Summary
La présente étude décrit une méthode hautement reproductible et traitable pour étudier in vitro les événements paracrines non canoniques de signalisation Wnt. Ce protocole a été appliqué pour évaluer l’impact de la signalisation paracrine Wnt5a dans les cellules de la crête neurale murine et les myoblastes.
Abstract
La signalisation Wnt non canonique régule l’organisation intracellulaire du filament d’actine et la migration polarisée des cellules progénitrices au cours de l’embryogenèse. Ce processus nécessite des interactions paracrines complexes et coordonnées entre les cellules émettrices et réceptrices de signaux. Étant donné que ces interactions peuvent se produire entre différents types de cellules de différentes lignées, l’évaluation in vivo des défauts spécifiques aux cellules peut être difficile. La présente étude décrit une méthode hautement reproductible pour évaluer la signalisation Wnt paracrine non canonique in vitro. Ce protocole a été conçu avec la capacité de (1) mener des évaluations fonctionnelles et moléculaires de la signalisation Wnt non canonique entre deux types de cellules d’intérêt; (2) disséquer le rôle des molécules émettrices de signaux par rapport aux molécules réceptrices de signaux dans la voie de signalisation Wnt non canonique; et (3) effectuer des expériences de sauvetage phénotypique avec des approches moléculaires ou pharmacologiques standard.
Ce protocole a été utilisé pour évaluer la signalisation Wnt non canonique médiée par les cellules de la crête neurale (NCC) dans les myoblastes. La présence de NCC est associée à une augmentation du nombre de filopodies cytoplasmiques et de lamellipodes phalloïdines positives dans les myoblastes et à une amélioration de la migration des myoblastes dans un test de cicatrisation. L’axe Wnt5a-ROR2 a été identifié comme une voie de signalisation Wnt non canonique cruciale entre la NCC et les progéniteurs de cardiomyoblastes du deuxième champ cardiaque (SHF). En conclusion, il s’agit d’un protocole très facile à traiter pour étudier les mécanismes de signalisation Wnt paracrines non canoniques in vitro.
Introduction
La signalisation Wnt non canonique est une voie conservée de manière évolutive qui régule l’organisation des filaments cellulaires et la migration directionnelle. Cette voie a été impliquée dans de multiples processus biologiques, y compris la morphogenèse des tissus embryonnaires 1,2,3, l’angiogenèse lymphatique et vasculaire 4,5,6,7, et la croissance du cancer et les métastases 8,9,10 . Au niveau cellulaire, la signalisation Wnt non canonique est réalisée par le biais d’interactions paracrines coordonnées entre les cellules émettrices et réceptrices de signaux. Ces interactions se produisent fréquemment entre des cellules de lignées ou de types différents et impliquent un réseau moléculaire diversifié qui comprend jusqu’à 19 ligands et plusieurs récepteurs, corécepteurs et effecteurs de transduction du signal en aval11. Pour compliquer davantage ce processus de signalisation, des études antérieures ont montré que les combinaisons ligand-récepteur peuvent varier d’une manière dépendante du contexte et des tissus 12,13, et que les mêmes ligands sources qui conduisent la signalisation Wnt non canonique dans les cellules réceptrices de signaux peuvent être produits par plusieurs types de cellules émettrices de signaux 14,15 . Compte tenu de la complexité cellulaire et moléculaire associée à la signalisation Wnt non canonique, la capacité d’étudier des mécanismes individuels et cliniquement pertinents in vivo a été limitée.
Des tentatives ont été faites pour étudier la signalisation Wnt non canonique en utilisant des techniques de culture cellulaire in vitro. Par exemple, des essais de cicatrisation effectués dans des monocouches cellulaires ont été utilisés pour évaluer fonctionnellement la migration directionnellecellulaire 4,16,17,18,19. Des techniques d’immunomarquage ont été utilisées pour effectuer des analyses spatiales de l’expression des protéines de surface afin d’évaluer les changements non canoniques induits par Wnt dans la morphologie cellulaire 7,10, l’architecture et la polarisation asymétrique18,19,20. Bien que ces approches aient fourni des outils importants pour caractériser les phénotypes liés au Wnt dans les cellules réceptrices de signaux, l’absence de composants d’envoi de signaux dans ces protocoles limite leur capacité à modéliser avec précision les mécanismes de signalisation paracrine observés in vivo. En conséquence, il reste un besoin critique de développer des systèmes in vitro qui permettent une évaluation robuste et reproductible des interactions de signalisation paracrine entre les cellules émettrices et réceptrices de la voie Wnt non canonique, en particulier celles de différents types de cellules.
À cette fin, l’objectif principal de cette étude était d’établir un protocole pour modéliser les interactions paracrines non canoniques de signalisation Wnt in vitro. Nous avons développé un système de coculture sans contact qui récapitule les composants d’envoi et de réception de signaux de ces interactions et permet l’utilisation d’approches moléculaires, génétiques ou pharmacologiques standard pour étudier indépendamment les mécanismes ligand-récepteur spécifiques dans la voie Wnt non canonique. Les mécanismes de signalisation Wnt médiée par NCC ont été examinés dans des myoblastes utilisant des lignées cellulaires murines établies. Comme preuve de principe, ce modèle a été utilisé pour corroborer les résultats d’études in vivo antérieures chez la souris qui impliquent l’axe Wnt5a-ROR2 comme voie de signalisation Wnt non canonique pertinente entre les NCC 21 et les progéniteurs de cardiomyoblastesSHF 3,22,23.
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Protocol
1. Expansion préexpérimentale et passage des cellules
- Culture cellulaire C2C12 :
- Préparer 500 mL de milieu de culture C2C12 en combinant le milieu Eagle’s Medium modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine.
- Décongeler un flacon de cellules C2C12 au bain-marie à 37 °C. Pendant que les cellules C2C12 dégèlent, ajouter 5 mL de milieu C2C12 à un tube conique de 15 mL. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans le tube de 15 ml à l’aide d’une pipette P1000.
REMARQUE: Les cellules C2C12 sont des cellules myoblastiques murines qui ont déjà été utilisées et validées comme lignée cellulaire primaire pour la modélisation des progéniteurs des cardiomyoblastes. - Mélanger délicatement les cellules C2C12 dans le tube conique à l’aide d’une pipette sérologique. Ensuite, ajouter tout le volume des cellules décongelées dans un milieu C2C12 (6 mL) dans une fiole de 75 cm2 .
- Ajouter 6 mL de milieu C2C12 frais dans la fiole pour un volume total de 12 mL. Tourner doucement la fiole de manière à ce que la solution de cellule et de milieu recouvre tout le fond de la fiole. Placer la fiole dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% CO2) pour permettre aux cellules d’adhérer.
- Laissez les cellules se dilater dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles atteignent ~60% de confluence.
REMARQUE: Cela peut être déterminé en retirant périodiquement les cellules de l’incubateur et en vérifiant rapidement leur confluence au microscope. Assurez-vous de minimiser le temps pendant lequel les cellules sont retirées de l’incubateur.
- Passage des cellules C2C12 :
- Réchauffer le milieu C2C12, 500 ml de 1x PBS et 0,25 % de trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C. Une fois les réactifs réchauffés, transférez tous les réactifs dans la hotte de culture cellulaire.
- Introduire la fiole contenant les cellules C2C12 dans le capot de culture cellulaire. Rincer doucement la fiole contenant les cellules C2C12 avec 1x PBS chaud deux fois.
- Incliner le ballon à un angle de 45° et aspirer le milieu C2C12 à l’aide d’une pipette en verre reliée à l’aspiration sous vide. Tout en maintenant un angle de 45°, ajouter délicatement 10 ml de 1x PBS chaud au coin de la fiole à l’aide d’une pipette sérologique. Posez la fiole à plat sur la surface et déplacez doucement la fiole en mouvements circulaires pour vous assurer que le PBS 1x lave toute la monocouche de cellules.
REMARQUE: Veillez à ne pas perturber la monocouche C2C12 lors de l’aspiration du milieu.
- Incliner le ballon à un angle de 45° et aspirer le milieu C2C12 à l’aide d’une pipette en verre reliée à l’aspiration sous vide. Tout en maintenant un angle de 45°, ajouter délicatement 10 ml de 1x PBS chaud au coin de la fiole à l’aide d’une pipette sérologique. Posez la fiole à plat sur la surface et déplacez doucement la fiole en mouvements circulaires pour vous assurer que le PBS 1x lave toute la monocouche de cellules.
- Retirez le 1x PBS après le deuxième lavage. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la fiole, déplacer doucement la fiole comme décrit ci-dessus pour permettre à la solution trypsine-EDTA de s’étaler sur la plus grande partie possible de la monocouche et placer la fiole dans l’incubateur pendant 2 min.
- Après 2 minutes d’incubation, retirez la fiole de l’incubateur et tapotez-la doucement pour détacher les cellules restantes.
- Ajouter 9 mL de milieu C2C12 dans la fiole à l’aide d’une pipette sérologique pour tremper la trypsine. À l’aide de la pipette sérologique, rincer délicatement les cellules avec le milieu et recueillir les 10 ml de suspension cellulaire trypsinisée. Ajouter 10 mL de la suspension cellulaire dans un tube conique frais de 15 ml et centrifuger à 100 × g pendant 5 min.
- Remettez le tube conique dans la hotte de culture cellulaire et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette en verre reliée à l’aspiration sous vide. Lors de l’aspiration du surnageant, veillez à ne pas perturber la pastille cellulaire au fond du tube conique. Pour ce faire, laissez ~0,2 mL du surnageant dans le tube conique. Remettez les cellules en suspension dans 10 mL de milieu C2C12 frais.
- Pour un passage supplémentaire, ajouter 1 mL des cellules remises en suspension dans une fiole de 75 cm2 . Ajouter 11 ml de milieu C2C12 dans la fiole à l’aide d’une pipette sérologique et placer la fiole dans l’incubateur.
- Culture cellulaire STO :
- Préparer le milieu de culture STO en préparant 500 mL de DMEM avec 7% FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 nM de L-glutamine.
- Préparer de la gélatine à 0,1 % en ajoutant 0,5 g de gélatine en poudre dans un flacon contenant 500 mL d’eau de qualité tissulaire ou autoclavée. Ajouter 7 mL de solution de gélatine à 0,1 % dans une fiole de 75 cm2 . Faire pivoter la fiole de telle sorte que la solution de gélatine recouvre tout le fond de la fiole. Laisser incuber la fiole pendant 30 min à température ambiante dans la hotte de culture cellulaire.
- Après 30 min d’incubation, retirer l’excès de gélatine à l’aide d’une pipette reliée à l’aspiration sous vide. Laissez les flacons rester dans l’incubateur pendant encore 30 minutes avant utilisation.
- Décongeler un flacon de cellules STO dans un bain-marie à 37 °C. À l’aide d’une pipette P1000, transférer immédiatement les cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu de culture STO fraîchement préparé.
REMARQUE: Les cellules STO sont des fibroblastes embryonnaires murins couramment utilisés comme cellules nourricières dans les protocoles de culture cellulaire. - Mélanger délicatement les cellules dans le tube conique à l’aide d’une pipette sérologique. Ajouter tout le volume (6 mL) de cellules dans une fiole de 75 cm2 recouverte de gélatine. Faire pivoter la fiole pour s’assurer que la suspension cellulaire est bien répartie le long du fond de la fiole.
- Ajouter 6 mL de milieu STO frais dans la fiole pour un volume total de 12 mL. Faire tourner la fiole comme décrit ci-dessus pour s’assurer que les cellules et le milieu sont bien répartis le long du fond de la fiole. Placer la fiole dans l’incubateur à 37 °C pour permettre aux cellules d’adhérer. Laissez les cellules proliférer dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles atteignent ~60-70% de confluence.
- Transmission des cellules STO :
- Milieu cellulaire STO chaud, 1xPBS et 0,25% trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Rincer doucement la fiole contenant les cellules STO avec 1x PBS chaud deux fois comme décrit à l’étape 1.2.2.1.
- Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la fiole à l’aide d’une pipette P1000. Placer la fiole dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 min.
- Après 5 min d’incubation, retirer la fiole de l’incubateur. Tapotez doucement la fiole pour détacher les cellules adhérentes.
- Ajouter 9 mL de milieu STO dans le ballon pour tremper la trypsine et recueillir les 10 mL de suspension cellulaire trypsinisée comme décrit ci-dessus. Ajouter 10 mL de la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger à 100 × g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu STO comme décrit ci-dessus. Pour un passage supplémentaire, ajouter 1 mL des cellules remises en suspension dans une fiole de 75 cm2 . Ajouter 11 mL de milieu STO, faire pivoter la fiole pour assurer une répartition uniforme des cellules et du milieu le long du fond de la fiole et placer la fiole dans l’incubateur.
- Culture cellulaire STO inactive et préparation du milieu basal cellulaire O9-1 :
- Préparer le milieu de culture basale cellulaire O9-1 en mélangeant 500 mL de DMEM avec 15 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine, 2 nM de L-glutamine, 0,1 mM minimum d’acides aminés non essentiels, 1 nM de pyruvate de sodium et 55 μM de bêta-mercaptoéthanol.
- Préparer la solution de mitomycine C dans 1x PBS à une concentration de 0,5 mg/mL en ajoutant 4 mL de 1x PBS directement dans un flacon de mitomycine C. Pipeter la solution plusieurs fois avec une pipette P1000. Pour dissoudre davantage la mitomycine C dans 1x PBS, placez le flacon sur un mélangeur vortex ou une bascule de paillasse pendant 45 min à 1 h.
- Inactiver les cellules STO en traitant les plaques STO avec une concentration finale de 0,01 mg/mL de mitomycine C ajoutée au milieu STO standard. Placer les plaques STO à l’intérieur de l’incubateur pendant 2 h, en prenant soin de protéger la fiole contenant la mitomycine C de la lumière en minimisant le temps passé à l’extérieur de l’incubateur. Après le traitement à la mitomycine, laver les cellules dans 1x PBS deux fois comme décrit à l’étape 1.2.2.1.
REMARQUE : La mitomycine C inhibe la prolifération des cellules STO afin qu’elles puissent être utilisées pour générer un milieu conditionné pendant plusieurs jours sans devenir trop confluent dans le flacon. - Après avoir retiré le PBS 1x, ajouter 12 mL de milieu de culture basal O9-1 aux cultures cellulaires STO inactivées et les incuber pendant 24 h. Prélevez le milieu de culture basal STO + O9-1 conditionné et inactivé et placez-le dans des tubes coniques de 50 ml enveloppés dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière.
- Ajouter 12 mL de milieu de culture basale O9-1 frais aux cultures cellulaires STO inactivées comme décrit ci-dessus. Répétez cette étape en ajoutant du milieu de culture basal O9-1 frais sur les mêmes flancs contenant les cellules STO inactivées toutes les 24 heures.
REMARQUE : Après le traitement à la mitomycine C, les cellules STO inactivées ne peuvent pas proliférer; par conséquent, les flacons contenant les cellules STO inactivées peuvent être réutilisés pour générer un milieu conditionné. - Entreposer les tubes coniques de 50 mL enveloppés de papier d’aluminium contenant le milieu de culture basal STO + O9-1 conditionné et inactivé à 4 °C jusqu’à ce qu’un total de 500 mL du milieu ait été recueilli.
- Culture cellulaire O9-1 :
- Préparer le milieu de culture de croissance cellulaire O9-1 en utilisant 500 mL de milieu basal STO + O9-1 conditionné et ajouter 103 unités de facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) et 25 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGF basique).
- Préparer des fioles enrobées de gélatine à 0,1 % comme décrit aux étapes 1.3.2 à 1.3.3.
- Décongeler un flacon de cellules O9-1 dans un bain-marie à 37 °C. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans un tube conique de 15 mL contenant 5 mL de milieu de croissance O9-1 fraîchement préparé.
REMARQUE : La lignée cellulaire O9-1 est la seule lignée cellulaire de crête neurale stable et multipotente qui a été générée à partir de la souris. Cette lignée cellulaire est couramment utilisée dans les expériences in vitro de la crête neurale. - Mélanger délicatement les cellules à l’aide d’une pipette sérologique. Ajouter la totalité des 6 mL de cellules dans une fiole de 75 cm2 recouverte de gélatine.
- Ajouter 6 mL de milieu de croissance O9-1 dans la fiole pour un volume total de 12 mL. Placer la fiole dans l’incubateur à 37 °C pour permettre aux cellules d’adhérer. Laissez les cellules proliférer dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles atteignent ~60-70% de confluence.
- Passage des cellules O9-1 :
- Milieu de croissance chaud O9-1, 1x PBS et 0,25% trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Rincer doucement la plaque contenant des cellules O9-1 avec 1x PBS chaud deux fois comme décrit à l’étape 1.2.2.1.
- Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % dans la fiole et la placer dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 min.
- Après 5 min d’incubation, retirer la fiole de l’incubateur et tapoter doucement la fiole pour détacher les cellules adhérentes.
- Ajouter 9 mL de milieu de croissance O9-1 dans la fiole pour tremper la trypsine. Prélever 10 mL de la suspension de cellules trypsinisées et ajouter 10 mL de cette suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 100 × g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu de croissance O9-1. Pour un passage supplémentaire, ajouter 1 mL des cellules remises en suspension dans une fiole de 75 cm2 . Ajouter 11 mL de milieu de croissance O9-1 et placer la fiole contenant les cellules dans 12 mL de milieu dans l’incubateur à 37 °C.
2. Cellules de placage dans un système de coculture
- Placage des chambres cellulaires C2C12:
- Après trypsinisation (tel que décrit à l’étape 1.2), remettre en suspension la pastille de cellule C2C12 dans 10 mL de milieu C2C12. Diluer les cellules dans un rapport de 1:20 dans un milieu C2C12 en retirant 0,5 mL des cellules C2C12 en suspension et en les ajoutant dans un nouveau tube conique de 15 mL contenant 9,5 mL de milieu C2C12 frais. Mélanger délicatement la suspension avec une pipette sérologique.
- Ajouter 1 mL des cellules C2C12 diluées 1:20 à chaque puits d’un nouveau puits à 4 chambres à l’aide d’une pipette P1000 et placer le puits à 4 chambres dans l’incubateur.
- Placage des inserts de cellules O9-1 :
- Après trypsinisation, remettre en suspension la pastille de cellule O9-1 dans 10 mL de milieu de croissance O9-1. Diluer les cellules dans un rapport de 1:20 dans un milieu de croissance O9-1 en retirant 0,5 mL des cellules C2C12 en suspension et en les ajoutant dans un nouveau tube conique de 15 mL contenant 9,5 mL de milieu de croissance O9-1 frais. Mélanger délicatement la suspension avec une pipette sérologique.
- Placer un seul insert perméable (voir le tableau des matériaux) à l’intérieur de chaque puits d’un nouveau puits à 4 chambres rempli de 1 mL de milieu de croissance O9-1.
NOTE: Ce puits à 4 chambres doit être différent de celui contenant les cellules C2C12 de l’étape 2.1.3. - Ajouter 300 μL de la suspension de cellules O9-1 diluée à chaque insert à l’aide d’une pipette P1000. S’assurer que le fond de chaque insert est immergé dans le puits rempli de 1,3 mL de milieu de croissance O9-1. Placez le puits dans l’incubateur à 37 °C.
- (Facultatif). Effectuer siRNA knockdown dans les cellules O9-1 ou C2C12.
- Effectuer l’élimination du gène par siRNA 18-24 h après avoir plaqué des inserts de cellules O9-1 ou des puits de chambre cellulaire C2C12.
- Diluer le siRNA et le réactif de transfection dans un milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) selon les recommandations des fabricants et les concentrations souhaitées pour l’expérience. Mélanger délicatement le siRNA dilué et le réactif de transfection (1:1) et incuber le mélange à température ambiante pendant 7 min.
NOTE: Dans ce protocole, des concentrations de 50 nM ont été utilisées car il a été déterminé que cette concentration de siRNA entraînait une neutralisation suffisante de l’expression du gène cible. - Ajouter les complexes siRNA-lipide aux inserts cellulaires O9-1 ou aux puits de chambre cellulaire C2C12 tels que déterminés par le plan expérimental et incuber les cellules avec les complexes siRNA-lipide pendant ~36-48 h.
- Diluer le siRNA et le réactif de transfection dans un milieu sérique réduit (voir le tableau des matériaux) selon les recommandations des fabricants et les concentrations souhaitées pour l’expérience. Mélanger délicatement le siRNA dilué et le réactif de transfection (1:1) et incuber le mélange à température ambiante pendant 7 min.
- Effectuer l’élimination du gène par siRNA 18-24 h après avoir plaqué des inserts de cellules O9-1 ou des puits de chambre cellulaire C2C12.
3. Effectuer un dosage des plaies et évaluer quantitativement la migration des myoblastes
- Essai de la plaie :
- Laissez les inserts de cellules O9-1 et les puits de chambre cellulaire C2C12 adhérer et proliférer dans l’incubateur jusqu’à ce que les deux cellules soient à ~70-80% de confluence avant de procéder à cette partie du protocole. Si les cellules se développent >90% confluentes, ne procédez pas au test de grattage, car les cellules se détacheront simplement du puits.
- Réchauffer 1x PBS et milieu C2C12 en les plaçant dans un bain-marie à 37 °C.
- Retirez bien le milieu surnageant de la chambre C2C12 et lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Retirez le 1x PBS et grattez immédiatement les cellules avec un embout de pipette P10 stérile.
- Passez fermement l’embout de la pipette P10 stérile dans une seule direction pour couvrir toute la longueur ou la largeur de la monocouche cellulaire (p. ex., de droite à gauche, de haut en bas). Assurez-vous de gratter chaque puits contenant des cellules une seule fois.
REMARQUE: Pour optimiser les résultats de grattage, grattez des puits de différentes conditions expérimentales à un niveau de confluence similaire. Pour ce faire, assurez-vous que chaque puits à 4 chambres a des cellules pour chaque condition expérimentale requise (par exemple, puits #1 témoin négatif, puits #2 témoin positif). De plus, utilisez une nouvelle pipette P10 stérile pour chaque égratignure et appliquez une force similaire à la pipette à chaque fois. N’essayez pas de créer plus d’une égratignure dans chaque puits. - Après avoir gratté, ajoutez rapidement 1 ml de 1x PBS dans le puits à l’aide d’une pointe de pipette P1000. Répétez ce processus pour chaque puits qui sera rayé.
REMARQUE : Compte tenu de la variabilité associée à chaque égratignure, il est recommandé d’utiliser plusieurs puits (n = 3) pour la création de plaies dans chaque condition expérimentale. Travaillez rapidement car il est essentiel de minimiser la durée pendant laquelle les cellules sont sans 1x PBS au cours de ces étapes. Après avoir retiré 1x PBS de chaque puits, il ne faut pas plus de 5 s pour générer une plaie dans chaque puits.
- Passez fermement l’embout de la pipette P10 stérile dans une seule direction pour couvrir toute la longueur ou la largeur de la monocouche cellulaire (p. ex., de droite à gauche, de haut en bas). Assurez-vous de gratter chaque puits contenant des cellules une seule fois.
- Après avoir généré une plaie et ajouté 1x PBS dans chaque puits, imagez l’égratignure à l’aide d’un microscope inversé à fond clair et utilisez cette image comme taille de la plaie de base (temps 0). Pour prendre des images, procédez comme suit :
- Allumez l’ordinateur et le microscope (voir le tableau des matériaux) en appuyant sur le bouton d’alimentation. Placez la glissière de la chambre sur la scène et faites pivoter le cadran de l’objectif à un grossissement de 5x.
- Ouvrez le logiciel d’imagerie (voir le tableau des matériaux) en double-cliquant sur l’icône du logiciel sur le bureau de l’ordinateur. Cliquez sur l’onglet Appareil photo sur l’écran d’accueil du logiciel. Cliquez sur le bouton En direct pour visualiser les cellules de l’onglet AxioCam IC .
- Assurez-vous que le filtre lumineux est complètement tiré pour permettre à la lumière de passer à l’appareil photo et à l’écran de l’ordinateur. Déplacez et/ou faites pivoter manuellement la glissière de la chambre pour positionner la zone de la plaie au centre de l’image en direct sur l’onglet AxioCam IC .
- Pour prendre des images, cliquez sur Aligner pour ouvrir un nouvel onglet en regard de l’onglet AxioCam IC qui contient l’image.
- Pour enregistrer cette image fixe, cliquez sur fichier en haut à gauche de la page d’accueil du logiciel | enregistrez sous | entrez le nom du fichier dans la zone Nom de fichier. Enregistrez la figure au format d’image Carl Zeiss (*.czi) (paramètre par défaut) et sélectionnez le bureau dans la barre de gauche pour enregistrer le fichier sur le bureau en tant que fichier .czi, qui ne peut être ouvert que dans le logiciel Zen lite 2012.
- Pour enregistrer l’image en tant que .tiff, cliquez sur Fichier | Enregistrer sous | entrez le nom du fichier dans la zone Nom de fichier. Enregistrez la figure en tant que fichier image balisé (*.tiff) en cliquant sur le bouton Type de fichier et en sélectionnant *.tiff dans le menu déroulant.
REMARQUE: Le format .tiff peut être ouvert dans n’importe quel logiciel de traitement d’image. - Repositionnez manuellement la lame de chambre pour prendre 2-3 images supplémentaires à d’autres points de la plaie dans le même puits.
REMARQUE: Au total, cela se traduira par 3-4 images non chevauchantes et à fort grossissement de la plaie dans chaque puits.
- Retirer le 1x PBS de chaque puits et ajouter 1 mL de milieu C2C12.
REMARQUE: Veillez à ne pas pipeter de manière trop agressive lorsque vous retirez ou ajoutez des solutions à la chambre après la génération de la plaie, car cela pourrait entraîner le détachement des cellules du puits de la chambre. De plus, inclinez le puits de la chambre afin que l’aspiration et la réintroduction des solutions puissent être effectuées aux coins de chaque puits afin de minimiser la perturbation de la monocouche cellulaire. - Assembler le système de coculture d’insertion de puits en plaçant manuellement les inserts contenant les cellules O9-1 dans chaque puits du puits de la chambre. Poussez doucement les inserts vers le bas dans le puits de sorte que le fond de l’insert se trouve juste au-dessus des cellules C2C12 sous-jacentes. Retournez les constructions d’insertion de puits dans l’incubateur.
REMARQUE: Ne laissez pas le bas de l’insert toucher physiquement et perturber mécaniquement les cellules C2C12 sous-jacentes. - Laissez les cellules migrer pendant un total de 9 à 12 h. Pour déterminer le temps de migration optimal, vérifiez les cellules 6 heures après la création de la plaie, puis toutes les 2-3 heures par la suite. Terminez l’expérience lorsque les cellules en contrôle ou dans des conditions de contrôle positif commencent à recouvrir complètement la plaie.
REMARQUE : Étant donné la nature sans contact de la construction, il n’est pas nécessaire de retirer l’insert sus-jacent des puits lors de la vérification de la progression de la migration par intervalle. La variabilité migratoire sera observée en fonction de facteurs tels que les types de cellules utilisées dans ce test, la densité cellulaire au moment de la génération de la plaie, la largeur de la plaie créée et les conditions expérimentales des cellules manipulées (p. ex. neutralisation du gène, ajout de protéines recombinantes). Les concentrations de ces réactifs doivent être déterminées expérimentalement en suivant les recommandations du fabricant.
4. Coloration par immunofluorescence et imagerie des myoblastes migrateurs
- Fin de l’essai de migration et déconstruction du système d’insertion de puits :
- Retirez les inserts de cellules O9-1 après une période de migration de 9 à 12 heures (ou un autre moment désigné par les conditions expérimentales). Aspirer soigneusement le milieu C2C12 à l’aide d’une pipette P1000. Ajoutez 0,5 mL de 1x PBS dans les puits de la chambre et prenez des images finales des cellules après la migration.
- Aspirez soigneusement tous les 0,5 ml de 1x PBS mélangés avec du milieu et retirez les chambres en plastique des puits de la chambre en utilisant les instructions de la trousse, en laissant la lame sous-jacente contenant les cellules C2C12.
REMARQUE: Veillez à ne pas perturber les cellules C2C12 adhérant à la lame lors du retrait des puits de la chambre.
- Réalisation de l’immunocoloration :
- Placez immédiatement la lame dans un support de lame contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Versez le PFA à 4 % et ajoutez 1x PBS (1x PBST) contenant du Triton X-100 contenant 0,1 % au support de lame pour laver la lame pendant 15 minutes à température ambiante. Versez le 1x PBST et ajoutez 1x PBS au support de glissière pour laver la lame pendant 10 minutes à température ambiante. Répétez cette étape une fois de plus pour un total de deux lavages PBS 1x.
- Retirez la diapositive du support de la glissière. Tracez les bords extérieurs de la lame avec un stylo hydrophobe pour créer une limite hydrophobe autour de la lame afin d’empêcher les solutions de se répandre de la lame. Veillez à ne pas perturber les cellules adhérentes.
- Ajouter à 1 % de solution bloquante d’albumine sérique bovine (BSA) (diluée dans 1x PBS) à la lame (~0,5 mL par lame). S’assurer que la solution est contenue dans la limite hydrophobe créée à l’étape 4.2.4. Incuber la lame pendant 1 h à température ambiante dans une chambre à lame humidifiée.
REMARQUE: Bien que le blocage de la BSA ne soit pas nécessaire pour l’immunomarquage de la phalloïdine, cette étape du protocole permet le couplage avec la coloration des anticorps de fluorescence. - Après blocage pendant 1 h, verser la solution bloquante de la lame, ajouter l’anticorps phalloïdine (dilué à 1:200 dans une solution de blocage de BSA à 1% en ajoutant 5 μL de l’anticorps à 995 μL de solution BSA) à la lame et incuber à 4 °C pendant la nuit. Encore une fois, assurez-vous que la solution est contenue dans la limite hydrophobe créée à l’étape 4.2.4. Étant donné que l’anticorps phalloïdine est conjugué au colorant Alexa Fluor-488, minimisez l’exposition à la lumière du réactif d’anticorps avant et après l’ajout à la lame.
- Le lendemain, placez la glissière dans un support de glissière protégé de l’exposition à la lumière (p. ex., enveloppez le support de glissière dans du papier d’aluminium ou utilisez un support de glissière non transparent). Lavez les cellules dans le support de lame avec 1x PBS pendant 10 min à température ambiante. Répétez le lavage pendant un total de trois lavages de 10 minutes.
- Ajouter le support de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et monter les lames avec des lames de couvercle en verre. Imagez les cellules qui ont migré à l’aide d’un microscope à fluorescence standard.
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Representative Results
Effets des CCN sur la capacité migratoire des myoblastes murins
Ce test a d’abord été appliqué pour évaluer l’impact des CCN sur la capacité migratoire des myoblastes. La figure 1 présente le modèle schématique de l’essai. Pour tester cet impact, des tests de grattage ont été effectués avec des myoblastes cultivés isolément (sans inserts NCC) par rapport à ceux cultivés en présence d’inserts. Comme témoin positif, 500 ng/mL de Wnt5a recombinant (rWnt5a) ont été ajoutés aux puits de chambre munis d’inserts NCC. Cette concentration de rWnt5a a été déterminée par une analyse dose-réponse effectuée dans des cellules C2C12 (figure supplémentaire S1). Des images représentatives des encarts des CCN sont présentées à la figure supplémentaire S2, qui démontre que les CCN sont en bonne santé à ce moment-là. L’immunofluorescence démontre une élimination robuste de Wnt5a au niveau de la protéine après incubation avec 50 nM de siRNA Wnt5a (figure supplémentaire S3). Après une période de migration de 9 heures, il a été constaté que la présence de NCC augmentait significativement la capacité migratoire des myoblastes par rapport aux myoblastes analysés en l’absence d’inserts de NCC (72,6% de la zone repeuplée des plaies contre 59,1% de la zone repeuplée des plaies, p = 0,033). L’ajout de rWnt5a aux puits de coculture a accéléré la migration des myoblastes, certaines zones de la plaie démontrant une récupération complète au point temporel de 9 heures, comme le montre la figure 2. Comme prévu, les myoblastes migrateurs dans les trois conditions présentaient une morphologie cellulaire migratoire normale, y compris des filopodies et des lamellopodes bien formés et saillants et une polarisation asymétrique des projections cytosquelettiques d’actine (Figure 2C).
Importance du Wnt5a dérivé de NCC pour la migration polarisée des myoblastes
Pour évaluer l’effet paracrine de Wnt5a dérivé de NCC sur la migration des myoblastes, des tests de cicatrisation des plaies ont été effectués sur les myoblastes après l’élimination médiée par siRNA de Wnt5a dans les NCC. Tout d’abord, l’efficacité de knockdown de Wnt5a a été validée dans les CCN par réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel. Le traitement avec 50 nM siRNA contre Wnt5a s’est avéré réduire l’expression du gène Wnt5a de 64% par rapport au siRNA témoin négatif (brouillé) (Figure 3A). En utilisant cette concentration, les inserts de cellules O9-1 ont été transfectés avec le siRNA témoin ou le siRNA Wnt5a 48 heures avant l’assemblage de la coculture. Les cellules C2C12 ont été cultivées dans des conditions normales et les plaies ont été créées à la confluence appropriée. Immédiatement après la génération de la plaie, des inserts de contrôle négatif ou de NCC knockdown Wnt5a ont été ajoutés à chaque puits. Après une période de migration de 10 heures, il a été constaté que l’élimination de Wnt5a dans les CCN réduisait significativement la capacité migratoire des myoblastes sous-jacents par rapport aux myoblastes analysés avec des NCC témoins (39,1% de la zone repeuplée des plaies contre 74,8% de la zone repeuplée des plaies, p < 0,001). De plus, les myoblastes dosés en présence de CCN avec knockdown de Wnt5a présentaient une morphologie cytologique anormale par immunomarquage, y compris des zones cytoplasmiques réduites et moins de projections cytosquelettiques d’actine (Figure 3D). Pour sauver la migration des myoblastes, une supplémentation exogène de 500 ng/mL de rWnt5a a été ajoutée aux puits de coculture contenant des inserts knockdown Wnt5a. L’ajout de rWnt5a exogène a permis de sauver complètement les défauts migratoires et morphologiques observés dans ces myoblastes (Figure 3C,D).
Signalisation Wnt5a à travers ROR2 dans les myoblastes en tant que moteur de migration polarisée
Pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires de réception du signal dans ce modèle paracrine, le test a été répété après l’élimination du récepteur ROR2 dans les myoblastes. Dans cette expérience, les myoblastes ont été transfectés avec 50 nM de siRNA ROR2 ~ 40 h avant la génération de la plaie, ce qui s’est avéré suffisant pour abattre l’expression du gène ROR2 de 54% (Figure 4A). Pendant ce temps, les inserts NCC ont été cultivés en parallèle dans des conditions normales. Une fois que les myoblastes ont atteint une confluence appropriée, des tests de grattage ont été effectués et des inserts de puits de coculture ont été assemblés. Après une période de migration de 10 heures en présence d’inserts de NCC, les myoblastes knockdown ROR2 ont démontré une capacité migratoire réduite par rapport aux myoblastes traités avec un siRNA témoin négatif (48,1% de la zone repeuplée contre 75,7% de la zone repeuplée de la plaie, p = 0,019) (Figure 4B,C). L’ajout de 500 ng/mL de rWnt5a n’a pas permis de sauver la capacité migratoire des myoblastes après l’élimination du ROR2, ce qui suggère que la déplétion du ROR2 perturbe la capacité des myoblastes à recevoir des signaux Wnt5a (Figure 4B,C). L’immunocoloration de la phalloïdine a corroboré les données migratoires et a montré qu’une réduction des lamellopodes et des filopodies à phalloïdine positives dans les myoblastes knockdown ROR2 n’était pas restaurée par un supplément de rWnt5a (Figure 4D).
Figure 1 : Modèle schématique de l’essai. L’étape 1 comprend l’expansion in vitro des myoblastes C2C12 et des CCN à l’aide de cellules nourricières STO. L’étape 2 implique le placage des NCC et des cellules C2C12 dans le système de coculture. L’étape 3 comprend le dosage de la plaie effectué dans les cellules C2C12 sous-jacentes pour évaluer la capacité migratoire cellulaire. L’étape 4 implique l’immunomarquage de la phalloïdine afin d’évaluer l’architecture cytologique et la morphologie des cellules migrées. Abréviations : CCN = cellules de la crête neurale; Ab = anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La présence de cellules de la crête neurale augmente la capacité migratoire des myoblastes. (A) La présence d’inserts de cellules de la crête neurale (NCC) au moment de la génération de la plaie entraîne une amélioration de la migration des myoblastes. L’ajout de Wnt5a recombinant exogène (rWnt5a) aux cocultures NCC-C2C12 a l’effet positif le plus fort sur la migration des myoblastes. (B) Quantification de la surface moyenne repeuplée des myoblastes 9 heures après la génération de la plaie (les barres d’erreur indiquent l’écart-type). (C) Coloration phalloïdine des myoblastes au bord de la plaie 9 h après la génération de la plaie. Les rectangles pointillés montrent des myoblastes colorés à la phalloïdine sur le front migratoire. Un total de n = 3 échantillons ont été utilisés pour chaque condition expérimentale quantifiée en B. Barres d’échelle = 200 μm (pour A et C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Wnt5a dérivé des cellules de la crête neurale est nécessaire à la migration des myoblastes. (A) Expression relative de l’ARNm de Wnt5a pour valider le knockdown médié par le siRNA dans les NCC. (B) La migration des myoblastes C2C12 est significativement réduite après l’élimination de Wnt5a dans les CCN. L’ajout de rWnt5a exogène est suffisant pour sauver ce déficit migratoire chez les myoblastes. (C) Quantification de la surface moyenne repeuplée des myoblastes 10 heures après la génération de la plaie (les barres d’erreur indiquent l’écart type). (D) Coloration phalloïdine des myoblastes au bord de la plaie 10 h après la génération de la plaie. Les rectangles pointillés montrent des myoblastes colorés à la phalloïdine sur le front migratoire. Un total de n = 3 échantillons ont été utilisés pour chaque condition expérimentale quantifiée en C. Barres d’échelle = 200 μm (pour B et D). Abréviations : CCN = cellules de la crête neurale; siRNA = petit ARN interférent. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Signaux Wnt5a à travers les récepteurs ROR2 dans les myoblastes pour stimuler la migration. (A) Expression relative de l’ARNm de ROR2 pour valider le knockdown médié par siRNA dans les cellules C2C12. (B) L’élimination du ROR2 chez les myoblastes réduit leur capacité migratoire malgré la présence de CCN. Le rWnt5a exogène ne parvient pas à sauver la migration des myoblastes après l’élimination du ROR2. (C) Quantification de la surface moyenne repeuplée des myoblastes 10 heures après la génération de la plaie (les barres d’erreur indiquent l’écart type). (D) Coloration phalloïdine des myoblastes au bord de la plaie 10 h après la génération de la plaie. Les rectangles pointillés montrent des myoblastes colorés à la phalloïdine sur le front migratoire. Un total de n = 3 échantillons ont été utilisés pour chaque condition expérimentale quantifiée en C. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviations : CCN = cellules de la crête neurale; siRNA = petit ARN interférent. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Analyse dose-dépendante de la supplémentation en Wnt5a recombinant. L’analyse dose-dépendante pour les tests de supplémentation en Wnt5a recombinant 0 ng / mL, 100 ng / mL et 500 ng / mL a révélé que 500 ng / mL de rWnt5a exogène était la concentration optimale pour conduire la migration des myoblastes et les changements cytoarchitecturaux de la phalloïdine au cours d’une période de migration in vitro de 12 heures. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Images représentatives des inserts de puits. Images en fond clair d’inserts de puits contenant des cellules de crête neurale O9-1 traitées avec (A) 50 nM de siRNA témoin négatif et (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviation : siRNA = petit ARN interférent. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Images représentatives de l’expression de la protéine Wnt5a dans les cellules O9-1 après une neutralisation de Wnt5a médiée par siRNA. Coloration par immunofluorescence de la protéine Wnt5a dans des puits de culture cellulaire contenant des cellules de crête neurale O9-1 traitées avec (A) 50 nM de contrôle négatif siRNA et (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Barres d’échelle = 20 μM. Abréviations : siRNA = petit ARN interférent; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La voie de signalisation non canonique Wnt/polarité cellulaire planaire (PCP) est une voie de signalisation cellulaire d’une importance critique qui a été impliquée dans de multiples processus de développement 24,25 et de maladie24,26. Au cours du développement embryonnaire, la signalisation Wnt non canonique implique un vaste réseau de signaux moléculaires provenant de cellules émettrices de signaux qui induisent finalement des changements dans la morphologie, l’organisation asymétrique et la migration directionnelle dans les cellules réceptrices de signaux11. Des études antérieures ont montré que les voies ligand-récepteurs spécifiques qui conduisent cette signalisation sont diverses, dépendent du contexte et varient souvent entre les types cellulaires12,13,14,15. En raison de cette complexité moléculaire, la capacité d’évaluer les interactions paracrines non canoniques de signalisation Wnt à l’aide de méthodes conventionnelles de recombinaison génétique in vivo a été limitée. Alors que les systèmes in vitro ont été de plus en plus utilisés comme approche alternative pour étudier les phénotypes cellulaires Wnt non canoniques, les protocoles disponibles se concentrent exclusivement sur les aspects de réception de signaux en aval de la voie et ne parviennent pas à modéliser suffisamment la nature intercellulaire et paracrine de ces événements de signalisation. Par conséquent, l’objectif de la présente étude était de développer un protocole pour un système de coculture sans contact qui récapitule les interactions paracrines Wnt in vitro. L’objectif de ce protocole était de modéliser deux aspects caractéristiques de la signalisation Wnt fonctionnelle non canonique in vitro, y compris l’organisation des protéines de filament intracellulaire et la capacité migratoire polarisée.
Comme preuve de concept, ce protocole a été appliqué pour étudier les mécanismes paracrines dans le contexte du développement cardiaque. Au cours de la cardiogenèse, les événements de signalisation réciproque entre les NCC cardiaques et les cellules progénitrices SHF sont cruciaux pour la maturation appropriée des voies d’écoulement cardiaque (OFT)27,28,29. Des travaux antérieurs ont montré qu’au cours du développement cardiaque de la souris, la signalisation Wnt/PCP médiée par NCC dans les cellules SHF pharyngées est nécessaire pour l’incorporation des cellules progénitrices SHF dans l’OFT en développement et pour l’alignement OFTnormal 21. Schleiffarth et al. et d’autres ont montré que l’élimination génétique du gène codant pour le ligand Wnt/PCP, Wnt5, perturbe l’organisation des cellules progénitrices de la SHF et la capacité migratoire, entraînant un OFT cardiaque raccourci et mal aligné22,23,30. Avec des lignées cellulaires murines établies de NCC (O9-1)31 et de myoblastes (C2C12), ce protocole démontre que la coculture avec les NCC est associée à une augmentation des filopodies cytoplasmiques et des lamellipodes phalloïdines positives et améliore la capacité migratoire des myoblastes dans un test de cicatrisation des plaies. Ces paramètres moléculaires et fonctionnels in vitro s’appuient sur des protocoles précédemment publiés pour la manipulation NCC31 et modélisent étroitement les changements phénotypiques in vivo décrits dans Wnt5a global knockout mice, validant l’utilité de ce modèle.
Pour déterminer la voie moléculaire spécifique conduisant à la signalisation Wnt non canonique entre les NCC et les myoblastes, des expériences parallèles de knockdown spécifiques à la cellule pour les gènes codant pour le ligand candidat, Wnt5a, dans les NCC et son récepteur correspondant, ROR2, dans les myoblastes ont été réalisées. Comme prévu, l’élimination des molécules dans les cellules émettrices de signaux (Wnt5a dans les NCC) et les cellules de réception du signal (ROR2 dans les myoblastes) a indépendamment perturbé les changements cytoarchitecturaux d’actine liés au Wnt / PCP et inhibé la migration des myoblastes. Il est important de noter que le sauvetage phénotypique avec Wnt5a recombinant n’a été observé que dans la condition de knockdown NCC-Wnt5a, qui soutient un mécanisme par lequel Wnt5a dérivé de NCC active la signalisation PCP dans les myoblastes par l’intermédiaire des récepteurs ROR2. Ces résultats sont cohérents avec les données des études génétiques de souris qui identifient l’axe Wnt5a-ROR2 comme un axe de signalisation Wnt/PCP crucial entre les NCC et les cellules SHF au cours du développement cardiaque embryonnaire 3,21. Bien qu’il n’ait pas été testé expérimentalement dans ce protocole, il n’est pas clair si Wnt5a dérivé de la SHF fournit des signaux paracrines réciproques à la crête neurale via les récepteurs ROR2. Cette hypothèse pourrait être testée à l’aide de ce protocole en répétant les expériences avec des cellules C2C12 sur le dessus et des cellules O9-1 sur le bas de la construction d’insertion de puits. Si Wnt5a dérivé de la SHF fournit un signal paracrine réciproque par NCC-ROR2, on pourrait s’attendre à ce que le knockdown de Wnt5a dans les cellules C2C12 inhibe la capacité migratoire et la polymérisation de l’actine des cellules O9-1 sous-jacentes.
Ce protocole présente plusieurs points forts. Premièrement, il s’agit d’un système d’insertion de puits sans contact qui intègre l’utilisation séquentielle de tests de cicatrisation des plaies et de techniques d’immunomarquage pour évaluer les caractéristiques fonctionnelles et moléculaires Wnt / PCP dans la même population de cellules réceptrices de signaux. Cela fournit non seulement une approche robuste pour phénotyper l’organisation intracellulaire non canonique des filaments induits par Wnt et les changements migratoires polarisés in vitro , mais permet également des évaluations plus granulaires des mécanismes de transduction du signal. Bien que ce protocole fournisse une preuve de principe concernant les molécules Wnt5a-ROR2, le modèle se prête également facilement à l’évaluation des effets d’autres ligands et récepteurs dans la voie de signalisation Wnt non canonique. On peut adapter davantage le protocole d’immunomarquage pour évaluer l’expression de multiples protéines effectrices potentielles en aval (par exemple, RhoA, P-JNK, Daam1, Rac1) dont il a été démontré qu’elles transduisaient des signaux Wnt non canoniques in vivo. De plus, les niveaux de protéines de ces différentes molécules effectrices peuvent être corrélés avec les phénotypes de cytoarchitecture migratoire ou d’actine. Deuxièmement, la nature sans contact du système de coculture permet la manipulation indépendante de molécules spécifiques émettrices de signaux par rapport aux molécules de réception de signaux dans la voie Wnt/PCP. Dans ces résultats représentatifs, il a été choisi pour effectuer un knockdown siRNA spécifique à la cellule. Cependant, ce protocole se prête également à l’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques ou de lignées cellulaires génétiquement modifiées pour évaluer les voies de ligand-récepteur candidates pour une application clinique. De même, on peut réaliser des expériences de sauvetage phénotypique en ajoutant des composés moléculaires ou pharmacologiques au milieu de coculture, comme cela a été montré avec le Wnt5a recombinant. Le ciblage de ces composés pour sauver sélectivement les perturbations d’envoi de signaux par rapport aux perturbations de réception de signaux valide davantage les voies mécanistes paracrines d’une manière qui n’est pas autorisée en utilisant les systèmes modèles in vivo actuels.
Ce protocole comporte de nombreuses étapes critiques. Premièrement, il est important de veiller à ce que les cellules primaires soient dilatées et maintenues à la confluence appropriée tout au long du protocole. Si les myoblastes C2C12 sont autorisés à proliférer jusqu’à 100% de confluence, ils commenceront à fusionner et à se différencier des myoblastes en myotubes. Par conséquent, ces cellules doivent être traversées à la densité appropriée telle que décrite. Deuxièmement, étant donné que les cellules nourricières STO sont nécessaires pour générer un milieu conditionné pour développer des cellules O9-1, il est impératif que l’on inactive de manière appropriée les cellules STO avec de la mitomycine C et que l’on fabrique suffisamment (au moins 500 mL) de milieu de croissance O9-1 en utilisant des cellules STO inactivées avant de décongeler et de plaquer les cellules O9-1. L’étape la plus critique de ce protocole est peut-être la génération de rayures appropriées avec une géométrie et une largeur uniformes dans la monocouche myoblastique32,33. L’étape 3.1.4 détaille plusieurs conseils pour optimiser cette partie du protocole. Malgré ces recommandations, il faut reconnaître que la variabilité associée aux tests de rayures 2D standard demeure un défi technique et une limite de ce protocole. Par conséquent, il est nécessaire d’avoir plusieurs répliques techniques de chaque condition expérimentale.
Enfin, bien que les résultats présentés ici aient été générés à l’aide de NCC et de myoblastes murins, ce protocole peut, en principe, être adapté pour inclure toute cellule émettrice et réceptrice de signaux d’intérêt. En conséquence, ce système a non seulement des applications pour faire progresser les mécanismes de base de la signalisation Wnt paracrine non canonique dans une variété de contextes de développement, mais il peut également être utilisé pour tester les mécanismes thérapeutiques pour les processus pathologiques liés au Wnt / PCP. Les exemples incluent le dépistage pharmacologique des médicaments qui inhibent la capacité migratoire induite par Wnt / PCP des cellules malignes ou rétablissent la migration directionnelle des types de cellules terminales dérivées du patient avec une capacité de signalisation PCP défectueuse au départ. Au-delà de la voie de signalisation Wnt non canonique, ce protocole peut également être adapté pour étudier d’autres mécanismes de signalisation paracrine et des voies entre deux types de cellules. Par exemple, l’élimination médiée par siRNA de molécules sécrétoires connues dans d’autres voies (par exemple, Notch, Bmp/Tgf-β, Fgf) dans les cellules O9-1 peut être associée à l’immunomarquage de marqueurs prolifératifs, de différenciation ou apoptotiques dans les myoblastes sous-jacents.
En conclusion, ce protocole établit un protocole expérimental nouveau et hautement traitable pour étudier les mécanismes de l’organisation non canonique des filaments intracellulaires liés au Wnt et de la migration polarisée in vitro. Les méthodes décrites ici améliorent les techniques existantes en maintenant la nature intercellulaire et paracrine des interactions Wnt et permettent l’évaluation indépendante des composantes d’envoi de signaux par rapport aux composantes de réception de signaux de cette voie. Ce protocole peut être largement appliqué pour étudier les mécanismes de signalisation paracrine de base Wnt / PCP entre deux types de cellules et le dépistage de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les processus pathologiques liés au Wnt / PCP.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par les prix F30HL154324 à O.T. et K08HL121191 et R03HL154301 à S.R.K. Les auteurs tiennent à reconnaître que le schéma de la figure 1 de ce manuscrit a été créé avec biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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