Summary
본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 사건을 연구하기 위한 매우 재현성 있고 다루기 쉬운 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 쥐 신경 볏 세포 및 근모세포에서 파라크린 Wnt5a 신호 전달의 영향을 평가하기 위해 적용되었습니다.
Abstract
비표준 Wnt 신호 전달은 배아 발생 동안 세포 내 액틴 필라멘트 조직 및 전구 세포의 분극 이동을 조절합니다. 이 프로세스에는 신호 전송 셀과 신호 수신 셀 간의 복잡하고 조정된 파라크린 상호 작용이 필요합니다. 이러한 상호 작용이 서로 다른 계통의 다양한 유형의 세포 간에 발생할 수 있다는 점을 감안할 때 세포 특이적 결함의 생체 내 평가는 어려울 수 있습니다. 본 연구는 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호전달을 평가하기 위한 고도로 재현성 있는 방법을 기술한다. 이 프로토콜은 (1) 관심있는 두 세포 유형 사이에서 비표준 Wnt 신호 전달의 기능적 및 분자 평가를 수행하는 능력으로 설계되었습니다. (2) 비표준 Wnt 신호 전달 경로에서 신호 전송 대 신호 수신 분자의 역할을 해부합니다. (3) 표준 분자 또는 약리학적 접근으로 표현형 구조 실험을 수행합니다.
이 프로토콜은 근모세포에서 신경 볏 세포(NCC) 매개 비표준 Wnt 신호 전달을 평가하는 데 사용되었습니다. NCC의 존재는 근아세포에서 팔로이딘 양성 세포질 필로포디아 및 라멜리포디아의 증가와 상처 치유 분석에서 개선된 근세포 이동과 관련이 있습니다. Wnt5a-ROR2 축은 NCC와 제 2 심장 필드 (SHF) 심근 세포 전구 세포 사이의 중요한 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 확인되었습니다. 결론적으로, 이것은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 전달 메커니즘을 연구하기 위한 매우 다루기 쉬운 프로토콜입니다.
Introduction
비표준 Wnt 신호 전달은 세포 필라멘트 조직과 방향 이동을 조절하는 진화적으로 보존된 경로입니다. 이 경로는 배아 조직 형태 형성 1,2,3, 림프 및 혈관 신생 4,5,6,7, 암 성장 및 전이 8,9,10을 포함한 여러 생물학적 과정과 관련이 있습니다. . 세포 수준에서 비표준 Wnt 신호 전달은 신호 송신 세포와 신호 수신 세포 간의 조정된 파라크린 상호 작용을 통해 수행됩니다. 이러한 상호작용은 상이한 계통 또는 유형의 세포 사이에서 빈번하게 발생하며, 최대 19개의 리간드 및 다중 수용체, 공동-수용체 및 다운스트림 신호 전달 이펙터(11)를 포함하는 다양한 분자 네트워크를 포함한다. 이러한 신호전달 과정을 더욱 복잡하게 만드는 것은 이전 연구에서 리간드-수용체 조합이 문맥 및 조직 의존적 방식으로 다양할 수 있으며12,13, 신호 수신 세포에서 비표준 Wnt 신호전달을 유도하는 동일한 소스 리간드가 여러 신호 전달 세포 유형에 의해 생성될 수 있음을 보여주었습니다.14,15 . 비표준 Wnt 신호 전달과 관련된 세포 및 분자 복잡성을 감안할 때 생체 내에서 개별 및 임상적으로 관련된 메커니즘을 연구하는 능력은 제한적이었습니다.
시험관 내에서 세포 배양 기술을 사용하여 비표준 Wnt 신호 전달을 연구하려는 시도가 있었습니다. 예를 들어, 세포 단층에서 수행된 상처-치유 분석은 세포 방향 이동 4,16,17,18,19를 기능적으로 평가하기 위해 사용되었다. 면역염색 기술은 세포 형태 7,10, 아키텍처및 비대칭 편광(18,19,20)에서 비표준 Wnt 유도 변화를 평가하기 위해 표면 단백질 발현의 공간 분석을 수행하는 데 사용되었습니다. 이러한 접근법이 신호 수신 세포에서 Wnt 관련 표현형을 특성화하는 데 중요한 도구를 제공했지만, 이러한 프로토콜에 신호 전달 성분이 없기 때문에 생체 내에서 관찰되는 파라 크린 신호 전달 메커니즘을 정확하게 모델링하는 능력이 제한됩니다. 결과적으로, 비표준 Wnt 경로의 신호 송신 및 수신 세포, 특히 다른 세포 유형의 세포 간의 파라크린 신호 상호 작용에 대한 강력하고 재현 가능한 평가를 허용하는 시험관 내 시스템을 개발할 중요한 필요성이 남아 있습니다.
이를 위해, 본 연구의 주요 목적은 시험관 내에서 파라크린 비표준 Wnt 신호 상호작용을 모델링하기 위한 프로토콜을 확립하는 것이었다. 우리는 이러한 상호 작용의 신호 전송 및 신호 수신 구성 요소를 요약하고 표준 분자, 유전 적 또는 약리학 적 접근법을 사용하여 비표준 Wnt 경로에서 특정 리간드 수용체 메커니즘을 독립적으로 연구 할 수있는 비접촉 공동 배양 시스템을 개발했습니다. NCC 매개 Wnt 신호 전달의 메커니즘은 확립 된 쥐 세포주를 사용하여 근세포 세포에서 조사되었습니다. 원리의 증거로서, 이 모델은 Wnt5a-ROR2 축을 NCC 21과 SHF 심근세포 전구세포 전구세포 3,22,23 사이의 관련 비표준 Wnt 신호 전달 경로로 암시하는 마우스에서의 이전 생체내 연구 결과를 확증하는 데 사용되었다.
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Protocol
1. 세포의 사전 실험 확장 및 계대 숙성
- C2C12 세포 배양:
- Dulbecco의 변형 된 Eagle 's 배지 (DMEM)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 결합하여 500mL의 C2C12 배양 배지를 준비합니다.
- C2C12 세포의 바이알을 37°C 수조에서 해동시킨다. C2C12 세포가 해동되는 동안 5mL의 C2C12 배지를 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 즉시 해동된 세포를 P1000 피펫을 사용하여 15mL 튜브로 옮깁니다.
참고: C2C12 세포는 이전에 심근세포 전구세포를 모델링하기 위한 1차 세포주로 사용 및 검증된 쥐 근원세포 세포입니다. - 혈청 피펫을 사용하여 원추형 튜브에서 C2C12 세포를 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 해동된 세포의 전체 부피를 C2C12 배지(6 mL)에 75cm2 플라스크에 첨가한다.
- 총 부피 12mL에 대해 6mL의 신선한 C2C12 배지를 플라스크에 추가합니다. 세포 및 배지 용액이 플라스크의 전체 바닥을 덮도록 플라스크를 부드럽게 회전시킵니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣고 세포가 부착되도록 한다.
- 세포가 ~ 60 % 컨플루언스에 도달 할 때까지 인큐베이터에서 확장되도록합니다.
참고: 이것은 인큐베이터에서 주기적으로 세포를 제거하고 현미경으로 밀도를 신속하게 확인하여 확인할 수 있습니다. 인큐베이터에서 세포가 제거되는 시간을 최소화하십시오.
- C2C12 세포 계대:
- C2C12 배지, 500mL의 1x PBS, 및 0.25% 트립신-EDTA를 37°C 수조에서 따뜻하게 합니다. 시약이 예열된 후 모든 시약을 세포 배양 후드로 옮깁니다.
- C2C12 세포가 들어 있는 플라스크를 세포 배양 후드에 넣습니다. C2C12 세포가 들어 있는 플라스크를 따뜻한 1x PBS로 두 번 부드럽게 헹굽니다.
- 플라스크를 45° 각도로 기울이고 진공 흡입에 연결된 유리 피펫으로 C2C12 배지를 흡입합니다. 45° 각도를 유지하면서 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크 모서리에 따뜻한 1x PBS 10mL를 조심스럽게 추가합니다. 플라스크를 표면에 평평하게 놓고 플라스크를 원을 그리며 부드럽게 움직여 1x PBS가 세포의 전체 단층을 세척하도록 합니다.
알림: 매체를 흡입하는 동안 C2C12 단층을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 플라스크를 45° 각도로 기울이고 진공 흡입에 연결된 유리 피펫으로 C2C12 배지를 흡입합니다. 45° 각도를 유지하면서 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크 모서리에 따뜻한 1x PBS 10mL를 조심스럽게 추가합니다. 플라스크를 표면에 평평하게 놓고 플라스크를 원을 그리며 부드럽게 움직여 1x PBS가 세포의 전체 단층을 세척하도록 합니다.
- 두 번째 세척 후에 1x PBS를 제거합니다. 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 추가하고 위에서 설명한 대로 플라스크를 부드럽게 움직여 트립신-EDTA 용액이 가능한 한 많은 단층에 퍼지도록 하고 플라스크를 인큐베이터에 2분 동안 놓습니다.
- 2분 배양 후 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내고 부드럽게 두드려 나머지 세포를 분리합니다.
- 혈청학적 피펫으로 플라스크에 9mL의 C2C12 배지를 추가하여 트립신을 담금질합니다. 혈청학적 피펫을 사용하여, 세포를 배지로 부드럽게 헹구고 트립신화된 세포 현탁액 10 mL를 수집한다. 세포 현탁액 10mL를 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 원추형 튜브를 세포 배양 후드로 되돌리고 진공 흡입에 연결된 유리 피펫으로 상청액을 제거합니다. 상청액을 흡인하는 동안 원추형 튜브 바닥의 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 이렇게하려면 원추형 튜브에 ~ 0.2mL의 상청액을 남겨 두십시오. 세포를 10mL의 새로운 C2C12 배지에 재현탁시킵니다.
- 추가 계대 배양을 위해 재현탁 세포 1mL를 75cm2 플라스크에 추가합니다. 혈청학적 피펫으로 플라스크에 C2C12 배지 11mL를 추가하고 플라스크를 인큐베이터에 넣습니다.
- STO 세포 배양:
- 7% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2nM L-글루타민으로 DMEM 500mL를 만들어 STO 배양액을 준비합니다.
- 티슈 등급 또는 오토클레이브 물 500mL가 들어 있는 병에 젤라틴 분말 0.5g을 추가하여 0.1% 젤라틴을 준비합니다. 75cm2 플라스크에 0.1% 젤라틴 용액 7mL를 추가합니다. 젤라틴 용액이 플라스크의 전체 바닥을 덮도록 플라스크를 회전시킵니다. 플라스크를 세포 배양 후드에서 실온에서 30분 동안 배양하도록 합니다.
- 30분 배양 후, 진공 흡입에 연결된 피펫을 사용하여 과량의 젤라틴을 제거한다. 플라스크를 사용하기 전에 30 분 동안 인큐베이터에 그대로 두십시오.
- STO 세포의 바이알을 37°C 수조에서 해동시킨다. P1000 피펫을 사용하여 해동된 세포를 새로 준비된 STO 배양 배지 5mL가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 즉시 옮깁니다.
참고: STO 세포는 세포 배양 프로토콜에서 영양세포로 일상적으로 사용되는 쥐 배아 섬유아세포입니다. - 혈청 피펫을 사용하여 원추형 튜브의 세포를 부드럽게 혼합하십시오. 세포의 전체 부피 (6 mL)를 젤라틴으로 코팅 된 75 cm2 플라스크에 첨가하십시오. 세포 현탁액이 플라스크의 바닥을 따라 잘 분포되도록 플라스크를 회전시킵니다.
- 총 부피 12mL에 대해 6mL의 신선한 STO 배지를 플라스크에 추가합니다. 세포와 배지가 플라스크의 바닥을 따라 잘 분포되도록 위에서 설명한 대로 플라스크를 회전시킵니다. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 넣어 세포가 부착되도록 한다. 세포가 ~60-70% 컨플루언시에 도달할 때까지 인큐베이터에서 증식하도록 합니다.
- STO 세포 계대:
- 37°C 수조에서 STO 세포 배지, 1xPBS 및 0.25% 트립신-EDTA를 따뜻하게 합니다.
- STO 세포가 포함된 플라스크를 단계 1.2.2.1에 설명된 대로 따뜻한 1x PBS로 두 번 부드럽게 헹굽니다.
- P1000 피펫을 사용하여 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 5분 동안 둡니다.
- 5 분 배양 후 인큐베이터에서 플라스크를 꺼냅니다. 플라스크를 부드럽게 두드려 부착 세포를 분리합니다.
- 9mL의 STO 배지를 플라스크에 첨가하여 트립신을 켄칭하고 전술한 바와 같이 10mL의 트립신화된 세포 현탁액을 수집한다. 10mL의 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 넣고 100× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 상기 기재된 바와 같이 세포를 10 mL의 STO 배지에 재현탁시킨다. 추가 계대 배양을 위해 재현탁 세포 1mL를 75cm2 플라스크에 추가합니다. STO 배지 11mL를 넣고 플라스크를 회전시켜 플라스크 바닥을 따라 세포와 배지가 고르게 분포되도록 하고 플라스크를 인큐베이터에 넣습니다.
- 비활성 STO 세포 배양 및 O9-1 세포 기저 배지 준비:
- 500mL의 DMEM을 15% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 2nM L-글루타민, 0.1mM 최소 비필수 아미노산, 1nM 나트륨 피루브산 및 55μM 베타-메르캅토에탄올과 혼합하여 O9-1 세포 기저 배양 배지를 준비합니다.
- 4 mL의 1x PBS를 미토마이신 C 바이알에 직접 첨가하여 0.5 mg/mL의 농도로 1x PBS에 미토마이신 C 용액을 준비합니다. P1000 피펫으로 용액을 여러 번 피펫팅합니다. 미토마이신 C를 1x PBS에 추가로 용해시키려면 바이알을 와류 믹서 또는 벤치탑 로커에 45분에서 1시간 동안 두십시오.
- 표준 STO 배지에 첨가된 최종 농도 0.01mg/mL 미토마이신 C로 STO 플레이트를 처리하여 STO 세포를 비활성화합니다. STO 플레이트를 인큐베이터 내부에 2시간 동안 놓고 인큐베이터 외부에서 보내는 시간을 최소화하여 미토마이신 C가 포함된 플라스크를 빛으로부터 보호하도록 주의하십시오. 미토마이신 처리 후, 단계 1.2.2.1에 기재된 바와 같이 세포를 1x PBS로 2회 세척한다.
참고: 미토마이신 C는 STO 세포의 증식을 억제하여 플라스크에서 과도하게 합류하지 않고 며칠 동안 컨디셔닝 배지를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. - 1x PBS를 제거한 후 비활성화된 STO 세포 배양에 O9-1 기본 배양액 12mL를 추가하고 24시간 동안 배양합니다. 조절되고 비활성화된 STO + O9-1 기초 배양 배지를 수집하고 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 싸인 50mL 원추형 튜브에 넣습니다.
- 12mL의 신선한 O9-1 기초 배양 배지를 상기 설명된 대로 불활성화된 STO 세포 배양물에 첨가한다. 24시간마다 비활성화된 STO 세포가 포함된 동일한 측면에 새로운 O9-1 기초 배양 배지를 추가하여 이 단계를 반복합니다.
참고: 미토마이신 C 처리 후 비활성화된 STO 세포는 증식할 수 없습니다. 따라서, 불활성화된 STO 세포를 함유하는 플라스크는 컨디셔닝 배지를 생성하기 위해 재사용될 수 있다. - 총 50mL의 배지가 수집될 때까지 4°C에서 조절되고 비활성화된 STO + O9-1 기본 배양 배지가 포함된 호일로 감싼 50mL 원뿔형 튜브를 보관하십시오.
- O9-1 세포 배양 :
- 500mL의 컨디셔닝 STO + O9-1 기초 배지를 사용하여 O9-1 세포 성장 배지를 준비하고 10 3 단위의백 혈병 억제 인자 (LIF) 및 25ng / mL 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (염기성 FGF)를 추가합니다.
- 1.3.2-1.3.3단계에 설명된 대로 0.1% 젤라틴 코팅 플라스크를 준비합니다.
- O9-1 세포의 바이알을 37°C 수조에서 해동시킨다. 해동된 세포를 새로 준비된 O9-1 성장 배지 5mL가 들어 있는 15mL 원추형 튜브로 즉시 옮깁니다.
참고: O9-1 세포주는 마우스에서 생성된 유일한 안정적이고 다능성 신경 볏 세포주입니다. 이 세포주는 일반적으로 시험 관 내 신경 볏 실험에 사용됩니다. - 혈청 학적 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 혼합하십시오. 전체 6mL의 세포를 젤라틴 코팅된 75cm2 플라스크에 추가합니다.
- 총 부피 12mL에 대해 6mL의 O9-1 성장 배지를 플라스크에 추가합니다. 플라스크를 37°C 인큐베이터에 넣어 세포가 부착되도록 한다. 세포가 ~60-70% 컨플루언시에 도달할 때까지 인큐베이터에서 증식하도록 합니다.
- O9-1 세포 계대:
- 37°C 수조에서 O9-1 성장 배지, 1x PBS, 및 0.25% 트립신-EDTA를 따뜻하게 한다.
- O9-1 세포가 포함된 플레이트를 단계 1.2.2.1에 설명된 대로 따뜻한 1x PBS로 두 번 부드럽게 헹굽니다.
- 플라스크에 0.25% 트립신-EDTA 1mL를 넣고 37°C 인큐베이터에 5분 동안 둡니다.
- 5분 배양 후 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 플라스크를 부드럽게 두드려 부착 세포를 분리합니다.
- 9mL의 O9-1 성장 배지를 플라스크에 추가하여 트립신을 켄칭합니다. 트립신 세포 현탁액 10mL를 수집하고 이 세포 현탁액 10mL를 15mL 원뿔형 튜브에 추가합니다. 튜브를 100 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다.
- 상청액을 제거하고 세포를 O9-1 성장 배지 10mL에 재현탁시킨다. 추가 계대 배양을 위해 1mL의 재현탁 세포를 75cm2 플라스크에 추가합니다. 11 mL의 O9-1 성장 배지를 첨가하고, 세포를 담은 플라스크를 37°C 배양기의 배지 12 mL에 넣는다.
2. 공동 배양 시스템의 도금 세포
- 도금 C2C12 셀 챔버:
- 트립신 화 후(단계 1.2에 설명된 대로) C2C12 세포 펠릿을 10mL의 C2C12 배지에 재현탁합니다. 재현탁된 C2C12 세포 0.5mL를 제거하고 9.5mL의 새로운 C2C12 배지가 포함된 새로운 15mL 원뿔형 튜브에 추가하여 C2C12 배지에서 1:20 비율로 세포를 희석합니다. 현탁액을 혈청 학적 피펫과 부드럽게 혼합하십시오.
- P1000 피펫을 사용하여 1:20 희석된 C2C12 세포 1mL를 새로운 4챔버 웰의 각 웰에 추가하고 4챔버 웰을 인큐베이터에 넣습니다.
- 도금 O9-1 셀 인서트:
- 트립신 화 후 O9-1 세포 펠릿을 O9-1 성장 배지 10mL에 재현탁합니다. 재현탁된 C2C12 세포 0.5mL를 제거하고 9.5mL의 새로운 O9-1 성장 배지가 포함된 새로운 15mL 원추형 튜브에 추가하여 O9-1 성장 배지에서 1:20 비율로 세포를 희석합니다. 현탁액을 혈청 학적 피펫과 부드럽게 혼합하십시오.
- 1mL의 O9-1 성장 배지로 채워진 새로운 4 챔버 웰의 각 웰 내부에 단일 투과성 삽입물 ( 재료 표 참조)을 놓습니다.
참고: 이 4개의 챔버가 있는 웰은 2.1.3단계의 C2C12 셀을 포함하는 웰과 달라야 합니다. - P1000 피펫을 사용하여 희석된 O9-1 세포 현탁액 300μL를 각 삽입물에 추가합니다. 각 삽입물의 바닥이 1.3mL의 O9-1 성장 배지로 채워진 웰 내에 잠겨 있는지 확인하십시오. 우물을 37 ° C 인큐베이터에 놓습니다.
- (선택 사항). O9-1 세포 또는 C2C12 세포에서 siRNA 녹다운을 수행합니다.
- O9-1 세포 삽입물 또는 C2C12 세포 챔버 웰을 도금한 후 siRNA 18-24시간에 유전자 녹다운을 수행합니다.
- siRNA 및 형질감염 시약을 제조업체의 권장 사항 및 실험에 원하는 농도에 따라 환원된 혈청 배지( 재료 표 참조)에 희석합니다. 희석된 siRNA와 형질주입 시약(1:1)을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 실온에서 7분 동안 배양합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 이 siRNA 농도가 표적 유전자 발현의 충분한 녹다운을 초래하는 것으로 결정되었기 때문에 50nM 농도가 사용되었습니다. - 실험 설계에 의해 결정된 대로 O9-1 세포 삽입물 또는 C2C12 세포 챔버 웰에 siRNA-지질 복합체를 추가하고 ~36-48시간 동안 siRNA-지질 복합체로 세포를 배양합니다.
- siRNA 및 형질감염 시약을 제조업체의 권장 사항 및 실험에 원하는 농도에 따라 환원된 혈청 배지( 재료 표 참조)에 희석합니다. 희석된 siRNA와 형질주입 시약(1:1)을 부드럽게 혼합하고 혼합물을 실온에서 7분 동안 배양합니다.
- O9-1 세포 삽입물 또는 C2C12 세포 챔버 웰을 도금한 후 siRNA 18-24시간에 유전자 녹다운을 수행합니다.
3. 상처 분석 수행 및 근원세포 이동의 정량적 평가
- 상처 분석:
- 프로토콜의 이 부분을 진행하기 전에 O9-1 세포 삽입물과 C2C12 세포 챔버 웰이 두 세포가 ~70-80% 컨플루언시가 될 때까지 인큐베이터에서 부착 및 증식하도록 합니다. 세포가 >90% 합류하여 성장하면 세포가 우물에서 분리될 뿐이므로 스크래치 분석을 진행하지 마십시오.
- 1x PBS 및 C2C12 배지를 37°C 수조에 넣어 따뜻하게 합니다.
- C2C12 챔버 웰로부터 상청액 배지를 제거하고 세포를 1x PBS로 한번 세척한다. 1x PBS를 제거하고 즉시 멸균 P10 피펫 팁으로 세포를 긁습니다.
- 멸균된 P10 피펫 팁을 단일 방향으로 단단히 통과시켜 세포 단층의 전체 길이 또는 너비(예: 오른쪽에서 왼쪽, 위에서 아래)에 걸쳐 있습니다. 세포가 들어있는 각 우물을 한 번만 긁으십시오.
알림: 스크래치 결과를 최적화하려면 유사한 수준의 컨플루언스에서 다양한 실험 조건의 웰을 스크래치합니다. 이렇게 하려면 각 4-챔버가 있는 웰에 필요한 각 실험 조건(예: 웰 #1 음성 대조군, 웰 #2 양성 대조군)에 대한 셀이 있는지 확인하십시오. 또한 스크래치마다 새로운 멸균 P10 피펫을 사용하고 매번 피펫에 비슷한 양의 힘을 가하십시오. 각 웰에 스크래치를 두 개 이상 만들지 마십시오. - 긁은 후 P1000 피펫 팁을 사용하여 1mL의 1x PBS를 웰에 빠르게 다시 추가합니다. 긁힐 각 우물에 대해이 과정을 반복하십시오.
참고: 각 스크래치와 관련된 가변성을 감안할 때 각 실험 조건에서 상처 생성에 여러 웰(n = 3)을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계에서 셀에 1x PBS가 없는 기간을 최소화하는 것이 중요하므로 신속하게 작업하십시오. 각 웰에서 1x PBS를 제거한 후 각 웰에 상처를 생성하는 데 5초 이상 걸리지 않아야 합니다.
- 멸균된 P10 피펫 팁을 단일 방향으로 단단히 통과시켜 세포 단층의 전체 길이 또는 너비(예: 오른쪽에서 왼쪽, 위에서 아래)에 걸쳐 있습니다. 세포가 들어있는 각 우물을 한 번만 긁으십시오.
- 상처를 생성하고 각 웰에 1x PBS를 다시 추가한 후 명시야 도립 현미경을 사용하여 스크래치를 이미지화하고 이 이미지를 기준 상처 크기(시간 0)로 사용합니다. 이미지를 촬영하려면 다음 단계를 수행하십시오.
- 전원 버튼을 눌러 컴퓨터와 현미경( 재료 표 참조)을 켭니다. 챔버 슬라이드를 스테이지에 놓고 대물 다이얼을 5배 배율로 돌립니다.
- 이미징 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열려면 컴퓨터 바탕 화면에서 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭합니다. 소프트웨어 홈 화면에서 카메라 탭을 클릭합니다. 라이브 버튼을 클릭하여 AxioCam IC 탭의 셀을 시각화합니다.
- 빛이 카메라와 컴퓨터 화면으로 통과할 수 있도록 조명 필터를 완전히 당겨야 합니다. 챔버 슬라이드를 수동으로 이동 및/또는 회전하여 AxioCam IC 탭의 라이브 이미지 중앙에 상처 영역을 배치합니다.
- 이미지를 촬영하려면 스냅을 클릭하여 이미지가 포함된 AxioCam IC 탭 옆에 있는 새 탭을 엽니다.
- 이 정지 이미지를 저장하려면 소프트웨어 홈 페이지의 왼쪽 상단에 있는 파일을 클릭하고 다른 이름으로 저장| 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력합니다|. 그림을 Carl Zeiss 이미지 (* .czi) 형식 (기본 설정)으로 저장하고 왼쪽 막대에서 바탕 화면을 선택하여 파일을 Zen lite 2012 소프트웨어 프로그램에서만 열 수있는 .czi 파일로 바탕 화면에 저장합니다.
- 그림을 .tiff로 저장하려면 파일 | 다른 이름으로 저장을 클릭하고 파일 이름 상자에 파일 이름을 입력합니다|. Figure를 태그가 지정된 이미지 파일(*.tiff)로 저장하려면 파일 형식(Save as Type) 버튼을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 *.tiff를 선택합니다.
참고: .tiff 형식은 모든 이미지 처리 소프트웨어에서 열 수 있습니다. - 챔버 슬라이드를 수동으로 재배치하여 동일한 웰에 있는 상처의 다른 지점에서 2-3개의 이미지를 더 촬영합니다.
참고: 전체적으로 이렇게 하면 각 웰의 상처에 대해 3-4개의 겹치지 않는 고배율 이미지가 생성됩니다.
- 각 웰에서 1x PBS를 제거하고 1mL의 C2C12 배지를 추가합니다.
알림: 상처 생성 후 챔버 웰에 용액을 제거하거나 추가할 때 너무 세게 피펫팅하지 않도록 주의해야 하며, 이렇게 하면 세포가 챔버 웰에서 분리될 수 있습니다. 또한 각 웰의 모서리에서 용액의 흡인 및 재 도입을 수행 할 수 있도록 챔버를 잘 기울여 세포 단층 파괴를 최소화하십시오. - 챔버 웰의 각 웰에 O9-1 세포가 포함된 인서트를 수동으로 배치하여 웰 인서트 공동배양 시스템을 조립합니다. 인서트의 바닥이 기본 C2C12 셀 바로 위에 오도록 인서트를 웰로 부드럽게 밀어 넣습니다. 웰 인서트 구조물을 인큐베이터로 되돌립니다.
알림: 인서트 바닥이 물리적으로 접촉하여 기본 C2C12 셀을 기계적으로 방해하지 않도록 하십시오. - 세포가 총 9-12 시간 동안 이동하도록합니다. 최적의 이동 시간을 결정하려면 상처 생성 후 6 시간에 세포를 확인한 다음 이후 2-3 시간마다 세포를 확인하십시오. 대조군 또는 양성 대조군 조건의 세포가 상처를 완전히 덮기 시작하면 실험을 종료합니다.
참고: 구조물의 비접촉 특성을 감안할 때, 간격 이동 진행을 확인할 때 웰에서 위에 놓인 삽입물을 제거할 필요가 없습니다. 이동 가변성은 이 분석에 사용된 세포 유형, 상처 생성 시 세포 밀도, 생성된 상처의 너비 및 조작된 세포의 실험 조건(예: 유전자 녹다운, 재조합 단백질 추가)과 같은 요인에 따라 관찰됩니다. 이러한 시약의 농도는 제조업체 권장 사항의 지침에 따라 실험적으로 결정되어야 합니다.
4. 이동하는 근세포의 면역형광염색 및 이미징
- 마이그레이션 분석을 종료하고 웰 삽입 시스템을 분해합니다.
- 9-12시간의 마이그레이션 기간(또는 실험 조건에 의해 지정된 대체 시간) 후에 O9-1 세포 삽입물을 제거합니다. P1000 피펫을 사용하여 C2C12 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 챔버 웰에 0.5mL의 1x PBS를 추가하고 이동 후 세포의 최종 이미지를 촬영합니다.
- 배지와 혼합된 1x PBS 0.5mL를 모두 조심스럽게 흡인하고 키트 지침을 사용하여 챔버 웰에서 플라스틱 챔버를 제거하고 C2C12 셀이 포함된 기본 슬라이드를 남깁니다.
알림: 챔버 웰을 제거할 때 슬라이드에 부착된 C2C12 셀을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 면역 염색 수행 :
- 즉시 슬라이드를 4% 파라포름알데히드(PFA)가 포함된 슬라이드 홀더에 넣고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 4% PFA를 붓고 0.1% 트리톤 X-100 함유 1x PBS(1x PBST)를 슬라이드 홀더에 첨가하여 슬라이드를 실온에서 15분 동안 세척합니다. 1x PBST를 붓고 슬라이드 홀더에 1x PBS를 추가하여 실온에서 10분 동안 슬라이드를 세척합니다. 총 2회의 1x PBS 세척에 대해 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 슬라이드 홀더에서 슬라이드를 제거합니다. 소수성 펜으로 슬라이드의 바깥 쪽 가장자리를 추적하여 슬라이드 주위에 소수성 경계를 만들어 슬라이드에서 용액이 쏟아지는 것을 방지합니다. 부착 세포를 방해하지 않도록주의하십시오.
- 1% 소 혈청 알부민(BSA) 차단 용액(1x PBS로 희석)을 슬라이드에 추가합니다(슬라이드당 ~0.5mL). 용액이 4.2.4단계에서 생성된 소수성 경계 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 가습된 슬라이드 챔버에서 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
참고: 팔로이딘 면역염색에는 BSA 차단이 필요하지 않지만, 프로토콜의 이 단계에서는 형광 항체 염색과 결합할 수 있습니다. - 1시간 동안 블로킹한 후, 슬라이드로부터 블로킹 용액을 붓고, 팔로이딘 항체(995μL의 BSA 용액에 5μL의 항체를 첨가하여 1% BSA 블로킹 용액에서 1:200으로 희석)를 슬라이드에 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다. 다시 말하지만, 용액이 4.2.4단계에서 생성된 소수성 경계 내에 포함되어 있는지 확인하십시오. 팔로이딘 항체가 Alexa Fluor-488 염료에 접합되어 있다는 점을 감안할 때, 슬라이드에 첨가하기 전과 후에 항체 시약의 광 노출을 최소화합니다.
- 다음 날, 슬라이드를 빛에 노출되지 않도록 슬라이드 홀더에 넣습니다(예: 슬라이드 홀더를 호일로 감싸거나 투명하지 않은 슬라이드 홀더 사용). 슬라이드 홀더의 셀을 1x PBS로 실온에서 10분 동안 세척합니다. 총 3회 10분 세척을 반복합니다.
- 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 함유 장착 매체를 추가하고 유리 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 표준 형광 현미경을 사용하여 이동한 세포를 이미지화합니다.
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Representative Results
쥐 근원 세포의 이동 능력에 대한 NCC의 영향
이 분석은 NCC가 근모세포의 이동 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 처음 적용되었습니다. 그림 1 은 분석의 개략적 모델을 간략하게 설명합니다. 이 영향을 테스트하기 위해 스크래치 분석은 삽입물이있는 상태에서 성장한 것과 비교하여 단독으로 성장한 근세포 (NCC 삽입물없이)로 수행되었습니다. 양성 대조군으로, 500ng/mL의 재조합 Wnt5a(rWnt5a)를 NCC 인서트가 있는 챔버 웰에 첨가하였다. 이 rWnt5a 농도는 C2C12 세포에서 수행된 용량-반응 분석에 의해 결정되었습니다(보충 그림 S1). NCC 인서트의 대표적인 이미지는 보충 그림 S2에 표시되어 있으며, 이는 NCC가 이 시점에서 정상임을 보여줍니다. 면역형광법은 50nM의 Wnt5a siRNA와 함께 배양한 후 단백질 수준에서 Wnt5a 의 강력한 녹다운을 보여줍니다(보충 그림 S3). 9 시간의 이동 기간 후, NCC의 존재는 NCC 삽입물이없는 상태에서 분석 된 근아 세포에 비해 근아 세포의 이동 능력을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다 (72.6 % 상처 재 거주 지역 대 59.1 % 상처 재 거주 지역, p = 0.033). 공동 배양 웰에 rWnt5a를 추가하면 근원 세포 이동이 가속화되었으며 일부 상처 부위는 그림 2와 같이 9 시간 시점까지 완전한 회복을 보여주었습니다. 예상대로, 세 가지 조건 모두에서 철새 근세포는 잘 형성되고 돌출된 필로포디아 및 lamellopodia와 액틴 세포골격 돌기의 비대칭 분극화를 포함하여 정상적인 이동 세포 형태를 나타냈습니다(그림 2C).
근원 세포의 편광 이동에 대한 NCC 유래 Wnt5a의 중요성
근원세포 이동에 대한 NCC 유래 Wnt5a의 파라크린 효과를 평가하기 위해, NCC에서 Wnt5a의 siRNA 매개 녹다운 후 근아세포에서 상처 치유 분석을 수행하였다. 첫째, Wnt5a 녹다운 효율은 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응에 의해 NCC에서 검증되었습니다. Wnt5a에 대해 50 nM siRNA로 처리하면 음성 대조군 (스크램블) siRNA에 비해 Wnt5a 유전자 발현이 64 % 감소하는 것으로 나타났습니다 (그림 3A). 이 농도를 사용하여, O9-1 세포 삽입물을 공동 배양물을 조립하기 48시간 전에 대조군 siRNA 또는 Wnt5a siRNA로 형질감염시켰다. C2C12 세포는 정상적인 조건에서 성장했고, 상처는 적절한 합류점에서 생성되었다. 상처 발생 직후, 음성 대조군 또는 Wnt5a 녹다운 NCC 삽입물을 각 웰에 첨가하였다. 10 시간의 이동 기간 후, NCC에서 Wnt5a의 녹다운은 대조군 NCC로 분석 된 근원 모세포에 비해 근본적인 근원 세포 이동 능력을 유의하게 감소 시키는 것으로 나타났습니다 (39.1 % 상처 재 거주 면적 대 74.8 % 상처 재 거주 지역, p < 0.001). 또한, Wnt5a의 녹다운과 함께 NCC의 존재하에 분석된 근원세포는 감소된 세포질 영역 및 더 적은 액틴 세포골격 돌기를 포함하여 면역염색에 의한 비정상적인 세포학적 형태를 나타냈습니다(그림 3D). 근원세포 이동을 구하기 위해, Wnt5a 녹다운 삽입물을 함유하는 공동배양 웰에 500ng/mL의 rWnt5a의 외인성 보충을 추가하였다. 외인성 rWnt5a의 첨가는 이러한 근아세포에서 관찰되는 이동 및 형태학적 결함을 완전히 구출하는 것으로 밝혀졌습니다(그림 3C,D).
편광 이동의 동인으로서 근아세포에서 ROR2를 통한 Wnt5a 신호 전달
이 파라 크린 모델에서 신호 수신 세포 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 근모세포에서 ROR2 수용체의 녹다운 후 분석을 반복했다. 이 실험에서, 근원 세포는 상처 생성 전에 ~ 40 시간 전에 50 nM의 ROR2 siRNA로 형질 감염되었으며, 이는 ROR2 유전자 발현을 54 % 녹다운시키기에 충분한 것으로 나타났습니다 (그림 4A). 이 기간 동안 NCC 인서트는 정상적인 조건에서 병렬로 성장했습니다. 근원 세포가 적절한 컨플루언스에 도달 한 후, 스크래치 분석을 수행하고, 공동 배양 웰 삽입물을 조립했다. NCC 삽입물이 있는 상태에서 10시간의 이동 기간 후, ROR2 녹다운 근세포는 음성 대조군 siRNA로 처리된 근모세포에 비해 감소된 이동 능력을 나타냈습니다(48.1% 상처 재거주 영역 대 75.7% 상처 재거주 영역, p = 0.019)(그림 4B,C). 500ng/mL rWnt5a의 추가는 ROR2 녹다운 후 근원세포 이동 능력을 구출하지 못했으며, 이는 ROR2 고갈이 근 세포가 Wnt5a 신호를 수신하는 능력을 방해함을 시사합니다(그림 4B,C). 팔로이딘에 대한 면역염색은 이동 데이터를 확증하고 ROR2 녹다운 근세포에서 팔로이딘 양성 lamellopodia 및 필로포디아의 감소가 보충 rWnt5a에 의해 회복되지 않았음을 보여주었습니다(그림 4D).
그림 1: 분석의 개략도 모델. 단계 1은 STO 영양세포를 이용한 C2C12 근원세포 및 NCC 의 시험관내 확장을 포함한다. 2단계는 코배양 시스템에서 NCC 및 C2C12 세포의 도금을 포함합니다. 3단계는 세포 이동 능력을 평가하기 위해 기저 C2C12 세포에서 수행되는 상처 분석을 포함합니다. 4단계는 이동된 세포의 세포학적 구조와 형태를 평가하기 위해 팔로이딘에 대한 면역염색을 포함합니다. 약어 : NCC = 신경 볏 세포; Ab = 항체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 신경 볏 세포의 존재는 근원세포 이동 능력을 증가시킵니다. (A) 상처 생성시 신경 볏 세포 (NCC) 삽입물의 존재는 근세포 이동을 개선시킨다. NCC-C2C12 공동 배양에 외인성 재조합 Wnt5a (rWnt5a)를 첨가하면 근원 세포 이동에 가장 긍정적 인 효과가 있습니다. (B) 상처 발생 후 9 시간에 평균 근원 세포 재 거주 면적의 정량화 (오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (C) 상처 생성 후 9 시간 동안 상처 경계에서 근세포의 팔로이딘 염색. 점선 직사각형은 철새 전선에서 팔로이딘으로 염색 된 근세포를 보여줍니다. 총 n=3개의 샘플을 B에서 정량화된 각 실험 조건에 대해 사용하였다. 스케일 바 = 200 μm (A 및 C의 경우). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신경 볏 세포 유래 Wnt5a는 근원세포 이동에 필요합니다. (A) NCC에서 siRNA 매개 녹다운을 검증하기 위한 Wnt5a의 상대적 mRNA 발현. (B) C2C12 근세포의 이동은 NCC에서 Wnt5a 녹다운 후 유의하게 감소된다. 외인성 rWnt5a의 추가는 근모세포에서 이러한 이동 결손을 구하기에 충분합니다. (C) 상처 발생 후 10 시간에 평균 근모세포 재 거주 면적의 정량화 (오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (D) 상처 생성 후 10 시간 동안 상처 경계에서 근원 세포의 팔로이딘 염색. 점선 직사각형은 철새 전선에서 팔로이딘으로 염색 된 근세포를 보여줍니다. C에서 정량화된 각각의 실험 조건에 대해 총 n=3개의 샘플을 사용하였다. 스케일 바 = 200 μm (B 및 D의 경우). 약어 : NCC = 신경 볏 세포; siRNA = 작은 간섭 RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 이동을 유도하기 위해 근아세포의 ROR2 수용체를 통한 Wnt5a 신호. (A) C2C12 세포에서 siRNA 매개 녹다운을 검증하기 위한 ROR2의 상대적 mRNA 발현. (B) 근원 세포에서 ROR2의 녹다운은 NCC의 존재에도 불구하고 이동 능력을 감소시킵니다. 외인성 rWnt5a는 ROR2 녹다운 후 근원 세포 이동을 구출하지 못합니다. (C) 상처 발생 후 10 시간에 평균 근모세포 재 거주 면적의 정량화 (오차 막대는 표준 편차를 나타냄). (D) 상처 생성 후 10 시간 동안 상처 경계에서 근원 세포의 팔로이딘 염색. 점선 직사각형은 철새 전선에서 팔로이딘으로 염색 된 근세포를 보여줍니다. C에서 정량화된 각각의 실험 조건에 대해 총 n=3개의 샘플을 사용하였다. 스케일 바 = 200 μm. 약어 : NCC = 신경 볏 세포; siRNA = 작은 간섭 RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S1: 재조합 Wnt5a 보충을 위한 용량 의존적 분석. 재조합 Wnt5a 보충 테스트 0 ng / mL, 100 ng / mL 및 500 ng / mL에 대한 용량 의존적 분석에서 500 ng / mL의 외인성 rWnt5a가 시험 관 내 12 시간 이동 기간 동안 근원 세포 이동 및 팔로이딘 세포 구조 변화를 유도하는 최적의 농도임을 발견했습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S2: 웰 인서트의 대표 이미지. (A) 50nM 음성 대조군 siRNA 및 (B) 50nM Wnt5a siRNA로 처리된 O9-1 신경 볏 세포를 포함하는 웰 삽입물의 명시야 이미지. 스케일 바 = 200 μm. 약어 : siRNA = 작은 간섭 RNA. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: siRNA 매개 Wnt5a 녹다운 후 O9-1 세포에서 Wnt5a 단백질 발현의 대표 이미지. (A) 50 nM 음성 대조군 siRNA 및 (B) 50 nM Wnt5a siRNA로 처리된 O9-1 신경 볏 세포를 함유하는 세포 배양 웰에서 Wnt5a 단백질의 면역형광 염색. 스케일 바 = 20 μM. 약어 : siRNA = 작은 간섭 RNA; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
비표준 Wnt/평면 세포 극성(PCP) 신호 전달 경로는 다중 발달 24,25 및 질병 과정24,26과 관련된 매우 중요한 세포 신호 전달 경로입니다. 배아 발달 동안, 비표준 Wnt 신호전달은 신호-수신 세포(11)에서 형태, 비대칭 조직 및 방향 이동의 변화를 궁극적으로 유도하는 신호-송신 세포로부터의 분자 신호의 광대한 네트워크를 포함한다. 이전 연구에 따르면 이 신호 전달을 유도하는 특정 리간드-수용체 경로는 다양하고 상황에 따라 다르며 종종 세포 유형12,13,14,15에 따라 다릅니다. 이러한 분자적 복잡성으로 인해, 생체내에서 종래의 유전자 재조합 방법을 사용하여 파라크린 비표준 Wnt 신호 상호작용을 평가하는 능력은 제한적이었다. 시험관 내 시스템이 비표준 Wnt 세포 표현형을 연구하기 위한 대체 접근 방식으로 점점 더 많이 사용되고 있지만, 사용 가능한 프로토콜은 경로의 다운스트림 신호 수신 측면에만 초점을 맞추고 이러한 신호 이벤트의 세포 간 및 파라크린 특성을 충분히 모델링하지 못합니다. 따라서, 본 연구의 목적은 시험관 내에서 파라크린 Wnt 상호작용을 요약하는 비접촉 공배양 시스템을 위한 프로토콜을 개발하는 것이었다. 이 프로토콜의 초점은 세포 내 필라멘트 단백질의 조직과 편광 된 이동 능력을 포함하여 시험관 내에서 기능적 비표준 Wnt 신호 전달의 두 가지 특징적인 측면을 모델링하는 것이 었습니다.
개념 증명으로이 프로토콜은 심장 발달의 맥락에서 파라 크린 메커니즘을 연구하는 데 적용되었습니다. 심장 형성 동안 심장 NCC와 SHF 전구 세포 사이의 상호 신호 전달 이벤트는 심장 유출로(OFT)의 적절한 성숙에 중요합니다.27,28,29. 이전 연구는 마우스 심장 발달 동안, 인두 SHF 세포에서 NCC-매개 Wnt / PCP 신호 전달이 SHF 전구 세포를 발달중인 OFT에 통합하고 정상적인 OFT 정렬(21)에 필요하다는 것을 보여 주었다. Schleiffarth et al. 및 다른 사람들은 Wnt/PCP 리간드인 Wnt5를 코딩하는 유전자의 유전적 녹아웃이 SHF 전구 세포 조직 및 이동 능력을 방해하여 단축되고 잘못 정렬된 심장 OFT22,23,30을 초래하는 것으로 나타났습니다. 확립된 쥐 NCC(O9-1)31 및 근원세포(C2C12) 세포주를 통해 이 프로토콜은 NCC와의 공동 배양이 팔로이딘 양성 세포질 필로포디아 및 라멜리포디아 증가와 관련이 있으며 상처 치유 분석에서 근원세포 이동 능력을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 이러한 분자 및 기능 종점은 NCC 조작31에 대해 이전에 발표된 프로토콜을 기반으로 하며 Wnt5a 글로벌 녹아웃 마우스에 설명된 생체 내 표현형 변화를 면밀히 모델링하여 이 모델의 유용성을 검증합니다.
NCC와 근모세포 사이의 비표준 Wnt 신호전달을 유도하는 특정 분자 경로를 확인하기 위해, NCC에서 후보 리간드 Wnt5a를 코딩하는 유전자와 근아세포에서 해당 수용체인 ROR2에 대한 병렬 세포 특이적 녹다운 실험을 수행하였다. 예상대로, 신호 전달 (NCC의 Wnt5a) 및 신호 수신 (근모세포의 ROR2) 세포에서 분자의 녹다운은 독립적으로 Wnt / PCP 관련 액틴 세포 구조 변화를 방해하고 근원 세포 이동을 억제했다. 중요하게도, 재조합 Wnt5a를 사용한 표현형 구조는 NCC-Wnt5a 녹다운 조건에서만 관찰되었으며, 이는 NCC 유래 Wnt5a가 ROR2 수용체를 통한 근원아세포에서 PCP 신호 전달을 활성화하는 메커니즘을 지원합니다. 이러한 결과는 배아심장 발달 동안 NCC와 SHF 세포 사이의 중요한 Wnt/PCP 신호 전달 축으로 Wnt5a-ROR2 축을 식별하는 마우스 유전 연구의 데이터와 일치합니다3,21. 이 프로토콜에서 실험적으로 테스트되지는 않았지만 SHF 유래 Wnt5a가 ROR2 수용체를 통해 신경 볏에 상호 파라 크린 신호를 제공하는지 여부는 불분명합니다. 이 가설은 웰 삽입 구조체의 상단에있는 C2C12 세포와 하단의 O9-1 세포로 실험을 반복함으로써이 프로토콜을 사용하여 테스트 할 수 있습니다. SHF 유래 Wnt5a가 NCC-ROR2를 통해 상호 파라 크린 신호를 제공한다면 C2C12 세포에서 Wnt5a의 녹다운이 기본 O9-1 세포의 이동 능력과 액틴 중합을 억제 할 것으로 예상됩니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 고유한 강점이 있습니다. 첫째, 동일한 신호 수신 세포 집단에서 기능적 및 분자적 Wnt/PCP 특성을 평가하기 위해 상처 치유 분석 및 면역염색 기술의 순차적 사용을 통합하는 비접촉식 웰 삽입 시스템입니다. 이는 비표준 Wnt 유도 세포 내 필라멘트 조직 및 시험관 내 편광 이동 변화에 대한 강력한 접근 방식을 제공할 뿐만 아니라 신호 전달 메커니즘에 대한 보다 세분화된 평가를 허용합니다. 이 프로토콜은 Wnt5a-ROR2 분자에 관한 원리 증명을 제공하지만 이 모델은 비표준 Wnt 신호 전달 경로에서 다른 리간드 및 수용체의 효과를 평가하는 데에도 쉽게 적합합니다. 생체내에서 비표준 Wnt 신호를 형질도입하는 것으로 밝혀진 다수의 잠재적 다운스트림 이펙터 단백질(예를 들어, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1)의 발현을 평가하기 위해 면역염색 프로토콜을 추가로 조정할 수 있다. 또한, 이들 다양한 이펙터 분자의 단백질 수준은 이동 또는 액틴 세포구조 표현형과 상관될 수 있다. 둘째, 공동 배양 시스템의 비접촉 특성은 Wnt/PCP 경로에서 특정 신호 전송 대 신호 수신 분자의 독립적인 조작을 허용합니다. 이러한 대표적인 결과에서, 세포 특이적 siRNA 넉다운을 수행하도록 선정되었다. 그러나, 이 프로토콜은 또한 임상 적용을 위한 후보 리간드-수용체 경로를 평가하기 위해 약리학적 억제제 또는 유전자 변형 세포주의 사용에 복종할 수 있다. 유사하게, 재조합 Wnt5a에서 보여진 바와 같이, 분자 또는 약리학적 화합물을 공배양 배지에 첨가함으로써 표현형 구조 실험을 수행할 수 있다. 신호 전송 대 신호 수신 혼란을 선택적으로 구출하기 위해 이러한 화합물을 표적으로 삼는 것은 현재의 생체 내 모델 시스템을 사용하여 허용되지 않는 방식으로 파라 크린 기계 론적 경로를 추가로 검증합니다.
이 프로토콜에는 많은 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 일차 세포가 프로토콜 전반에 걸쳐 적절한 컨플루언시로 확장되고 유지되도록 하는 것이 중요합니다. C2C12 근아세포가 100% 융합성으로 증식하도록 허용되면 근모세포와 융합되어 근관으로 분화되기 시작합니다. 따라서 이러한 세포는 설명된 대로 적절한 밀도로 계대배양되어야 합니다. 둘째, Sto 영양세포가 O9-1 세포를 성장시키기 위한 조절된 배지를 생성하는 데 필요하다는 점을 감안할 때, O9-1 세포를 해동 및 도금하기 전에 미토마이신 C로 STO 세포를 적절하게 불활성화시키고 불활성화된 STO 세포를 사용하여 충분한(최소 500mL) O9-1 성장 배지를 만드는 것이 필수적입니다. 아마도 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 근원세포 단층(32,33)에서 균일한 기하학적 구조와 폭을 갖는 적절한 스크래치를 생성하는 것이다. 3.1.4단계에서는 프로토콜의 이 부분을 최적화하기 위한 몇 가지 팁을 자세히 설명합니다. 이러한 권장 사항에도 불구하고 표준 2D 스크래치 분석과 관련된 가변성은 이 프로토콜의 기술적 과제이자 한계로 남아 있음을 인정해야 합니다. 따라서 각 실험 조건에 대해 여러 기술 반복이 필요합니다.
마지막으로, 여기에 제시된 결과가 뮤린 NCC 및 근모세포를 사용하여 생성되었지만, 이 프로토콜은 원칙적으로 임의의 신호-송신 및 신호-수신 관심 셀을 포함하도록 조정될 수 있다. 결과적으로이 시스템은 다양한 발달 맥락에서 파라 크린 비표준 Wnt 신호 전달의 기본 메커니즘을 발전시키는 응용 프로그램을 가질뿐만 아니라 Wnt / PCP 관련 질병 과정에 대한 치료 메커니즘을 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다. 예를 들어 악성 세포의 Wnt/PCP 유도 이동 능력을 억제하거나 기준선에서 PCP 신호 전달 능력이 결함이 있는 환자 유래 말단 세포 유형의 방향 이동을 복원하는 약물에 대한 약리학적 스크리닝이 포함됩니다. 비표준 Wnt 신호 전달 경로 외에도 이 프로토콜은 다른 파라크린 신호 전달 메커니즘 및 두 세포 유형 간의 경로를 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 예를 들어, O9-1 세포에서 다른 경로 (예를 들어, Notch, Bmp/Tgf-β, Fgf)에서 공지된 분비 분자의 siRNA 매개 녹다운은 기저 근모세포에서 증식, 분화 또는 세포사멸 마커의 면역염색과 결합될 수 있다.
결론적으로, 이 프로토콜은 비표준 Wnt 관련 세포내 필라멘트 조직 및 시험관 내 분극 이동의 메커니즘을 연구하기 위한 새롭고 다루기 쉬운 실험 프로토콜을 설정합니다. 여기에 설명 된 방법은 Wnt 상호 작용의 세포 간 및 파라 크린 특성을 유지함으로써 기존 기술을 개선하고이 경로의 신호 전송 대 신호 수신 구성 요소의 독립적 인 평가를 허용합니다. 이 프로토콜은 두 세포 유형 간의 기본 파라크린 Wnt/PCP 신호 전달 메커니즘을 조사하고 Wnt/PCP 관련 질병 프로세스를 표적으로 하는 새로운 치료 화합물을 스크리닝하는 데 광범위하게 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 상 F30HL154324를 O.T.에, K08HL121191 및 R03HL154301을 S.R.K.에 부분적으로 지원했습니다. 저자는 이 원고의 그림 1 에 있는 도식이 biorender.com 로 작성되었음을 인정하고자 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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