Summary
该协议描述了暴露于颗粒物（PM）的复合动物模型，该颗粒物质加重心肌缺血伴动脉粥样硬化。
Abstract
空气污染（尤其是颗粒物污染）引起的健康问题越来越受到关注，尤其是在心血管疾病患者中，这加剧了复杂的疾病，导致预后不良。单纯心肌缺血（MI）或颗粒物（PM）暴露模型不适用于这种多原因疾病的研究。本文描述了一种结合PM暴露、动脉粥样硬化和心肌缺血构建复合模型的方法。ApoE−/− 小鼠喂食高脂饮食16周发展动脉粥样硬化，气管滴注PM标准混悬液模拟PM肺部暴露，最后一次暴露后一周结扎左前降冠状动脉。PM气管滴注可以模拟急性肺部暴露，同时显着降低实验成本;经典的左前降支结扎术搭配无创气管插管和新型辅助扩容装置，可以保证动物的存活率，降低手术难度。该动物模型可以合理模拟患者因空气污染加重心肌梗死的病理变化，为多病因疾病相关动物模型的构建提供参考。
Introduction
空气污染与高全因死亡率有关，并且比水污染、土壤污染和职业暴露的总和更能造成疾病负担1。世卫组织的一份报告显示，2016年室外空气污染导致全球城市和农村地区420万人过早死亡2。全世界91%的人生活在空气质量超过世卫组织指南限值的地方2。此外，细颗粒物（PM）（直径≤2.5微米，PM2.5）被认为是对全球公共卫生最严重的空气污染威胁3，特别是对低收入和中等收入国家城市居民。
空气污染对心血管疾病的不利影响值得更多关注。先前的研究表明，PM会导致心血管疾病（CVD）的风险增加4。暴露于高浓度的超细颗粒数小时可导致心肌梗死死亡率增加。对于有心肌梗死病史的人来说，暴露于超细颗粒会显着增加复发的风险5。此外，人们普遍认为PM暴露会加速动脉粥样硬化6的进展。
对于医学研究，选择合适的动物模型至关重要。单纯动脉粥样硬化动物模型7、心肌缺血动物模型8和PM暴露动物模型9 已经存在。ApoE−/− （载脂蛋白E敲除）小鼠是用于动脉粥样硬化研究的传统小鼠模型。清除ApoE−/− 小鼠血浆脂蛋白的能力严重受损。高脂肪饮食喂养会导致严重的动脉粥样硬化，类似于在人类中观察到的动脉粥样硬化性心脏病的饮食依赖性7。左前降冠状动脉（LAD）结扎术是诱发缺血事件的典型方法8，10。气管输注已被用于许多研究，并因其更好的模拟和更低的成本而从暴露模型11，12 中脱颖而出。
然而，单一疾病的动物模型在科学研究中具有明显的局限性。仅由LAD结扎引起的心肌缺血在实际情况中没有模拟。在自然状态下，心肌缺血通常是由斑块破裂和冠状动脉阻塞引起的13。缺血性心肌病患者通常有动脉粥样硬化性基本病变13。体内也存在脂质代谢异常和炎症反应14。因此，由物理因素或自然条件下引起的缺血具有不同的病理表现。现有研究表明，伴有动脉粥样硬化的心肌缺血模型中的梗死和炎症更为严重15，16。PM暴露会诱发炎症和氧化应激，从而进一步加重动脉粥样硬化和心肌缺血1。三个因子通常在自然状态下共存，因此使用复合模型可以更好地模拟实际情况。
该协议描述了开发结合动脉粥样硬化（AS）和PM急性暴露的心肌缺血（MI）动物模型。用高脂肪饮食喂养ApoE−/− 小鼠以诱导动脉粥样硬化。通过气管滴注PM悬浮液来模拟PM的肺部暴露。小鼠LAD结扎用于诱导心肌缺血。将这些方法结合起来并进行了优化，以更好地模拟疾病状态并提高动物的存活率。无需大型曝光装置或气体麻醉机，使实验易于进行。该模型可用于研究PM暴露在空气污染中对动脉粥样硬化和缺血性心肌病的影响，并研究为治疗具有此类复杂因素的疾病而开发的新药。
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Protocol
此处描述的所有动物活动均由中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准。6-8周龄的雄性ApoE−/−小鼠（C57BL / 6背景）用于研究。
1. 实验准备
- 制备三溴乙醇麻醉剂（15mg / mL）：将0.75g三溴乙醇溶解在1mL叔戊醇中（见 材料表）。完全溶解后，用无菌盐水将其稀释至50mL。将溶液在4°C储存在无菌容器中，避免暴露在光线下。
注意：在该协议中，由于动物的最佳麻醉恢复时间和存活率，使用了三溴乙醇。选择麻醉方案时，请遵循当地动物伦理委员会的建议。 - 制备PM悬浮液：在10 mL离心管中测量5mg DPM（柴油颗粒物，参见 材料表）。加入 5 mL 生理盐水，将试管倒置以充分混合。用石蜡膜密封管子，然后将其放入超声波清洗机中2-3小时（40KHz，80w）进行超声波破碎。
注意：悬浮液应均匀且无颗粒团聚。使用前摇匀。
2.诱导小鼠动脉粥样硬化
- 用高脂肪饮食（蛋黄粉10%，猪油10%，甾醇1%，维持饲料79%，见 材料表）喂养小鼠12周。
- 为了估计动脉粥样硬化的进展，随机选择2-3只小鼠，并通过超声成像或直接解剖观察检查主动脉弓中是否有斑块17。
注意：对于解剖观察，通过随机抽样选择动物并在麻醉后实施安乐死。然后，打开他们的胸腔，直接看到血管。解剖观察通常更可靠，因为超声成像可能无法检测到所有斑块。 - 一旦判断动脉粥样硬化形成，就为下一步准备小鼠。
3.口鼻插管和颗粒物急性暴露
注意：在高脂肪喂养 12 周后，PM 将每周暴露一次，持续 4 周，并持续给予高脂肪饮食。
- 准备一个解剖板（见 材料表），橡皮筋从顶部边缘固定1.5厘米。将解剖板与工作台平面成 60° 角固定。
- 通过腹膜内注射使用三溴乙醇麻醉剂麻醉小鼠（每10g体重0.1mL）。2-3分钟后，翻转鼠标以检查是否有矫正反射。捏住脚趾以确认镇静。滴无菌润滑剂在眼睛上。
- 用酒精湿巾对解剖板进行消毒。
- 将麻醉的鼠标仰卧放在板上，并将上门牙钩在橡皮筋上。
- 使用带有柔性管的小型 LED 聚光灯（请参阅 材料表）。将光线聚焦在位于腋窝线中点附近的气管上。
- 将一小根无菌棉签放入小鼠的嘴里，然后卷起棉签将舌头伸出。
- 握住舌头并轻轻向上拉，使口腔、咽部和气管沿同一纵向。声门是气管的入口，将显示为一个亮点，每次呼吸都会打开和关闭。
- 继续轻轻握住舌头。通过瞄准声门将套管（22G）插入小鼠的气管中，在套管插入气管后拔出针芯。
- 使用带有少量生理盐水的移液枪测试管子是否正确在黄鼠狼中。如果管子在正确的位置，移液器枪中的液柱将在每次呼吸时弹跳。
- 用移液器枪将 50 μL DPM 悬浮液（在步骤 1.2 中制备）放入管中。悬浮液将在呼吸时自然吸入小鼠的肺部。
注意：为确保呼吸顺畅，最好给鼠标两倍的DPM悬浮液（一次25μL），间隔10秒。 - PM 暴露后取下宠物留置针头。等待鼠标留在加热垫上，直到它们恢复意识（10-20分钟），然后放回家庭笼子。
4.冠状动脉结扎术
注意：心肌缺血建模手术（冠状动脉结扎术）在第16周进行 。
- 准备手术器械。高压灭菌后，将所有手术工具存放在密封的器械盒中。手术前将它们浸泡在75%酒精中20-30分钟。
- 构建手术平台。要达到适当的平台坡度，请使用细胞培养皿盖（150 mm x 25 mm）。将 0-0 根真丝（10-15 厘米长）对折，并使用胶带将线的末端连接到倾斜平台的顶部以形成悬挂环。
- 按照步骤3.2中描述的程序麻醉小鼠。
注意：每次三溴乙醇给药之间必须确保间隔1周。 - 用酒精湿巾对平台进行消毒。
- 将鼠标仰卧放在插管平台上，并将上门牙钩在步骤4.2中所述的悬浮环上。用胶带粘住尾巴、四肢和胡须。
- 手术前用脱毛膏去除左胸部和相邻右胸部的部分毛发。
- 按照步骤3.4-3.8中描述的程序对小鼠进行口鼻气插管。
- 将宠物留置针与动物呼吸机连接（见 材料表）。呼吸机设置：呼吸频率 - 120 次/分钟;吸入/呼吸比 - 1：1.1;潮气量 - 1.7 毫升。
- 用碘伏剂和酒精擦拭皮肤进行消毒。
- 暴露内心。用眼科剪刀切开0.5-1厘米的皮肤，支撑肌肉（胸浅肌和前锯肌）以暴露肋骨。用眼科镊子（带钩子）夹住肋骨，然后在第三个肋间隙做一个小切口（见 材料表）。用自制的开胸工具制作手术窗口。
注意：皮肤切口位于剑突和腋窝线的约三分之一处。 - 撕裂心包膜。然后可以按照步骤4.11-4.14连接LAD。
注意：如果肺叶挡住了视线，请使用小型无菌棉签将其推到心脏后面。 - 首先，找到 LAD。
- 使用微血管止血钳用针固定无菌6-0丝缝线（见 材料表）。将丝线穿过冠状动脉所在区域的2毫米宽的心肌。
注意：不要尝试仅结扎LAD，这可能会导致术中大出血。 - 在结扎和心肌组织之间放置一小块无菌 5-0 丝，以防止组织破裂。
- 将LAD和一小束心肌紧紧地绑在它周围。当左心室 （LV） 前壁变白时，结扎术被视为成功;如果连接心电图机，可以同时观察到 ST 段抬高。
- 轻轻挤出胸部的空气。用无菌5-0丝依次缝合肋间肌肉和皮肤。
注意：要挤压胸部的空气，请在肺扩张的瞬间关闭胸部，并用食指和中指轻轻挤压中间的胸腔，让空气从最后一针之外逸出。注射器也可用于提取胸腔气体。
注意：建议进行简单的中断缝合，因为小鼠在清醒时可能会啃丝。
5. 恢复
- 手术后清理所有血迹，否则小鼠会被其他人攻击。
- 将鼠标放在加热垫上的侧卧位置。连续监测小鼠体征5-20分钟，直到它们从麻醉中恢复。监测时间取决于身体的状态。
注意：小鼠在侧卧位置呼吸更容易。 - 一旦矫正反射恢复，将小鼠转移到装有食物和水瓶的加热垫上的清洁恢复笼中。继续监测15-30分钟，以确保小鼠存活。在鼠标完全自主移动之前，请使其远离他人。
- 为防止伤口感染，根据所需剂量（1，00，000-1，50，000 U/kg）肌内注射青霉素钠。详情请参阅药物标签进行剂量转换。
- 将鼠标放回主笼中。在样品收集之前，在接下来的24小时内继续监测。为长期实验使用镇痛药。
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Representative Results
小鼠冠状动脉结扎后24小时实施安乐死，麻醉后采集血液。用三溴乙醇麻醉小鼠（如步骤3.2），并从眶后窦收集血液样品。摘取心脏，并通过2，3，5-三苯基氯化四唑（TTC）染色检查缺血程度 （图1）。当TTC与琥珀酸脱氢酶反应时，正常组织变为红色，而缺血组织由于脱氢酶活性降低而保持苍白18。MI+PM 组的心脏梗死面积比 MI 组大。
图2 显示了主动脉中的斑块通过油红O染色17，19。油红O可以精确地着色组织中的中性脂肪，例如甘油三酯17。图片中的红色斑点表示斑块。AS+PM 组的主动脉比 AS 组的主动脉有更多的斑块。 图 3 显示了提到的自制开箱工具及其用法。
图1：小鼠心脏组织中的TTC染色测定。 梗死区域显示为白色。PM暴露加重心肌缺血。假手术：没有心肌梗死手术或PM暴露;心肌梗死：遭受心肌梗死手术，但没有PM暴露;MI+PM：遭受了MI手术和PM暴露。 请点击此处查看此图的大图。
图2：ApoE−/− 小鼠主动脉油红O染色的代表性示例。 主动脉中的斑块被染成红色。高脂肪喂养导致ApoE-/- 小鼠动脉粥样硬化，PM暴露加重动脉粥样硬化。假：正常饮食的野生型小鼠;AS：高脂肪饮食的ApoE-/- 小鼠;AS+PM：ApoE-/- 高脂肪饮食小鼠，患有PM暴露。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：自制开胸工具。 使用时，将胸部打开工具交叉放置以打开操作窗口。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
复合动物模型的建立与单一MI模型略有不同。在复合模型的开发中，保持高存活率具有挑战性。随着高脂肪喂养时间的延长，ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化的严重程度将变得更加严重7，并且小鼠的虚弱导致死亡率增加。因此，有必要在实验过程中不断监测小鼠的状况，并根据实验的需要调整诱导动脉粥样硬化的时间。
PM暴露可能对小鼠的存活率几乎没有影响。但重复气管插管会引起小鼠20口内出血和水肿，增加后续实验的难度。因此，有必要勤奋地练习插管过程。尝试在尽可能少的尝试中找到正确的位置。由于该实验需要很长时间，因此需要缩短小鼠的长门牙。手术过程中需要避免修剪小鼠的长门牙，包括气管插管;否则，锋利的门牙可能会划伤小鼠舌头并导致出血。
LAD结扎手术会影响小鼠的存活率。谨慎选择经典和保守的LAD冠状动脉胸内结扎术，而不是“高效模型”10 （一种将心脏挤出胸部的方法），以更少的培训成本获得更好的术后长期生存率。
手术中最关键的要素是麻醉、维持小鼠的呼吸和防止出血。与戊巴比妥相比，三溴乙醇可显著提高小鼠的存活率。小鼠将在麻醉后2-5分钟失去知觉，这种情况通常持续到手术结束。如果小鼠醒来，则额外注射0.05mL麻醉剂。
胸腔打开后，应将呼吸机一直连接起来。如果气管插管中间脱落，应立即用止血钳密封胸腔，重新连接呼吸机后可以继续实验。手术期间应避免出血。出血过程往往发生在开放性胸部、心包切除和 LAD 结扎。如果发生出血，请用棉签去除血液。闭合胸腔时应完全挤压排气，闭合胸腔时应使用胸管8 。
小鼠PM暴露方法主要包括暴露塔21、尾静脉注射22和气管滴注23。暴露塔具有巨大的成本（因为昂贵的设备和巨大的PM消耗），而尾静脉注射与PM暴露的自然模式完全不同。气管滴注是一种折衷方式。与PM暴露下的呼吸相比，气管滴漏是一个被动暴露过程。PM在气管和肺部的分布可能与自然状态不同。但作为一种经典方法，气管滴注定量准确，易于实施9。虽然鼻腔滴注危害较小，但在滴鼻时，一些悬浮液可能会进入肺部，一些可能会进入消化系统，有些会留在鼻腔中。由于PM悬浮液不会全部进入肺部，因此鼻腔滴注无法模拟暴露于空气污染。相反，将颗粒物质注入气管可确保所有颗粒物质直接进入肺部。此外，鼻腔较小，需要更高浓度的悬浮液才能达到所需剂量，使得控制施用的平均剂量更加困难。
当前的协议存在某些限制。用于气管滴注的PM悬浮液的原料是柴油发动机的标准颗粒物。它主要含有多环芳烃，是PM的主要成分之一。来自大气的PM的化学成分包括硝酸盐，硫酸盐，元素，有机碳，有机化合物（例如，多环芳烃），生物化合物（例如，内毒素，细胞碎片）和金属（例如，铁，铜，镍，锌和钒）24。颗粒物标准可能与空气中的颗粒物不同，这也不是一个完美的选择。颗粒物的成分因地区、气候和季节而异。因此，从空气中收集的PM是不确定的，导致实验具有挑战性，无法重复相同的结果。使用PM标准品可以使研究具有更好的可重复性。
总之，已经描述了基于颗粒物暴露后动脉粥样硬化发生的心肌缺血模型。该模型可用于研究空气污染对心血管疾病的影响，为建立复杂疾病的动物模型提供参考。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益需要申报。
Acknowledgments
该模型是在国家自然科学基金（第81673640号、81841001号、81803814号）和国家重大创新药物科技计划（2017ZX09301012002和2017ZX09101002001-001-3）的支持下开发的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 75% alcohol disinfectant | |||
| Animal ventilator | Shanghai Alcott Biotech | ALC-V8S | |
| Cotton swabs | Sterile | ||
| Cotton swabs for babies | Sterile , Approximately 3 mm in diameter | ||
| Culture Dish | Corning | 430597 | 150 mm x 25 mm |
| Diesel Particulate Matter | National Institute of Standards Technology | 1650b | |
| Dissection board | About 25 x 17 cm. The dissecting board can be replaced with a wooden board of the same size | ||
| High-fat diet for mice | Prescription: egg yolk powder 10%, lard 10%, sterol 1%, maintenance feed 79% | ||
| Iodophor disinfectant | |||
| LED spotlight | 5 V, 3 W,with hoses and clamps | ||
| Medical silk yarn ball | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 0-0 |
| Medical tape | 3M | 1527C-0 | |
| Micro Vascular Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | W40350 | |
| Needle Holders | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JC32010 | |
| Normal saline | |||
| Ophthalmic Scissors | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | Y00040 | |
| Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with hooks | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1080 | |
| Ophthalmic tweezer, 10cm, curved, with teeth | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. Surgical Instruments Factory | JD1060 | |
| Pipet Tips | Axygen | T-200-Y-R-S | 0-200 μL |
| Pipette | eppendorf | 3121000074 | 100 uL |
| Safety pin | Approximately 4.5 cm in length , for making chest opening tools | ||
| Small Animal I.V. Cannulas | Baayen healthcare suzhou | BAAN-322025 | I.V CATHETER 22FG x 25 MM |
| Suture needle with thread | Shanghai Medical Suture Needle Factory Co., Ltd. | - | 6-0,Nylon line |
| Suture needle with thread | JinHuan Medical | F503 | 5-0 |
| Syringe | 1 mL | ||
| Tert-amyl alcohol | |||
| Zoom-stereo microscope | Mshot | MZ62 |
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