’expliquer par le taux plus lent de diffusion des nutriments et de l’oxygène à travers les tissus embryonnaires dans la culture statique par rapport à la culture dans des bouteilles rotatives1,10.
En outre, la teneur élevée en sérum de sang de cordon ombilical de rat et d’humain fournit des résultats plus cohérents pour la croissance d’embryons post-implantés précoces que les milieux complétés uniquement par du sérum de rat13,18. Il est important de noter que le sérum utilisé pour la culture d’embryons doit être préparé à partir de sang fraîchement extrait. Bien que le sérum de rat de haute qualité pour la culture d’embryons entiers soit disponible dans le commerce, le sérum humain doit être isolé à l’interne. La supplémentation en sérum de sang de cordon ombilical humain peut être remplacée par du sérum isolé du sang humain adulte, qui est largement accessible et assure toujours une croissance embryonnaire constante et efficace.
Le développement réussi et efficace de l’embryon ex utero dépend également fortement de l’isolement précis de l’embryon. Tout d’abord, la procédure de dissection doit être effectuée dans un milieu de dissection chauffé à 37 ° C et les embryons disséqués doivent être transférés dans les bouteilles / plaques de culture dans les 30 minutes. Deuxièmement, l’isolement précis de l’embryon à partir de la décidua et l’ablation de la membrane de Reichert sans endommager l’épiblaste sont essentiels pour obtenir une grande efficacité du développement embryonnaire. Troisièmement, seuls les embryons au stade adéquat doivent être sélectionnés pour la culture, car les embryons précoces / retardés ne se développeront pas correctement.
La manipulation des embryons pendant le transfert est un autre point essentiel pendant la culture ex utero , principalement après le développement du sac vitellin embryonnaire. Les embryons doivent être transférés avec précaution, car les dommages aux principaux vaisseaux sanguins du sac vitellin pourraient affecter le bon développement. En général, plus la période de culture embryonnaire est longue, plus l’efficacité du développement normal de l’embryon est faible, c’est-à-dire que les embryons explantés à E7.5 se développeront avec une efficacité plus élevée que ceux explantés à E6.5 ou E5.5. De plus, la présence d’antibiotiques dans le milieu est fondamentale pour prévenir la contamination si un microscope à dissection attribué à l’intérieur d’une hotte biologique n’est pas disponible.
Il n’est pas exclu que d’autres plates-formes, niveaux de pression ou conditions puissent permettre des résultats similaires ou améliorés aux résultats obtenus avec le présent protocole. Une optimisation supplémentaire des conditions décrites dans cette étude est nécessaire pour atteindre une efficacité du développement embryonnaire égale à celle observée par le développement intra-utérin. En outre, le développement futur d’un milieu défini sans sérum pourrait aider à définir les besoins métaboliques et chimiques spécifiques au cours du développement d’embryons de mammifères et à réduire la variabilité sérique d’un lot à l’autre. La nécessité d’un mélange constant de nutriments et de gaz après E8.5 à l’aide de la culture en bouteilles rotatives dans les paramètres actuels limite les capacités d’imagerie à long terme pendant les étapes d’organogenèse. Le développement futur de dispositifs microfluidiques permettant un mélange de gaz et de nutriments en culture statique couplé à des installations de microscopie pourrait aider à surmonter ce défi.
Les embryons cultivés ex utero peuvent être manipulés expérimentalement et maintenus en culture jusqu’aux stades avancés de l’organogenèse en dehors de l’utérus. Nous avons déjà démontré la capacité d’introduire diverses perturbations dans le développement des embryons, telles que la manipulation génétique par électroporation ou infection lentivirale, l’imagerie vivante, la greffe cellulaire et les études tératogènes13. En fin de compte, cette plate-forme peut aider à découvrir la spécification du devenir cellulaire et les mécanismes de formation d’organes chez les mammifères en permettant l’expérimentation en temps réel d’embryons de souris vivants jusqu’à six jours de développement post-implantation précoce.
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Disclosures
J.H.H est un conseiller de Biological Industries Ltd et a déposé une demande de brevet couvrant les conditions de culture à rouleaux et statiques décrites dans le présent document (déposée par J.H.H. et le Weizmann Institute of Science). D’autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par Pascal et Ilana Mantoux; Conseil européen de la recherche (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Conseil de recherches médicales des agents de bord (FAMRI); Chaire du Fonds israélien de recherche sur le cancer (ICRF), BSF, Helen and Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen and Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, le Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore size filter (250 mL) | JetBiofil | FCA-206-250 | |
| 0.22 µm pore size syringe PVDF filter | Millipore | SLGV033RS | |
| 8-well µ-plates glass bottom/ibiTreat | iBidi | 80827/80826 | |
| Bottle with adaptor cap for gas inlet | Arad Technologies | ||
| Bungs (Hole) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 06 | Used to seal the bottles to the drum |
| Bungs (Solid) | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 07 | Used to seal the rotating drum |
| Culture bottles | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC 03/BTC 04 | Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04 |
| D(+)-glucose Monohydrate | J.T. Baker | ||
| Diamond knife | Fine Science Tools | 10100-30/45 | |
| Digital Pressure Gauge | Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd | BX-DPG80 | |
| DMEM | GIBCO | 11880 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological industries | 02-020-1A | |
| Fetal Bovine Serum | Biological industries | 04-013-1A | |
| Gas regulation module | Arad Technologies | HannaLab1 | |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | glutamine |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| HEPES | GIBCO | 15630056 | |
| Microsurgical forceps (Dumont #5, #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Pasteur pipettes (glass) | Hilgenberg | 3150102 | |
| Pasteur pipettes (plastic) | Alexred | SO P12201 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biological industries | 03-031-1B | |
| Petri Dishes (60 mm and 100 mm) | Falcon | 351007/351029 | |
| Precision incubator system | B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering | BTC01 | BTC01 model with gas bubbler kit |
| Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL) | Greiner Bio-One | #456005 | |
| Rat whole embryo culture serum | ENVIGO Bioproducts | B-4520 | |
| Stereoscopic microscope equipped with heating plate | Nikon | SMZ18 | |
| Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration | Pic Solution | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 |
References
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