Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/63247
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

Summary

המחקר הנוכחי מתווה שיטה הניתנת לשחזור ומתיחה גבוהה לחקר אירועי איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה. פרוטוקול זה יושם כדי להעריך את ההשפעה של איתות Wnt5a של פרקרין בתאי הצמרת העצבית של מורין ובמיובלסטים.

Abstract

איתות Wnt לא-קנוני מווסת את ארגון חוטי האקטין התוך-תאיים ואת הנדידה המקוטבת של תאי אב במהלך העובר. תהליך זה דורש אינטראקציות פרקריניות מורכבות ומתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. בהתחשב בכך שאינטראקציות אלה יכולות להתרחש בין סוגים שונים של תאים משושלות שונות, הערכת in vivo של פגמים ספציפיים לתאים יכולה להיות מאתגרת. המחקר הנוכחי מתאר שיטה בעלת יכולת שחזור גבוהה להערכת איתות Wnt פרקריני לא-קנוני במבחנה. פרוטוקול זה תוכנן עם היכולת (1) לבצע הערכות פונקציונליות ומולקולריות של איתות Wnt לא-קנוני בין כל שני סוגי תאים בעלי עניין; (2) לנתח את התפקיד של מולקולות שולחות אותות לעומת מולקולות קולטות אותות במסלול האיתות הלא-קנוני של Wnt; ו-(3) לבצע ניסויי הצלה פנוטיפיים בגישות מולקולריות או פרמקולוגיות סטנדרטיות.

פרוטוקול זה שימש להערכת איתות Wnt לא-קנוני בתיווך תאי עצב (NCC) במיובלסטים. נוכחותם של NCCs קשורה למספר מוגבר של פילופודיה ציטופלסמית חיובית לפלואידין ולמליפודיה במיובלסטים ונדידת מיובלסטים משופרת בבדיקת ריפוי פצעים. ציר Wnt5a-ROR2 זוהה כמסלול איתות Wnt לא-קנוני חיוני בין NCC לבין אבות קרדיומיובלסטים בשדה הלב השני (SHF). לסיכום, זהו פרוטוקול נוח מאוד לחקר מנגנוני איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה.

Introduction

איתות Wnt לא-קנוני הוא מסלול משומר אבולוציונית המווסת את ארגון החוטים התאיים ואת ההגירה הכיוונית. מסלול זה היה מעורב בתהליכים ביולוגיים מרובים, כולל מורפוגנזה של רקמה עוברית 1,2,3, אנגיוגנזה לימפטית וכלי דם 4,5,6,7, וצמיחת סרטן וגרורות 8,9,10 . ברמה התאית, איתות Wnt לא-קנוני מתבצע באמצעות אינטראקציות פרקריניות מתואמות בין תאים השולחים אותות וקולטי אותות. אינטראקציות אלה מתרחשות לעתים קרובות בין תאים של שושלות או סוגים שונים ומערבות רשת מולקולרית מגוונת הכוללת עד 19 ליגנדות וקולטנים מרובים, קולטנים משותפים ואפקטים של התמרת אותות במורד הזרם11. מה שמסבך עוד יותר את תהליך האיתות הזה, מחקרים קודמים הראו כי שילובי ליגנד-קולטן יכולים להשתנות באופן תלוי הקשר ורקמות 12,13, וכי אותן ליגנדות מקור המניעות איתות Wnt לא-קנוני בתאים קולטי אותות יכולות להיות מיוצרות על ידי מספר סוגי תאים השולחים אותות 14,15 . בהתחשב במורכבות התאית והמולקולרית הקשורה לאיתות Wnt לא-קנוני, היכולת לחקור מנגנונים אינדיבידואליים ורלוונטיים מבחינה קלינית in vivo הייתה מוגבלת.

נעשו ניסיונות לחקור איתות Wnt לא-קנוני באמצעות טכניקות של תרביות תאים במבחנה. לדוגמה, מבחני ריפוי פצעים שבוצעו במונולרים תאיים שימשו להערכה פונקציונלית של נדידה כיוונית תאית 4,16,17,18,19. טכניקות אימונוסטינינג שימשו לביצוע ניתוחים מרחביים של ביטוי חלבונים על פני השטח כדי להעריך שינויים שאינם נגרמים על ידי Wnt במורפולוגיה תאית 7,10, ארכיטקטורה וקיטוב אסימטרי18,19,20. אף על פי שגישות אלה סיפקו כלים חשובים לאפיון פנוטיפים הקשורים ל-Wnt בתאים קולטי אותות, היעדרם של רכיבים השולחים אותות בפרוטוקולים אלה מגביל את יכולתם ליצור מודלים מדויקים של מנגנוני איתות פראקריניים שנצפו in vivo. כתוצאה מכך, עדיין קיים צורך קריטי בפיתוח מערכות חוץ גופיות המאפשרות הערכה איתנה וניתנת לשחזור של אינטראקציות איתות פראקריניות בין תאים השולחים אותות וקולטים של מסלול Wnt הלא-קנוני, במיוחד אלה של סוגי תאים שונים.

לשם כך, המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה ליצור פרוטוקול למודל אינטראקציות איתות Wnt לא-קנוניות במבחנה. פיתחנו מערכת קולקולטורה ללא מגע המשחזרת רכיבים של שליחת אותות וקבלת אותות של אינטראקציות אלה ומאפשרת שימוש בגישות מולקולריות, גנטיות או פרמקולוגיות סטנדרטיות כדי לחקור באופן עצמאי מנגנוני קולטני ליגנד ספציפיים במסלול Wnt הלא-קנוני. מנגנונים של איתות Wnt בתיווך NCC נבדקו במיובלסטים באמצעות קווי תאי מורין מבוססים. כהוכחה עקרונית, מודל זה שימש כדי לאשש ממצאים של מחקרי in vivo קודמים בעכברים המרמזים על ציר Wnt5a-ROR2 כמסלול איתות Wnt לא-קנוני רלוונטי בין NCCs 21 לבין אבות קרדיומיובלסטים SHF 3,22,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התפשטות קדם-ניסויית ומעבר של תאים

  1. תרבית תאים C2C12:
    1. הכינו 500 מ"ל של מדיום תרבית C2C12 על ידי שילוב מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. להפשיר בקבוקון של C2C12 תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. בזמן שתאי C2C12 מופשירים, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיום C2C12 לצינור חרוטי של 15 מ"ל. מיד להעביר את התאים מופשרים לצינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000.
      הערה: תאי C2C12 הם תאי מורין מיובלסט ששימשו בעבר ואומתו כקו תאים ראשוני למידול אבות קרדיומיובלסט.
    3. מערבבים בעדינות תאי C2C12 בצינור החרוטי באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר מכן, הוסף את כל נפח התאים המופשרים במדיום C2C12 (6 מ"ל) לבקבוקבגודל 75 ס"מ 2.
    4. הוסיפו 6 מ"ל של C2C12 בינוני טרי לבקבוקון לקבלת נפח כולל של 12 מ"ל. סובבו בעדינות את הבקבוקון כך שתמיסת התא והמדיה תכסה את כל החלק התחתון של הצלוחית. מניחים את הבקבוקון באינקובטור של תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) כדי לאפשר לתאים להידבק.
    5. אפשרו לתאים להתרחב באינקובטור עד שיגיעו למפגש של ~60%.
      הערה: ניתן לקבוע זאת על ידי הסרה תקופתית של התאים מהאינקובטור ובדיקה מהירה של המפגש שלהם תחת מיקרוסקופ. הקפד למזער את הזמן שבו תאים מוסרים מן האינקובטור.
  2. העברת תאי C2C12:
    1. חמם את C2C12 בינוני, 500 מ"ל של 1x PBS, ו 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר חימום הריאגנטים, מעבירים את כל הריאגנטים למכסה המנוע של תרבית התאים.
    2. הביאו את הבקבוקון המכיל את תאי C2C12 לתוך מכסה המנוע של תרבית התאים. יש לשטוף בעדינות את הבקבוקון המכיל את תאי C2C12 עם PBS חם 1x פעמיים.
      1. הטה את הבקבוקון בזווית של 45° ושאף את המדיום C2C12 באמצעות פיפטה מזכוכית המחוברת לשאיבה בוואקום. תוך שמירה על זווית של 45°, הוסיפו בזהירות 10 מ"ל של PBS חם 1x לפינת הבקבוקון באמצעות פיפטה סרולוגית. הניחו את הבקבוקון שטוח על פני השטח והזיזו בעדינות את הבקבוקון בתנועות מעגליות כדי להבטיח שה-PBS 1x ישטוף את כל ה-monolayer של התאים.
        הערה: היזהר שלא לשבש את ה-C2C12 החד-שכבתי בעת שאיפת המדיום.
    3. יש להסיר את ה-PBS 1x לאחר השטיפה השנייה. הוסיפו 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוקון, הזיזו בעדינות את הבקבוקון כפי שתואר לעיל כדי לאפשר לתמיסת הטריפסין-EDTA להתפשט על פני כמה שיותר מהמונולאייר והניחו את הבקבוקון באינקובטור למשך 2 דקות.
    4. לאחר דגירה של 2 דקות, הסר את הבקבוקון מהאינקובטור והקש עליו בעדינות כדי לנתק את כל התאים הנותרים.
    5. הוסיפו 9 מ"ל של מדיום C2C12 לבקבוקון עם פיפטה סרולוגית כדי להרוות את הטריפסין. באמצעות פיפטה סרולוגית, בעדינות לשטוף את התאים עם המדיום ולאסוף את 10 מ"ל של השעיית תאים טריפסיניזציה. הוסף 10 מ"ל של מתלה התא לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 100 × גרם למשך 5 דקות.
    6. החזירו את הצינור החרוטי למכסה המנוע של תרבית התאים והסירו את הסופר-נאטנט בעזרת פיפטה מזכוכית המחוברת לשאיבה בוואקום. בזמן שאיפת הסופר-נטנט, היזהרו לא להפריע לכדור התא בתחתית הצינור החרוטי. כדי לעשות זאת, להשאיר ~ 0.2 מ"ל של supernatant בצינור חרוטי. יש לתלות את התאים ב-10 מ"ל של מדיום C2C12 טרי.
    7. לקבלת מעבר נוסף, יש להוסיף 1 מ"ל מהתאים המחיים לתוך בקבוקבגודל 75 ס"מ 2. מוסיפים 11 מ"ל של C2C12 בינוני לבקבוקון עם פיפטה סרולוגית ומניחים את הבקבוקון באינקובטור.
  3. תרבית תאי STO:
    1. הכינו את תרבית STO בינונית על ידי ייצור 500 מ"ל של DMEM עם 7% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-2 ננומטר L-גלוטמין.
    2. הכינו 0.1% ג'לטין על ידי הוספת 0.5 גרם אבקת ג'לטין לבקבוק המכיל 500 מ"ל של מים ברמת רקמות או אוטוקלב. הוסף 7 מ"ל של תמיסת ג'לטין 0.1% לבקבוקבגודל 75 ס"מ 2. סובבו את הבקבוקון כך שתמיסת הג'לטין תכסה את כל תחתית הצלוחית. תנו לבקבוקון לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית התאים.
    3. לאחר דגירה של 30 דקות, יש להסיר את עודפי הג'לטין באמצעות פיפטה המחוברת לשאיבה בוואקום. תנו לצלוחיות להישאר באינקובטור עוד 30 דקות לפני השימוש.
    4. הפשרת בקבוקון של תאי STO באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה P1000, מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום תרבית STO טרי.
      הערה: תאי STO הם פיברובלסטים עובריים של מורין המשמשים באופן שגרתי כתאי הזנה בפרוטוקולים של תרביות תאים.
    5. מערבבים בעדינות את התאים בצינור החרוטי באמצעות פיפטה סרולוגית. הוסף את כל נפח התאים (6 מ"ל) לבקבוקון מצופה ג'לטין בגודל75 ס"מ 2. סובב את הבקבוקון כדי לוודא שמתלה התא מופץ היטב לאורך החלק התחתון של הצלוחית.
    6. הוסיפו 6 מ"ל של STO בינוני טרי לבקבוקון לקבלת נפח כולל של 12 מ"ל. סובב את הבקבוקון כמתואר לעיל כדי להבטיח שהתאים והמדיום מפוזרים היטב לאורך החלק התחתון של הבקבוקון. מניחים את הבקבוקון באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להידבק. אפשרו לתאים להתרבות באינקובטור עד שהם מגיעים למפגש של ~60-70%.
  4. מעבר תאי STO:
    1. מדיום תאי STO חם, 1xPBS ו-0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. יש לשטוף בעדינות את הבקבוקון המכיל תאי STO עם PBS חם פי 1 כמתואר בשלב 1.2.2.1.
    3. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוקון באמצעות פיפטה P1000. מניחים את הבקבוקון באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 דקות דגירה, להסיר את הבקבוק מן החממה. הקישו בעדינות על הבקבוקון כדי לנתק את התאים הנדבקים.
    5. הוסף 9 מ"ל של מדיום STO לבקבוקון כדי להרוות את הטריפסין ולאסוף את 10 מ"ל של תרחיף תאים טריפסיני כמתואר לעיל. הוסף 10 מ"ל של מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 100 × גרם למשך 5 דקות.
    6. הסר את supernatant ו resuse את התאים ב 10 מ"ל של מדיום STO כפי שתואר לעיל. לקבלת מעבר נוסף, יש להוסיף 1 מ"ל מהתאים המחיים לתוך בקבוקבגודל 75 ס"מ 2. הוסף 11 מ"ל של מדיום STO, סובב את הבקבוקון כדי להבטיח חלוקה שווה של התאים והמדיום לאורך החלק התחתון של הבקבוקון, והנח את הבקבוקון באינקובטור.
  5. תרבית תאי STO לא פעילה ותכשיר מדיום בסיסי של תאי O9-1:
    1. הכן את תרבית הבסיס של תאי O9-1 על-ידי ערבוב של 500 מ"ל של DMEM עם 15% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 2 ננומטר L-גלוטמין, 0.1 mM חומצות אמינו לא חיוניות מינימליות, נתרן פירובט 1 ננומטר ובטא-מרקפטואתנול של 55 מיקרומטר.
    2. הכינו תמיסת מיטומיצין C ב-1x PBS בריכוז של 0.5 מ"ג/מ"ל על ידי הוספת 4 מ"ל של 1x PBS ישירות לבקבוקון מיטומיצין C. פיפטה את התמיסה מספר פעמים עם פיפטה P1000. כדי להמיס עוד יותר את המיטומיצין C ב-PBS אחד, הניחו את הבקבוקון על מערבל מערבולות או נדנדת ספסל למשך 45 דקות עד שעה.
    3. השבת את תאי ה-STO על-ידי טיפול בלוחות ה-STO בריכוז סופי של 0.01 מ"ג/מ"ל מיטומיצין C שנוסף למדיום ה-STO הסטנדרטי. הניחו את לוחות ה-STO בתוך האינקובטור למשך שעתיים, תוך הקפדה על הגנה על הבקבוקון המכיל מיטומיצין C מפני אור על ידי מזעור זמן השהייה מחוץ לאינקובטור. לאחר טיפול מיטומיצין, יש לשטוף את התאים ב-PBS 1x פעמיים כפי שמתואר בשלב 1.2.2.1.
      הערה: מיטומיצין C מעכב את התפשטות תאי ה-STO, כך שניתן להשתמש בהם ליצירת מדיום מותנה במשך מספר ימים מבלי להפוך לתגובת יתר בבקבוקון.
    4. לאחר הסרת PBS 1x, הוסף 12 מ"ל של מדיום תרבית בסיסית O9-1 לתרביות תאי STO מומתים ודגרה אותם במשך 24 שעות. אסוף את מדיום התרבות הבסיסית STO + O9-1 המותנה והשהה אותו בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל עטופים בנייר כסף כדי להגן עליו מפני אור.
    5. הוסף 12 מ"ל של תרבית בסיסית O9-1 טרייה לתרביות תאי STO מומתים כמתואר לעיל. חזור על שלב זה על ידי הוספת מדיום תרבית בסיסית O9-1 טרי לאותם אגפים המכילים את תאי ה- STO המומתים כל 24 שעות.
      הערה: לאחר טיפול מיטומיצין C, תאי ה-STO המומתים אינם יכולים להתרבות; לפיכך, צלוחיות המכילות את תאי STO מומתים ניתן לעשות שימוש חוזר כדי ליצור מדיום מותנה.
    6. אחסנו את הצינורות החרוטיים עטופים בנייר כסף של 50 מ"ל המכילים מדיום תרבית בסיסית מותנה ולא פעילה של STO + O9-1 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לאיסוף כולל של 500 מ"ל מהמדיום.
  6. תרבית תאים O9-1:
    1. הכינו מדיום של תרבית גידול תאים O9-1 באמצעות 500 מ"ל של מדיום בסיסי מותנה STO + O9-1, והוסיפו 103 יחידות של גורם מעכב לוקמיה (LIF) ו-25 ng/mL גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (basic-FGF).
    2. הכינו צלוחיות מצופות ג'לטין 0.1% כמתואר בשלבים 1.3.2-1.3.3.
    3. הפשרת בקבוקון של תאי O9-1 באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים מיד את התאים המופשרים לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום גידול O9-1 טרי.
      הערה: קו התאים O9-1 הוא קו התאים העצבי היציב והרב-פוטנטי היחיד שנוצר מהעכבר. קו תאים זה משמש בדרך כלל בניסויים עצביים במבחנה .
    4. מערבבים בעדינות את התאים באמצעות פיפטה סרולוגית. מוסיפים את כל 6 מ"ל התאים לבקבוקון מצופה ג'לטין בגודל 75 ס"מ2 .
    5. הוסף 6 מ"ל של מדיום גידול O9-1 לבקבוקון עבור נפח כולל של 12 מ"ל. מניחים את הבקבוקון באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להידבק. אפשרו לתאים להתרבות באינקובטור עד שהם מגיעים למפגש של ~60-70%.
  7. מעבר תאי O9-1:
    1. בינוני צמיחה חם O9-1, 1x PBS ו- 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. יש לשטוף בעדינות את הצלחת המכילה תאי O9-1 עם PBS חם 1x פעמיים כמתואר בשלב 1.2.2.1.
    3. מוסיפים 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לבקבוקון ומניחים אותו באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. לאחר 5 דקות דגירה, הסר את הבקבוקון מהאינקובטור והקש על הבקבוקון בעדינות כדי לנתק את כל התאים הנדבקים.
    5. הוסף 9 מ"ל של מדיום צמיחה O9-1 לבקבוקון כדי להרוות את הטריפסין. לאסוף 10 מ"ל של השעיית התא טריפסיני ולהוסיף 10 מ"ל של השעיית תא זה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור ב 100 × גרם במשך 5 דקות.
    6. הסר את supernatant ו resuse את התאים ב 10 מ"ל של מדיום הצמיחה O9-1. לקבלת מעבר נוסף, יש להוסיף 1 מ"ל מהתאים המחודשים לבקבוקוןבגודל 75 ס"מ 2. הוסף 11 מ"ל של מדיום צמיחה O9-1 והנח את הבקבוקון המכיל את התאים ב 12 מ"ל של בינוני באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.

2. ציפוי תאים במערכת קולקולטורה

  1. ציפוי תאי C2C12:
    1. לאחר טריפסיניזציה (כמתואר בשלב 1.2), יש לתלות מחדש את גלולת התא C2C12 ב-10 מ"ל של מדיום C2C12. דלל את התאים ביחס של 1:20 במדיום C2C12 על ידי הסרת 0.5 מ"ל מתאי C2C12 המחודשים והוספתם לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל המכיל 9.5 מ"ל של מדיום C2C12 טרי. מערבבים בעדינות את המתלה עם פיפטה סרולוגית.
    2. הוסף 1 מ"ל של תאי C2C12 מדולל 1:20 לכל באר של באר חדשה בת 4 תאים באמצעות פיפטה P1000 והנח את הבאר בעלת 4 התאים באינקובטור.
  2. ציפוי תא O9-1 מוסיף:
    1. לאחר טריפסינליזציה, יש לתלות מחדש את גלולת התא O9-1 ב-10 מ"ל של מדיום גדילה O9-1. דלל את התאים ביחס של 1:20 במדיום גדילה O9-1 על ידי הסרת 0.5 מ"ל מתאי C2C12 שעברו החייאה והוספתם לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל המכיל 9.5 מ"ל של מדיום גידול O9-1 טרי. מערבבים בעדינות את המתלה עם פיפטה סרולוגית.
    2. הנח תוסף חדיר יחיד (ראה טבלת החומרים) בתוך כל באר של באר חדשה בת 4 תאים מלאה במדיום גידול O9-1 של 1 מ"ל.
      הערה: באר זו בעלת 4 התאים צריכה להיות שונה מזו המכילה את תאי C2C12 משלב 2.1.3.
    3. הוסף 300 μL של תרחיף תא O9-1 מדולל לכל תוספת באמצעות פיפטה P1000. ודא שהחלק התחתון של כל תוספת שקוע בתוך הבאר המלאה ב-1.3 מ"ל של מדיום צמיחה O9-1. מניחים את הבאר באינקובטור 37 מעלות צלזיוס.
  3. (אופציונלי). בצע הפלת siRNA בתאי O9-1 או C2C12.
    1. בצע הפלת גנים על ידי siRNA 18-24 שעות לאחר ציפוי או תוספות תא O9-1 או בארות תא תא C2C12.
      1. יש לדלל את ה-siRNA ואת מגיב הטרנספקציה במדיום מופחת בסרום (ראו טבלת חומרים) בהתאם להמלצות היצרנים ולריכוזים הרצויים לניסוי. מערבבים בעדינות את ה-siRNA המדולל ואת מגיב הטרנספקציה (1:1) ודוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות.
        הערה: בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בריכוזים של 50 ננומטר מכיוון שריכוז siRNA זה נקבע כדי לגרום לפגיעה מספקת בביטוי גני המטרה.
      2. הוסף את קומפלקסי ה-siRNA-ליפידים לתוספות התאים O9-1 או לבארות התא C2C12 כפי שנקבע על ידי התכנון הניסיוני ודגירה של התאים עם קומפלקסי siRNA-ליפידים במשך ~36-48 שעות.

3. ביצוע בדיקת פצעים והערכה כמותית של נדידת מיובלסט

  1. בדיקת הפצע:
    1. אפשר לתאי O9-1 ולבארות התאים C2C12 להידבק ולהתרבות באינקובטור עד ששני התאים יהיו במפגש של ~70-80% לפני שתמשיך עם חלק זה של הפרוטוקול. אם התאים גדלים ב->90% מפגש, אל תמשיכו בבדיקת השריטות, מכיוון שהתאים רק יתנתקו מהבאר.
    2. חם 1x PBS ו C2C12 בינוני על ידי הצבתם באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    3. הסר היטב מדיום סופר-נאטנטי מתא C2C12 ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS אחד. הסר את 1x PBS ומיד לגרד את התאים עם קצה פיפטה P10 סטרילי.
      1. מעבירים את קצה הפיפטה הסטרילי P10 בחוזקה בכיוון אחד כדי להתפרס על כל האורך או הרוחב של המונולייר של התא (למשל, מימין לשמאל, מלמעלה למטה). הקפד לגרד כל באר המכילה תאים רק פעם אחת.
        הערה: כדי למטב את תוצאות הגירוד, יש לגרד בארות של תנאי ניסוי שונים ברמת מפגש דומה. כדי לעשות זאת, ודא שלכל באר בת 4 תאים יש תאים עבור כל תנאי ניסוי נדרש (למשל, ובכן #1 בקרה שלילית, ובכן #2 בקרה חיובית). בנוסף, השתמש פיפטה P10 סטרילית חדשה עבור כל שריטה והפעל כמות דומה של כוח על פיפטה בכל פעם. אל תנסה ליצור יותר משריטה אחת בכל באר.
      2. לאחר הגירוד, הוסיפו במהירות 1 מ"ל של PBS 1x בחזרה לבאר באמצעות קצה פיפטה P1000. חזור על תהליך זה עבור כל באר כי יהיה שרוט.
        הערה: בהתחשב בשונות הקשורה לכל שריטה, מומלץ להשתמש במספר בארות (n = 3) ליצירת פצעים בכל מצב ניסויי. עבוד במהירות מכיוון שחיוני למזער את משך הזמן שבו התאים נמצאים ללא PBS אחד במהלך שלבים אלה. לאחר הסרת 1x PBS מכל באר, אחד לא צריך לקחת יותר מ 5 s כדי ליצור פצע בכל באר.
    4. לאחר יצירת פצע והוספת PBS 1x בחזרה לכל באר, דמיין את השריטה באמצעות מיקרוסקופ הפוך של שדה בהיר והשתמש בתמונה זו כגודל הפצע הבסיסי (זמן 0). כדי לצלם תמונות, בצע את השלבים הבאים:
      1. הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ (עיין בטבלת החומרים) על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. הנח את שקופית התא על הבמה וסובב את חוגת המטרה להגדלה של פי 5.
      2. פתח את תוכנת ההדמיה (עיין בטבלת החומרים) על-ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה בשולחן העבודה של המחשב. לחץ על הכרטיסייה מצלמה במסך הבית של התוכנה. לחץ על לחצן Live כדי להציג באופן חזותי את התאים בכרטיסייה AxioCam IC .
      3. ודא שמסנן האור נמשך כל הדרך החוצה כדי לאפשר לאור לעבור למצלמה ולמסך המחשב. הזז ו/או סובב ידנית את שקופית התא כדי למקם את אזור הפצע במרכז התמונה החיה בכרטיסיית AxioCam IC .
      4. כדי לצלם תמונות, לחץ על הצמד כדי לפתוח כרטיסייה חדשה לצד הכרטיסיה AxioCam IC המכילה את התמונה.
      5. כדי לשמור תמונת סטילס זו, לחץ על הקובץ בפינה הימנית העליונה של דף הבית של התוכנה | לשמור בשם | הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. שמור את הדמות בתבנית Carl Zeiss image (*.czi) (הגדרת ברירת המחדל), ובחר שולחן עבודה בסרגל בצד שמאל כדי לשמור את הקובץ בשולחן העבודה כקובץ .czi, שניתן לפתוח רק בתוכנת Zen lite 2012.
      6. כדי לשמור את התמונה .tiff, לחץ על קובץ | לשמור בשם | הזן את שם הקובץ בתיבה שם הקובץ. שמור את האיור כקובץ תמונה מתויג (*.tiff) על ידי לחיצה על לחצן שמור כסוג ובחירה באפשרות *.tiff מהתפריט הנפתח.
        הערה: ניתן לפתוח את פורמט .tiff בכל תוכנת עיבוד תמונה.
      7. מקם מחדש באופן ידני את שקופית התא כדי לצלם 2-3 תמונות נוספות בנקודות אחרות של הפצע באותה באר.
        הערה: בסך הכל, התוצאה תהיה 3-4 תמונות לא חופפות, בהגדלה גבוהה של הפצע בכל באר.
    5. הסר את ה- PBS 1x מכל באר והוסף 1 מ"ל של מדיום C2C12.
      הערה: יש להיזהר שלא לבצע פיפטה אגרסיבית מדי בעת הסרה או הוספה של תמיסות לתא היטב לאחר יצירת פצעים, שכן הדבר עלול לגרום לתאים להתנתק מהתא היטב. בנוסף, הטה את התא היטב, כך שניתן יהיה לבצע שאיפה והצגה מחדש של פתרונות בפינות של כל באר כדי למזער את ההפרעה החד-שכבתית של התא.
    6. הרכיבו את מערכת הקידוח על ידי מיקום ידני של התוספות המכילות את תאי O9-1 בכל באר של החדר. דחפו בעדינות את התוספות כלפי מטה לתוך הבאר, כך שתחתית התוסף ממוקמת בדיוק מעל תאי C2C12 שמתחתיהם. החזירו את מבני הבאר לאינקובטור.
      הערה: אל תאפשר לחלק התחתון של התוסף לגעת פיזית ולשבש מכנית את תאי C2C12 שמתחתיהם.
    7. אפשר לתאים לנדוד למשך 9-12 שעות בסך הכל. כדי לקבוע את זמן הנדידה האופטימלי, בדוק את התאים בשעה 6 שעות לאחר יצירת הפצע, ולאחר מכן כל 2-3 שעות לאחר מכן. סיים את הניסוי כאשר התאים בשליטה או בתנאי בקרה חיוביים מתחילים לכסות לחלוטין את הפצע.
      הערה: בהתחשב באופי ללא מגע של המבנה, אין צורך להסיר את ההוספה העודפת מהבארות בעת בדיקת התקדמות ההעברה במרווחי זמן. שונות נודדת תיראה בהתאם לגורמים כגון סוגי התאים המשמשים בבדיקה זו, צפיפות התאים בזמן יצירת הפצע, רוחב הפצע שנוצר ותנאי ניסוי של תאים שעברו מניפולציה (למשל, נפילת גנים, תוספת חלבון רקומביננטי). ריכוזים של ריאגנטים אלה צריכים להיקבע באופן ניסיוני עם הדרכה מהמלצות היצרן.

4. צביעה אימונופלואורסצנטית והדמיה של מיובלסטים נודדים

  1. סיום בדיקת ההעברה ופירוק מערכת הכנסת הבאר:
    1. הסר את תוספות התא O9-1 לאחר תקופת העברה של 9-12 שעות (או זמן חלופי שנקבע על-ידי תנאי הניסוי). שאפו בזהירות את המדיום C2C12 באמצעות פיפטה P1000. הוסף 0.5 מ"ל של PBS 1x לבארות התא, וצלם תמונות סופיות של תאים לאחר נדידה.
    2. שאפו בזהירות את כל 0.5 מ"ל של 1x PBS מעורבב עם בינוני והסר את תאי הפלסטיק מבארות התא באמצעות הוראות ערכה, והשאיר את השקופית הבסיסית המכילה את תאי C2C12.
      הערה: היזהר שלא לשבש את תאי C2C12 הנדבקים לשקופית בעת הסרת בארות התא.
  2. ביצוע אימונוסטינינג:
    1. הניחו מיד את השקופית במחזיק שקופיות המכיל 4% פרפורמלדהיד (PFA) ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו החוצה את ה-PFA של 4% והוסיפו 0.1% Triton X-100 המכיל 1x PBS (1x PBST) למחזיק השקופיות כדי לשטוף את המגלשה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שפכו את ה-PBST 1x והוסיפו PBS אחד למחזיק השקופיות כדי לשטוף את המגלשה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב זה פעם נוספת לקבלת סך של שתי כביסות PBS 1x.
    2. הסר את השקופית ממחזיק השקופית. עקבו אחר הקצוות החיצוניים של השקופית בעזרת עט הידרופובי כדי ליצור גבול הידרופובי סביב המגלשה כדי למנוע שפיכת תמיסות מהשקופית. היזהרו לא להפריע לתאים הנדבקים.
    3. הוסף תמיסת חסימה של אלבומין בסרום בקר (BSA) (מדולל ב-1x PBS) לשקופית (~0.5 מ"ל לכל שקופית). ודא שהתמיסה כלולה בגבול ההידרופובי שנוצר בשלב 4.2.4. יש לדגור על המגלשה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא שקופיות לח.
      הערה: למרות שחסימת BSA אינה נדרשת עבור חיסון של פלואידין, שלב זה בפרוטוקול מאפשר צימוד עם צביעת נוגדנים פלואורסצנטיים.
    4. לאחר חסימה במשך שעה אחת, שפכו את תמיסת החסימה מהשקופית, הוסיפו נוגדן פאלוידין (מדולל ל-1:200 בתמיסת חסימת BSA של 1% על ידי הוספת 5 μL של הנוגדן ל-995 μL של תמיסת BSA) למגלשה ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שוב, ודא שהפתרון כלול בגבול ההידרופובי שנוצר בשלב 4.2.4. בהתחשב בכך שנוגדן הפלואידין מצומד לצבע Alexa Fluor-488, יש למזער את החשיפה לאור של מגיב הנוגדן לפני ואחרי הוספה לשקופית.
    5. למחרת, מקם את השקופית במחזיק שקופיות המוגן מפני חשיפה לאור (לדוגמה, עטוף את מחזיק השקופיות בנייר כסף או השתמש במחזיק שקופיות שאינו שקוף). שטפו את התאים במחזיק השקופיות עם PBS אחד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על הכביסה במשך שלוש כביסות של 10 דקות בסך הכל.
    6. הוסף מדיום הרכבה 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) והרכב את השקופיות עם כיסויי זכוכית. דמיינו את התאים שהיגרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההשפעות של NCCs על יכולת הנדידה של מיובלסטים של מורין
בדיקה זו יושמה לראשונה כדי להעריך את ההשפעה של NCCs על יכולת הנדידה של מיובלסטים. איור 1 מתאר את המודל הסכמטי של הבדיקה. כדי לבחון השפעה זו, בוצעו בדיקות שריטה עם מיובלסטים שגודלו בבידוד (ללא תוספות NCC) בהשוואה לאלה שגודלו בנוכחות תוספות. כבקרה חיובית, 500 ננוגרם/מ"ל של Wnt5a רקומביננטי (rWnt5a) נוספו לבארות תא עם תוספות NCC. ריכוז זה של rWnt5a נקבע על-ידי ניתוח מינון-תגובה שבוצע בתאי C2C12 (איור משלים S1). תמונות מייצגות של תוספות NCC מוצגות באיור משלים S2, מה שמוכיח שה-NCCs בריאים בנקודת זמן זו. אימונופלואורסצנציה מדגימה פגיעה חזקה של Wnt5a ברמת החלבון לאחר הדגירה עם 50 ננומטר של Wnt5a siRNA (איור משלים S3). לאחר תקופת נדידה של 9 שעות, נמצא כי נוכחותם של NCCs הגדילה באופן משמעותי את יכולת הנדידה של מיובלסטים בהשוואה למיובלסטים שנבדקו בהיעדר תוספות NCC (72.6% אזור מאוכלס מחדש בפצע לעומת 59.1% אזור מאוכלס מחדש בפצע, p = 0.033). התוספת של rWnt5a לבארות קולקולטורה האיצה את נדידת המיובלסט, כאשר חלק מאזורי הפצע הדגימו התאוששות מלאה בנקודת הזמן של 9 שעות, כפי שניתן לראות באיור 2. כצפוי, מיובלסטים נודדים בכל שלושת התנאים הציגו מורפולוגיה תאית נודדת רגילה, כולל פילופודיה ולמלופודיה בנויות היטב ובולטות וקיטוב אסימטרי של תחזיות אקטין ציטוסקטליות (איור 2C).

החשיבות של Wnt5a שמקורו ב-NCC עבור נדידה מקוטבת של מיובלסטים
כדי להעריך את ההשפעה הפראקרינית של Wnt5a שמקורו ב-NCC על נדידת מיובלסט, בוצעו בדיקות ריפוי פצעים במיובלסטים בעקבות ההדחה בתיווך siRNA של Wnt5a ב-NCCs. ראשית, יעילות ההדחה של Wnt5a אומתה ב-NCCs על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת. נמצא כי טיפול ב-siRNA של 50 ננומטר נגד Wnt5a מפחית את ביטוי הגנים של Wnt5a ב-64% בהשוואה ל-siRNA של בקרה שלילית (מקושקשת) (איור 3A). באמצעות ריכוז זה, תוספות תאי O9-1 עברו טרנספקציה עם בקרת siRNA או Wnt5a siRNA 48 שעות לפני הרכבת הקוקולטורה. תאי C2C12 גודלו בתנאים רגילים, ופצעים נוצרו במפגש המתאים. מיד לאחר יצירת הפצע, נוספו לכל באר שליטה שלילית או תוספות NCC של Wnt5a knockdown. לאחר תקופת נדידה של 10 שעות, נמצא כי הפלת Wnt5a ב- NCCs הפחיתה באופן משמעותי את יכולת הנדידה הבסיסית של מיובלסטים בהשוואה למיובלסטים שנבדקו עם NCCs של בקרה (39.1% אזור מאוכלס מחדש בפצע לעומת 74.8% אזור מאוכלס מחדש בפצע, p < 0.001). יתר על כן, מיובלסטים שנבדקו בנוכחות NCCs עם פגיעה ב-Wnt5a הראו מורפולוגיה ציטולוגית חריגה על-ידי אימונוסטינינג, כולל אזורים ציטופלסמיים מופחתים ופחות תחזיות של אקטין ציטוסקטלי (איור 3D). כדי להציל את נדידת מיובלסט, נוספה תוספת אקסוגנית של 500 ננוגרם/מ"ל של rWnt5a לבארות קולקולטורה המכילות תוספות נוק-דאון Wnt5a. נמצא כי תוספת של rWnt5a אקסוגני מצילה לחלוטין פגמים נודדים ומורפולוגיים שנצפו במיובלסטים האלה (איור 3C,D).

איתות Wnt5a דרך ROR2 במיובלסטים כגורם לנדידה מקוטבת
כדי להבין טוב יותר את מנגנוני התאים הקולטים אותות במודל פרקריני זה, הבדיקה חזרה על עצמה לאחר הפלת קולטן ROR2 במיובלסטים. בניסוי הזה, מיובלסטים הועתקו עם 50 ננומטר של ROR2 siRNA ~40 שעות לפני יצירת הפצע, מה שהוכח כמספיק כדי להפיל את ביטוי הגן ROR2 ב-54% (איור 4A). במהלך תקופה זו, תוספות NCC גודלו במקביל בתנאים רגילים. לאחר שהמיובלסטים הגיעו למפגש מתאים, בוצעו מבחני שריטה, והורכבו תוספות באר קולקולטורה. לאחר תקופת נדידה של 10 שעות בנוכחות תוספות NCC, מיובלסטים של ROR2 הדגימו יכולת נדידה מופחתת בהשוואה למיובלסטים שטופלו ב-siRNA של בקרה שלילית (48.1% אזור מאוכלס מחדש בפצעים לעומת 75.7% אזור מאוכלס מחדש בפצע, p = 0.019) (איור 4B,C). התוספת של 500 ng/mL rWnt5a לא הצליחה להציל את יכולת הנדידה של מיובלסט בעקבות הפלת ROR2, מה שמרמז על כך שדלדול ROR2 משבש את היכולת של מיובלסטים לקלוט אותות Wnt5a (איור 4B,C). אימונוסטינינג של פאלוידין אישש את נתוני הנדידה והראה כי ירידה בלמלופודיה ופילופודיה חיוביות לפאלוידין במיובלסטים של ROR2 לא שוחזרה על-ידי rWnt5a משלים (איור 4D).

Figure 1
איור 1: מודל סכמטי של הבדיקה. שלב 1 כולל הרחבה חוץ-גופית של מיובלסטים C2C12 ו-NCCs באמצעות תאי הזנה של STO. שלב 2 כולל ציפוי של תאי NCCs ו-C2C12 במערכת הקולטורה. שלב 3 כולל את בדיקת הפצע המבוצעת בתאי C2C12 הבסיסיים כדי להעריך את יכולת הנדידה של התאים. שלב 4 כולל חיסון לפלוידין כדי להעריך ארכיטקטורה ציטולוגית ומורפולוגיה של תאים נודדים. קיצורים: NCCs = תאי פסגה עצביים; Ab = נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: נוכחות של תאי צמרת עצבית מגבירה את יכולת הנדידה של מיובלסט. (A) נוכחות של תאי פסגה עצביים (NCC) בזמן יצירת הפצע מובילה לנדידת מיובלסטים משופרת. לתוספת של רקומביננטי אקסוגני Wnt5a (rWnt5a) לקולקולטורות NCC-C2C12 יש את ההשפעה החיובית החזקה ביותר על נדידת מיובלסט. (B) כימות של אזור האכלוס הממוצע של מיובלסט ב-9 שעות לאחר יצירת הפצע (קווי השגיאה מראים סטיית תקן). (C) הכתמת פלוידין של מיובלסטים בגבול הפצע 9 שעות לאחר יצירת הפצע. מלבנים מקווקווים מראים מיובלסטים מוכתמים בפלוידין בחזית הנודדת. בסך הכל n = 3 דגימות שימשו עבור כל תנאי ניסוי שכומת ב- B. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (עבור A ו- C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: Wnt5a שמקורו בתאי פסגה עצביים נחוץ לנדידת מיובלסט. (A) ביטוי mRNA יחסי של Wnt5a כדי לאמת את ההדחה בתיווך siRNA ב-NCCs. (B) נדידת מיובלסטים C2C12 מופחתת באופן משמעותי בעקבות ההפלה של Wnt5a ב-NCCs. תוספת של rWnt5a אקסוגני מספיקה כדי להציל את הגירעון הנודד הזה במיובלסטים. (C) כימות של אזור ממוצע מאוכלס מחדש של מיובלסט ב-10 שעות לאחר יצירת פצעים (קווי שגיאה מראים סטיית תקן). (D) הכתמת פלוידין של מיובלסטים בגבול הפצע 10 שעות לאחר יצירת הפצע. מלבנים מקווקווים מראים מיובלסטים מוכתמים בפלוידין בחזית הנודדת. בסך הכל n = 3 דגימות שימשו עבור כל תנאי ניסוי שכומת ב- C. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר (עבור B ו- D). קיצורים: NCCs = תאי פסגה עצביים; siRNA = רנ"א מתערב קטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אותות Wnt5a דרך קולטני ROR2 במיובלסטים כדי להניע נדידה. (A) ביטוי mRNA יחסי של ROR2 כדי לאמת את ההפלה בתיווך siRNA בתאי C2C12. (B) פגיעה ב-ROR2 במיובלסטים מפחיתה את יכולת הנדידה שלהם למרות נוכחותם של NCCs. rWnt5a אקסוגני לא מצליח להציל את נדידת המיובלסט לאחר הפלת ROR2. (C) כימות של אזור ממוצע מאוכלס מחדש של מיובלסט ב-10 שעות לאחר יצירת פצעים (קווי שגיאה מראים סטיית תקן). (D) הכתמת פלוידין של מיובלסטים בגבול הפצע 10 שעות לאחר יצירת הפצע. מלבנים מקווקווים מראים מיובלסטים מוכתמים בפלוידין בחזית הנודדת. בסך הכל n = 3 דגימות שימשו עבור כל תנאי ניסוי שכומת ב- C. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצורים: NCCs = תאי פסגה עצביים; siRNA = רנ"א מתערב קטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: ניתוח תלוי מינון עבור תוספת Wnt5a רקומביננטית. ניתוח תלוי מינון לבדיקת תוספי Wnt5a רקומביננטיים 0 ng/mL, 100 ng/mL ו-500 ng/mL מצא כי 500 ng/mL של rWnt5a אקסוגני הוא הריכוז האופטימלי להנעת נדידת מיובלסט ושינויים ציטו-ארכיטקטוניים של פלוידין במהלך תקופת נדידה של 12 שעות במבחנה. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: תמונות מייצגות של תוספות באר. תמונות שדה בהיר של תוספות באר המכילות תאי פסגה עצביים O9-1 שטופלו ב-(A) 50 ננומטר בקרה שלילית siRNA ו-(B) 50 ננומטר Wnt5a siRNA. סרגלי קנה מידה = 200 מיקרומטר. קיצור: siRNA = RNA מפריע קטן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: תמונות מייצגות של ביטוי חלבון Wnt5a בתאי O9-1 בעקבות פגיעה ב-Wnt5a בתיווך siRNA. צביעה אימונופלואורסצנטית של חלבון Wnt5a בבארות תרבית תאים המכילות תאי פסגה עצביים O9-1 שטופלו ב-(A) 50 ננומטר בקרה שלילית siRNA ו-(B) 50 ננומטר Wnt5a siRNA. סרגלי קנה מידה = 20 μM. קיצורים: siRNA = RNA מפריע קטן; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מסלול האיתות הלא-קנוני Wnt/קוטביות התא המישורי (PCP) הוא מסלול איתות תאי בעל חשיבות קריטית שהיה מעורב במספר תהליכים התפתחותיים 24,25 ומחלות 24,26. במהלך ההתפתחות העוברית, איתות Wnt לא-קנוני כולל רשת נרחבת של אותות מולקולריים מתאים השולחים אותות, אשר בסופו של דבר גורמים לשינויים במורפולוגיה, בארגון אסימטרי ובנדידה כיוונית בתאים קולטי אותות11. מחקרים קודמים הראו כי מסלולי קולטני הליגנד הספציפיים המניעים את האיתות הזה הם מגוונים, תלויי הקשר, ולעתים קרובות משתנים בין סוגי תאים12,13,14,15. בשל מורכבות מולקולרית זו, היכולת להעריך אינטראקציות איתות Wnt פרקריניות לא-קנוניות באמצעות שיטות רקומבינציה גנטית קונבנציונליות in vivo הייתה מוגבלת. בעוד שמערכות חוץ גופיות שימשו יותר ויותר כגישה חלופית לחקר פנוטיפים תאיים של Wnt שאינם קנוניים, הפרוטוקולים הזמינים מתמקדים אך ורק בהיבטים של קליטת אותות במורד הזרם של המסלול ואינם מצליחים לדמות במידה מספקת את האופי הבין-תאי והפאראקריני של אירועי איתות אלה. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח פרוטוקול למערכת חקלאות ללא מגע המשחזרת אינטראקציות Wnt פרקריניות במבחנה. המיקוד של פרוטוקול זה היה לדגום שני היבטים אופייניים של איתות Wnt פונקציונלי לא-קנוני במבחנה, כולל ארגון חלבוני נימה תוך-תאיים ויכולת נדידה מקוטבת.

כהוכחת היתכנות, פרוטוקול זה יושם כדי לחקור מנגנונים פרקריניים בהקשר של התפתחות הלב. במהלך קרדיוגנזה, אירועי איתות הדדיים בין NCCs לבביים ותאי אב SHF הם חיוניים להבשלה המתאימה של דרכי זרימת הלב (OFT)27,28,29. עבודות קודמות הראו כי במהלך התפתחות לב עכבר, נדרש איתות Wnt/PCP בתיווך NCC בתאי SHF בלוע לשילוב תאי אב SHF ב-OFT המתפתח וליישור OFTתקין 21. Schleiffarth et al. ואחרים הראו כי נוקאאוט גנטי של הגן המקודד את ליגנד Wnt/PCP, Wnt5, הוכח כמשבש את ארגון תאי האב של SHF ואת יכולת הנדידה, וכתוצאה מכך OFT לבבי לא מיושר ולא מיושר 22,23,30. עם קווי תאים מבוססים של מורין NCC (O9-1)31 ומיובלסט (C2C12), פרוטוקול זה מדגים כי קולקולטורה עם NCCs קשורה לעלייה בפילופודיה ציטופלסמית חיובית לפאלוידין ולמליפודיה ומשפר את יכולת הנדידה של מיובלסט בבדיקת ריפוי פצעים. נקודות קצה מולקולריות ופונקציונליות אלה במבחנה מתבססות על פרוטוקולים שפורסמו בעבר עבור מניפולציה של NCC31 ומדגימות מקרוב את השינויים הפנוטיפיים in vivo המתוארים בעכברי נוקאאוט גלובליים של Wnt5a, המאמתים את התועלת של מודל זה.

כדי לקבוע את המסלול המולקולרי הספציפי המניע איתות Wnt לא-קנוני בין NCCs למיובלסטים, בוצעו ניסויים מקבילים ספציפיים לתאים עבור הגנים המקודדים את הליגנד המועמד, Wnt5a, ב-NCCs והקולטן המקביל לו, ROR2, במיובלסטים. כצפוי, פגיעה במולקולות הן בתאי שליחת אותות (Wnt5a ב-NCCs) והן בתאי קליטת אותות (ROR2 במיובלסטים) שיבשה באופן עצמאי שינויים ציטו-ארכיטקטוניים הקשורים לאקטין מסוג Wnt/PCP ועיכבה את נדידת המיובלסט. חשוב לציין כי הצלה פנוטיפית עם Wnt5a רקומביננטי נצפתה רק במצב ההדחה NCC-Wnt5a, התומך במנגנון לפיו Wnt5a שמקורו ב-NCC מפעיל איתות PCP במיובלסטים באמצעות קולטני ROR2. תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם נתונים ממחקרים גנטיים של עכברים המזהים את ציר Wnt5a-ROR2 כציר איתות Wnt/PCP חיוני בין NCCs לתאי SHF במהלך התפתחות הלב העוברי 3,21. למרות שלא נבדק בניסוי בפרוטוקול זה, עדיין לא ברור אם Wnt5a שמקורו ב-SHF מספק אותות פרקרין הדדיים לפסגה העצבית באמצעות קולטני ROR2. ניתן לבחון השערה זו באמצעות פרוטוקול זה על ידי חזרה על הניסויים עם תאי C2C12 בחלק העליון ותאי O9-1 בתחתית מבנה הבאר. אם Wnt5a שמקורו ב-SHF אכן מספק אות פרקריני הדדי דרך NCC-ROR2, אז אפשר היה לצפות שהפלת Wnt5a בתאי C2C12 תעכב את יכולת הנדידה ואת פילמור האקטין של תאי O9-1 הבסיסיים.

ישנן מספר נקודות חוזק ייחודיות של פרוטוקול זה. ראשית, זוהי מערכת החדרה ללא מגע המשלבת שימוש רציף במבחני ריפוי פצעים וטכניקות חיסון כדי להעריך מאפייני Wnt/PCP פונקציונליים ומולקולריים באותה אוכלוסייה של תאים קולטי אותות. זה לא רק מספק גישה איתנה לפנוטיפ של ארגון נימה תוך-תאית שאינה נגרמת על ידי Wnt ושינויים נודדים מקוטבים במבחנה , אלא גם מאפשר הערכות פרטניות יותר של מנגנוני העברת אותות. בעוד שפרוטוקול זה מספק הוכחה עקרונית לגבי מולקולות Wnt5a-ROR2, המודל גם מתאים בקלות להערכת ההשפעות של ליגנדות וקולטנים אחרים במסלול האיתות הלא-קנוני של Wnt. ניתן להמשיך ולהתאים את פרוטוקול ה-immunostaining כדי להעריך את הביטוי של מספר חלבונים בעלי השפעה פוטנציאלית במורד הזרם (למשל, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) שהוכחו כמתמרים אותות Wnt לא-קנוניים in vivo. בנוסף, רמות החלבון של מולקולות ההשפעה השונות הללו יכולות להיות מתואמות עם פנוטיפים של ציטו-ארכיטקטורה נודדת או אקטין. שנית, האופי ללא מגע של מערכת הקוקולטה מאפשר מניפולציה עצמאית של מולקולות ספציפיות של שליחת אותות לעומת מולקולות קולטות אותות במסלול Wnt/PCP. בתוצאות מייצגות אלה, הוא נבחר לבצע נוק-דאון של siRNA ספציפי לתאים. עם זאת, פרוטוקול זה מקובל גם על השימוש במעכבים פרמקולוגיים או קווי תאים מהונדסים גנטית להערכת מסלולי קולטני ליגנד מועמדים ליישום קליני. באופן דומה, ניתן לבצע ניסויי הצלה פנוטיפיים על ידי הוספת תרכובות מולקולריות או פרמקולוגיות למדיום הקוקולטורה, כפי שהוכח עם Wnt5a רקומביננטי. התמקדות בתרכובות אלה להצלה סלקטיבית של שליחות אותות לעומת דרגות קליטת אותות מאמתת עוד יותר מסלולים מכניסטיים פרקריניים בדרכים שאינן מותרות באמצעות מערכות מודל in vivo הנוכחיות.

ישנם שלבים קריטיים רבים של פרוטוקול זה. ראשית, חשוב לוודא שהתאים הראשוניים מורחבים ומתוחזקים במפגש המתאים לאורך כל הפרוטוקול. אם מיובלסטים C2C12 יורשו להתרבות עד 100% מפגש, הם יתחילו להתמזג ולהבדיל ממיובלסטים למיובלטים. לפיכך, תאים אלה חייבים להיות מועברים בצפיפות המתאימה כמתואר. שנית, בהתחשב בכך שתאי הזנה של STO נחוצים כדי לייצר תווך מותנה כדי לגדל תאי O9-1, הכרחי לנטרל כראוי תאי STO עם מיטומיצין C וליצור מספיק (לפחות 500 מ"ל) O9-1 מדיום גדילה באמצעות תאי STO מושתקים לפני הפשרה וציפוי של תאי O9-1. אולי השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא יצירת שריטות מתאימות עם גיאומטריה ורוחב אחידים במונולייר myoblast32,33. שלב 3.1.4 מפרט מספר טיפים לאופטימיזציה של חלק זה של הפרוטוקול. למרות המלצות אלה, יש להכיר בכך שהשונות הקשורה למבחני שריטה דו-ממדיים סטנדרטיים נותרה אתגר טכני ומגבלה של פרוטוקול זה. לכן, יש צורך במספר שכפולים טכניים של כל תנאי ניסוי.

לבסוף, למרות שהתוצאות המוצגות כאן נוצרו באמצעות NCCs של מורין ומיובלסטים, פרוטוקול זה יכול, באופן עקרוני, להיות מותאם כך שיכלול כל תא ששולח אותות ומקבל אותות שמעניין אותו. כתוצאה מכך, למערכת זו יש לא רק יישומים לקידום מנגנונים בסיסיים של איתות Wnt פרקריני לא-קנוני במגוון הקשרים התפתחותיים, אלא שהיא יכולה לשמש גם לבדיקת מנגנונים טיפוליים לתהליכי מחלה הקשורים ל-Wnt/PCP. דוגמאות לכך כוללות סריקה פרמקולוגית לתרופות המעכבות את יכולת הנדידה המושרה על ידי Wnt/PCP של תאים ממאירים או משחזרות נדידה כיוונית של סוגי תאים סופניים שמקורם בחולה עם יכולת איתות PCP פגומה בנקודת ההתחלה. מעבר למסלול האיתות הלא-קנוני של Wnt, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם לחקר מנגנוני איתות ומסלולים אחרים של פראקרינים בין שני סוגי תאים. לדוגמה, ניתן להצמיד נוקאאוט בתיווך siRNA של מולקולות הפרשה ידועות במסלולים אחרים (למשל, Notch, Bmp/Tgf-β, Fgf) בתאי O9-1 עם חיזוק חיסוני של סמנים מתרבים, התמיינות או אפופטוטיים במיובלסטים שמתחת.

לסיכום, פרוטוקול זה קובע פרוטוקול ניסויי חדשני וניתן להרחבה כדי לחקור מנגנונים של ארגון נימה תוך-תאית שאינה קשורה ל-Wnt והגירה מקוטבת במבחנה. השיטות המתוארות כאן משפרות את הטכניקות הקיימות על ידי שמירה על האופי הבין-תאי והפאראקריני של אינטראקציות Wnt ומאפשרות הערכה עצמאית של מרכיבי שליחת אותות לעומת קבלת אותות במסלול זה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם באופן נרחב כדי לחקור מנגנוני איתות בסיסיים של Paracrine Wnt/PCP בין שני סוגי תאים ולבדוק תרכובות טיפוליות חדשות המכוונות לתהליכי מחלה הקשורים ל-Wnt/PCP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרסי NIH F30HL154324 ל- O.T. ו- K08HL121191 ו- R03HL154301 ל- S.R.K. המחברים רוצים להכיר בכך שהסכימה באיור 1 בכתב היד הזה נוצרה עם biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M-7522
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10 Stored at 4 °C
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology sc-2323 Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell line ATCC CRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2 ThermoFisher Scientific 156499
Chamber Slide System, 4-well ThermoFisher Scientific 154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) Corning 10-017-CV Stored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane Corning 353095
Fetal bovine serum Fisher Scientific W3381E Stored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1% ATCC PCS-999-027 Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µL USA Scientific 1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x Gibco 11140-050
Minimum essential medium (MEM) Corning 10-022-CV
Mitomycin C Roche 10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm Springside Scientific HRTCG2455
O9-1 neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
Opti-MEM I, 1x Gibco 31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4% Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) Fisher Scientific W3470H Stored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488 Abcam ab176753 Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CV Stored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a protein R&D Systems 645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mM Gibco 11360-070
Square Petri dish with grid Thomas Scientific 1219C98
STO murine fibroblast feeder cells ATCC CRL-1503
Triton X-100 solution Sigma Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25% Fisher Scientific W3513C Stored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope Carl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy software Carl Zeiss AG imaging software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
  2. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
  3. Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
  4. Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
  5. Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
  6. Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
  7. Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
  8. Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
  9. Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
  10. Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
  11. Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
  12. Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
  13. Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
  14. Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
  15. Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
  16. Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
  17. Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
  18. Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
  19. Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
  20. Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
  21. Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
  22. Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
  23. Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
  24. Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
  25. Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
  26. Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
  27. Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
  28. Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
  29. Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
  30. Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
  31. Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
  32. Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
  33. Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 178
מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים <em>במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R.… More

Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R. Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (178), e63247, doi:10.3791/63247 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter