Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

النمذجة Paracrine إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/63247
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

Summary

تحدد الدراسة الحالية طريقة قابلة للتكرار وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة لدراسة أحداث إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. تم تطبيق هذا البروتوكول لتقييم تأثير إشارات باراكرين Wnt5a في خلايا القمة العصبية للفئران والأرومات العضلية.

Abstract

تنظم إشارات Wnt غير المتعارف عليها تنظيم خيوط الأكتين داخل الخلايا والهجرة المستقطبة للخلايا السلفية أثناء التطور الجنيني. تتطلب هذه العملية تفاعلات باراكرين معقدة ومنسقة بين خلايا إرسال الإشارات وخلايا استقبال الإشارات. بالنظر إلى أن هذه التفاعلات يمكن أن تحدث بين أنواع مختلفة من الخلايا من سلالات مختلفة ، فإن التقييم في الجسم الحي للعيوب الخاصة بالخلية يمكن أن يكون صعبا. تصف الدراسة الحالية طريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. تم تصميم هذا البروتوكول مع القدرة على (1) إجراء تقييمات وظيفية وجزيئية لإشارات Wnt غير المتعارف عليها بين أي نوعين من الخلايا ذات الأهمية. (2) تشريح دور جزيئات إرسال الإشارات مقابل جزيئات استقبال الإشارات في مسار إشارات Wnt غير المتعارف عليه ؛ و (3) إجراء تجارب إنقاذ النمط الظاهري باستخدام الأساليب الجزيئية أو الدوائية القياسية.

تم استخدام هذا البروتوكول لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها بوساطة خلية القمة العصبية (NCC) في الأرومات العضلية. يرتبط وجود NCCs بزيادة عدد الفيلوبوديا السيتوبلازمية الإيجابية للقضيب والصفيحيات في الأرومات العضلية وتحسين هجرة الأرومة العضلية في مقايسة التئام الجروح. تم تحديد محور Wnt5a-ROR2 على أنه مسار إشارات Wnt غير قانوني حاسم بين NCC وأسلاف الأرومة العضلية القلبية في مجال القلب الثاني (SHF). في الختام ، هذا بروتوكول قابل للتتبع للغاية لدراسة آليات إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر.

Introduction

إشارات Wnt غير المتعارف عليها هي مسار محفوظ تطوريا ينظم تنظيم الخيوط الخلوية والهجرة الاتجاهية. وقد تورط هذا المسار في عمليات بيولوجية متعددة ، بما في ذلك تشكل الأنسجة الجنينية1،2،3 ، وتكوين الأوعية الدموية اللمفاوية والأوعية الدموية4،5،6،7 ، ونمو السرطان وورم خبيث8،9،10 . على المستوى الخلوي ، يتم تنفيذ إشارات Wnt غير المتعارف عليها من خلال تفاعلات paracrine المنسقة بين خلايا إرسال الإشارات واستقبال الإشارات. تحدث هذه التفاعلات بشكل متكرر بين الخلايا من سلالات أو أنواع مختلفة وتتضمن شبكة جزيئية متنوعة تشمل ما يصل إلى 19 رابطا ومستقبلات متعددة ومستقبلات مشتركة ومستجيبات نقل إشارة المصب11. ومما يزيد من تعقيد عملية الإشارات هذه ، أظهرت الدراسات السابقة أن مجموعات مستقبلات الرباط يمكن أن تختلف بطريقة تعتمد على السياق والأنسجة 12,13 ، وأن نفس روابط المصدر التي تقود إشارات Wnt غير المتعارف عليها في خلايا استقبال الإشارة يمكن إنتاجها بواسطة أنواع متعددة من الخلايا المرسلة للإشارات 14,15 . نظرا للتعقيد الخلوي والجزيئي المرتبط بإشارات Wnt غير المتعارف عليها ، كانت القدرة على دراسة الآليات الفردية وذات الصلة سريريا في الجسم الحي محدودة.

بذلت محاولات لدراسة إشارات Wnt غير المتعارف عليها باستخدام تقنيات زراعة الخلايا في المختبر. على سبيل المثال ، تم استخدام فحوصات التئام الجروح التي يتم إجراؤها في أحاديات الطبقة الخلوية لتقييم الهجرة الاتجاهية الخلويةوظيفيا 4،16،17،18،19. تم استخدام تقنيات التلوين المناعي لإجراء تحليلات مكانية لتعبير البروتين السطحي لتقييم التغيرات غير المتعارف عليها Wnt في التشكل الخلوي7،10 ، والهندسة المعمارية ، والاستقطاب غير المتماثل18،19،20. على الرغم من أن هذه الأساليب قد وفرت أدوات مهمة لتوصيف الأنماط الظاهرية المرتبطة ب Wnt في خلايا استقبال الإشارات ، إلا أن عدم وجود مكونات إرسال إشارة في هذه البروتوكولات يحد من قدرتها على نمذجة آليات إشارات paracrine بدقة والتي لوحظت في الجسم الحي. نتيجة لذلك ، لا تزال هناك حاجة ماسة لتطوير أنظمة في المختبر تسمح بإجراء تقييم قوي وقابل للتكرار لتفاعلات إشارات paracrine بين خلايا إرسال الإشارات وتلقيها لمسار Wnt غير المتعارف عليه ، لا سيما تلك الخاصة بأنواع الخلايا المختلفة.

تحقيقا لهذه الغاية ، كان الهدف الأساسي من هذه الدراسة هو إنشاء بروتوكول لنمذجة تفاعلات إشارات Wnt غير المتعارف عليها في المختبر. لقد طورنا نظام زراعة مشتركة غير متصل يلخص مكونات إرسال الإشارات واستقبال الإشارات لهذه التفاعلات ويسمح باستخدام الأساليب الجزيئية أو الجينية أو الدوائية القياسية لدراسة آليات مستقبلات الليجند المحددة بشكل مستقل في مسار Wnt غير القانوني. تم فحص آليات إشارات Wnt بوساطة NCC في الأرومات العضلية باستخدام خطوط خلايا الفئران الثابتة. كدليل على المبدأ ، تم استخدام هذا النموذج لتأكيد نتائج الدراسات السابقة في الجسم الحي في الفئران التي تورط محور Wnt5a-ROR2 كمسار إشارات Wnt غير قانوني ذي صلة بين NCCs21 وأسلاف الأرومة العضلية القلبيةSHF 3،22،23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التوسع قبل التجريبي وتمرير الخلايا

  1. ثقافة الخلايا C2C12:
    1. قم بإعداد 500 مل من وسط الاستزراع C2C12 من خلال الجمع بين وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. قم بإذابة قارورة من خلايا C2C12 في حمام مائي 37 درجة مئوية. أثناء ذوبان خلايا C2C12 ، أضف 5 مل من وسط C2C12 إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. انقل الخلايا المذابة على الفور إلى أنبوب 15 مل باستخدام ماصة P1000.
      ملاحظة: خلايا C2C12 هي خلايا الأرومة العضلية للفأر التي تم استخدامها سابقا والتحقق من صحتها كخط خلية أولي لنمذجة أسلاف الأرومة العضلية القلبية.
    3. امزج خلايا C2C12 برفق في الأنبوب المخروطي باستخدام ماصة مصلية. بعد ذلك ، أضف الحجم الكامل للخلايا المذابة في وسط C2C12 (6 مل) إلى دورق 75 سم2 .
    4. أضف 6 مل من وسط C2C12 الطازج إلى الدورق ليصبح حجمه الإجمالي 12 مل. قم بتدوير القارورة برفق بحيث يغطي محلول الخلية والوسائط الجزء السفلي من القارورة بالكامل. ضع القارورة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) للسماح للخلايا بالالتصاق.
    5. اسمح للخلايا بالتوسع في الحاضنة حتى تصل إلى ~ 60٪ التقاء.
      ملاحظة: يمكن تحديد ذلك عن طريق إزالة الخلايا بشكل دوري من الحاضنة والتحقق بسرعة من التقائها تحت المجهر. تأكد من تقليل الوقت الذي تتم فيه إزالة الخلايا من الحاضنة.
  2. تمرير خلايا C2C12:
    1. قم بتسخين وسط C2C12 ، و 500 مل من 1x PBS ، و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد تسخين الكواشف ، انقل جميع الكواشف إلى غطاء زراعة الخلية.
    2. أحضر الدورق الذي يحتوي على خلايا C2C12 إلى غطاء زراعة الخلية. اشطف القارورة التي تحتوي على خلايا C2C12 برفق باستخدام 1x PBS الدافئ مرتين.
      1. قم بإمالة القارورة بزاوية 45 درجة واستنشاق وسط C2C12 باستخدام ماصة زجاجية متصلة بالشفط الفراغي. مع الحفاظ على زاوية 45 درجة ، أضف بعناية 10 مل من 1x PBS الدافئ إلى زاوية القارورة باستخدام ماصة مصلية. ضع القارورة بشكل مسطح على السطح وحرك القارورة برفق بحركات دائرية للتأكد من أن 1x PBS يغسل فوق الطبقة الأحادية بأكملها من الخلايا.
        ملاحظة: احرص على عدم تعطيل الطبقة الأحادية C2C12 أثناء شفط الوسط.
    3. قم بإزالة 1x PBS بعد الغسيل الثاني. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA إلى القارورة ، وحرك القارورة برفق كما هو موضح أعلاه للسماح لمحلول التربسين-EDTA بالانتشار على أكبر قدر ممكن من الطبقة الأحادية ووضع القارورة في الحاضنة لمدة 2 دقيقة.
    4. بعد 2 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة واضغط عليها برفق لفصل أي خلايا متبقية.
    5. أضف 9 مل من وسط C2C12 إلى القارورة باستخدام ماصة مصلية لإخماد التربسين. باستخدام ماصة المصلية ، شطف الخلايا برفق مع الوسط وجمع 10 مل من تعليق الخلايا التربسينية. أضف 10 مل من معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. أعد الأنبوب المخروطي إلى غطاء زراعة الخلية وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بالشفط الفراغي. أثناء استنشاق المادة الطافية ، احرص على عدم تعطيل حبيبات الخلية في قاع الأنبوب المخروطي. للقيام بذلك ، اترك ~ 0.2 مل من المادة الطافية في الأنبوب المخروطي. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط C2C12 الطازج.
    7. لمزيد من المرور ، أضف 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق 75 سم2 . أضف 11 مل من وسط C2C12 إلى القارورة باستخدام ماصة مصلية وضع القارورة في الحاضنة.
  3. زراعة خلايا STO:
    1. قم بإعداد وسط استزراع STO عن طريق صنع 500 مل من DMEM مع 7٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 2 نانومتر L-glutamine.
    2. تحضير 0.1 ٪ الجيلاتين عن طريق إضافة 0.5 غرام من مسحوق الجيلاتين إلى زجاجة تحتوي على 500 مل من المياه من الدرجة الأنسجة أو التعقيم. أضف 7 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى دورق 75 سم2 . قم بتدوير القارورة بحيث يغطي محلول الجيلاتين الجزء السفلي من القارورة بالكامل. دع القارورة تحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غطاء زراعة الخلية.
    3. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة الجيلاتين الزائد باستخدام ماصة متصلة بالشفط الفراغي. دع القوارير تبقى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة أخرى قبل الاستخدام.
    4. قم بإذابة قارورة من خلايا STO في حمام مائي 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة P1000 ، انقل الخلايا المذابة على الفور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط استزراع STO الطازج.
      ملاحظة: خلايا STO هي خلايا ليفية جنينية للفئران تستخدم بشكل روتيني كخلايا مغذية في بروتوكولات زراعة الخلايا.
    5. امزج الخلايا الموجودة في الأنبوب المخروطي برفق باستخدام ماصة مصلية. أضف الحجم الكامل (6 مل) من الخلايا إلى دورق مغلف بالجيلاتين 75 سم2 . قم بتدوير الدورق للتأكد من توزيع معلق الخلية جيدا على طول الجزء السفلي من القارورة.
    6. أضف 6 مل من وسط STO الطازج إلى القارورة بحجم إجمالي 12 مل. قم بتدوير الدورق كما هو موضح أعلاه للتأكد من توزيع الخلايا والوسط بشكل جيد على طول الجزء السفلي من الدورقة. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق. اسمح للخلايا بالتكاثر في الحاضنة حتى تصل إلى التقاء ~ 60-70٪.
  4. تمرير خلايا STO:
    1. وسط خلية STO دافئ ، 1xPBS ، و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. اشطف القارورة التي تحتوي على خلايا STO برفق باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ 1x مرتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.
    3. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA إلى القارورة باستخدام ماصة P1000. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 دقائق من الحضانة ، قم بإزالة القارورة من الحاضنة. اضغط برفق على القارورة لفصل أي خلايا ملتصقة.
    5. أضف 9 مل من وسط STO إلى القارورة لإخماد التربسين وجمع 10 مل من معلق الخلايا التربسينية كما هو موضح أعلاه. أضف 10 مل من معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط STO كما هو موضح أعلاه. لمزيد من المرور ، أضف 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق 75 سم2 . أضف 11 مل من وسط STO ، وقم بتدوير القارورة لضمان التوزيع المتساوي للخلايا والوسط على طول الجزء السفلي من القارورة ، وضع القارورة في الحاضنة.
  5. زراعة خلايا STO غير النشطة وإعداد الوسط القاعدي للخلية O9-1:
    1. تحضير وسط الاستزراع القاعدي للخلايا O9-1 عن طريق خلط 500 مل من DMEM مع 15٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 2 نانومتر L-جلوتامين ، 0.1 مللي متر كحد أدنى من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، 1 نانومتر بيروفات الصوديوم ، و 55 ميكرومتر بيتا ميركابتوإيثانول.
    2. تحضير محلول ميتومايسين سي في 1x PBS بتركيز 0.5 مجم / مل بإضافة 4 مل من 1x PBS مباشرة إلى قارورة ميتوميسين سي. ماصة الحل عدة مرات مع ماصة P1000. لمزيد من إذابة الميتوميسين C في 1x PBS ، ضع القارورة على خلاط دوامة أو هزاز منضدة لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
    3. قم بإلغاء تنشيط خلايا STO عن طريق معالجة ألواح STO بتركيز نهائي قدره 0.01 مجم / مل ميتوميسين C مضاف إلى وسط STO القياسي. ضع ألواح STO داخل الحاضنة لمدة 2 ساعة ، مع الحرص على حماية القارورة التي تحتوي على ميتوميسين C من الضوء عن طريق تقليل الوقت الذي يقضيه خارج الحاضنة. بعد علاج الميتوميسين ، اغسل الخلايا في 1x PBS مرتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.
      ملاحظة: يمنع ميتوميسين C تكاثر خلايا STO بحيث يمكن استخدامها لتوليد وسط مكيف على مدى عدة أيام دون أن تصبح مفرطة في الدورقة.
    4. بعد إزالة 1x PBS ، أضف 12 مل من وسط الاستزراع القاعدي O9-1 إلى مزارع خلايا STO المعطلة واحتضانها لمدة 24 ساعة. اجمع وسط الاستزراع القاعدي STO + O9-1 المشروط والمعطل وضعه في أنابيب مخروطية سعة 50 مل ملفوفة بورق لحمايته من الضوء.
    5. أضف 12 مل من وسط الاستزراع القاعدي O9-1 الطازج إلى مزارع خلايا STO المعطلة كما هو موضح أعلاه. كرر هذه الخطوة بإضافة وسط استزراع قاعدي O9-1 جديد إلى نفس الأجنحة التي تحتوي على خلايا STO المعطلة كل 24 ساعة.
      ملاحظة: بعد علاج ميتوميسين سي ، لا يمكن أن تتكاثر خلايا STO المعطلة ؛ وبالتالي ، يمكن إعادة استخدام القوارير التي تحتوي على خلايا STO المعطلة لتوليد وسيط مشروط.
    6. قم بتخزين الأنابيب المخروطية المغلفة بالرقائق سعة 50 مل والتي تحتوي على وسط استزراع قاعدي مشروط ومعطل STO + O9-1 عند 4 درجات مئوية حتى يتم جمع إجمالي 500 مل من الوسط.
  6. O9-1 ثقافة الخلية:
    1. تحضير وسط زراعة الخلايا O9-1 باستخدام 500 مل من الوسط القاعدي المشروط STO + O9-1 ، وإضافة 103 وحدات من العامل المثبط لسرطان الدم (LIF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 25 نانوغرام / مل (FGF الأساسي).
    2. تحضير 0.1٪ قوارير مغلفة بالجيلاتين كما هو موضح في الخطوات 1.3.2-1.3.3.
    3. قم بإذابة قارورة من خلايا O9-1 في حمام مائي 37 درجة مئوية. انقل الخلايا المذابة على الفور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط نمو O9-1 الطازج.
      ملاحظة: خط الخلية O9-1 هو خط خلية القمة العصبية الوحيد المستقر ومتعدد القدرات الذي تم إنشاؤه من الماوس. يستخدم خط الخلية هذا بشكل شائع في القمة العصبية في التجارب المختبرية .
    4. امزج الخلايا برفق باستخدام ماصة مصلية. أضف 6 مل من الخلايا بالكامل إلى دورق 75 سم2 مغلف بالجيلاتين.
    5. أضف 6 مل من وسط نمو O9-1 إلى القارورة لحجم إجمالي قدره 12 مل. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق. اسمح للخلايا بالتكاثر في الحاضنة حتى تصل إلى التقاء ~ 60-70٪.
  7. تمرير خلايا O9-1:
    1. وسط نمو O9-1 دافئ ، 1x PBS ، و 0.25٪ تربسين-EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. اشطف اللوحة التي تحتوي على خلايا O9-1 برفق باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ 1x مرتين كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.
    3. أضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA إلى القارورة وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 دقائق من الحضانة ، أخرج القارورة من الحاضنة واضغط على القارورة برفق لفصل أي خلايا ملتصقة.
    5. أضف 9 مل من وسط نمو O9-1 إلى القارورة لإخماد التربسين. اجمع 10 مل من معلق الخلايا التربسينية وأضف 10 مل من هذا التعليق الخلوي إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط نمو O9-1. للحصول على تمرير إضافي ، أضف 1 مل من الخلايا المعاد تعليقها إلى دورق 75 سم2 . أضف 11 مل من وسط نمو O9-1 وضع القارورة التي تحتوي على الخلايا في 12 مل من الوسط في حاضنة 37 درجة مئوية.

2. تصفيح الخلايا في نظام الاستزراع المشترك

  1. طلاء غرف الخلايا C2C12:
    1. بعد التربسين (كما هو موضح في الخطوة 1.2) ، أعد تعليق حبيبات الخلية C2C12 في 10 مل من وسط C2C12. قم بتخفيف الخلايا بنسبة 1:20 في وسط C2C12 عن طريق إزالة 0.5 مل من خلايا C2C12 المعاد تعليقها وإضافتها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9.5 مل من وسط C2C12 الطازج. امزج التعليق برفق مع ماصة مصلية.
    2. أضف 1 مل من خلايا C2C12 المخففة 1:20 إلى كل بئر من بئر جديد مكون من 4 غرف باستخدام ماصة P1000 وضع البئر المكون من 4 غرف في الحاضنة.
  2. تصفيح O9-1 إدراج الخلية:
    1. بعد التربسين, إعادة تعليق بيليه خلية O9-1 في 10 مل من وسط نمو O9-1. قم بتخفيف الخلايا بنسبة 1:20 في وسط نمو O9-1 عن طريق إزالة 0.5 مل من خلايا C2C12 المعاد تعليقها وإضافتها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9.5 مل من وسط نمو O9-1 الطازج. امزج التعليق برفق مع ماصة مصلية.
    2. ضع ملحقا واحدا قابلا للنفاذ (انظر جدول المواد) داخل كل بئر في بئر جديد مكون من 4 غرف مملوء ب 1 مل من وسط نمو O9-1.
      ملاحظة: يجب أن يكون هذا البئر المكون من 4 غرف مختلفا عن البئر الذي يحتوي على خلايا C2C12 من الخطوة 2.1.3.
    3. أضف 300 ميكرولتر من معلق الخلية O9-1 المخفف إلى كل ملحق باستخدام ماصة P1000. تأكد من غمر الجزء السفلي من كل ملحق داخل البئر المملوء ب 1.3 مل من وسط نمو O9-1. ضع البئر في حاضنة 37 درجة مئوية.
  3. (اختياري). قم بإجراء ضربة قاضية siRNA في خلايا O9-1 أو خلايا C2C12.
    1. قم بإجراء ضربة قاضية للجين بواسطة siRNA 18-24 h بعد طلاء إما إدخالات خلية O9-1 أو آبار غرفة الخلية C2C12.
      1. قم بتخفيف siRNA وكاشف النقل في وسط مصل مختزل (انظر جدول المواد) وفقا لتوصيات الشركات المصنعة والتركيزات المطلوبة للتجربة. اخلطي برفق siRNA المخفف وكاشف النقل (1: 1) واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق.
        ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام تركيزات 50 نانومتر حيث تم تحديد تركيز siRNA هذا ليؤدي إلى ضربة قاضية كافية للتعبير الجيني المستهدف.
      2. أضف مجمعات الدهون siRNA إما إلى إدخالات خلية O9-1 أو آبار غرفة الخلية C2C12 على النحو الذي يحدده التصميم التجريبي واحتضان الخلايا بمجمعات الدهون siRNA لمدة ~ 36-48 ساعة.

3. إجراء فحص الجروح والتقييم الكمي لهجرة الأرومة العضلية

  1. فحص الجرح:
    1. اسمح لإدخالات الخلية O9-1 وآبار غرفة الخلية C2C12 بالالتصاق والتكاثر في الحاضنة حتى تصل كلتا الخليتين إلى التقاء ~ 70-80٪ قبل متابعة هذا الجزء من البروتوكول. إذا نمت الخلايا بنسبة >90٪ ، فلا تتابع فحص الخدش ، لأن الخلايا ستنفصل فقط عن البئر.
    2. قم بتسخين 1x PBS و C2C12 المتوسطة بوضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة الوسط الطافي من غرفة C2C12 جيدا واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS. قم بإزالة 1x PBS وخدش الخلايا على الفور بطرف ماصة P10 معقم.
      1. مرر طرف ماصة P10 المعقم بإحكام في اتجاه واحد ليمتد بطول أو عرض الطبقة الأحادية للخلية بالكامل (على سبيل المثال ، من اليمين إلى اليسار ، من أعلى إلى أسفل). تأكد من خدش كل بئر تحتوي على خلايا مرة واحدة فقط.
        ملاحظة: لتحسين نتائج الخدش ، خدش الآبار ذات الظروف التجريبية المختلفة عند مستوى التقاء مماثل. للقيام بذلك ، تأكد من أن كل بئر مكون من 4 غرف يحتوي على خلايا لكل حالة تجريبية مطلوبة (على سبيل المثال ، التحكم السلبي # 1 ، التحكم الإيجابي # 2). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم ماصة P10 معقمة جديدة لكل خدش وقم بتطبيق مقدار مماثل من القوة على الماصة في كل مرة. لا تحاول إنشاء أكثر من خدش واحد في كل بئر.
      2. بعد الخدش ، أضف بسرعة 1 مل من 1x PBS مرة أخرى إلى البئر باستخدام طرف ماصة P1000. كرر هذه العملية لكل بئر سيتم خدشه.
        ملاحظة: نظرا للتباين المرتبط بكل خدش ، يوصى باستخدام آبار متعددة (ن = 3) لإنشاء الجرح في كل حالة تجريبية. اعمل على وجه السرعة لأنه من الأهمية بمكان تقليل المدة التي تكون فيها الخلايا بدون 1x PBS أثناء هذه الخطوات. بعد إزالة 1x PBS من كل بئر ، لا ينبغي للمرء أن يأخذ أكثر من 5 ثوان لتوليد جرح في كل بئر.
    4. بعد توليد جرح وإضافة 1x PBS مرة أخرى إلى كل بئر ، قم بتصوير الخدش باستخدام مجهر مقلوب برايتفيلد واستخدم هذه الصورة كحجم الجرح الأساسي (الوقت 0). لالتقاط الصور ، قم بتنفيذ الخطوات التالية:
      1. قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر (انظر جدول المواد) بالضغط على زر الطاقة. ضع شريحة الحجرة على المسرح وقم بتدوير قرص الهدف إلى تكبير 5x.
      2. افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) بالنقر المزدوج فوق رمز البرنامج على سطح مكتب الكمبيوتر. انقر فوق علامة التبويب الكاميرا على الشاشة الرئيسية للبرنامج. انقر فوق الزر Live لتصور الخلايا الموجودة في علامة التبويب AxioCam IC .
      3. تأكد من سحب مرشح الضوء بالكامل للسماح للضوء بالمرور إلى الكاميرا وشاشة الكمبيوتر. حرك و/أو قم بتدوير شريحة الحجرة يدويا لوضع منطقة الجرح في وسط الصورة الحية على علامة التبويب AxioCam IC .
      4. لالتقاط الصور، انقر فوق محاذاة لفتح علامة تبويب جديدة بجوار علامة التبويب AxioCam IC التي تحتوي على الصورة.
      5. لحفظ هذه الصورة الثابتة ، انقر فوق ملف في الجزء العلوي الأيسر من الصفحة الرئيسية للبرنامج | حفظ باسم | أدخل اسم الملف في مربع اسم الملف . احفظ الشكل بتنسيق Carl Zeiss image (*.czi) (الإعداد الافتراضي)، وحدد desktop على الشريط الموجود على اليسار لحفظ الملف على سطح المكتب كملف . czi ، والذي لا يمكن فتحه إلا في برنامج Zen lite 2012.
      6. لحفظ الصورة كملف .tiff، انقر فوق ملف | حفظ باسم | أدخل اسم الملف في المربع اسم الملف. احفظ الشكل كملف صورة موسومة (*.tiff) بالنقر فوق الزر حفظ كنوع وتحديد *.tiff من القائمة المنسدلة.
        ملاحظة: يمكن فتح تنسيق .tiff في أي برنامج لمعالجة الصور.
      7. قم بتغيير موضع شريحة الحجرة يدويا لالتقاط 2-3 صور أخرى في نقاط أخرى من الجرح في نفس البئر.
        ملاحظة: في المجموع ، سيؤدي ذلك إلى 3-4 صور غير متداخلة وعالية التكبير للجرح في كل بئر.
    5. قم بإزالة 1x PBS من كل بئر وأضف 1 مل من وسط C2C12.
      ملاحظة: احرص على عدم استخدام الماصة بقوة شديدة عند إزالة أو إضافة محاليل إلى الغرفة جيدا بعد توليد الجرح ، لأن هذا قد يتسبب في انفصال الخلايا عن بئر الغرفة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإمالة الغرفة جيدا بحيث يمكن إجراء الشفط وإعادة إدخال المحاليل في زوايا كل بئر لتقليل اضطراب الطبقة الأحادية للخلية.
    6. قم بتجميع نظام الاستزراع المشترك لإدخال البئر عن طريق وضع الإدخالات التي تحتوي على خلايا O9-1 يدويا في كل بئر من بئر الغرفة. ادفع الإدخالات برفق لأسفل في البئر بحيث يقع الجزء السفلي من الإدخال فوق خلايا C2C12 الأساسية مباشرة. أعد تركيبات إدراج البئر إلى الحاضنة.
      ملاحظة: لا تسمح للجزء السفلي من الملحق باللمس المادي وتعطيل خلايا C2C12 الأساسية ميكانيكيا.
    7. اسمح للخلايا بالترحيل لمدة 9-12 ساعة. لتحديد وقت الترحيل الأمثل ، تحقق من الخلايا في 6 ساعات بعد إنشاء الجرح ، ثم كل 2-3 ساعات بعد ذلك. قم بإنهاء التجربة عندما تبدأ الخلايا المسيطرة أو ظروف التحكم الإيجابية في تغطية الجرح بالكامل.
      ملاحظة: نظرا لطبيعة عدم الاتصال للبناء ، لا يلزم إزالة الملحق العلوي من الآبار عند التحقق من تقدم ترحيل الفاصل الزمني. سيتم ملاحظة تباين الهجرة اعتمادا على عوامل مثل أنواع الخلايا المستخدمة في هذا الفحص ، والكثافة الخلوية في وقت توليد الجرح ، وعرض الجرح الذي تم إنشاؤه ، والظروف التجريبية للخلايا التي تم التلاعب بها (على سبيل المثال ، ضربة قاضية للجينات ، إضافة البروتين المؤتلف). يجب تحديد تركيزات هذه الكواشف تجريبيا بتوجيه من توصيات الشركة المصنعة.

4. تلطيخ المناعي وتصوير الخلايا العضلية المهاجرة

  1. إنهاء فحص الترحيل وتفكيك نظام إدخال البئر:
    1. قم بإزالة إدخالات الخلية O9-1 بعد فترة ترحيل 9-12 ساعة (أو وقت بديل تحدده الظروف التجريبية). استنشاق وسط C2C12 بعناية باستخدام ماصة P1000. أضف 0.5 مل من 1x PBS إلى آبار الغرفة ، والتقط صورا نهائية للخلايا بعد الترحيل.
    2. استنشاق بعناية كل 0.5 مل من 1x PBS مختلطة مع وسيط وإزالة الغرف البلاستيكية من آبار الغرفة باستخدام تعليمات المجموعة ، وترك الشريحة الأساسية التي تحتوي على خلايا C2C12.
      ملاحظة: احرص على عدم تعطيل خلايا C2C12 الملتصقة بالشريحة عند إزالة آبار الغرفة.
  2. أداء التلوين المناعي:
    1. ضع الشريحة على الفور في حامل منزلق يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اسكب 4٪ PFA وأضف 0.1٪ Triton X-100 المحتوي على 1x PBS (1x PBST) إلى حامل الشريحة لغسل الشريحة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اسكب 1x PBST وأضف 1x PBS إلى حامل الشريحة لغسل الشريحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر هذه الخطوة مرة أخرى لما مجموعه غسلتين 1x PBS.
    2. قم بإزالة الشريحة من حامل الشريحة. تتبع الحواف الخارجية للشريحة باستخدام قلم كاره للماء لإنشاء حدود كارهة للماء حول الشريحة لمنع انسكاب المحاليل من الشريحة. احرص على عدم تعطيل الخلايا الملتصقة.
    3. أضف محلول حجب ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 1٪ (مخفف في 1x PBS) إلى الشريحة (~ 0.5 مل لكل شريحة). تأكد من احتواء المحلول داخل الحدود الكارهة للماء التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.4. احتضان الشريحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة شريحة مرطبة.
      ملاحظة: على الرغم من أن حجب BSA غير مطلوب للتلطيخ المناعي للقضيب ، فإن هذه الخطوة في البروتوكول تسمح بالاقتران مع تلطيخ الأجسام المضادة الفلورية.
    4. بعد الحجب لمدة 1 ساعة ، اسكب محلول الحجب من الشريحة ، وأضف الجسم المضاد phalloidin (المخفف إلى 1: 200 في محلول حجب BSA بنسبة 1٪ عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 995 ميكرولتر من محلول BSA) إلى الشريحة واحتضانها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. مرة أخرى ، تأكد من احتواء المحلول داخل الحدود الكارهة للماء التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.4. بالنظر إلى أن الجسم المضاد phalloidin مقترن بصبغة Alexa Fluor-488 ، قلل من التعرض للضوء لكاشف الأجسام المضادة قبل وبعد الإضافة إلى الشريحة.
    5. في اليوم التالي، ضع الشريحة في حامل منزلق محمي من التعرض للضوء (على سبيل المثال، لف حامل الشريحة بورق أو استخدم حامل منزلق غير شفاف). اغسل الخلايا الموجودة في حامل الشرائح باستخدام 1x PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الغسيل لمدة ثلاث غسلات لمدة 10 دقائق.
    6. أضف 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - وسيط تركيب يحتوي على وركب الشرائح بأغطية زجاجية. قم بتصوير الخلايا التي هاجرت باستخدام مجهر مضان قياسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

آثار NCCs على القدرة المهاجرة للأرومات العضلية للفئران
تم تطبيق هذا الاختبار لأول مرة لتقييم تأثير NCCs على القدرة المهاجرة للخلايا العضلية. يوضح الشكل 1 النموذج التخطيطي للفحص. لاختبار هذا التأثير ، تم إجراء فحوصات الخدش باستخدام الأرومات العضلية التي نمت في عزلة (بدون إدخالات NCC) مقارنة بتلك التي نمت في وجود إدراجات. كعنصر تحكم إيجابي ، تمت إضافة 500 نانوغرام / مل من Wnt5a المؤتلف (rWnt5a) إلى آبار الغرفة مع إدخالات NCC. تم تحديد تركيز rWnt5a هذا من خلال تحليل الجرعة والاستجابة الذي تم إجراؤه في خلايا C2C12 (الشكل التكميلي S1). يتم عرض الصور التمثيلية لإدراج NCC في الشكل التكميلي S2 ، مما يدل على أن NCCs تتمتع بصحة جيدة في هذه النقطة الزمنية. يظهر التألق المناعي ضربة قاضية قوية ل Wnt5a على مستوى البروتين بعد الحضانة مع 50 نانومتر من Wnt5a siRNA (الشكل التكميلي S3). بعد فترة هجرة مدتها 9 ساعات ، وجد أن وجود NCCs زاد بشكل كبير من قدرة هجرة الأرومات العضلية مقارنة بالأرومات العضلية التي تم فحصها في غياب إدخالات NCC (72.6٪ منطقة معاد سكنها بالجروح مقابل 59.1٪ منطقة معاد توطينها بالجروح ، p = 0.033). أدت إضافة rWnt5a إلى آبار الاستزراع المشترك إلى تسريع هجرة الأرومة العضلية ، حيث أظهرت بعض مناطق الجرح الشفاء التام بحلول النقطة الزمنية 9 ساعات ، كما هو موضح في الشكل 2. كما هو متوقع ، أظهرت الأرومات العضلية المهاجرة في جميع الحالات الثلاثة مورفولوجيا خلوية مهاجرة طبيعية ، بما في ذلك الفيلوبوديا جيدة التكوين والبارزة و lamellopodia والاستقطاب غير المتماثل لإسقاطات الأكتين الهيكلية الخلوية (الشكل 2C).

أهمية Wnt5a المشتق من NCC للهجرة المستقطبة للخلايا العضلية
لتقييم تأثير paracrine ل Wnt5a المشتق من NCC على هجرة الأرومة العضلية ، تم إجراء فحوصات التئام الجروح في الخلايا العضلية بعد ضربة قاضية بوساطة siRNA ل Wnt5a في NCCs. أولا ، تم التحقق من كفاءة ضربة قاضية Wnt5a في NCCs عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي. تم العثور على العلاج باستخدام 50 نانومتر siRNA ضد Wnt5a لتقليل التعبير الجيني Wnt5a بنسبة 64٪ مقارنة بالتحكم السلبي (المخفوق) siRNA (الشكل 3A). باستخدام هذا التركيز ، تم نقل إدخالات خلية O9-1 إما باستخدام siRNA الضابطة أو Wnt5a siRNA 48 h قبل تجميع الاستزراع المشترك. نمت خلايا C2C12 في ظل الظروف العادية ، وتم إنشاء الجروح عند التقاء مناسب. مباشرة بعد توليد الجرح ، تمت إضافة التحكم السلبي أو إدخالات NCC بالضربة القاضية Wnt5a إلى كل بئر. بعد فترة هجرة مدتها 10 ساعات ، وجد أن ضربة قاضية ل Wnt5a في NCCs قللت بشكل كبير من قدرة هجرة الأرومة العضلية الأساسية مقارنة بالخلايا العضلية التي تم فحصها باستخدام NCCs الضابطة (39.1٪ منطقة معاد توطينها بالجروح مقابل 74.8٪ منطقة معاد سكنها بالجروح ، p < 0.001). علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا العضلية التي تم فحصها في وجود NCCs مع ضربة قاضية ل Wnt5a مورفولوجيا خلوية غير طبيعية عن طريق التلطيخ المناعي ، بما في ذلك انخفاض مناطق السيتوبلازم وعدد أقل من إسقاطات الأكتين الخلوي الهيكلي (الشكل 3D). لإنقاذ هجرة الأرومة العضلية ، تمت إضافة مكملات خارجية من 500 نانوغرام / مل من rWnt5a إلى آبار الاستزراع المشترك التي تحتوي على إدخالات ضربة قاضية Wnt5a. تم العثور على إضافة rWnt5a الخارجية لإنقاذ العيوب المهاجرة والمورفولوجية التي لوحظت في هذه الأرومات العضلية (الشكل 3C ، D).

إشارات Wnt5a من خلال ROR2 في الخلايا العضلية كمحرك للهجرة المستقطبة
لفهم آليات الخلايا المستقبلة للإشارة بشكل أفضل في نموذج paracrine هذا ، تم تكرار الفحص بعد ضربة قاضية لمستقبل ROR2 في الأرومات العضلية. في هذه التجربة ، تم نقل الخلايا العضلية باستخدام 50 نانومتر من ROR2 siRNA ~ 40 ساعة قبل توليد الجرح ، والذي ثبت أنه كاف لهدم التعبير الجيني ROR2 بنسبة 54٪ (الشكل 4 أ). خلال هذا الوقت ، نمت إدراج NCC بالتوازي في ظل الظروف العادية. بعد أن وصلت الأرومات العضلية إلى نقطة التقاء مناسبة ، تم إجراء فحوصات الخدش ، وتم تجميع إدخالات بئر الاستزراع المشترك. بعد فترة هجرة مدتها 10 ساعات في وجود إدخالات NCC ، أظهرت الأرومات العضلية ROR2 قدرة هجرة منخفضة مقارنة بالأرومات العضلية المعالجة بالتحكم السلبي siRNA (48.1٪ منطقة معاد سكنها بالجروح مقابل 75.7٪ منطقة معاد سكنها بالجروح ، p = 0.019) (الشكل 4B ، C). فشلت إضافة 500 نانوغرام / مل rWnt5a في إنقاذ قدرة هجرة الأرومة العضلية بعد ضربة قاضية ROR2 ، مما يشير إلى أن استنفاد ROR2 يعطل قدرة الخلايا العضلية على استقبال إشارات Wnt5a (الشكل 4B ، C). أكد التلوين المناعي لل phalloidin البيانات المهاجرة وأظهر أن الانخفاض في الصفائحية الإيجابية للقضيب و filopodia في الخلايا العضلية ROR2 لم يتم استعادته بواسطة rWnt5a التكميلي (الشكل 4D).

Figure 1
الشكل 1: نموذج تخطيطي للفحص. تتضمن الخطوة 1 التوسع في المختبر للخلايا العضلية C2C12 و NCCs باستخدام خلايا تغذية STO. تتضمن الخطوة 2 طلاء خلايا NCCs و C2C12 في نظام الاستزراع المشترك. تتضمن الخطوة 3 فحص الجرح الذي يتم إجراؤه في خلايا C2C12 الأساسية لتقييم قدرة الهجرة الخلوية. تتضمن الخطوة 4 تلطيخا مناعيا لل phalloidin لتقييم البنية الخلوية ومورفولوجيا الخلايا المهاجرة. الاختصارات: NCCs = خلايا القمة العصبية ؛ Ab = الأجسام المضادة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: يزيد وجود خلايا القمة العصبية من قدرة هجرة الأرومة العضلية. (أ) يؤدي وجود حشوات خلية قمة عصبية (NCC) في وقت توليد الجرح إلى تحسين هجرة الأرومة العضلية. إن إضافة Wnt5a المؤتلف الخارجي (rWnt5a) إلى الثقافات المشتركة NCC-C2C12 له أقوى تأثير إيجابي على هجرة الأرومة العضلية. (ب) القياس الكمي لمتوسط المنطقة المعاد سكنها في الأرومة العضلية عند 9 ساعات بعد توليد الجرح (تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري). (ج) تلطيخ Phalloidin من myoblasts على حدود الجرح 9 ساعات بعد توليد الجرح. تظهر المستطيلات المتقطعة الأرومات العضلية الملطخة بالقضيب في الجبهة المهاجرة. تم استخدام ما مجموعه n = 3 عينات لكل حالة تجريبية محددة كميا في B. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (ل A و C). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: Wnt5a المشتق من خلايا القمة العصبية ضروري لهجرة الأرومة العضلية. (أ) تعبير mRNA النسبي ل Wnt5a للتحقق من صحة الضربة القاضية بوساطة siRNA في NCCs. (ب) يتم تقليل هجرة الأرومات العضلية C2C12 بشكل كبير بعد ضربة قاضية Wnt5a في NCCs. إضافة rWnt5a الخارجية كافية لإنقاذ هذا العجز المهاجر في الخلايا العضلية. (ج) القياس الكمي لمتوسط المنطقة المعاد سكنها بالخلايا العضلية عند 10 ساعات بعد توليد الجرح (تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري). (د) تلطيخ القضيب للخلايا العضلية عند حدود الجرح بعد 10 ساعات من توليد الجرح. تظهر المستطيلات المتقطعة الأرومات العضلية الملطخة بالقضيب في الجبهة المهاجرة. تم استخدام ما مجموعه n = 3 عينات لكل حالة تجريبية محددة كميا في C. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (ل B و D). الاختصارات: NCCs = خلايا القمة العصبية ؛ siRNA = الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: إشارات Wnt5a من خلال مستقبلات ROR2 في الخلايا العضلية لدفع الهجرة. (أ) تعبير mRNA النسبي ل ROR2 للتحقق من صحة الضربة القاضية بوساطة siRNA في خلايا C2C12. (ب) ضربة قاضية من ROR2 في الخلايا العضلية يقلل من قدرتها على الهجرة على الرغم من وجود NCCs. فشل rWnt5a الخارجي في إنقاذ هجرة الأرومة العضلية بعد ضربة قاضية ROR2. (ج) القياس الكمي لمتوسط المنطقة المعاد سكنها بالخلايا العضلية عند 10 ساعات بعد توليد الجرح (تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري). (د) تلطيخ القضيب للخلايا العضلية عند حدود الجرح بعد 10 ساعات من توليد الجرح. تظهر المستطيلات المتقطعة الأرومات العضلية الملطخة بالقضيب في الجبهة المهاجرة. تم استخدام ما مجموعه n = 3 عينات لكل حالة تجريبية محددة كميا في C. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: NCCs = خلايا القمة العصبية ؛ siRNA = الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي S1: التحليل المعتمد على الجرعة لمكملات Wnt5a المؤتلفة. وجد التحليل المعتمد على الجرعة لاختبار مكملات Wnt5a المؤتلف 0 نانوغرام / مل و 100 نانوغرام / مل و 500 نانوغرام / مل 500 نانوغرام / مل من rWnt5a الخارجي هو التركيز الأمثل لدفع هجرة الأرومة العضلية والتغيرات المعمارية الخلوية القضيبية خلال فترة هجرة 12 ساعة في المختبر. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: صور تمثيلية لإدراج الآبار. صور برايتفيلد لإدخالات الآبار التي تحتوي على خلايا قمة عصبية O9-1 معالجة ب (A) 50 نانومتر من siRNA للتحكم السلبي و (B) 50 نانومتر Wnt5a siRNA. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر. اختصار: siRNA = الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: صور تمثيلية لتعبير بروتين Wnt5a في خلايا O9-1 بعد ضربة قاضية Wnt5a بوساطة siRNA. تلطيخ التألق المناعي لبروتين Wnt5a في آبار زراعة الخلايا التي تحتوي على خلايا القمة العصبية O9-1 المعالجة ب (A) 50 نانومتر من siRNA للتحكم السلبي و (B) 50 نانومتر Wnt5a siRNA. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: siRNA = الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يعد مسار إشارات Wnt / قطبية الخلية المستوية (PCP) غير المتعارف عليه مسارا للإشارات الخلوية مهما للغاية وقد تورط في عمليات تنموية متعددة 24,25 ومرض24,26. أثناء التطور الجنيني ، تتضمن إشارات Wnt غير المتعارف عليها شبكة موسعة من الإشارات الجزيئية من الخلايا المرسلة للإشارات التي تحفز في النهاية تغييرات في التشكل والتنظيم غير المتماثل والهجرة الاتجاهية في الخلايا المستقبلة للإشارة11. أظهرت الدراسات السابقة أن مسارات مستقبلات الرباط المحددة التي تقود هذه الإشارات متنوعة وتعتمد على السياق وغالبا ما تختلف بين أنواع الخلايا12،13،14،15. بسبب هذا التعقيد الجزيئي ، كانت القدرة على تقييم تفاعلات إشارات Wnt غير المتعارف عليها باستخدام طرق إعادة التركيب الجيني التقليدية في الجسم الحي محدودة. بينما تم استخدام الأنظمة في المختبر بشكل متزايد كنهج بديل لدراسة الأنماط الظاهرية الخلوية Wnt غير المتعارف عليها ، تركز البروتوكولات المتاحة حصريا على جوانب استقبال الإشارات النهائية للمسار وتفشل في نمذجة الطبيعة بين الخلايا وشبه النظيرة بشكل كاف لأحداث الإشارات هذه. لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول لنظام الاستزراع المشترك غير التلامسي الذي يلخص تفاعلات Paracrine Wnt في المختبر. كان تركيز هذا البروتوكول على نمذجة جانبين مميزين لإشارات Wnt الوظيفية غير المتعارف عليها في المختبر ، بما في ذلك تنظيم بروتينات الخيوط داخل الخلايا والقدرة على الهجرة المستقطبة.

كدليل على المفهوم ، تم تطبيق هذا البروتوكول لدراسة آليات paracrine في سياق نمو القلب. أثناء تكوين القلب ، تعد أحداث الإشارات المتبادلة بين NCCs القلبية والخلايا السلفية SHF ضرورية للنضج المناسب لمجرى التدفق القلبي (OFT)27،28،29. أظهر العمل السابق أنه أثناء نمو قلب الفأر ، يلزم وجود إشارات Wnt / PCP بوساطة NCC في خلايا SHF البلعومية لدمج الخلايا السلفية SHF في OFT النامية ولمحاذاة OFT الطبيعية21. أظهر Schleiffarth et al. وآخرون أن الضربة القاضية الجينية للجين الذي يشفر ليجند Wnt / PCP ، Wnt5 ، قد ثبت أنها تعطل تنظيم الخلايا السلفية SHF وقدرتها على الهجرة ، مما يؤدي إلى تقصير القلب وانحرافه OFT22،23،30. مع خطوط خلايا الفئران NCC (O9-1) 31 والخلايا العضلية (C2C12) ، يوضح هذا البروتوكول أن الاستزراع المشترك مع NCCs يرتبط بزيادة فيلوبوديا السيتوبلازم الإيجابية للقضيب والصفيحيات ويحسن قدرة هجرة الأرومة العضلية في مقايسة التئام الجروح. تعتمد نقاط النهاية الجزيئية والوظيفية هذه في المختبر على البروتوكولات المنشورة مسبقا لمعالجة NCC31 ونموذج عن كثب للتغيرات المظهرية في الجسم الحي الموصوفة في الفئران بالضربة القاضية العالمية Wnt5a ، مما يؤكد صحة فائدة هذا النموذج.

لتحديد المسار الجزيئي المحدد الذي يقود إشارات Wnt غير المتعارف عليها بين NCCs والأرومات العضلية ، تم إجراء تجارب ضربة قاضية متوازية خاصة بالخلية للجينات التي تشفر الربيطة المرشحة ، Wnt5a ، في NCCs والمستقبلات المقابلة لها ، ROR2 ، في الأرومات العضلية. كما هو متوقع ، فإن ضربة قاضية للجزيئات في كل من خلايا إرسال الإشارات (Wnt5a في NCCs) وخلايا استقبال الإشارات (ROR2 في الخلايا العضلية) عطلت بشكل مستقل التغيرات المعمارية الخلوية المرتبطة بالأكتين Wnt / PCP ومنعت هجرة الأرومة العضلية. الأهم من ذلك ، لم يلاحظ الإنقاذ الظاهري مع Wnt5a المؤتلف إلا في حالة ضربة قاضية NCC-Wnt5a ، والتي تدعم آلية يقوم من خلالها Wnt5a المشتق من NCC بتنشيط إشارات PCP في الأرومات العضلية من خلال مستقبلات ROR2. تتوافق هذه النتائج مع البيانات المستمدة من الدراسات الجينية للفأر التي تحدد محور Wnt5a-ROR2 كمحور إشارات Wnt / PCP حاسم بين NCCs وخلايا SHF أثناء نمو القلب الجنيني 3,21. على الرغم من عدم اختباره تجريبيا في هذا البروتوكول ، إلا أنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان Wnt5a المشتق من SHF يوفر إشارات نظيرة متبادلة إلى القمة العصبية من خلال مستقبلات ROR2. يمكن اختبار هذه الفرضية باستخدام هذا البروتوكول عن طريق تكرار التجارب مع خلايا C2C12 في الأعلى وخلايا O9-1 في الجزء السفلي من بناء إدراج البئر. إذا كان Wnt5a المشتق من SHF يوفر إشارة نظيرة متبادلة من خلال NCC-ROR2 ، فإن المرء يتوقع أن تمنع ضربة قاضية Wnt5a في خلايا C2C12 القدرة على الهجرة وبلمرة الأكتين لخلايا O9-1 الأساسية.

هناك العديد من نقاط القوة الفريدة لهذا البروتوكول. أولا ، إنه نظام إدخال بئر غير متصل يتضمن الاستخدام المتسلسل لفحوصات التئام الجروح وتقنيات التلوين المناعي لتقييم الخصائص الوظيفية والجزيئية Wnt / PCP في نفس مجموعة الخلايا المستقبلة للإشارة. لا يوفر هذا فقط نهجا قويا للتنميط الظاهري لتنظيم الخيوط داخل الخلايا غير المتعارف عليها Wnt والتغيرات المهاجرة المستقطبة في المختبر ولكنه يسمح أيضا بإجراء تقييمات أكثر دقة لآليات نقل الإشارة. بينما يوفر هذا البروتوكول دليلا على المبدأ فيما يتعلق بجزيئات Wnt5a-ROR2 ، فإن النموذج يفسح المجال بسهولة لتقييم تأثيرات الروابط والمستقبلات الأخرى في مسار إشارات Wnt غير المتعارف عليه. يمكن للمرء أن يكيف بروتوكول التلوين المناعي لتقييم التعبير عن العديد من البروتينات المستجيبة المحتملة في المصب (على سبيل المثال ، RhoA ، p-JNK ، Daam1 ، Rac1) التي ثبت أنها تنقل إشارات Wnt غير المتعارف عليها في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ربط مستويات البروتين لهذه الجزيئات المستجيبة المختلفة إما بالأنماط الظاهرية المهاجرة أو العمارة الخلوية الأكتينية. ثانيا ، تسمح طبيعة عدم الاتصال لنظام الاستزراع المشترك بالتلاعب المستقل بجزيئات إرسال إشارة محددة مقابل جزيئات استقبال الإشارة في مسار Wnt / PCP. في هذه النتائج التمثيلية ، تم انتخابه لأداء ضربة قاضية siRNA خاصة بالخلية. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول قابل أيضا لاستخدام مثبطات الأدوية أو خطوط الخلايا المعدلة وراثيا لتقييم مسارات مستقبلات الرباط المرشحة للتطبيق السريري. وبالمثل ، يمكن للمرء إجراء تجارب إنقاذ النمط الظاهري عن طريق إضافة مركبات جزيئية أو دوائية إلى وسط الاستزراع المشترك ، كما هو موضح مع Wnt5a المؤتلف. إن استهداف هذه المركبات لإنقاذ اختلالات إرسال الإشارات مقابل استقبال الإشارات بشكل انتقائي يزيد من صحة المسارات الميكانيكية شبه النظيرة بطرق غير مسموح بها باستخدام أنظمة النماذج الحالية في الجسم الحي .

هناك العديد من الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول. أولا ، من المهم التأكد من توسيع الخلايا الأولية والحفاظ عليها عند التقاء مناسب في جميع أنحاء البروتوكول. إذا سمح للخلايا العضلية C2C12 بالتكاثر إلى التقاء بنسبة 100٪ ، فستبدأ في الاندماج والتمايز من الأرومات العضلية إلى الأنابيب العضلية. ومن ثم ، يجب تمرير هذه الخلايا بالكثافة المناسبة كما هو موضح. ثانيا ، نظرا لأن خلايا تغذية STO ضرورية لتوليد وسط مشروط لنمو خلايا O9-1 ، فمن الضروري أن يقوم المرء بتعطيل خلايا STO بشكل مناسب مع ميتوميسين C ويجعل وسط نمو O9-1 كافيا (500 مل على الأقل) باستخدام خلايا STO المعطلة قبل إذابة وطلاء خلايا O9-1. ربما تكون الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي توليد الخدوش المناسبة ذات الهندسة والعرض الموحدين في الطبقة الأحادية الأرومة العضلية32,33. الخطوة 3.1.4 تفاصيل عدة نصائح لتحسين هذا الجزء من البروتوكول. على الرغم من هذه التوصيات ، ينبغي الاعتراف بأن التباين المرتبط بمقايسات الخدش 2D القياسية لا يزال يمثل تحديا تقنيا وقيودا على هذا البروتوكول. لذلك ، من الضروري أن يكون لديك نسخ تقنية متعددة لكل حالة تجريبية.

أخيرا ، على الرغم من أن النتائج المقدمة هنا تم إنشاؤها باستخدام NCCs والأرومات العضلية للفئران ، يمكن تكييف هذا البروتوكول ، من حيث المبدأ ، ليشمل أي خلية إرسال واستقبال إشارة ذات أهمية. نتيجة لذلك ، لا يحتوي هذا النظام على تطبيقات لتطوير الآليات الأساسية لإشارات Wnt غير المتعارف عليها في مجموعة متنوعة من السياقات التنموية فحسب ، بل يمكن استخدامه أيضا لاختبار الآليات العلاجية لعمليات الأمراض المرتبطة ب Wnt / PCP. ومن الأمثلة على ذلك الفحص الدوائي للأدوية التي تمنع قدرة الهجرة التي يسببها Wnt / PCP للخلايا الخبيثة أو استعادة الهجرة الاتجاهية لأنواع الخلايا الطرفية المشتقة من المريض مع قدرة إشارات PCP المعيبة عند خط الأساس. بالإضافة إلى مسار إشارات Wnt غير المتعارف عليه ، يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لدراسة آليات ومسارات إشارات paracrine الأخرى بين نوعين من الخلايا. على سبيل المثال ، يمكن أن تقترن ضربة قاضية بوساطة siRNA للجزيئات الإفرازية المعروفة في مسارات أخرى (على سبيل المثال ، Notch و Bmp / Tgf-β و Fgf) في خلايا O9-1 بتلطيخ مناعي للعلامات التكاثرية أو التمايز أو موت الخلايا المبرمج في الأرومات العضلية الكامنة.

في الختام ، ينشئ هذا البروتوكول بروتوكولا تجريبيا جديدا وقابلا للسير للغاية لدراسة آليات تنظيم الخيوط داخل الخلايا غير المرتبطة ب Wnt والهجرة المستقطبة في المختبر. تعمل الطرق الموصوفة هنا على تحسين التقنيات الحالية من خلال الحفاظ على الطبيعة بين الخلايا وشبه النظيرة لتفاعلات Wnt والسماح بالتقييم المستقل لمكونات إرسال الإشارات مقابل مكونات استقبال الإشارات في هذا المسار. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع للتحقيق في آليات إشارات Paracrine Wnt / PCP الأساسية بين نوعين من الخلايا وفحص المركبات العلاجية الجديدة التي تستهدف عمليات الأمراض المرتبطة ب Wnt / PCP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F30HL154324 إلى O.T. و K08HL121191 و R03HL154301 إلى SRK. يود المؤلفون أن يعترفوا بأن المخطط في الشكل 1 في هذه المخطوطة تم إنشاؤه باستخدام biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M-7522
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10 Stored at 4 °C
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology sc-2323 Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell line ATCC CRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2 ThermoFisher Scientific 156499
Chamber Slide System, 4-well ThermoFisher Scientific 154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) Corning 10-017-CV Stored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane Corning 353095
Fetal bovine serum Fisher Scientific W3381E Stored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1% ATCC PCS-999-027 Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µL USA Scientific 1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x Gibco 11140-050
Minimum essential medium (MEM) Corning 10-022-CV
Mitomycin C Roche 10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm Springside Scientific HRTCG2455
O9-1 neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
Opti-MEM I, 1x Gibco 31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4% Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) Fisher Scientific W3470H Stored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488 Abcam ab176753 Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CV Stored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a protein R&D Systems 645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mM Gibco 11360-070
Square Petri dish with grid Thomas Scientific 1219C98
STO murine fibroblast feeder cells ATCC CRL-1503
Triton X-100 solution Sigma Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25% Fisher Scientific W3513C Stored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope Carl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy software Carl Zeiss AG imaging software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 178 ،
النمذجة Paracrine إشارات Wnt غير المتعارف عليها <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R.… More

Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R. Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (178), e63247, doi:10.3791/63247 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter