Summary
El presente estudio describe un método altamente reproducible y manejable para estudiar eventos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro. Este protocolo se aplicó para evaluar el impacto de la señalización paracrina Wnt5a en células murinas de la cresta neural y mioblastos.
Abstract
La señalización Wnt no canónica regula la organización intracelular del filamento de actina y la migración polarizada de las células progenitoras durante la embriogénesis. Este proceso requiere interacciones paracrinas complejas y coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Dado que estas interacciones pueden ocurrir entre varios tipos de células de diferentes linajes, la evaluación in vivo de defectos específicos de células puede ser un desafío. El presente estudio describe un método altamente reproducible para evaluar la señalización paracrina no canónica de Wnt in vitro. Este protocolo fue diseñado con la capacidad de (1) realizar evaluaciones funcionales y moleculares de la señalización Wnt no canónica entre dos tipos de células de interés; (2) diseccionar el papel de las moléculas de envío de señales versus moléculas receptoras de señales en la vía de señalización Wnt no canónica; y (3) realizar experimentos fenotípicos de rescate con enfoques moleculares o farmacológicos estándar.
Este protocolo se utilizó para evaluar la señalización Wnt no canónica mediada por células de la cresta neural (NCC) en mioblastos. La presencia de NCC se asocia con un mayor número de filopodios citoplasmáticos positivos para faloidina y lamellipodia en mioblastos y una mejor migración de mioblastos en un ensayo de cicatrización de heridas. El eje Wnt5a-ROR2 se identificó como una vía de señalización Wnt no canónica crucial entre NCC y progenitores de cardiomioblastos del segundo campo cardíaco (SHF). En conclusión, este es un protocolo altamente manejable para estudiar los mecanismos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro.
Introduction
La señalización Wnt no canónica es una vía conservada evolutivamente que regula la organización del filamento celular y la migración direccional. Esta vía ha sido implicada en múltiples procesos biológicos, incluyendo la morfogénesis tisular embrionaria 1,2,3, la angiogénesis linfática y vascular 4,5,6,7, y el crecimiento y metástasis del cáncer 8,9,10 . A nivel celular, la señalización Wnt no canónica se lleva a cabo a través de interacciones paracrinas coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Estas interacciones ocurren frecuentemente entre células de diferentes linajes o tipos e involucran una red molecular diversa que incluye hasta 19 ligandos y múltiples receptores, correceptores y efectores de transducción de señales aguas abajo11. Para complicar aún más este proceso de señalización, estudios previos han demostrado que las combinaciones ligando-receptor pueden variar de manera dependiente del contexto y del tejido 12,13, y que los mismos ligandos fuente que impulsan la señalización Wnt no canónica en las células receptoras de señales pueden ser producidos por múltiples tipos de células emisoras de señales 14,15 . Dada la complejidad celular y molecular asociada con la señalización Wnt no canónica, la capacidad de estudiar mecanismos individuales y clínicamente relevantes in vivo ha sido limitada.
Se han hecho intentos para estudiar la señalización Wnt no canónica utilizando técnicas de cultivo celular in vitro. Por ejemplo, los ensayos de cicatrización de heridas realizados en monocapas celulares se han utilizado para evaluar funcionalmente la migración direccional celular 4,16,17,18,19. Se han utilizado técnicas de inmunotinción para realizar análisis espaciales de la expresión de proteínas de superficie para evaluar cambios no canónicos inducidos por Wnt en morfología celular 7,10, arquitectura y polarización asimétrica18,19,20. Aunque estos enfoques han proporcionado herramientas importantes para caracterizar fenotipos relacionados con Wnt en células receptoras de señales, la falta de componentes de envío de señales en estos protocolos limita su capacidad para modelar con precisión los mecanismos de señalización paracrina observados in vivo. Como resultado, sigue existiendo una necesidad crítica de desarrollar sistemas in vitro que permitan una evaluación robusta y reproducible de las interacciones de señalización paracrina entre las células emisoras y receptoras de señales de la vía Wnt no canónica, particularmente aquellas de diferentes tipos celulares.
Con este fin, el objetivo principal de este estudio fue establecer un protocolo para modelar interacciones de señalización Wnt paracrinas no canónicas in vitro. Desarrollamos un sistema de cocultivo sin contacto que recapitula los componentes de envío y recepción de señales de estas interacciones y permite el uso de enfoques moleculares, genéticos o farmacológicos estándar para estudiar de forma independiente mecanismos específicos de ligando-receptor en la vía Wnt no canónica. Los mecanismos de señalización Wnt mediada por NCC se examinaron en mioblastos utilizando líneas celulares murinas establecidas. Como prueba de principio, este modelo se utilizó para corroborar los hallazgos de estudios previos in vivo en ratones que implican el eje Wnt5a-ROR2 como una vía de señalización Wnt no canónica relevante entre NCCs 21 y progenitores de cardiomioblastos SHF 3,22,23.
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Protocol
1. Expansión preexperimental y paso de células
- Cultivo celular C2C12:
- Preparar 500 ml de medio de cultivo C2C12 combinando el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.
- Descongele un vial de células C2C12 en un baño maría a 37 °C. Mientras las células C2C12 se están descongelando, agregue 5 ml de medio C2C12 a un tubo cónico de 15 ml. Transfiera inmediatamente las células descongeladas al tubo de 15 ml utilizando una pipeta P1000.
NOTA: Las células C2C12 son células de mioblastos murinos que se han utilizado y validado previamente como línea celular primaria para modelar progenitores de cardiomioblastos. - Mezclar suavemente las células C2C12 en el tubo cónico con una pipeta serológica. A continuación, añadir todo el volumen de células descongeladas en medio C2C12 (6 ml) a un matraz de 75cm2 .
- Añadir 6 ml de C2C12 medio fresco al matraz para obtener un volumen total de 12 ml. Gire suavemente el matraz de forma que la solución celular y de medios cubra todo el fondo del matraz. Colocar el matraz en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5%CO2) para permitir que las células se adhieran.
- Permita que las células se expandan en la incubadora hasta que alcancen ~ 60% de confluencia.
NOTA: Esto se puede determinar retirando periódicamente las células de la incubadora y verificando rápidamente su confluencia bajo un microscopio. Asegúrese de minimizar el tiempo que se extraen las células de la incubadora.
- Paso de células C2C12:
- Calentar el C2C12 medio, 500 ml de 1x PBS y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maría a 37 °C. Después de que los reactivos se hayan calentado, transfiera todos los reactivos a la campana de cultivo celular.
- Introducir el matraz que contiene las células C2C12 en la campana de cultivo celular. Enjuagar suavemente el matraz que contiene las células C2C12 con 1x PBS caliente dos veces.
- Incline el matraz en un ángulo de 45° y aspire el medio C2C12 con una pipeta de vidrio conectada a la aspiración al vacío. Mientras mantiene un ángulo de 45°, añadir con cuidado 10 ml de PBS 1x tibio a la esquina del matraz con una pipeta serológica. Coloque el matraz plano sobre la superficie y mueva suavemente el matraz con movimientos circulares para asegurarse de que el 1x PBS se lave sobre toda la monocapa de células.
NOTA: Tenga cuidado de no interrumpir la monocapa C2C12 mientras aspira el medio.
- Incline el matraz en un ángulo de 45° y aspire el medio C2C12 con una pipeta de vidrio conectada a la aspiración al vacío. Mientras mantiene un ángulo de 45°, añadir con cuidado 10 ml de PBS 1x tibio a la esquina del matraz con una pipeta serológica. Coloque el matraz plano sobre la superficie y mueva suavemente el matraz con movimientos circulares para asegurarse de que el 1x PBS se lave sobre toda la monocapa de células.
- Retire el 1x PBS después del segundo lavado. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz, mover suavemente el matraz como se ha descrito anteriormente para permitir que la solución de tripsina-EDTA se extienda sobre la mayor cantidad posible de monocapa y colocar el matraz en la incubadora durante 2 min.
- Después de 2 minutos de incubación, retire el matraz de la incubadora y golpee suavemente para desprender las células restantes.
- Añadir 9 ml de medio C2C12 al matraz con una pipeta serológica para calmar la tripsina. Usando la pipeta serológica, enjuague suavemente las células con el medio y recoja los 10 ml de suspensión de células tripsinizadas. Añadir 10 ml de la suspensión celular a un tubo cónico fresco de 15 ml y centrifugar a 100 × g durante 5 min.
- Devuelva el tubo cónico a la campana de cultivo celular y retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio conectada a la aspiración al vacío. Mientras aspira el sobrenadante, tenga cuidado de no interrumpir el pellet celular en la parte inferior del tubo cónico. Para hacer esto, deje ~ 0.2 ml del sobrenadante en el tubo cónico. Resuspender las células en 10 ml de medio C2C12 fresco.
- Para una evacuación adicional, añadir 1 ml de células resuspendidas en un matraz de 75 cm2 . Añadir 11 ml de C2C12 medio al matraz con una pipeta serológica y colocar el matraz en la incubadora.
- Cultivo de células STO:
- Prepare el medio de cultivo STO haciendo 500 ml de DMEM con 7% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 2 nM de L-glutamina.
- Prepare gelatina al 0,1% agregando 0,5 g de gelatina en polvo a una botella que contenga 500 ml de agua de grado tisular o esterilizada en autoclave. Añadir 7 ml de solución de gelatina al 0,1% en un matraz de 75cm2 . Gire el matraz de forma que la solución de gelatina cubra todo el fondo del matraz. Deje incubar el matraz durante 30 minutos a temperatura ambiente en la campana de cultivo celular.
- Después de 30 minutos de incubación, retire el exceso de gelatina con una pipeta conectada a la aspiración al vacío. Deje que los matraces permanezcan en la incubadora durante otros 30 minutos antes de su uso.
- Descongele un vial de células STO en un baño maría a 37 °C. Con una pipeta P1000, transfiera inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo STO recién preparado.
NOTA: Las células STO son fibroblastos embrionarios murinos que se utilizan rutinariamente como células alimentadoras en protocolos de cultivo celular. - Mezclar suavemente las células en el tubo cónico con una pipeta serológica. Añadir todo el volumen (6 ml) de células a un matraz recubierto de gelatina de 75cm2 . Gire el matraz para asegurarse de que la suspensión celular esté bien distribuida a lo largo de la parte inferior del matraz.
- Añadir 6 ml de STO medio fresco al matraz para obtener un volumen total de 12 ml. Gire el matraz como se ha descrito anteriormente para asegurarse de que las células y el medio estén bien distribuidos a lo largo de la parte inferior del matraz. Colocar el matraz en la incubadora a 37 °C para permitir que las células se adhieran. Permita que las células proliferen en la incubadora hasta que alcancen ~ 60-70% de confluencia.
- Pasando células STO:
- Medio de células STO calientes, 1xPBS y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maría a 37 °C.
- Enjuagar suavemente el matraz que contiene células STO con 1x PBS caliente dos veces, como se describe en el paso 1.2.2.1.
- Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz con una pipeta P1000. Introducir el matraz en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Después de 5 minutos de incubación, retirar el matraz de la incubadora. Golpee suavemente el matraz para separar las células adherentes.
- Añadir 9 ml de medio STO al matraz para apagar la tripsina y recoger los 10 ml de suspensión de células tripsinizadas como se ha descrito anteriormente. Añadir 10 ml de la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 100 × g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de medio STO como se describió anteriormente. Para una evacuación adicional, añadir 1 ml de células resuspendidas en un matraz de 75 cm2 . Añadir 11 ml de medio STO, girar el matraz para asegurar una distribución uniforme de las células y el medio a lo largo de la parte inferior del matraz y colocar el matraz en la incubadora.
- Cultivo de células STO inactivas y preparación del medio basal de células O9-1:
- Preparar el medio de cultivo basal de células O9-1 mezclando 500 ml de DMEM con 15% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 2 nM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales mínimos, piruvato de sodio de 1 nM y 55 μM de beta-mercaptoetanol.
- Prepare la solución de mitomicina C en 1x PBS a una concentración de 0.5 mg/ml agregando 4 ml de 1x PBS directamente a un vial de mitomicina C. Pipetear la solución varias veces con una pipeta P1000. Para disolver aún más la mitomicina C en 1x PBS, coloque el vial en un mezclador de vórtice o balancín de sobremesa durante 45 min a 1 h.
- Inactivar las células STO tratando las placas STO con una concentración final de 0,01 mg/ml de mitomicina C añadida al medio STO estándar. Colocar las placas STO dentro de la incubadora durante 2 h, teniendo cuidado de proteger de la luz el matraz que contiene mitomicina C minimizando el tiempo pasado fuera de la incubadora. Después del tratamiento con mitomicina, lavar las células en 1x PBS dos veces como se describe en el paso 1.2.2.1.
NOTA: La mitomicina C inhibe la proliferación de células STO para que puedan usarse para generar medio acondicionado durante varios días sin llegar a ser demasiado confluentes en el matraz. - Después de retirar el 1x PBS, añadir 12 ml de medio de cultivo basal O9-1 a los cultivos celulares STO inactivados e incubarlos durante 24 h. Recoja el medio de cultivo basal STO + O9-1 condicionado e inactivado y colóquelo en tubos cónicos de 50 ml envueltos en papel de aluminio para protegerlo de la luz.
- Añadir 12 ml de medio de cultivo basal fresco O9-1 a los cultivos de células STO inactivadas como se describió anteriormente. Repita este paso añadiendo medio de cultivo basal O9-1 fresco a los mismos flancos que contienen las células STO inactivadas cada 24 h.
NOTA: Después del tratamiento con mitomicina C, las células STO inactivadas no pueden proliferar; por lo tanto, los matraces que contienen las células STO inactivadas pueden reutilizarse para generar medio acondicionado. - Conservar los tubos cónicos de 50 ml envueltos en papel de aluminio que contienen medio de cultivo basal STO + O9-1 inactivado y acondicionado a 4 °C hasta que se haya recogido un total de 500 ml del medio.
- Cultivo celular O9-1:
- Preparar el medio de cultivo celular O9-1 utilizando 500 ml de medio basal STO + O9-1 condicionado, y añadir 103 unidades de factor inhibidor de la leucemia (LIF) y 25 ng/ml de factor básico de crecimiento de fibroblastos (básico-FGF).
- Preparar matraces recubiertos de gelatina al 0,1% como se describe en los pasos 1.3.2-1.3.3.
- Descongele un vial de células O9-1 en un baño maría a 37 °C. Transfiera inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 5 ml de medio de cultivo O9-1 recién preparado.
NOTA: La línea celular O9-1 es la única línea celular de cresta neural estable y multipotente que se ha generado a partir del ratón. Esta línea celular se usa comúnmente en experimentos in vitro de cresta neural. - Mezclar suavemente las células con una pipeta serológica. Añadir los 6 ml de células completas a un matraz recubierto de gelatina de 75 cm2 .
- Añadir 6 ml de medio de cultivo de O9-1 al matraz para obtener un volumen total de 12 ml. Colocar el matraz en la incubadora a 37 °C para permitir que las células se adhieran. Permita que las células proliferen en la incubadora hasta que alcancen ~ 60-70% de confluencia.
- Pasando células O9-1:
- Medio de crecimiento O9-1 caliente, 1x PBS y tripsina-EDTA al 0,25% en un baño maría a 37 °C.
- Enjuague suavemente la placa que contiene células O9-1 con PBS caliente 1x dos veces como se describe en el paso 1.2.2.1.
- Añadir 1 ml de tripsina-EDTA al 0,25% al matraz y colocarlo en la incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Después de 5 minutos de incubación, retire el matraz de la incubadora y golpee suavemente el matraz para separar las células adherentes.
- Añadir 9 ml de medio de crecimiento de O9-1 al matraz para calmar la tripsina. Recoja 10 ml de la suspensión de células tripsinizadas y agregue 10 ml de esta suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 100 × g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 10 ml de medio de crecimiento O9-1. Para una evacuación adicional, añadir 1 ml de células resuspendidas a un matraz de75 cm 2 . Añadir 11 ml de medio de cultivo O9-1 y colocar el matraz que contiene las células en 12 ml de medio en la incubadora a 37 °C.
2. Recubrimiento de células en un sistema de cocultivo
- Cámaras celulares de recubrimiento C2C12:
- Después de la tripsinización (como se describe en el paso 1.2), resuspender el pellet de células C2C12 en 10 ml de medio C2C12. Diluir las células en una proporción de 1:20 en medio C2C12 eliminando 0,5 ml de las células C2C12 resuspendidas y añadiéndolas a un nuevo tubo cónico de 15 ml que contenga 9,5 ml de medio C2C12 fresco. Mezclar suavemente la suspensión con una pipeta serológica.
- Agregue 1 ml de células C2C12 diluidas 1:20 a cada pocillo de un nuevo pocillo de 4 cámaras usando una pipeta P1000 y coloque el pocillo de 4 cámaras en la incubadora.
- Insertos de celda O9-1 de recubrimiento:
- Después de la tripsinización, resuspender el pellet de células O9-1 en 10 ml de medio de crecimiento O9-1. Diluir las células en una proporción de 1:20 en medio de crecimiento O9-1 eliminando 0,5 ml de las células C2C12 resuspendidas y añadiéndolas a un nuevo tubo cónico de 15 ml que contiene 9,5 ml de medio de crecimiento O9-1 fresco. Mezclar suavemente la suspensión con una pipeta serológica.
- Coloque un solo inserto permeable (consulte la Tabla de materiales) dentro de cada pocillo de un nuevo pocillo de 4 cámaras lleno con 1 ml de medio de cultivo O9-1.
NOTA: Este pocillo de 4 cámaras debe ser diferente del que contiene las células C2C12 del paso 2.1.3. - Añadir 300 μL de la suspensión de células O9-1 diluidas a cada inserto utilizando una pipeta P1000. Asegúrese de que la parte inferior de cada inserto esté sumergida dentro del pozo lleno con 1,3 ml de medio de crecimiento O9-1. Colocar el pozo en la incubadora a 37 °C.
- (Opcional). Realizar el derribo de ARNip en las células O9-1 o C2C12.
- Realizar la eliminación del gen por siRNA 18-24 h después de placar insertos de células O9-1 o pozos de cámara celular C2C12.
- Diluir el ARNip y el reactivo de transfección en un medio sérico reducido (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes y las concentraciones deseadas para el experimento. Mezclar suavemente el ARNip diluido y el reactivo de transfección (1:1) e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 7 min.
NOTA: En este protocolo, se utilizaron concentraciones de 50 nM, ya que se determinó que esta concentración de siRNA resultaba en una reducción suficiente de la expresión génica objetivo. - Agregue los complejos siRNA-lípido a los insertos celulares O9-1 o a los pocillos de la cámara celular C2C12 según lo determinado por el diseño experimental e incube las células con los complejos siRNA-lípidos durante ~ 36-48 h.
- Diluir el ARNip y el reactivo de transfección en un medio sérico reducido (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes y las concentraciones deseadas para el experimento. Mezclar suavemente el ARNip diluido y el reactivo de transfección (1:1) e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 7 min.
- Realizar la eliminación del gen por siRNA 18-24 h después de placar insertos de células O9-1 o pozos de cámara celular C2C12.
3. Realización del ensayo de heridas y evaluación cuantitativa de la migración de mioblastos
- Ensayo de herida:
- Permita que los insertos de células O9-1 y los pocillos de la cámara celular C2C12 se adhieran y proliferen en la incubadora hasta que ambas células estén en ~ 70-80% de confluencia antes de proceder con esta parte del protocolo. Si las células crecen >90% confluentes, no proceda con el ensayo de rasguño, ya que las células simplemente se desprenderán del pozo.
- Calentar 1x PBS y C2C12 medio colocándolos en un baño maría a 37 °C.
- Retire bien el medio sobrenadante de la cámara C2C12 y lave las células una vez con 1x PBS. Retire el 1x PBS e inmediatamente rasque las células con una punta de pipeta P10 estéril.
- Pase la punta de pipeta P10 estéril firmemente en una sola dirección para abarcar toda la longitud o anchura de la monocapa celular (por ejemplo, de derecha a izquierda, de arriba a abajo). Asegúrese de rascar cada pocillo que contenga células solo una vez.
NOTA: Para optimizar los resultados de rascado, rasque pocillos de diferentes condiciones experimentales a un nivel similar de confluencia. Para hacer esto, asegúrese de que cada pocillo de 4 cámaras tenga células para cada condición experimental requerida (por ejemplo, control negativo # 1, control positivo # 2). Además, utilice una nueva pipeta estéril P10 para cada rasguño y aplique una cantidad similar de fuerza a la pipeta cada vez. No intente crear más de un rasguño en cada pozo. - Después de rascarse, agregue rápidamente 1 ml de 1x PBS al pozo con una punta de pipeta P1000. Repita este proceso para cada pozo que se rayará.
NOTA: Dada la variabilidad asociada con cada rasguño, se recomienda que se utilicen múltiples pocillos (n = 3) para la creación de heridas en cada condición experimental. Trabaje de manera expedita, ya que es fundamental minimizar la duración durante la cual las celdas están sin 1x PBS durante estos pasos. Después de retirar 1x PBS de cada pozo, no se debe tomar más de 5 s para generar una herida en cada pozo.
- Pase la punta de pipeta P10 estéril firmemente en una sola dirección para abarcar toda la longitud o anchura de la monocapa celular (por ejemplo, de derecha a izquierda, de arriba a abajo). Asegúrese de rascar cada pocillo que contenga células solo una vez.
- Después de generar una herida y agregar 1x PBS nuevamente en cada pocillo, tome una imagen del rasguño usando un microscopio invertido de campo claro y use esta imagen como el tamaño de la herida de referencia (tiempo 0). Para tomar imágenes, realice los pasos siguientes:
- Encienda la computadora y el microscopio (consulte la Tabla de materiales) presionando el botón de encendido. Coloque la diapositiva de la cámara en el escenario y gire el dial del objetivo a un aumento de 5x.
- Abra el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el icono del software en el escritorio del equipo. Haga clic en la pestaña Cámara en la pantalla de inicio del software. Haga clic en el botón Live para visualizar las celdas en la pestaña AxioCam IC .
- Asegúrese de que el filtro de luz esté completamente extendido para permitir que la luz pase a la cámara y a la pantalla de la computadora. Mueva y/o gire manualmente la diapositiva de la cámara para colocar el área de la herida en el centro de la imagen en vivo en la pestaña AxioCam IC .
- Para tomar imágenes, haga clic en ajustar para abrir una nueva pestaña junto a la pestaña AxioCam IC que contiene la imagen.
- Para guardar esta imagen fija, haga clic en archivo en la parte superior izquierda de la página de inicio del software | guarde como | escriba el nombre del archivo en el cuadro de nombre de archivo. Guarde la figura en formato de imagen Carl Zeiss (*.czi) (la configuración predeterminada) y seleccione escritorio en la barra de la izquierda para guardar el archivo en el escritorio como un archivo .czi, que solo se puede abrir en el programa de software Zen lite 2012.
- Para guardar la imagen como una .tiff, haga clic en archivo | guardar como | escriba el nombre de archivo en el cuadro nombre de archivo. Guarde la figura como archivo de imagen etiquetado (*.tiff) haciendo clic en el botón Guardar como tipo y seleccionando *.tiff en el menú desplegable.
NOTA: El formato .tiff se puede abrir en cualquier software de procesamiento de imágenes. - Cambie manualmente la diapositiva de la cámara para tomar 2-3 imágenes más en otros puntos de la herida en el mismo pozo.
NOTA: En total, esto dará como resultado 3-4 imágenes no superpuestas y de gran aumento de la herida en cada pozo.
- Retire el 1x PBS de cada pocillo y agregue 1 ml de medio C2C12.
NOTA: Tenga cuidado de no pipetear demasiado agresivamente al extraer o agregar soluciones a la cámara después de la generación de la herida, ya que esto puede hacer que las células se desprendan bien de la cámara. Además, incline bien la cámara para que la aspiración y la reintroducción de soluciones se puedan hacer en las esquinas de cada pocillo para minimizar la interrupción de la monocapa celular. - Ensamble el sistema de cocultivo de insertos de pozo colocando manualmente los insertos que contienen las células O9-1 en cada pocillo del pozo de la cámara. Empuje suavemente los insertos hacia abajo en el pozo de tal manera que la parte inferior del inserto se encuentre justo encima de las células C2C12 subyacentes. Devuelva las construcciones de inserción de pozo a la incubadora.
NOTA: No permita que la parte inferior del inserto toque físicamente e interrumpa mecánicamente las celdas C2C12 subyacentes. - Permita que las células migren durante un total de 9-12 h. Para determinar el tiempo óptimo de migración, verifique las células a las 6 h después de la creación de la herida, luego cada 2-3 h a partir de entonces. Termine el experimento cuando las células en condiciones de control o control positivo comiencen a cubrir completamente la herida.
NOTA: Dada la naturaleza sin contacto de la construcción, no es necesario retirar el inserto suprayacente de los pozos al verificar la progresión de la migración del intervalo. La variabilidad migratoria se observará dependiendo de factores tales como los tipos de células utilizadas en este ensayo, la densidad celular en el momento de la generación de la herida, el ancho de la herida creada y las condiciones experimentales de las células manipuladas (por ejemplo, eliminación de genes, adición de proteínas recombinantes). Las concentraciones de estos reactivos deben determinarse experimentalmente con la orientación de las recomendaciones del fabricante.
4. Tinción por inmunofluorescencia e imágenes de mioblastos migratorios
- Terminación del ensayo de migración y deconstrucción del sistema de inserción del pozo:
- Retire los insertos de células O9-1 después de un período de migración de 9-12 h (o tiempo alternativo designado por las condiciones experimentales). Aspirar cuidadosamente el medio C2C12 con una pipeta P1000. Agregue 0.5 ml de 1x PBS a los pocillos de la cámara y tome imágenes finales de las células después de la migración.
- Aspire cuidadosamente todos los 0,5 ml de 1x PBS mezclado con medio y retire las cámaras de plástico de los pozos de la cámara siguiendo las instrucciones del kit, dejando el portaobjetos subyacente que contiene las células C2C12.
NOTA: Tenga cuidado de no interrumpir las células C2C12 adherentes al portaobjetos cuando retire los pocillos de la cámara.
- Realización de inmunotinción:
- Coloque inmediatamente el portaportaobjetos en un portaportaobjetos que contenga 4% de paraformaldehído (PFA) e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Vierta el PFA al 4% y agregue 1x PBS (1x PBST) que contiene Triton X-100% al portaportaobjetos para lavar el portaobjetos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Vierta el 1x PBST y agregue 1x PBS al soporte de la diapositiva para lavar el portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita este paso una vez más para un total de dos lavados 1x PBS.
- Retire la diapositiva del portaobjetos. Traza los bordes exteriores de la diapositiva con un bolígrafo hidrófobo para crear un límite hidrófobo alrededor de la diapositiva y evitar que las soluciones se derramen de la diapositiva. Tenga cuidado de no interrumpir las células adherentes.
- Agregue una solución bloqueadora de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% (diluida en 1x PBS) al portaobjetos (~0.5 ml por portaobjetos). Asegúrese de que la solución está contenida dentro del límite hidrofóbico creado en el paso 4.2.4. Incubar el portaobjetos durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de portaobjetos humidificada.
NOTA: Aunque el bloqueo de BSA no es necesario para la inmunotinción de faloidina, este paso en el protocolo permite el acoplamiento con la tinción de anticuerpos de fluorescencia. - Después de bloquear durante 1 h, vierta la solución bloqueadora del portaobjetos, agregue el anticuerpo faloidina (diluido a 1:200 en una solución bloqueadora de BSA al 1% agregando 5 μL del anticuerpo a 995 μL de solución de BSA) al portaobjetos e incube a 4 °C durante la noche. Una vez más, asegúrese de que la solución está contenida dentro del límite hidrofóbico creado en el paso 4.2.4. Dado que el anticuerpo faloidina está conjugado con el colorante Alexa Fluor-488, minimice la exposición a la luz del reactivo de anticuerpos antes y después de agregarlo al portaobjetos.
- Al día siguiente, coloque la diapositiva en un portaportaobjetos protegido de la exposición a la luz (p. ej., envuelva el portaportaobjetos en papel de aluminio o use un portaportaobjetos no transparente). Lave las celdas en el portaportaobjetos con 1x PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita el lavado para un total de tres lavados de 10 minutos.
- Agregue un medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y monte las guías con cubreobjetos de vidrio. Obtener imágenes de las células que han migrado utilizando un microscopio de fluorescencia estándar.
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Representative Results
Efectos de los NCC sobre la capacidad migratoria de los mioblastos murinos
Este ensayo se aplicó por primera vez para evaluar el impacto de los NCC en la capacidad migratoria de los mioblastos. La figura 1 describe el modelo esquemático del ensayo. Para probar este impacto, se realizaron ensayos de rasguño con mioblastos que se cultivaron de forma aislada (sin inserciones NCC) en comparación con los cultivados en presencia de inserciones. Como control positivo, se agregaron 500 ng/mL de Wnt5a recombinante (rWnt5a) a los pocillos de la cámara con inserciones NCC. Esta concentración de rWnt5a se determinó mediante un análisis dosis-respuesta realizado en células C2C12 (Figura suplementaria S1). Las imágenes representativas de los insertos NCC se muestran en la Figura Suplementaria S2, lo que demuestra que los NCC están sanos en este momento dado. La inmunofluorescencia demuestra un derribo robusto de Wnt5a a nivel de proteína después de la incubación con 50 nM de siRNA Wnt5a (Figura Suplementaria S3). Después de un período de migración de 9 h, se encontró que la presencia de NCC aumentó significativamente la capacidad migratoria de los mioblastos en comparación con los mioblastos ensayados en ausencia de inserciones de NCC (72,6% de área repoblada de heridas vs 59,1% de área repoblada de heridas, p = 0,033). La adición de rWnt5a a los pozos de cocultivo aceleró la migración de mioblastos, con algunas áreas de heridas que demostraron una recuperación completa en el punto de tiempo de 9 h, como se muestra en la Figura 2. Como era de esperar, los mioblastos migratorios en las tres condiciones exhibieron una morfología celular migratoria normal, incluyendo filopodios y lamellopodios bien formados y sobresalientes y polarización asimétrica de las proyecciones citoesqueléticas de actina (Figura 2C).
Importancia de Wnt5a derivado de NCC para la migración polarizada de mioblastos
Para evaluar el efecto paracrino de Wnt5a derivado de NCC en la migración de mioblastos, se realizaron ensayos de cicatrización de heridas en mioblastos después del derribo mediado por ARNip de Wnt5a en NCC. En primer lugar, la eficiencia de derribo de Wnt5a se validó en NCC mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real. Se encontró que el tratamiento con siRNA de 50 nM contra Wnt5a reduce la expresión del gen Wnt5a en un 64% en comparación con el siRNA de control negativo (codificado) (Figura 3A). Usando esta concentración, los insertos de células O9-1 se transfectaron con siRNA de control o siRNA Wnt5a 48 h antes de ensamblar el cocultivo. Las células C2C12 se cultivaron en condiciones normales y se crearon heridas en la confluencia apropiada. Inmediatamente después de la generación de la herida, se agregaron insertos NCC de control negativo o Wnt5a a cada pocillo. Después de un período de migración de 10 h, se encontró que la eliminación de Wnt5a en los NCC redujo significativamente la capacidad migratoria de mioblastos subyacentes en comparación con los mioblastos ensayados con NCC de control (39,1% del área repoblada de heridas frente al 74,8% del área repoblada de heridas, p < 0,001). Además, los mioblastos ensayados en presencia de NCC con knockdown de Wnt5a mostraron una morfología citológica anormal por inmunotinción, incluyendo áreas citoplasmáticas reducidas y menos proyecciones citoesqueléticas de actina (Figura 3D). Para rescatar la migración de mioblastos, se agregó suplementación exógena de 500 ng / ml de rWnt5a a los pozos de cocultivo que contenían insertos de derribo de Wnt5a. Se encontró que la adición de rWnt5a exógeno rescata completamente los defectos migratorios y morfológicos observados en estos mioblastos (Figura 3C, D).
Señalización de Wnt5a a través de ROR2 en mioblastos como impulsor de la migración polarizada
Para comprender mejor los mecanismos de las células receptoras de señales en este modelo paracrino, el ensayo se repitió después de la caída del receptor ROR2 en mioblastos. En este experimento, los mioblastos se transfectaron con 50 nM de ROR2 siRNA ~ 40 h antes de la generación de la herida, lo que demostró ser suficiente para derribar la expresión del gen ROR2 en un 54% (Figura 4A). Durante este tiempo, los insertos NCC se cultivaron en paralelo en condiciones normales. Después de que los mioblastos alcanzaron la confluencia apropiada, se realizaron ensayos de rasguño y se ensamblaron insertos de pozos de cocultivo. Después de un período de migración de 10 h en presencia de insertos NCC, los mioblastos de derribo de ROR2 demostraron una capacidad migratoria reducida en comparación con los mioblastos tratados con siRNA de control negativo (48,1% de área repoblada de heridas vs 75,7% de área repoblada de heridas, p = 0,019) (Figura 4B, C). La adición de 500 ng/mL rWnt5a no logró rescatar la capacidad migratoria de mioblastos después del derribo de ROR2, lo que sugiere que el agotamiento de ROR2 interrumpe la capacidad de los mioblastos para recibir señales Wnt5a (Figura 4B, C). La inmunotinción para faloidina corroboró los datos migratorios y mostró que una reducción en lamellopodios y filopodios positivos para faloidina en mioblastos de derribo ROR2 no fue restaurada por rWnt5a suplementario (Figura 4D).
Figura 1: Modelo esquemático del ensayo. El paso 1 incluye la expansión in vitro de mioblastos C2C12 y NCC utilizando células alimentadoras STO. El paso 2 implica el recubrimiento de células NCC y C2C12 en el sistema de cocultivo. El paso 3 incluye el ensayo de la herida realizado en células C2C12 subyacentes para evaluar la capacidad migratoria celular. El paso 4 implica la inmunotinción de faloidina para evaluar la arquitectura citológica y la morfología de las células migradas. Abreviaturas: NCCs = células de la cresta neural; Ab = anticuerpo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La presencia de células de la cresta neural aumenta la capacidad migratoria de mioblastos. (A) La presencia de insertos de células de la cresta neural (NCC) en el momento de la generación de la herida conduce a una mejor migración de mioblastos. La adición de Wnt5a recombinante exógeno (rWnt5a) a los cocultivos NCC-C2C12 tiene el efecto positivo más fuerte en la migración de mioblastos. (B) Cuantificación del área media de mioblastos repoblados a las 9 h después de la generación de la herida (las barras de error muestran desviación estándar). (C) Tinción con faloidina de mioblastos en el borde de la herida 9 h después de la generación de la herida. Los rectángulos discontinuos muestran mioblastos teñidos de faloidina en el frente migratorio. Se utilizó un total de n = 3 muestras para cada condición experimental cuantificada en B. Barras de escala = 200 μm (para A y C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El Wnt5a derivado de células de la cresta neural es necesario para la migración de mioblastos. (A) Expresión relativa de ARNm de Wnt5a para validar la eliminación mediada por ARNip en NCC. (B) La migración de mioblastos C2C12 se reduce significativamente después del derribo de Wnt5a en NCC. La adición de rWnt5a exógeno es suficiente para rescatar este déficit migratorio en mioblastos. (C) Cuantificación del área promedio repoblada por mioblastos a las 10 h después de la generación de la herida (las barras de error muestran la desviación estándar). (D) Tinción con faloidina de mioblastos en el borde de la herida 10 h después de la generación de la herida. Los rectángulos discontinuos muestran mioblastos teñidos de faloidina en el frente migratorio. Se utilizó un total de n = 3 muestras para cada condición experimental cuantificada en C. Barras de escala = 200 μm (para B y D). Abreviaturas: NCCs = células de la cresta neural; ARNip = ARN interferente pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Señales Wnt5a a través de los receptores ROR2 en mioblastos para impulsar la migración. (A) Expresión relativa de ARNm de ROR2 para validar la eliminación mediada por ARNip en células C2C12. (B) La eliminación de ROR2 en mioblastos reduce su capacidad migratoria a pesar de la presencia de NCC. El rWnt5a exógeno no logra rescatar la migración de mioblastos después del derribo de ROR2. (C) Cuantificación del área promedio repoblada por mioblastos a las 10 h después de la generación de la herida (las barras de error muestran la desviación estándar). (D) Tinción con faloidina de mioblastos en el borde de la herida 10 h después de la generación de la herida. Los rectángulos discontinuos muestran mioblastos teñidos de faloidina en el frente migratorio. Se utilizó un total de n = 3 muestras para cada condición experimental cuantificada en C. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: NCCs = células de la cresta neural; ARNip = ARN interferente pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria S1: Análisis dependiente de la dosis para la suplementación recombinante con Wnt5a. El análisis dependiente de la dosis para las pruebas de suplementación con Wnt5a recombinante de 0 ng/mL, 100 ng/mL y 500 ng/mL encontró que 500 ng/mL de rWnt5a exógeno era la concentración óptima para impulsar la migración de mioblastos y los cambios citoarquitectónicos de faloidina durante un período migratorio de 12 h in vitro. Barras de escala = 200 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Imágenes representativas de insertos de pozos. Imágenes de campo claro de insertos de pocillos que contienen células de la cresta neural O9-1 tratadas con (A) 50 nM de control negativo siRNA y (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Barras de escala = 200 μm. Abreviatura: siRNA = ARN interferente pequeño. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Imágenes representativas de la expresión de la proteína Wnt5a en células O9-1 después del derribo de Wnt5a mediado por ARNsi. Tinción por inmunofluorescencia de la proteína Wnt5a en pocillos de cultivo celular que contienen células de la cresta neural O9-1 tratadas con (A) 50 nM de control negativo siRNA y (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Barras de escala = 20 μM. Abreviaturas: siRNA = ARN interferente pequeño; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La vía de señalización no canónica Wnt/polaridad celular plana (PCP) es una vía de señalización celular de importancia crítica que ha sido implicada en múltiples procesos de desarrollo 24,25 y de enfermedad24,26. Durante el desarrollo embrionario, la señalización Wnt no canónica implica una red expansiva de señales moleculares de células emisoras de señales que finalmente inducen cambios en la morfología, la organización asimétrica y la migración direccional en las células receptoras de señales11. Estudios previos han demostrado que las vías específicas ligando-receptor que impulsan esta señalización son diversas, dependen del contexto y, a menudo, varían entre los tipos de células12,13,14,15. Debido a esta complejidad molecular, la capacidad de evaluar las interacciones de señalización Wnt paracrinas no canónicas utilizando métodos convencionales de recombinación genética in vivo ha sido limitada. Si bien los sistemas in vitro se han utilizado cada vez más como un enfoque alternativo para estudiar fenotipos celulares Wnt no canónicos, los protocolos disponibles se centran exclusivamente en los aspectos de recepción de señales aguas abajo de la vía y no modelan suficientemente la naturaleza intercelular y paracrina de estos eventos de señalización. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue desarrollar un protocolo para un sistema de cocultivo sin contacto que recapitule las interacciones paracrinas de Wnt in vitro. El objetivo de este protocolo fue modelar dos aspectos característicos de la señalización funcional no canónica de Wnt in vitro, incluida la organización de las proteínas de filamentos intracelulares y la capacidad migratoria polarizada.
Como prueba de concepto, este protocolo se aplicó para estudiar los mecanismos paracrinos en el contexto del desarrollo del corazón. Durante la cardiogénesis, los eventos de señalización recíproca entre las NCC cardíacas y las células progenitoras de SHF son cruciales para la maduración adecuada del tracto de salida cardíaca (OFT)27,28,29. Trabajos previos han demostrado que durante el desarrollo cardíaco del ratón, se requiere señalización Wnt/PCP mediada por NCC en células SHF faríngeas para la incorporación de células progenitoras SHF en el OFT en desarrollo y para la alineación normal de OFT21. Schleiffarth et al. y otros han demostrado que se ha demostrado que el knockout genético del gen que codifica el ligando Wnt/PCP, Wnt5, interrumpe la organización de las células progenitoras SHF y la capacidad migratoria, lo que resulta en un OFT cardíaco escorzado y desalineado22,23,30. Con líneas celulares murinas establecidas de NCC (O9-1)31 y mioblastos (C2C12), este protocolo demuestra que el cocultivo con NCC se asocia con un aumento de filopodios citoplasmáticos positivos para faloidina y lamellipodia y mejora la capacidad migratoria de mioblastos en un ensayo de cicatrización de heridas. Estos criterios de valoración moleculares y funcionales in vitro se basan en protocolos publicados previamente para la manipulación de NCC31 y modelan de cerca los cambios fenotípicos in vivo descritos en ratones knockout globales Wnt5a, validando la utilidad de este modelo.
Para determinar la vía molecular específica que impulsa la señalización Wnt no canónica entre NCC y mioblastos, se realizaron experimentos paralelos de knockdown específicos de células para los genes que codifican el ligando candidato, Wnt5a, en NCC y su receptor correspondiente, ROR2, en mioblastos. Como era de esperar, el derribo de moléculas tanto en las células de envío de señales (Wnt5a en NCC) como en las receptoras de señales (ROR2 en mioblastos) interrumpió de forma independiente los cambios citoarquitectónicos de actina relacionados con Wnt / PCP e inhibió la migración de mioblastos. Es importante destacar que el rescate fenotípico con Wnt5a recombinante solo se observó en la condición de derribo NCC-Wnt5a, que respalda un mecanismo por el cual Wnt5a derivado de NCC activa la señalización de PCP en mioblastos a través de receptores ROR2. Estos resultados son consistentes con los datos de estudios genéticos de ratón que identifican el eje Wnt5a-ROR2 como un eje de señalización Wnt/PCP crucial entre las NCC y las células SHF durante el desarrollo del corazón embrionario 3,21. Aunque no se ha probado experimentalmente en este protocolo, no está claro si Wnt5a derivado de SHF proporciona señales paracrinas recíprocas a la cresta neural a través de los receptores ROR2. Esta hipótesis podría probarse utilizando este protocolo repitiendo los experimentos con células C2C12 en la parte superior y células O9-1 en la parte inferior de la construcción del inserto del pozo. Si Wnt5a derivado de SHF proporciona una señal paracrina recíproca a través de NCC-ROR2, entonces uno esperaría que el derribo de Wnt5a en las células C2C12 inhibiera la capacidad migratoria y la polimerización de actina de las células O9-1 subyacentes.
Hay varias fortalezas únicas de este protocolo. En primer lugar, es un sistema de inserción de pocillos sin contacto que incorpora el uso secuencial de ensayos de cicatrización de heridas y técnicas de inmunotinción para evaluar las características funcionales y moleculares de Wnt/PCP en la misma población de células receptoras de señales. Esto no solo proporciona un enfoque robusto para el fenotipado de la organización de filamentos intracelulares no canónicos inducidos por Wnt y los cambios migratorios polarizados in vitro , sino que también permite evaluaciones más granulares de los mecanismos de transducción de señales. Si bien este protocolo proporciona una prueba de principio con respecto a las moléculas Wnt5a-ROR2, el modelo también se presta fácilmente a evaluar los efectos de otros ligandos y receptores en la vía de señalización Wnt no canónica. Se puede adaptar aún más el protocolo de inmunotinción para evaluar la expresión de múltiples proteínas efectoras potenciales aguas abajo (por ejemplo, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) que se ha demostrado que transducen señales Wnt no canónicas in vivo. Además, los niveles de proteínas de estas diversas moléculas efectoras pueden correlacionarse con fenotipos migratorios o citoarquitectónicos de actina. En segundo lugar, la naturaleza sin contacto del sistema de cocultivo permite la manipulación independiente de moléculas específicas de envío de señales frente a moléculas receptoras de señales en la vía Wnt/PCP. En estos resultados representativos, se eligió realizar el derribo de siRNA específico de la célula. Sin embargo, este protocolo también es susceptible al uso de inhibidores farmacológicos o líneas celulares modificadas genéticamente para evaluar las vías candidatas ligando-receptor para su aplicación clínica. Del mismo modo, se pueden realizar experimentos de rescate fenotípicos agregando compuestos moleculares o farmacológicos al medio de cocultivo, como se demostró con Wnt5a recombinante. La orientación de estos compuestos para rescatar selectivamente los trastornos de envío de señales frente a los de recepción de señales valida aún más las vías mecanicistas paracrinas de maneras que no están permitidas utilizando sistemas modelo actuales in vivo .
Hay muchos pasos críticos de este protocolo. En primer lugar, es importante asegurarse de que las células primarias se expandan y mantengan en la confluencia adecuada a lo largo del protocolo. Si se permite que los mioblastos C2C12 proliferen al 100% de confluencia, comenzarán a fusionarse y diferenciarse de los mioblastos en miotubos. Por lo tanto, estas células deben pasar a la densidad apropiada como se describe. En segundo lugar, dado que las células alimentadoras de STO son necesarias para generar un medio acondicionado para cultivar células O9-1, es imperativo que se inactiven adecuadamente las células STO con mitomicina C y se produzca suficiente (al menos 500 ml) de medio de crecimiento O9-1 utilizando células STO inactivadas antes de descongelar y colocar en placas las células O9-1. Quizás el paso más crítico en este protocolo es la generación de arañazos apropiados con geometría y anchura uniformes en la monocapa de mioblastos32,33. El paso 3.1.4 detalla varios consejos para optimizar esta parte del protocolo. A pesar de estas recomendaciones, debe reconocerse que la variabilidad asociada con los ensayos de scratch 2D estándar sigue siendo un desafío técnico y una limitación de este protocolo. Por lo tanto, es necesario tener múltiples réplicas técnicas de cada condición experimental.
Finalmente, aunque los resultados presentados aquí se generaron utilizando NCC murinos y mioblastos, este protocolo puede, en principio, adaptarse para incluir cualquier célula de envío y recepción de señales de interés. Como resultado, este sistema no solo tiene aplicaciones para avanzar en los mecanismos básicos de señalización paracrina no canónica de Wnt en una variedad de contextos de desarrollo, sino que también se puede usar para probar mecanismos terapéuticos para procesos de enfermedades relacionadas con Wnt / PCP. Los ejemplos incluyen la detección farmacológica de medicamentos que inhiben la capacidad migratoria inducida por Wnt/PCP de las células malignas o restauran la migración direccional de tipos de células terminales derivadas del paciente con capacidad de señalización de PCP defectuosa al inicio del estudio. Más allá de la vía de señalización Wnt no canónica, este protocolo también se puede adaptar para estudiar otros mecanismos de señalización paracrina y vías entre dos tipos de células. Por ejemplo, el derribo mediado por ARNip de moléculas secretoras conocidas en otras vías (por ejemplo, Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) en células O9-1 puede combinarse con inmunotinción de marcadores proliferativos, de diferenciación o apoptóticos en mioblastos subyacentes.
En conclusión, este protocolo establece un protocolo experimental novedoso y altamente manejable para estudiar los mecanismos de organización de filamentos intracelulares no canónicos relacionados con Wnt y la migración polarizada in vitro. Los métodos descritos aquí mejoran las técnicas existentes al mantener la naturaleza intercelular y paracrina de las interacciones Wnt y permiten la evaluación independiente de los componentes de envío de señales versus receptores de señales de esta vía. Este protocolo se puede aplicar ampliamente para investigar los mecanismos básicos de señalización paracrina Wnt/PCP entre dos tipos de células y detectar nuevos compuestos terapéuticos dirigidos a procesos de enfermedades relacionadas con Wnt/PCP.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por los premios NIH F30HL154324 a O.T. y K08HL121191 y R03HL154301 a S.R.K. Los autores desean reconocer que el esquema de la Figura 1 de este manuscrito fue creado con biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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