Summary
В настоящем исследовании излагается высоковоспроизводимый и поддающийся лечению метод изучения паракринных неканонических сигнальных событий Wnt in vitro. Этот протокол был применен для оценки влияния паракринной передачи сигналов Wnt5a на клетки нервного гребня мышей и миобласты.
Abstract
Неканоническая передача сигналов Wnt регулирует внутриклеточную организацию актиновой нити и поляризованную миграцию клеток-предшественников во время эмбриогенеза. Этот процесс требует сложных и скоординированных паракринных взаимодействий между сигнальными и сигнальными клетками. Учитывая, что эти взаимодействия могут происходить между различными типами клеток из разных линий, оценка in vivo клеточных специфических дефектов может быть сложной задачей. Настоящее исследование описывает высоковоспроизводимый метод оценки паракринной неканонической передачи сигналов Wnt in vitro. Этот протокол был разработан с возможностью (1) проведения функциональных и молекулярных оценок неканонической передачи сигналов Wnt между любыми двумя типами клеток, представляющими интерес; (2) проанализировать роль молекул, посылающих сигнал, по сравнению с молекулами, принимающими сигнал в неканоническом сигнальном пути Wnt; и (3) проводить фенотипические спасательные эксперименты со стандартными молекулярными или фармакологическими подходами.
Этот протокол использовался для оценки неканонической передачи сигналов Wnt в миобластах, опосредованной нейронными гребневыми клетками (NCC). Наличие NCC связано с увеличением числа фаллоидин-положительных цитоплазматических филоподий и ламеллиподий в миобластах и улучшенной миграцией миобластов в ранозаживляющем анализе. Ось Wnt5a-ROR2 была идентифицирована как важнейший неканонический сигнальный путь Wnt между NCC и кардиомиобластами второго поля сердца (SHF). В заключение, это очень удобный протокол для изучения паракринных неканонических сигнальных механизмов Wnt in vitro.
Introduction
Неканоническая передача сигналов Wnt является эволюционно сохраненным путем, который регулирует организацию клеточной нити и направленную миграцию. Этот путь был вовлечен в многочисленные биологические процессы, включая морфогенез эмбриональной ткани 1,2,3, лимфатический и сосудистый ангиогенез 4,5,6,7 и рост рака и метастазирование 8,9,10 . На клеточном уровне неканоническая сигнализация Wnt осуществляется посредством скоординированных паракринных взаимодействий между сигнально-посылающими и принимающими сигнал клетками. Эти взаимодействия часто происходят между клетками разных линий или типов и включают разнообразную молекулярную сеть, которая включает в себя до 19 лигандов и множественные рецепторы, коорецепторы и эффекторы трансдукции нисходящего сигнала11. Еще больше усложняя этот процесс передачи сигналов, предыдущие исследования показали, что комбинации лиганд-рецептор могут изменяться в зависимости от контекста и ткани12,13, и что одни и те же исходные лиганды, которые управляют неканонической передачей сигналов Wnt в клетках, принимающих сигнал, могут быть произведены несколькими типами сигнальных клеток14,15 . Учитывая клеточную и молекулярную сложность, связанную с неканонической передачей сигналов Wnt, способность изучать индивидуальные и клинически значимые механизмы in vivo была ограничена.
Были предприняты попытки изучить неканоническую передачу сигналов Wnt с использованием методов клеточной культуры in vitro. Например, ранозаживляющие анализы, выполненные в клеточных монослоях, использовались для функциональной оценки клеточной направленной миграции 4,16,17,18,19. Методы иммуноокрашения были использованы для выполнения пространственного анализа экспрессии поверхностного белка для оценки неканонических Wnt-индуцированных изменений в клеточной морфологии 7,10, архитектуре и асимметричной поляризации 18,19,20. Хотя эти подходы предоставили важные инструменты для характеристики фенотипов, связанных с Wnt, в клетках, принимающих сигнал, отсутствие компонентов, посылающих сигнал в этих протоколах, ограничивает их способность точно моделировать паракринные сигнальные механизмы, наблюдаемые in vivo. В результате сохраняется острая необходимость в разработке систем in vitro, которые позволяют надежно и воспроизводимо оценивать паракринные сигнальные взаимодействия между сигнальными и принимающими клетками неканонического пути Wnt, особенно с различными типами клеток.
С этой целью основной целью данного исследования было создание протокола для моделирования паракринных неканонических сигнальных взаимодействий Wnt in vitro. Мы разработали бесконтактную систему кокультуры, которая рекапитулирует сигнально-посылающие и сигнально-принимающие компоненты этих взаимодействий и позволяет использовать стандартные молекулярные, генетические или фармакологические подходы для независимого изучения специфических лиганд-рецепторных механизмов в неканоническом пути Wnt. Механизмы NCC-опосредованной передачи Wnt были исследованы в миобластах с использованием установленных линий мышиных клеток. В качестве доказательства принципа эта модель была использована для подтверждения результатов предыдущих исследований in vivo на мышах, которые подразумевают ось Wnt5a-ROR2 в качестве соответствующего неканонического сигнального пути Wnt между NCC21 и предшественниками кардиомиобластов SHF 3,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Предэкспериментальное расширение и прохождение клеток
- Культура клеток C2C12:
- Приготовьте 500 мл питательной среды C2C12, комбинируя модифицированную среду Eagle's (DMEM) Dulbecco с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином.
- Разморозьте флакон клеток C2C12 на водяной бане 37 °C. Пока клетки C2C12 оттаивают, добавьте 5 мл среды C2C12 в коническую трубку объемом 15 мл. Немедленно перенесите размороженные клетки в трубку объемом 15 мл с помощью пипетки P1000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки C2C12 представляют собой мышиные клетки миобластов, которые ранее использовались и проверялись в качестве первичной клеточной линии для моделирования предшественников кардиомиобластов. - Аккуратно смешайте клетки C2C12 в конической трубке с помощью серологической пипетки. Затем добавьте весь объем размороженных клеток в среде C2C12 (6 мл) в колбу размером 75см2 .
- Добавьте в колбу 6 мл свежей среды C2C12 общим объемом 12 мл. Осторожно поверните колбу таким образом, чтобы раствор ячейки и среды покрывали все дно колбы. Поместите колбу в инкубатор клеточной культуры (37 °C, 5% CO2), чтобы клетки прилипли.
- Позвольте клеткам расширяться в инкубаторе, пока они не достигнут ~ 60% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно определить, периодически удаляя клетки из инкубатора и быстро проверяя их слияние под микроскопом. Обязательно минимизируйте время, в течение которого клетки удаляются из инкубатора.
- Прохождение ячеек C2C12:
- Нагрейте среду C2C12, 500 мл 1x PBS и 0,25% трипсина-ЭДТА на водяной бане с температурой 37 °C. После того, как реагенты будут нагреты, перенесите все реагенты в вытяжку для культивирования клеток.
- Внесите колбу, содержащую клетки C2C12, в вытяжку для культивирования клеток. Осторожно промойте колбу, содержащую ячейки C2C12, теплым 1x PBS дважды.
- Наклоните колбу под углом 45° и аспирируйте среду C2C12 стеклянной пипеткой, подключенной к вакуумному всасыванию. Сохраняя угол 45°, осторожно добавьте 10 мл теплого 1x PBS в угол колбы с помощью серологической пипетки. Положите колбу плашмя на поверхность и осторожно переместите колбу круговыми движениями, чтобы гарантировать, что 1x PBS омывает весь монослой ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарушить монослой C2C12 во время аспирации среды.
- Наклоните колбу под углом 45° и аспирируйте среду C2C12 стеклянной пипеткой, подключенной к вакуумному всасыванию. Сохраняя угол 45°, осторожно добавьте 10 мл теплого 1x PBS в угол колбы с помощью серологической пипетки. Положите колбу плашмя на поверхность и осторожно переместите колбу круговыми движениями, чтобы гарантировать, что 1x PBS омывает весь монослой ячеек.
- Снимите 1x PBS после второй стирки. Добавьте в колбу 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА, осторожно переместите колбу, как описано выше, чтобы раствор трипсина-ЭДТА растекался по как можно большему количеству монослоя, и поместите колбу в инкубатор на 2 мин.
- После 2 мин инкубации извлеките колбу из инкубатора и осторожно постучите по ней, чтобы отсоединить оставшиеся клетки.
- Добавьте 9 мл среды C2C12 в колбу с серологической пипеткой, чтобы погасить трипсин. Используя серологическую пипетку, аккуратно промойте клетки средой и соберите 10 мл трипсинизированной клеточной суспензии. Добавьте 10 мл клеточной суспензии в свежую коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу по 100 × г в течение 5 мин.
- Верните коническую трубку в вытяжку клеточной культуры и удалите супернатант стеклянной пипеткой, подключенной к вакуумному всасыванию. Во время аспирации супернатанта позаботьтесь о том, чтобы не нарушить гранулу клетки в нижней части конической трубки. Для этого оставьте ~0,2 мл надосадочного вещества в конической трубке. Повторное суспендирование клеток в 10 мл свежей среды C2C12.
- Для дополнительной пассации добавьте 1 мл повторно суспендированных клеток в колбу размером 75см2 . Добавьте 11 мл среды C2C12 в колбу с серологической пипеткой и поместите колбу в инкубатор.
- Культура клеток STO:
- Готовят питательную среду STO, производя 500 мл DMEM с 7% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 нМ L-глутамина.
- Приготовьте 0,1% желатина, добавив 0,5 г желатинового порошка во флакон, содержащий 500 мл тканевой или автоклавной воды. Добавьте 7 мл 0,1% раствора желатина в колбу объемом 75см2 . Поверните колбу так, чтобы желатиновый раствор покрыл все дно колбы. Дайте колбе инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в вытяжке для культивирования клеток.
- После 30-минутной инкубации удалите избыток желатина с помощью пипетки, подключенной к вакуумному всасыванию. Дайте колбам остаться в инкубаторе еще на 30 минут перед использованием.
- Разморозьте флакон с клетками STO на водяной бане с температурой 37 °C. Используя пипетку P1000, немедленно перенесите размороженные клетки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл свежеприготовленной питательной среды STO.
ПРИМЕЧАНИЕ: STO-клетки являются мышиными эмбриональными фибробластами, обычно используемыми в качестве фидерных клеток в протоколах клеточных культур. - Аккуратно перемешайте клетки в конической трубке с помощью серологической пипетки. Добавьте весь объем (6 мл) клеток в колбу размером 75см2 с желатиновым покрытием. Поверните колбу, чтобы убедиться, что клеточная суспензия хорошо распределена по дну колбы.
- Добавьте в колбу 6 мл свежей среды STO общим объемом 12 мл. Поверните колбу, как описано выше, чтобы убедиться, что ячейки и среда хорошо распределены по дну колбы. Поместите колбу в инкубатор при температуре 37 °C, чтобы клетки прилипли. Позвольте клеткам размножаться в инкубаторе до тех пор, пока они не достигнут ~ 60-70% слияния.
- Прохождение ячеек STO:
- Теплая клеточная среда STO, 1xPBS и 0,25% трипсина-ЭДТА на водяной бане 37 °C.
- Осторожно промойте колбу, содержащую ячейки STO с теплым 1x PBS, дважды, как описано на этапе 1.2.2.1.
- Добавьте 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в колбу с помощью пипетки P1000. Поместите колбу в инкубатор при температуре 37 °C на 5 мин.
- После 5 мин инкубации выньте колбу из инкубатора. Осторожно постучите по колбе, чтобы отсоединить все прилипшие ячейки.
- Добавьте 9 мл среды STO в колбу, чтобы погасить трипсин и собрать 10 мл трипсинизированной клеточной суспензии, как описано выше. Добавьте 10 мл клеточной суспензии в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугу по 100 × г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 10 мл среды STO, как описано выше. Для дополнительной пассации добавьте 1 мл повторно суспендированных клеток в колбу размером 75см2 . Добавьте 11 мл среды STO, поверните колбу, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и среды по дну колбы, и поместите колбу в инкубатор.
- Неактивная культура клеток STO и препарат базальной среды клеток O9-1:
- Готовят клеточную базальную культуральную среду O9-1 путем смешивания 500 мл DMEM с 15% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 2 нМ L-глутамина, 0,1 мМ минимальных заменяемых аминокислот, 1 нМ пирувата натрия и 55 мкМ бета-меркаптоэтанола.
- Готовят раствор митомицина С в 1x PBS в концентрации 0,5 мг/мл, добавляя 4 мл 1x PBS непосредственно во флакон митомицина C. Пипетка раствора несколько раз с пипеткой P1000. Для дальнейшего растворения митомицина С в 1x PBS поместите флакон на вихревой смеситель или столешницу на 45 мин до 1 ч.
- Инактивируют клетки STO путем обработки пластин STO конечной концентрацией 0,01 мг/мл митомицина C, добавленного к стандартной среде STO. Поместите пластины STO внутрь инкубатора на 2 ч, заботясь о защите колбы, содержащей митомицин С, от света, минимизируя время, проведенное вне инкубатора. После лечения митомицином промывайте клетки в 1x PBS дважды, как описано на этапе 1.2.2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Митомицин С ингибирует пролиферацию клеток STO, так что их можно использовать для генерации кондиционированной среды в течение нескольких дней, не становясь чрезмерно конфлюентными в колбе. - После удаления 1x PBS добавляют 12 мл базальной культуральной среды O9-1 к инактивированным культурам клеток STO и инкубируют их в течение 24 ч. Соберите кондиционированную, инактивированную базальную культуральную среду STO + O9-1 и поместите ее в конические трубки объемом 50 мл, обернутые в фольгу, чтобы защитить ее от света.
- Добавьте 12 мл свежей базальной культуральной среды O9-1 к инактивированным клеточным культурам STO, как описано выше. Повторите этот шаг, добавляя свежую базальную культуральную среду O9-1 к тем же бокам, содержащим инактивированные клетки STO, каждые 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения митомицином С инактивированные клетки STO не могут размножаться; следовательно, колбы, содержащие инактивированные клетки STO, могут быть повторно использованы для получения кондиционированной среды. - Хранить обернутые фольгой 50 мл конические трубки, содержащие кондиционированную, инактивированную базальную культуральную среду STO + O9-1, при 4 °C до тех пор, пока не будет собрано в общей сложности 500 мл среды.
- Культура клеток O9-1:
- Готовят среду для культивирования клеток O9-1, используя 500 мл кондиционированной базальной среды STO + O9-1, и добавляют 103 единицы ингибирующего фактора лейкемии (LIF) и 25 нг/мл основного фактора роста фибробластов (basic-FGF).
- Приготовьте колбы с желатиновым покрытием 0,1%, как описано на этапах 1.3.2-1.3.3.
- Разморозьте флакон с клетками O9-1 на водяной бане с температурой 37 °C. Немедленно переместите размороженные клетки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл свежеприготовленной питательной среды O9-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия O9-1 является единственной стабильной, мультипотентной клеточной линией нервного гребня, которая была сгенерирована мышью. Эта клеточная линия обычно используется в экспериментах с нервным гребнем in vitro . - Аккуратно перемешайте клетки с помощью серологической пипетки. Добавьте все 6 мл клеток в колбу размером 75см2 с желатиновым покрытием.
- Добавьте в колбу 6 мл питательной среды O9-1 общим объемом 12 мл. Поместите колбу в инкубатор при температуре 37 °C, чтобы клетки прилипли. Позвольте клеткам размножаться в инкубаторе до тех пор, пока они не достигнут ~ 60-70% слияния.
- Прохождение ячеек O9-1:
- Теплая питательная среда O9-1, 1x PBS и 0,25% трипсина-ЭДТА на водяной бане 37 °C.
- Осторожно промойте пластину, содержащую ячейки O9-1, теплым 1x PBS дважды, как описано на этапе 1.2.2.1.
- Добавьте в колбу 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 5 мин.
- После 5 мин инкубации извлеките колбу из инкубатора и осторожно постучите по колбе, чтобы отсоединить все прилипшие клетки.
- Добавьте 9 мл питательной среды O9-1 в колбу, чтобы закалить трипсин. Соберите 10 мл трипсинизированной клеточной суспензии и добавьте 10 мл этой клеточной суспензии в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугируют пробирку по 100 × г в течение 5 мин.
- Удалите надосадочный материал и повторно суспендируйте клетки в 10 мл питательной среды O9-1. Для дополнительного пассирования добавьте 1 мл повторно суспендированных клеток в колбу размером 75см2 . Добавьте 11 мл питательной среды O9-1 и поместите колбу, содержащую клетки, в 12 мл среды в инкубатор с температурой 37 °C.
2. Покрытие клеток в системе кокультуры
- Покрытие камер ячейки C2C12:
- После трипсинизации (как описано на этапе 1.2) повторно суспендируют гранулу клетки C2C12 в 10 мл среды C2C12. Разбавьте клетки в соотношении 1:20 в среде C2C12, удалив 0,5 мл из повторно суспендированных клеток C2C12 и добавив их в новую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9,5 мл свежей среды C2C12. Аккуратно смешайте суспензию с серологической пипеткой.
- Добавьте 1 мл разбавленных клеток C2C12 1:20 в каждую лунку нового 4-камерного колодца с помощью пипетки P1000 и поместите 4-камерный колодец в инкубатор.
- Пластинчатые вставки O9-1:
- После трипсинизации повторно суспендируют гранулу клетки O9-1 в 10 мл питательной среды O9-1. Разбавляют клетки в соотношении 1:20 в питательной среде O9-1, удаляя 0,5 мл из повторно суспендированных клеток C2C12 и добавляя их в новую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9,5 мл свежей питательной среды O9-1. Аккуратно смешайте суспензию с серологической пипеткой.
- Поместите одну проницаемую вставку (см. Таблицу материалов) внутри каждой скважины новой 4-камерной скважины, заполненной 1 мл питательной среды O9-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот 4-камерный колодец должен отличаться от того, который содержит ячейки C2C12 из шага 2.1.3. - Добавьте 300 мкл разбавленной клеточной суспензии O9-1 к каждой вставке с помощью пипетки P1000. Убедитесь, что дно каждой вставки погружено в скважину, заполненную 1,3 мл питательной среды O9-1. Поместите колодец в инкубатор при температуре 37 °C.
- (Необязательно). Выполняют нокдаун siRNA в клетках O9-1 или C2C12.
- Выполняйте нокдаун генов с помощью siRNA через 18-24 ч после покрытия либо клеточных вставок O9-1, либо колодцев клеточной камеры C2C12.
- Разбавляют siRNA и трансфекционный реагент в восстановленной сывороточной среде (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителей и желаемыми для эксперимента концентрациями. Осторожно смешайте разбавленную siRNA и трансфекционный реагент (1:1) и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 7 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались концентрации 50 нМ, поскольку эта концентрация siRNA была определена, чтобы привести к достаточному нокдауну экспрессии генов-мишеней. - Добавьте siRNA-липидные комплексы либо в клеточные вставки O9-1, либо в колодцы клеточной камеры C2C12, как определено экспериментальным дизайном, и инкубируйте клетки с комплексами siRNA-липидов в течение ~ 36-48 ч.
- Разбавляют siRNA и трансфекционный реагент в восстановленной сывороточной среде (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителей и желаемыми для эксперимента концентрациями. Осторожно смешайте разбавленную siRNA и трансфекционный реагент (1:1) и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 7 мин.
- Выполняйте нокдаун генов с помощью siRNA через 18-24 ч после покрытия либо клеточных вставок O9-1, либо колодцев клеточной камеры C2C12.
3. Выполнение раневого анализа и количественная оценка миграции миобластов
- Раневой анализ:
- Позвольте клеточным вставкам O9-1 и клеткам C2C12 прилипнуть и размножаться в инкубаторе до тех пор, пока обе клетки не достигнут слияния ~ 70-80%, прежде чем приступать к этой части протокола. Если клетки вырастают >90% сливающимися, не приступайте к анализу царапин, так как клетки будут просто отделяться от колодца.
- Прогрейте 1x PBS и C2C12 среду, поместив их в водяную баню с температурой 37 °C.
- Удалите надосадочную среду из камеры C2C12 и промыть ячейки один раз с 1x PBS. Снимите 1x PBS и немедленно поцарапайте клетки стерильным наконечником пипетки P10.
- Проведите стерильным наконечником пипетки P10 твердо в одном направлении, чтобы охватить всю длину или ширину монослоя ячейки (например, справа налево, сверху вниз). Обязательно поцарапайте каждую лунку, содержащую клетки, только один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации результатов скретчинга царапают скважины различных экспериментальных условий при одинаковом уровне слияния. Для этого убедитесь, что каждая 4-камерная скважина имеет ячейки для каждого требуемого экспериментального условия (например, отрицательный контроль скважины No 1, положительный контроль скважины No 2). Кроме того, используйте новую стерильную пипетку P10 для каждой царапины и прикладывайте аналогичное усилие к пипетке каждый раз. Не пытайтесь создать более одной царапины в каждой скважине. - После царапин быстро добавьте 1 мл 1x PBS обратно в скважину, используя наконечник пипетки P1000. Повторите этот процесс для каждой скважины, которая будет поцарапана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая изменчивость, связанную с каждой царапиной, рекомендуется использовать несколько лунок (n = 3) для создания раны в каждом экспериментальном состоянии. Работайте быстро, так как очень важно свести к минимуму продолжительность, в течение которой ячейки находятся без 1x PBS на этих этапах. После удаления 1x PBS из каждой лунки не следует принимать более 5 с, чтобы создать рану в каждой лунке.
- Проведите стерильным наконечником пипетки P10 твердо в одном направлении, чтобы охватить всю длину или ширину монослоя ячейки (например, справа налево, сверху вниз). Обязательно поцарапайте каждую лунку, содержащую клетки, только один раз.
- После создания раны и добавления 1x PBS обратно в каждую скважину, визуализируйте царапину с помощью перевернутого микроскопа с ярким полем и используйте это изображение в качестве базового размера раны (время 0). Чтобы сделать снимки, выполните следующие действия.
- Включите компьютер и микроскоп (см. Таблицу материалов), нажав кнопку питания. Поместите затвор камеры на сцену и поверните объектив на 5-кратное увеличение.
- Откройте программное обеспечение для создания образов (см. Таблицу материалов), дважды щелкнув значок программного обеспечения на рабочем столе компьютера. Перейдите на вкладку Камера на начальном экране программного обеспечения. Нажмите кнопку Live , чтобы визуализировать ячейки на вкладке AxioCam IC .
- Убедитесь, что световой фильтр вытянут наружу, чтобы свет проходил на камеру и экран компьютера. Вручную перемещайте и/или поворачивайте затвор камеры, чтобы расположить раневую область в центре живого изображения на вкладке AxioCam IC .
- Чтобы сделать снимки, нажмите кнопку привязки , чтобы открыть новую вкладку рядом с вкладкой AxioCam IC , содержащей изображение.
- Чтобы сохранить это неподвижное изображение, нажмите файл в левом верхнем углу домашней страницы программного обеспечения , | сохранить как | введите имя файла в поле имя файла. Сохраните рисунок в формате изображения Carl Zeiss (*.czi) (настройка по умолчанию) и выберите рабочий стол на панели слева, чтобы сохранить файл на рабочем столе в виде файла .czi , который можно открыть только в программном обеспечении Zen lite 2012.
- Чтобы сохранить рисунок в виде .tiff, щелкните файл | сохранить как | введите имя файла в поле Имя файла. Сохраните рисунок как файл изображения с тегами (*.tiff), нажав кнопку сохранить как тип и выбрав *.tiff в раскрывающемся меню.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формат .tiff можно открыть в любом программном обеспечении для обработки изображений. - Вручную переместите слайд камеры, чтобы сделать еще 2-3 снимка в других точках раны в том же колодце.
ПРИМЕЧАНИЕ: В общей сложности это приведет к 3-4 неперекрывающимся изображениям раны с высоким увеличением в каждой лунке.
- Удалите 1x PBS из каждой скважины и добавьте 1 мл среды C2C12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не делать пипетки слишком агрессивно при удалении или добавлении растворов в камеру после образования раны, так как это может привести к отделению клеток от камеры. Кроме того, наклоните камеру так, чтобы аспирация и повторное введение растворов могли быть выполнены по углам каждой скважины, чтобы свести к минимуму разрушение монослоя ячейки. - Соберите систему кокультуры колодезных вставок, вручную разместив вставки, содержащие ячейки O9-1, в каждую скважину камерного колодца. Осторожно вставьте вставки вниз в колодец так, чтобы нижняя часть вставки располагалась чуть выше нижележащих ячеек C2C12. Верните конструкции вставки колодца в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте физического касания нижней части вставки и механического разрушения нижележащих клеток C2C12. - Дайте клеткам мигрировать в общей сложности 9-12 ч. Чтобы определить оптимальное время миграции, проверяйте клетки через 6 ч после создания раны, затем каждые 2-3 ч после этого. Заканчивают эксперимент, когда клетки в контрольных или положительных контрольных условиях начинают полностью закрывать рану.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая бесконтактный характер конструкции, вышележащую вставку нет необходимости удалять из скважин при проверке интервальной прогрессии миграции. Миграционная изменчивость будет наблюдаться в зависимости от таких факторов, как типы клеток, используемые в этом анализе, плотность клеток во время генерации раны, ширина созданной раны и экспериментальные условия манипулирования клетками (например, нокдаун генов, добавление рекомбинантного белка). Концентрации этих реагентов должны быть определены экспериментально под руководством рекомендаций производителя.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация мигрирующих миобластов
- Завершение миграционного анализа и деконструкция системы врезки скважины:
- Удалите вставки ячеек O9-1 после 9-12-часового периода миграции (или альтернативного времени, обозначенного экспериментальными условиями). Тщательно аспирируйте среду C2C12 с помощью пипетки P1000. Добавьте 0,5 мл 1x PBS в камерные скважины и сделайте окончательные снимки клеток после миграции.
- Осторожно аспирируйте все 0,5 мл 1x PBS, смешанные со средой, и извлеките пластиковые камеры из колодцев камеры, используя инструкции по комплекту, оставив нижележащий слайд, содержащий ячейки C2C12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарушить ячейки C2C12, прилипшие к затвору при удалении камерных колодцев.
- Выполнение иммуноокрашивания:
- Немедленно поместите слайд в держатель для слайдов, содержащий 4% параформальдегида (PFA), и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Вылейте 4% PFA и добавьте 0,1% Triton X-100,содержащего 1x PBS (1x PBST) в держатель слайда, чтобы мыть слайд в течение 15 минут при комнатной температуре. Вылейте 1x PBST и добавьте 1x PBS в держатель слайда, чтобы мыть слайд в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторите этот шаг еще раз, чтобы выполнить в общей сложности две промывки PBS по 1 раз.
- Извлеките слайд из держателя слайда. Обведите внешние края слайда гидрофобной ручкой, чтобы создать гидрофобную границу вокруг слайда, чтобы предотвратить попадание растворов с слайда. Позаботьтесь о том, чтобы не нарушить адгезивные клетки.
- Добавьте к слайду 1% раствор для блокировки бычьего сывороточного альбумина (BSA) (разбавленный в 1x PBS) (~0,5 мл на слайд). Убедитесь, что раствор содержится в пределах гидрофобной границы, созданной на шаге 4.2.4. Инкубировать горку в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненной скользящей камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя блокировка BSA не требуется для иммуноокрашивания фаллоидина, этот шаг в протоколе позволяет связать с окрашиванием флуоресцентных антител. - После блокировки в течение 1 ч высыпают блокирующий раствор из слайда, добавляют фаллоидиновое антитело (разбавленное до 1:200 в 1% блокирующем растворе BSA путем добавления 5 мкл антитела к 995 мкл раствора BSA) к слайду и инкубируют при 4 °C в течение ночи. Опять же, убедитесь, что раствор содержится в пределах гидрофобной границы, созданной на этапе 4.2.4. Учитывая, что фаллоидиновое антитело конъюгировано с красителем Alexa Fluor-488, минимизируйте световое воздействие реагента антител до и после добавления на слайд.
- На следующий день поместите слайд в держатель для слайдов, защищенный от воздействия света (например, заверните держатель слайда в фольгу или используйте непрозрачный держатель для слайдов). Мойте ячейки в держателе слайда с 1x PBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите стирку в общей сложности три 10-минутные стирки.
- Добавьте 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI)-содержащую монтажную среду и установите слайды с помощью стеклянных крышек. Представьте себе клетки, которые мигрировали, с помощью стандартного флуоресцентного микроскопа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Влияние ННК на мигрирующую способность мышиных миобластов
Этот анализ был впервые применен для оценки влияния NCC на миграционную способность миобластов. На рисунке 1 показана схематическая модель анализа. Чтобы проверить это воздействие, были проведены анализы царапин с миобластами, которые были выращены изолированно (без вставок NCC) по сравнению с теми, которые выращены в присутствии вкладышей. В качестве положительного контроля 500 нг/мл рекомбинантного Wnt5a (rWnt5a) добавляли в камерные скважины со вставками NCC. Эта концентрация rWnt5a была определена с помощью анализа «доза-реакция», выполненного в клетках C2C12 (дополнительный рисунок S1). Репрезентативные изображения вставок NCC показаны на дополнительном рисунке S2, демонстрируя, что НКЦ здоровы на данный момент времени. Иммунофлуоресценция демонстрирует устойчивое нокдаун Wnt5a на уровне белка после инкубации с 50 нМ siRNA Wnt5a (дополнительный рисунок S3). После 9-часового периода миграции было установлено, что присутствие NCC значительно увеличивает мигрирующую способность миобластов по сравнению с миобластами, анализируемыми при отсутствии Вставок NCC (72,6% рано-вновь заселенной площади против 59,1% рано-заселенной площади, p = 0,033). Добавление rWnt5a к колодцам кокультуры ускорило миграцию миобластов, причем некоторые раневые участки демонстрировали полное восстановление к 9-часовой временной точке, как показано на рисунке 2. Как и ожидалось, мигрирующие миобласты во всех трех условиях демонстрировали нормальную мигрирующую клеточную морфологию, включая хорошо сформированные и выступающие филоподии и ламеллоподии и асимметричную поляризацию актиновых цитоскелетных проекций (рисунок 2C).
Важность Wnt5a, полученного из NCC, для поляризованной миграции миобластов
Для оценки паракринного эффекта Wnt5a, полученного из NCC, на миграцию миобластов были проведены ранозаживляющие анализы в миобластах после опосредованного siRNA-опосредованного нокдауна Wnt5a в NCC. Во-первых, эффективность нокдауна Wnt5a была подтверждена в NCC количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени. Было обнаружено, что лечение 50 нМ siRNA против Wnt5a снижает экспрессию гена Wnt5a на 64% по сравнению с отрицательной контрольной (скремблированной) siRNA (рисунок 3A). Используя эту концентрацию, клеточные вставки O9-1 трансфектировали либо контрольной siRNA, либо Wnt5a siRNA за 48 ч до сборки кокультуры. Клетки C2C12 выращивали в нормальных условиях, а раны создавали при соответствующем слиянии. Сразу после генерации раны к каждой скважине добавлялись отрицательные контрольные или нокдаунные вставки NCC Wnt5a. После 10-часового периода миграции было обнаружено, что нокдаун Wnt5a в NCC значительно снижает основную миобластную миобластную миобластную способность по сравнению с миобластами, анализируемыми контрольными NCC (39,1% раневой вновь заселенной площади против 74,8% раневой вновь заселенной площади, p < 0,001). Кроме того, миобласты, проанализированные в присутствии NCC с нокдауном Wnt5a, демонстрировали аномальную цитологическую морфологию путем иммуноокрашения, включая уменьшенные цитоплазматические участки и меньшее количество актиновых цитоскелетных проекций (рисунок 3D). Чтобы спасти миграцию миобластов, экзогенные добавки 500 нг/мл rWnt5a были добавлены в кокультурные колодцы, содержащие нокдаунные вставки Wnt5a. Было обнаружено, что добавление экзогенного rWnt5a полностью спасает мигрирующие и морфологические дефекты, наблюдаемые в этих миобластах (рисунок 3C,D).
Передача сигналов Wnt5a через ROR2 в миобластах как драйвер поляризованной миграции
Чтобы лучше понять механизмы приемных сигналов клеток в этой паракринной модели, анализ был повторен после нокдауна рецептора ROR2 в миобластах. В этом эксперименте миобласты были трансфектированы 50 нМ сиРНК ROR2 ~ 40 ч до генерации раны, что, как было показано, достаточно для снижения экспрессии гена ROR2 на 54% (рисунок 4A). В течение этого времени вставки NCC выращивались параллельно в нормальных условиях. После того, как миобласты достигли соответствующего слияния, были выполнены анализы царапин и собраны вставки колодца для кокультуры. После 10-часового периода миграции в присутствии вставок NCC нокдаунные миобласты ROR2 продемонстрировали снижение миграционной способности по сравнению с миобластами, обработанными отрицательной контрольной siRNA (48,1% раневой вновь заселенной области против 75,7% раневой вновь заселенной области, p = 0,019) (Рисунок 4B, C). Добавление 500 нг/мл rWnt5a не смогло спасти миграционную способность миобластов после нокдауна ROR2 , предполагая, что истощение ROR2 нарушает способность миобластов принимать сигналы Wnt5a (рисунок 4B, C). Иммуноокрашивание фаллоидина подтвердило миграционные данные и показало, что снижение фаллоидин-положительной ламеллоподии и филоподии в нокдаун-миобластах ROR2 не восстанавливалось дополнительным rWnt5a (рисунок 4D).
Рисунок 1: Схематическая модель анализа. Этап 1 включает расширение in vitro миобласт C2C12 и NCC с использованием фидерных клеток STO. Этап 2 включает в себя покрытие NCC и клеток C2C12 в системе кокультуры. Этап 3 включает раневой анализ, выполняемый в нижележащих клетках C2C12 для оценки клеточной мигрирующей способности. Шаг 4 включает иммуноокрашивание фаллоидина для оценки цитологической архитектуры и морфологии мигрировавших клеток. Сокращения: NCC = клетки нервного гребня; Ab = антитело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Наличие клеток нервного гребня увеличивает миграционную способность миобласта. (А) Наличие вставок клеток нервного гребня (NCC) во время генерации раны приводит к улучшению миграции миобластов. Добавление экзогенного рекомбинантного Wnt5a (rWnt5a) к кокультурам NCC-C2C12 оказывает сильнейшее положительное влияние на миграцию миобластов. (B) Количественная оценка средней площади повторного заполнения миобласта через 9 ч после образования раны (полосы погрешностей показывают стандартное отклонение). (C) Окрашивание фаллоидином миобластов на границе раны через 9 ч после образования раны. Пунктирные прямоугольники показывают окрашенные фаллоидином миобласты на миграционном фронте. В общей сложности n = 3 образца были использованы для каждого экспериментального условия, количественно выраженного в B. Шкала стержней = 200 мкм (для А и С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Wnt5a, полученный из клеток нейронного гребня, необходим для миграции миобластов. (A) Относительная экспрессия мРНК Wnt5a для проверки опосредованного siRNA нокдауна в NCC. (B) Миграция миобласт C2C12 значительно снижается после нокдауна Wnt5a в NCC. Добавление экзогенного rWnt5a достаточно для спасения этого миграционного дефицита в миобластах. (C) Количественная оценка средней площади повторного заселения миобластов через 10 ч после образования раны (полосы погрешностей показывают стандартное отклонение). (D) Окрашивание фаллоидином миобластов на границе раны через 10 ч после образования раны. Пунктирные прямоугольники показывают окрашенные фаллоидином миобласты на миграционном фронте. В общей сложности n = 3 образца были использованы для каждого экспериментального условия, количественно оцененного в C. Шкала стержней = 200 мкм (для B и D). Сокращения: NCC = клетки нервного гребня; siRNA = малая интерферирующая РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Wnt5a сигнализирует через рецепторы ROR2 в миобластах для стимулирования миграции. (A) Относительная экспрессия мРНК ROR2 для проверки опосредованного siRNA нокдауна в клетках C2C12. (B) Нокдаун ROR2 в миобластах снижает их миграционную способность, несмотря на наличие NCC. Экзогенный rWnt5a не может спасти миграцию миобластов после нокдауна ROR2 . (C) Количественная оценка средней площади повторного заселения миобластов через 10 ч после образования раны (полосы погрешностей показывают стандартное отклонение). (D) Окрашивание фаллоидином миобластов на границе раны через 10 ч после образования раны. Пунктирные прямоугольники показывают окрашенные фаллоидином миобласты на миграционном фронте. В общей сложности n = 3 образца были использованы для каждого экспериментального условия, количественно оцененного в C. Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: NCC = клетки нервного гребня; siRNA = малая интерферирующая РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Дозозависимый анализ для рекомбинантных добавок Wnt5a. Дозозависимый анализ для тестирования рекомбинантных добавок Wnt5a 0 нг/мл, 100 нг/мл и 500 нг/мл показал, что 500 нг/мл экзогенного rWnt5a являются оптимальной концентрацией для управления миграцией миобластов и фаллоидиновыми цитоархитектурными изменениями в течение 12-часового миграционного периода in vitro. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Репрезентативные изображения вставок скважин. Яркие изображения колодезных вкладышей, содержащих клетки нервного гребня O9-1, обработанные (A) 50 нМ отрицательной контрольной siRNA и (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Шкала стержней = 200 мкм. Аббревиатура: siRNA = малая интерферирующая РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Репрезентативные изображения экспрессии белка Wnt5a в клетках O9-1 после нокдауна Wnt5a, опосредованного siRNA. Иммунофлуоресцентное окрашивание белка Wnt5a в клетках клеточных культур, содержащих клетки нервного гребня O9-1, обработанные (A) 50 нМ отрицательной контрольной siRNA и (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Шкала баров = 20 мкМ. Аббревиатуры: siRNA = малая интерферирующая РНК; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Неканонический сигнальный путь полярности Wnt/планарных клеток (PCP) является критически важным клеточным сигнальным путем, который был вовлечен в множественные процессы развития24,25 и болезни24,26. Во время эмбрионального развития неканоническая передача сигналов Wnt включает в себя обширную сеть молекулярных сигналов от сигнальных клеток, которые в конечном итоге вызывают изменения в морфологии, асимметричной организации и направленной миграции в клетках, принимающих сигнал11. Предыдущие исследования показали, что специфические лиганд-рецепторные пути, которые управляют этой передачей сигналов, разнообразны, зависят от контекста и часто варьируются между типами клеток 12,13,14,15. Из-за этой молекулярной сложности способность оценивать паракринные неканонические сигнальные взаимодействия Wnt с использованием обычных методов генетической рекомбинации in vivo была ограничена. В то время как системы in vitro все чаще используются в качестве альтернативного подхода для изучения неканонических клеточных фенотипов Wnt, доступные протоколы сосредоточены исключительно на нисходящих аспектах приема сигнала пути и не могут в достаточной степени моделировать межклеточную и паракринную природу этих сигнальных событий. Поэтому целью настоящего исследования была разработка протокола для бесконтактной системы кокультуры, которая повторяет паракринные взаимодействия Wnt in vitro. Основное внимание в этом протоколе было уделено моделированию двух характерных аспектов функциональной неканонической передачи сигналов Wnt in vitro, включая организацию внутриклеточных нитевидных белков и поляризованную миграционную способность.
В качестве доказательства концепции этот протокол был применен для изучения паракринных механизмов в контексте развития сердца. Во время кардиогенеза взаимные сигнальные события между сердечными NCC и клетками-предшественниками СВЧ имеют решающее значение для соответствующего созревания сердечного оттока (OFT)27,28,29. Предыдущая работа показала, что во время развития сердца у мышей NCC-опосредованная передача сигналов Wnt/PCP в глоточных клетках SHF требуется для включения клеток-предшественников SHF в развивающийся OFT и для нормального выравнивания OFT21. Schleiffarth et al. и другие показали, что генетический нокаут гена, кодирующего лиганд Wnt /PCP, Wnt5, нарушает организацию клеток-предшественников СВФ и миграционную способность, что приводит к ракурсированному и смещенному сердечному OFT 22,23,30. При установленных мышиных клеточных линиях NCC (O9-1)31 и миобластов (C2C12) этот протокол демонстрирует, что кокультура с NCC связана с увеличением фаллоидин-положительной цитоплазматической филоподии и ламеллиподии и улучшает миграционную способность миобластов в ранозаживляющем анализе. Эти молекулярные и функциональные конечные точки in vitro основаны на ранее опубликованных протоколах для манипуляций NCC31 и тесно моделируют фенотипические изменения in vivo, описанные у глобальных нокаутирующих мышей Wnt5a, подтверждая полезность этой модели.
Чтобы определить специфический молекулярный путь, приводящий к неканонической передаче сигналов Wnt между NCC и миобластами, были проведены параллельные клеточные эксперименты с нокдауном для генов, кодирующих лиганд-кандидат Wnt5a в NCC и соответствующий ему рецептор ROR2 в миобластах. Как и ожидалось, нокдаун молекул как в сигнально-посылающих (Wnt5a в NCC), так и в сигнально-принимающих (ROR2 в миобластах) клетках независимо друг от друга нарушил Wnt/PCP связанные с актинами цитоархитектурные изменения и ингибировал миграцию миобластов. Важно отметить, что фенотипическое спасение с рекомбинантным Wnt5a наблюдалось только в состоянии нокдауна NCC-Wnt5a, которое поддерживает механизм, посредством которого NCC-производный Wnt5a активирует передачу сигналов PCP в миобластах через рецепторы ROR2. Эти результаты согласуются с данными генетических исследований на мышах, которые идентифицируют ось Wnt5a-ROR2 как важнейшую сигнальную ось Wnt / PCP между NCC и клетками SHF во время эмбрионального развития сердца 3,21. Хотя это не было экспериментально протестировано в этом протоколе, остается неясным, обеспечивает ли Wnt5a, полученный из SHF, взаимные паракринные сигналы к нервному гребню через рецепторы ROR2. Эта гипотеза может быть проверена с использованием этого протокола путем повторения экспериментов с ячейками C2C12 сверху и ячейками O9-1 в нижней части конструкции вставки скважины. Если Wnt5a, полученный из SHF, действительно обеспечивает реципрокный паракринный сигнал через NCC-ROR2, то можно было бы ожидать, что нокдаун Wnt5a в клетках C2C12 ингибирует миграционную способность и полимеризацию актина нижележащих клеток O9-1.
Есть несколько уникальных сильных сторон этого протокола. Во-первых, это бесконтактная система вставки колодца, которая включает в себя последовательное использование ранозаживляющих анализов и методов иммуноокрашения для оценки функциональных и молекулярных характеристик Wnt / PCP в одной и той же популяции клеток, принимающих сигнал. Это не только обеспечивает надежный подход к фенотипированию неканонической Wnt-индуцированной внутриклеточной организации нитей и поляризованных миграционных изменений in vitro , но также позволяет проводить более детальные оценки механизмов передачи сигнала. Хотя этот протокол обеспечивает принципиальное доказательство в отношении молекул Wnt5a-ROR2, модель также легко поддается оценке эффектов других лигандов и рецепторов в неканоническом сигнальном пути Wnt. Можно дополнительно адаптировать протокол иммуноокрашивания для оценки экспрессии множественных потенциальных последующих эффекторных белков (например, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1), которые, как было показано, преобразуют неканонические сигналы Wnt in vivo. Кроме того, уровни белка этих различных эффекторных молекул могут быть коррелированы с мигрирующими или актиновыми цитоархитектурными фенотипами. Во-вторых, бесконтактная природа системы кокультуры позволяет независимо манипулировать специфическими молекулами, посылающими сигнал, и молекулами, принимающими сигнал, в пути Wnt/PCP. В этих репрезентативных результатах он был избран для выполнения клеточно-специфического нокдауна siRNA. Однако этот протокол также поддается использованию фармакологических ингибиторов или генетически модифицированных клеточных линий для оценки потенциальных лиганд-рецепторных путей для клинического применения. Аналогичным образом, можно проводить фенотипические спасательные эксперименты, добавляя молекулярные или фармакологические соединения в кокультурную среду, как было показано с рекомбинантным Wnt5a. Нацеливание этих соединений на избирательное спасение сигнальных и сигнальных нарушений дополнительно проверяет паракринные механистические пути способами, которые не допускаются с использованием современных модельных систем in vivo .
Есть много критических шагов этого протокола. Во-первых, важно обеспечить, чтобы первичные ячейки расширялись и поддерживались при соответствующем слиянии на протяжении всего протокола. Если миобластам C2C12 позволить размножаться до 100% слияния, они начнут сливаться и дифференцироваться от миобластов в миотрубы. Следовательно, эти клетки должны проходить с соответствующей плотностью, как описано. Во-вторых, учитывая, что фидерные клетки STO необходимы для генерации кондиционированной среды для выращивания клеток O9-1, крайне важно, чтобы кто-то соответствующим образом инактивировал клетки STO митомицином C и сделал достаточную (по крайней мере 500 мл) питательную среду O9-1 с использованием инактивированных клеток STO до оттаивания и покрытия клеток O9-1. Возможно, наиболее важным шагом в этом протоколе является генерация соответствующих царапин с однородной геометрией и шириной в монослое миобласта32,33. Шаг 3.1.4 подробно описывает несколько советов по оптимизации этой части протокола. Несмотря на эти рекомендации, следует признать, что изменчивость, связанная со стандартными 2D-скретч-анализами, остается технической проблемой и ограничением этого протокола. Поэтому необходимо иметь несколько технических реплик каждого экспериментального условия.
Наконец, хотя результаты, представленные здесь, были получены с использованием мышиных NCC и миобластов, этот протокол в принципе может быть адаптирован для включения любой интересующей вас ячейки, посылающей и принимающей сигнал. В результате эта система не только имеет приложения для продвижения основных механизмов паракринной неканонической передачи сигналов Wnt в различных контекстах развития, но также может быть использована для тестирования терапевтических механизмов для процессов заболеваний, связанных с Wnt / PCP. Примеры включают фармакологический скрининг лекарств, которые ингибируют Wnt/PCP-индуцированную миграционную способность злокачественных клеток или восстанавливают направленную миграцию терминальных типов клеток, полученных от пациента, с дефектной сигнальной способностью PCP на исходном уровне. Помимо неканонического сигнального пути Wnt, этот протокол также может быть адаптирован для изучения других паракринных сигнальных механизмов и путей между двумя типами клеток. Например, siRNA-опосредованный нокдаун известных секреторных молекул в других путях (например, Notch, Bmp/ Tgf-β, Fgf) в клетках O9-1 может быть связан с иммуноокрашиванием пролиферативных, дифференцированных или апоптотических маркеров в нижележащих миобластах.
В заключение, этот протокол устанавливает новый и очень удобный экспериментальный протокол для изучения механизмов неканонической организации внутриклеточной нити, связанной с Wnt, и поляризованной миграции in vitro. Методы, описанные здесь, улучшают существующие методы, поддерживая межклеточную и паракринную природу взаимодействий Wnt и позволяют независимо оценивать передачу сигнала по сравнению с принимающими сигнал компонентами этого пути. Этот протокол может быть широко применен для исследования основных паракринных механизмов передачи сигналов Wnt / PCP между двумя типами клеток и скрининга новых терапевтических соединений, нацеленных на процессы заболеваний, связанные с Wnt / PCP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана наградами NIH F30HL154324 для O.T. и K08HL121191 и R03HL154301 для S.R.K. Авторы хотели бы признать, что схема на рисунке 1 в этой рукописи была создана с biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al.
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al.
