Summary
Denne studien skisserer en svært reproduserbar og håndterbar metode for å studere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalhendelser in vitro. Denne protokollen ble brukt til å evaluere virkningen av parakrin Wnt5a-signalering i murine nevrale kamceller og myoblaster.
Abstract
Ikke-kanonisk Wnt-signalering regulerer intracellulær aktinfilamentorganisasjon og polarisert migrasjon av stamceller under embryogenese. Denne prosessen krever komplekse og koordinerte parakrine interaksjoner mellom signal-sending og signal-mottak celler. Gitt at disse interaksjonene kan forekomme mellom ulike typer celler fra forskjellige linjer, kan in vivo evaluering av cellespesifikke defekter være utfordrende. Denne studien beskriver en svært reproduserbar metode for å evaluere parakrin ikke-kanonisk Wnt-signalering in vitro. Denne protokollen ble utformet med evnen til å (1) gjennomføre funksjonelle og molekylære vurderinger av ikke-kanonisk Wnt-signalering mellom to celletyper av interesse; (2) dissekere rollen som signal-sending versus signal-mottakende molekyler i den ikke-kanoniske Wnt-signalveien; og (3) utføre fenotypiske redningseksperimenter med standard molekylære eller farmakologiske tilnærminger.
Denne protokollen ble brukt til å evaluere nevrale crest cell (NCC)-mediert ikke-kanonisk Wnt-signalering i myoblaster. Tilstedeværelsen av NCC er assosiert med et økt antall phalloidin-positive cytoplasmatiske filopodier og lamellipodier i myoblaster og forbedret myoblastmigrasjon i en sårhelende analyse. Wnt5a-ROR2-aksen ble identifisert som en avgjørende ikke-kanonisk Wnt-signalvei mellom NCC og andre hjertefelt (SHF) kardiomyoblast-forfedre. Avslutningsvis er dette en svært håndterbar protokoll for å studere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalmekanismer in vitro.
Introduction
Noncanonical Wnt signalering er en evolusjonært bevart vei som regulerer cellulær filament organisasjon og retningsbestemt migrasjon. Denne banen har vært involvert i flere biologiske prosesser, inkludert embryonale vevsmorfogenese 1,2,3, lymfatisk og vaskulær angiogenese4,5,6,7, og kreftvekst og metastase 8,9,10 . På mobilnivå utføres ikke-kanonisk Wnt-signalering gjennom koordinerte parakrine interaksjoner mellom signalsendings- og signalmottaksceller. Disse interaksjonene forekommer ofte mellom celler av forskjellige avstamninger eller typer og involverer et mangfoldig molekylært nettverk som inkluderer opptil 19 ligander og flere reseptorer, co-reseptorer og nedstrøms signaltransduksjonseffektorer11. For ytterligere å komplisere denne signalprosessen, har tidligere studier vist at ligand-reseptorkombinasjoner kan variere på en kontekst- og vevsavhengig måte12,13, og at de samme kildeligandene som driver ikke-kanonisk Wnt-signalering i signalmottaksceller, kan produseres av flere signalsendende celletyper14,15 . Gitt den cellulære og molekylære kompleksiteten forbundet med ikke-kanonisk Wnt-signalering, har evnen til å studere individuelle og klinisk relevante mekanismer in vivo vært begrenset.
Det er gjort forsøk på å studere ikke-kanonisk Wnt-signalering ved hjelp av cellekulturteknikker in vitro. For eksempel har sårhelingsanalyser utført i cellulære monolag blitt brukt til å funksjonelt vurdere cellulær retningsmigrasjon 4,16,17,18,19. Immunostaining-teknikker har blitt brukt til å utføre romlige analyser av overflateproteinuttrykk for å evaluere ikke-kanoniske Wnt-induserte endringer i cellulær morfologi 7,10, arkitektur og asymmetrisk polarisasjon18,19,20. Selv om disse tilnærmingene har gitt viktige verktøy for å karakterisere Wnt-relaterte fenotyper i signalmottaksceller, begrenser mangelen på signalsendingskomponenter i disse protokollene deres evne til nøyaktig å modellere parakrine signalmekanismer observert in vivo. Som et resultat er det fortsatt et kritisk behov for å utvikle in vitro-systemer som tillater robust og reproduserbar evaluering av parakrine signalinteraksjoner mellom signalsende- og mottaksceller i den ikke-kanoniske Wnt-banen, spesielt de av forskjellige celletyper.
Til dette formål var det primære målet med denne studien å etablere en protokoll for å modellere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalinteraksjoner in vitro. Vi utviklet et ikke-kontakt kokultursystem som rekapitulerer signalsendings- og signalmottakskomponenter i disse interaksjonene og tillater bruk av standard molekylære, genetiske eller farmakologiske tilnærminger for uavhengig å studere spesifikke ligandreseptormekanismer i den ikke-kanoniske Wnt-banen. Mekanismer for NCC-mediert Wnt-signalering ble undersøkt i myoblaster ved hjelp av etablerte murincellelinjer. Som prinsippbevis ble denne modellen brukt til å bekrefte funn fra tidligere in vivo-studier hos mus som impliserer Wnt5a-ROR2-aksen som en relevant ikke-kanonisk Wnt-signalvei mellom NCCs 21 og SHF kardiomyoblast forfedre 3,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preeksperimentell ekspansjon og passaging av celler
- C2C12 cellekultur:
- Forbered 500 ml C2C12 kulturmedium ved å kombinere Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin.
- Tine et hetteglass med C2C12-celler i 37 °C vannbad. Mens C2C12-cellene tiner, tilsett 5 ml C2C12 medium til et 15 ml konisk rør. Overfør de tinte cellene umiddelbart til 15 ml røret ved hjelp av en P1000-pipette.
MERK: C2C12-celler er murine myoblastceller som tidligere har blitt brukt og validert som en primær cellelinje for modellering av kardiomyoblast-forfedre. - Bland forsiktig C2C12-celler i det koniske røret ved hjelp av en serologisk pipette. Deretter legger du hele volumet av tinte celler i C2C12 medium (6 ml) til en 75 cm2 kolbe.
- Tilsett 6 ml ferskt C2C12-medium til kolben for et totalt volum på 12 ml. Roter kolben forsiktig slik at cellen og medieløsningen dekker hele bunnen av kolben. Plasser kolben i en cellekulturinkubator (37 ° C, 5% CO2) for å la cellene feste seg.
- La cellene utvide seg i inkubatoren til de når ~ 60% sammenløp.
MERK: Dette kan bestemmes ved periodisk å fjerne cellene fra inkubatoren og raskt sjekke deres sammenløp under et mikroskop. Pass på å minimere tiden som celler fjernes fra inkubatoren.
- Passerer C2C12-celler:
- Varm C2C12 medium, 500 ml 1x PBS og 0,25% trypsin-EDTA i et 37 ° C vannbad. Etter at reagensene er oppvarmet, overfør alle reagensene til cellekulturhetten.
- Ta kolben som inneholder C2C12-cellene inn i cellekulturhetten. Skyll kolben som inneholder C2C12-cellene forsiktig med varm 1x PBS to ganger.
- Vipp kolben i 45° vinkel og aspirer C2C12-mediet med en glasspipette koblet til vakuumsug. Mens du opprettholder en 45 ° vinkel, legg forsiktig 10 ml varm 1x PBS til hjørnet av kolben ved hjelp av en serologisk pipette. Legg kolben flatt på overflaten og beveg kolben forsiktig i sirkulære bevegelser for å sikre at 1x PBS vasker over hele monolaget av celler.
MERK: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer C2C12-monolaget mens du aspirerer mediet.
- Vipp kolben i 45° vinkel og aspirer C2C12-mediet med en glasspipette koblet til vakuumsug. Mens du opprettholder en 45 ° vinkel, legg forsiktig 10 ml varm 1x PBS til hjørnet av kolben ved hjelp av en serologisk pipette. Legg kolben flatt på overflaten og beveg kolben forsiktig i sirkulære bevegelser for å sikre at 1x PBS vasker over hele monolaget av celler.
- Fjern 1x PBS etter den andre vasken. Tilsett 1 ml 0,25% trypsin-EDTA til kolben, flytt kolben forsiktig som beskrevet ovenfor for å la trypsin-EDTA-løsningen spre seg over så mye av monolaget som mulig og plasser kolben i inkubatoren i 2 minutter.
- Etter 2 min inkubasjon, fjern kolben fra inkubatoren og trykk forsiktig på den for å løsne eventuelle gjenværende celler.
- Tilsett 9 ml C2C12 medium til kolben med en serologisk pipette for å slukke trypsinet. Skyll cellene forsiktig med mediet ved hjelp av den serologiske pipetten og samle opp 10 ml trypsinisert cellesuspensjon. Tilsett 10 ml av cellesuspensjonen til et friskt 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 100 × g i 5 minutter.
- Sett det koniske røret tilbake til cellekulturhetten og fjern supernatanten med en glasspipette koblet til vakuumsug. Mens du aspirerer supernatanten, må du passe på at du ikke forstyrrer cellepelleten i bunnen av det koniske røret. For å gjøre dette, la ~ 0,2 ml av supernatanten ligge i det koniske røret. Resuspender cellene i 10 ml friskt C2C12-medium.
- For ytterligere passering, tilsett 1 ml av de resuspenderte cellene i en 75 cm2 kolbe. Tilsett 11 ml C2C12 medium til kolben med en serologisk pipette og plasser kolben i inkubatoren.
- STO-cellekultur:
- Forbered STO kulturmedium ved å lage 500 ml DMEM med 7% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 2 nM L-glutamin.
- Forbered 0,1% gelatin ved å tilsette 0,5 g gelatinpulver til en flaske som inneholder 500 ml vevskvalitet eller autoklavert vann. Tilsett 7 ml 0,1% gelatinoppløsning til en 75 cm2 kolbe. Roter kolben slik at gelatinoppløsningen dekker hele bunnen av kolben. La kolben ruge i 30 minutter ved romtemperatur i cellekulturhetten.
- Etter inkubasjon på 30 minutter, fjern overflødig gelatin ved hjelp av en pipette koblet til vakuumsug. La kolbene forbli i inkubatoren i ytterligere 30 minutter før bruk.
- Tine et hetteglass med STO-celler i et vannbad på 37 °C. Bruk en P1000-pipette til å overføre de tinte cellene umiddelbart til et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml nytilberedt STO-kulturmedium.
MERK: STO-celler er murine embryonale fibroblaster som rutinemessig brukes som materceller i cellekulturprotokoller. - Bland forsiktig cellene i det koniske røret ved hjelp av en serologisk pipette. Tilsett hele volumet (6 ml) av celler til en gelatinbelagt 75 cm2 kolbe. Roter kolben for å sikre at cellesuspensjonen er godt fordelt langs bunnen av kolben.
- Tilsett 6 ml ferskt STO-medium i kolben for et totalt volum på 12 ml. Roter kolben som beskrevet ovenfor for å sikre at cellene og mediet er godt fordelt langs bunnen av kolben. Plasser kolben i inkubatoren på 37 °C slik at cellene fester seg. La cellene spre seg i inkubatoren til de når ~ 60-70% sammenløp.
- Sende STO-celler:
- Varmt STO-cellemedium, 1xPBS og 0,25% trypsin-EDTA i et vannbad på 37 °C.
- Skyll kolben som inneholder STO-celler forsiktig med varme 1x PBS to ganger som beskrevet i trinn 1.2.2.1.
- Tilsett 1 ml 0,25 % trypsin-EDTA i kolben ved hjelp av en P1000-pipette. Plasser kolben i inkubatoren på 37 °C i 5 minutter.
- Etter 5 min inkubasjon, fjern kolben fra inkubatoren. Trykk forsiktig på kolben for å løsne eventuelle tilhørende celler.
- Tilsett 9 ml STO-medium til kolben for å slukke trypsinet og samle 10 ml trypsinisert cellesuspensjon som beskrevet ovenfor. Tilsett 10 ml av cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 100 × g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 10 ml STO-medium som beskrevet ovenfor. For ytterligere passering, tilsett 1 ml av de resuspenderte cellene i en 75 cm2 kolbe. Tilsett 11 ml STO-medium, roter kolben for å sikre jevn fordeling av cellene og mediet langs bunnen av kolben, og plasser kolben i inkubatoren.
- Inaktiv STO-cellekultur og O9-1-celle basalmediumpreparat:
- Forbered O9-1 celle basal kultur medium ved å blande 500 ml DMEM med 15% FBS, 1% penicillin / streptomycin, 2 nM L-glutamin, 0,1 mM minimum ikke-essensielle aminosyrer, 1 nM natriumpyruvat og 55 μM beta-merkaptoetanol.
- Forbered mitomycin C-oppløsning i 1x PBS i en konsentrasjon på 0,5 mg / ml ved å tilsette 4 ml 1x PBS direkte til et mitomycin C hetteglass. Pipetter løsningen flere ganger med en P1000-pipette. For ytterligere å oppløse mitomycin C i 1x PBS, plasser hetteglasset på en virvelblander eller benkrocker i 45 minutter til 1 time.
- Inaktiver STO-cellene ved å behandle STO-platene med en endelig konsentrasjon på 0,01 mg/ml mitomycin C tilsatt standard STO-medium. Plasser STO-platene inne i inkubatoren i 2 timer, og pass på å beskytte kolben som inneholder mitomycin C mot lys ved å minimere tiden utenfor inkubatoren. Etter mitomycinbehandling vaskes cellene i 1x PBS to ganger som beskrevet i trinn 1.2.2.1.
MERK: Mitomycin C hemmer spredning av STO-celler slik at de kan brukes til å generere betinget medium over flere dager uten å bli overkonfluent i kolben. - Etter å ha fjernet 1x PBS, tilsett 12 ml O9-1 basal kulturmedium til de inaktiverte STO-cellekulturene og inkuber dem i 24 timer. Samle det betingede, inaktiverte STO + O9-1 basale kulturmediet og legg det i 50 ml koniske rør innpakket i folie for å beskytte det mot lys.
- Tilsett 12 ml friskt O9-1 basalt kulturmedium til de inaktiverte STO-cellekulturene som beskrevet ovenfor. Gjenta dette trinnet ved å tilsette ferskt O9-1 basalt kulturmedium til de samme flankene som inneholder de inaktiverte STO-cellene hver 24.
MERK: Etter mitomycin C-behandling kan de inaktiverte STO-cellene ikke spre seg; derfor kan kolbene som inneholder de inaktiverte STO-cellene gjenbrukes for å generere betinget medium. - Oppbevar de folieinnpakkede 50 ml koniske rørene som inneholder betinget, inaktivert STO + O9-1 basalt kulturmedium ved 4 °C til totalt 500 ml av mediet er samlet opp.
- O9-1 cellekultur:
- Forbered O9-1 cellevekstkulturmedium ved bruk av 500 ml betinget STO + O9-1 basalmedium, og tilsett 103 enheter leukemihemmende faktor (LIF) og 25 ng / ml grunnleggende fibroblastvekstfaktor (basisk FGF).
- Klargjør 0,1 % gelatinbelagte kolber som beskrevet i trinn 1.3.2-1.3.3.
- Tine et hetteglass med O9-1-celler i et vannbad på 37 °C. Overfør straks de tinte cellene til et 15 ml konisk rør som inneholder 5 ml nytilberedt O9-1 vekstmedium.
MERK: O9-1-cellelinjen er den eneste stabile, multipotente nevrale kamcellelinjen som er generert fra musen. Denne cellelinjen brukes ofte i nevrale kam in vitro-eksperimenter . - Bland cellene forsiktig ved hjelp av en serologisk pipette. Tilsett hele 6 ml celler i en gelatinbelagt 75 cm2 kolbe.
- Tilsett 6 ml O9-1 vekstmedium til kolben for et totalt volum på 12 ml. Plasser kolben i inkubatoren på 37 °C slik at cellene fester seg. La cellene spre seg i inkubatoren til de når ~ 60-70% sammenløp.
- Passerer O9-1 celler:
- Varmt O9-1 vekstmedium, 1x PBS og 0.25% trypsin-EDTA i et 37 ° C vannbad.
- Skyll forsiktig platen som inneholder O9-1-celler med varm 1x PBS to ganger som beskrevet i trinn 1.2.2.1.
- Tilsett 1 ml 0,25% trypsin-EDTA til kolben og legg den i 37 ° C-inkubatoren i 5 minutter.
- Etter 5 min inkubasjon, fjern kolben fra inkubatoren og trykk forsiktig på kolben for å løsne eventuelle adherente celler.
- Tilsett 9 ml O9-1 vekstmedium til kolben for å slukke trypsinet. Samle 10 ml av trypsinisert cellesuspensjon og tilsett 10 ml av denne cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør. Sentrifuge røret ved 100 × g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 10 ml O9-1 vekstmedium. For ytterligere passasje, tilsett 1 ml av de resuspenderte cellene til en 75 cm2 kolbe. Tilsett 11 ml O9-1 vekstmedium og plasser kolben som inneholder cellene i 12 ml medium i inkubatoren på 37 °C.
2. Plating celler i et kokultursystem
- Plating C2C12 cellekamre:
- Etter trypsinisering (som beskrevet i trinn 1.2) resuspenderes C2C12-cellepelleten i 10 ml C2C12 medium. Fortynn cellene i et 1:20-forhold i C2C12-medium ved å fjerne 0,5 ml av de resuspenderte C2C12-cellene og legge dem til et nytt 15 ml konisk rør som inneholder 9,5 ml friskt C2C12-medium. Bland suspensjonen forsiktig med en serologisk pipette.
- Tilsett 1 ml av de 1:20-fortynnede C2C12-cellene til hver brønn i en ny 4-kammerbrønn ved hjelp av en P1000-pipette og plasser 4-kammerbrønnen i inkubatoren.
- Plating O9-1 celle innlegg:
- Etter trypsinisering, resuspender O9-1 cellepelleten i 10 ml O9-1 vekstmedium. Fortynn cellene i et 1:20-forhold i O9-1 vekstmedium ved å fjerne 0,5 ml av de resuspenderte C2C12-cellene og legge dem til et nytt 15 ml konisk rør som inneholder 9,5 ml friskt O9-1 vekstmedium. Bland suspensjonen forsiktig med en serologisk pipette.
- Plasser en enkelt permeabel innsats (se materialtabellen) inne i hver brønn i en ny 4-kammerbrønn fylt med 1 ml O9-1 vekstmedium.
MERK: Denne 4-kammerbrønnen skal være forskjellig fra den som inneholder C2C12-cellene fra trinn 2.1.3. - Tilsett 300 μL av den fortynnede O9-1-cellesuspensjonen til hver innsats ved hjelp av en P1000-pipette. Sørg for at bunnen av hver innsats er nedsenket i brønnen fylt med 1,3 ml O9-1 vekstmedium. Plasser brønnen i inkubatoren på 37 °C.
- (Valgfritt). Utfør siRNA-knockdown i O9-1-cellene eller C2C12-cellene.
- Utfør gen knockdown av siRNA 18-24 timer etter plating enten O9-1 celleinnlegg eller C2C12 cellekammerbrønner.
- Fortynn siRNA- og transfeksjonsreagenset i redusert serummedium (se materialtabellen) i henhold til produsentens anbefalinger og de ønskede konsentrasjonene for forsøket. Bland forsiktig det fortynnede siRNA- og transfeksjonsreagenset (1:1) og inkuber blandingen ved romtemperatur i 7 minutter.
MERK: I denne protokollen ble 50 nM-konsentrasjoner brukt da denne siRNA-konsentrasjonen ble bestemt å resultere i tilstrekkelig knockdown av målgenuttrykk. - Legg til siRNA-lipidkompleksene til enten O9-1-celleinnsatsene eller C2C12-cellekammerbrønnene som bestemt av eksperimentell design, og inkuber cellene med siRNA-lipidkompleksene i ~ 36-48 timer.
- Fortynn siRNA- og transfeksjonsreagenset i redusert serummedium (se materialtabellen) i henhold til produsentens anbefalinger og de ønskede konsentrasjonene for forsøket. Bland forsiktig det fortynnede siRNA- og transfeksjonsreagenset (1:1) og inkuber blandingen ved romtemperatur i 7 minutter.
- Utfør gen knockdown av siRNA 18-24 timer etter plating enten O9-1 celleinnlegg eller C2C12 cellekammerbrønner.
3. Utføre såranalyse og kvantitativt vurdere myoblastmigrasjon
- Såranalyse:
- La O9-1-celleinnsatsene og C2C12-cellekammerbrønnene feste seg og spre seg i inkubatoren til begge cellene er på ~ 70-80% sammenløp før du fortsetter med denne delen av protokollen. Hvis celler vokser >90% sammenflytende, ikke fortsett med riperanalysen, da celler bare vil løsne fra brønnen.
- Varm 1x PBS og C2C12 medium ved å plassere dem i et 37 ° C vannbad.
- Fjern supernatant medium fra C2C12-kammeret godt og vask cellene en gang med 1x PBS. Fjern 1x PBS og skrap straks cellene med en steril P10 pipettespiss.
- Før den sterile P10-pipettespissen godt i én retning slik at den strekker seg over hele lengden eller bredden på cellemonolaget (f.eks. fra høyre mot venstre, fra topp til bunn). Pass på å skrape hver brønn som inneholder celler bare en gang.
MERK: For å optimalisere skraperesultater, skrape brønner av forskjellige eksperimentelle forhold på et lignende nivå av sammenløp. For å gjøre dette, sørg for at hver 4-kammerbrønn har celler for hver nødvendige eksperimentelle tilstand (f.eks. Brønn # 1 negativ kontroll, brønn # 2 positiv kontroll). I tillegg bruker du en ny steril P10-pipette for hver ripe og påfører pipetten tilsvarende kraft hver gang. Ikke prøv å lage mer enn en ripe i hver brønn. - Etter riper, tilsett raskt 1 ml 1x PBS tilbake i brønnen ved hjelp av en P1000 pipettespiss. Gjenta denne prosessen for hver brønn som vil bli riper.
MERK: Gitt variasjonen knyttet til hver ripe, anbefales det at flere brønner (n = 3) brukes til sårdannelse i hver eksperimentell tilstand. Arbeid raskt, da det er viktig å minimere varigheten som cellene er uten 1x PBS under disse trinnene. Etter å ha fjernet 1x PBS fra hver brønn, bør man ikke ta mer enn 5 s for å generere et sår i hver brønn.
- Før den sterile P10-pipettespissen godt i én retning slik at den strekker seg over hele lengden eller bredden på cellemonolaget (f.eks. fra høyre mot venstre, fra topp til bunn). Pass på å skrape hver brønn som inneholder celler bare en gang.
- Etter å ha generert et sår og lagt 1x PBS tilbake i hver brønn, kan du avbilde ripen ved hjelp av et brightfield invertert mikroskop og bruke dette bildet som baseline sårstørrelse (tid 0). Hvis du vil ta bilder, gjør du følgende:
- Slå på datamaskinen og mikroskopet (se materialtabellen) ved å trykke på strømknappen. Plasser kammerglidningen på scenen og roter objektivhjulet til 5x forstørrelse.
- Åpne bildebehandlingsprogramvaren (se materialtabellen) ved å dobbeltklikke på programvareikonet på skrivebordet. Klikk kategorien Kamera på programvarens startskjerm. Klikk Live-knappen for å visualisere cellene i AxioCam IC-fanen .
- Forsikre deg om at lysfilteret trekkes helt ut for å la lyset passere til kameraet og dataskjermen. Flytt og/eller roter kammerlysbildet manuelt for å plassere sårområdet midt i det direktesendte bildet på AxioCam IC-fanen .
- Hvis du vil ta bilder, klikker du fest for å åpne en ny fane ved siden av AxioCam IC-fanen som inneholder bildet.
- For å lagre dette stillbildet, klikk på filen øverst til venstre på programvarens hjemmeside | lagre som | skriv inn filnavnet i filnavnboksen . Lagre figuren i Carl Zeiss-bildeformat (*.czi) (standardinnstillingen), og velg skrivebord på linjen til venstre for å lagre filen på skrivebordet som en .czi-fil , som bare kan åpnes i Zen lite 2012-programmet.
- Hvis du vil lagre bildet som en .tiff, klikker du fil | lagrer som | skriver inn filnavnet i filnavnboksen. Lagre figuren som kodet bildefil (*.tiff) ved å klikke på lagre som type-knappen og velge *.tiff fra rullegardinmenyen.
MERK: Det .tiff formatet kan åpnes i hvilken som helst bildebehandlingsprogramvare. - Plasser kammerglasset manuelt for å ta 2-3 bilder til på andre punkter i såret i samme brønn.
MERK: Totalt vil dette resultere i 3-4 ikke-overlappende bilder med høy forstørrelse av såret i hver brønn.
- Fjern 1x PBS fra hver brønn og tilsett 1 ml C2C12 medium.
MERK: Vær forsiktig så du ikke pipetter for aggressivt når du fjerner eller tilsetter løsninger i kammerbrønnen etter sårgenerering, da dette kan føre til at celler løsner fra kammerbrønnen. I tillegg vipper du kammeret godt slik at aspirasjon og gjeninnføring av løsninger kan gjøres i hjørnene av hver brønn for å minimere forstyrrelser i cellemonolag. - Monter kokultursystemet for brønninnsats ved å plassere innsatsene som inneholder O9-1-cellene manuelt i hver brønn i kammerbrønnen. Skyv innsatsene forsiktig ned i brønnen slik at bunnen av innsatsen sitter like over de underliggende C2C12-cellene. Returner brønninnsatskonstruksjonene til inkubatoren.
MERK: Ikke la bunnen av innsatsen fysisk berøre og mekanisk forstyrre de underliggende C2C12-cellene. - La cellene migrere i totalt 9-12 timer. For å bestemme den optimale migrasjonstiden, kontroller cellene ved 6 timer etter såropprettelse, deretter hver 2-3 timer etterpå. Avslutt eksperimentet når cellene i kontroll eller positive kontrollforhold begynner å dekke såret helt.
MERK: Gitt konstruksjonens ikke-kontaktforhold, trenger ikke den overliggende innsatsen å fjernes fra brønnene når man kontrollerer intervallmigrasjonsprogresjonen. Migreringsvariabilitet vil bli observert avhengig av faktorer som celletyper som brukes i denne analysen, cellulær tetthet på tidspunktet for sårgenerering, bredden på såret som er opprettet, og eksperimentelle forhold for manipulerte celler (f.eks. Genknockdown, rekombinant proteintilsetning). Konsentrasjonene av disse reagensene bør bestemmes eksperimentelt etter veiledning fra produsentens anbefalinger.
4. Immunfluorescensfarging og avbildning av migrerende myoblaster
- Avslutte migreringsanalysen og dekonstruere brønninnsatssystemet:
- Fjern O9-1-celleinnsatsene etter en migrasjonsperiode på 9-12 timer (eller alternativ tid utpekt av eksperimentelle forhold). Inspirer C2C12-mediet forsiktig ved hjelp av en P1000-pipette. Tilsett 0,5 ml 1x PBS i kammerbrønnene, og ta de endelige bildene av celler etter migrering.
- Aspirer forsiktig alle 0,5 ml 1x PBS blandet med medium og fjern plastkamrene fra kammerbrønnene ved hjelp av kit-instruksjoner, og la det underliggende lysbildet inneholde C2C12-cellene.
MERK: Vær forsiktig så du ikke forstyrrer C2C12-cellene som er festet til lysbildet når du fjerner kammerbrønnene.
- Utføre immunostaining:
- Legg lysbildet umiddelbart i en lysbildeholder som inneholder 4 % paraformaldehyd (PFA) og rug i 10 minutter ved romtemperatur. Hell ut 4% PFA og tilsett 0,1% Triton X-100 som inneholder 1x PBS (1x PBST) til lysbildeholderen for å vaske lysbildet i 15 minutter ved romtemperatur. Hell ut 1x PBST og tilsett 1x PBS i lysbildeholderen for å vaske lysbildet i 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta dette trinnet en gang til for totalt to 1x PBS-vasker.
- Fjern lysbildet fra lysbildeholderen. Spor ytterkantene av lysbildet med en hydrofob penn for å lage en hydrofob grense rundt lysbildet for å forhindre at løsninger søler fra lysbildet. Pass på at du ikke forstyrrer de tilhørende cellene.
- Tilsett 1 % bovin serumalbumin (BSA) blokkeringsløsning (fortynnet i 1x PBS) til lysbildet (~0,5 ml per lysbilde). Kontroller at løsningen er innenfor den hydrofobe grensen som er opprettet i trinn 4.2.4. Inkuber lysbildet i 1 time ved romtemperatur i et fuktet glidekammer.
MERK: Selv om BSA-blokkering ikke er nødvendig for phalloidinimmunfarging, tillater dette trinnet i protokollen kobling med fluorescensantistofffarging. - Etter blokkering i 1 time, hell ut blokkeringsløsningen fra lysbildet, tilsett phalloidinantistoff (fortynnet til 1:200 i 1% BSA-blokkeringsløsning ved å tilsette 5 μL av antistoffet til 995 μL BSA-løsning) til lysbildet og inkubere ved 4 ° C over natten. Igjen, sørg for at løsningen er inneholdt innenfor den hydrofobe grensen opprettet i trinn 4.2.4. Gitt at phalloidin antistoffet er konjugert til Alexa Fluor-488 fargestoff, minimere lyseksponering av antistoffreagenset før og etter tilsetning til lysbildet.
- Neste dag plasserer du lysbildet i en lysbildeholder som er beskyttet mot lyseksponering (f.eks. pakk lysbildeholderen i folie eller bruk en ikke-gjennomsiktig lysbildeholder). Vask cellene i lysbildeholderen med 1x PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Gjenta vasken i totalt tre 10 min vasker.
- Legg til 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) -holdig monteringsmedium og monter lysbildene med glassdeksler. Avbilde cellene som har migrert ved hjelp av et standard fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effekter av NCC på migrasjonskapasiteten til murine myoblaster
Denne analysen ble først brukt for å evaluere virkningen av NCC på myoblastenes migrasjonskapasitet. Figur 1 skisserer den skjematiske modellen av analysen. For å teste denne effekten ble det utført skrapeanalyser med myoblaster som ble dyrket isolert (uten NCC-innlegg) sammenlignet med de som ble dyrket i nærvær av innlegg. Som en positiv kontroll ble 500 ng/ml rekombinant Wnt5a (rWnt5a) tilsatt kammerbrønner med NCC-innsatser. Denne konsentrasjonen av rWnt5a ble bestemt ved en dose-respons-analyse utført i C2C12-celler (supplerende figur S1). Representative bilder av NCC-innsatser er vist i supplerende figur S2, som viser at NCC-ene er friske på dette tidspunktet. Immunfluorescens viser robust knockdown av Wnt5a på proteinnivå etter inkubasjon med 50 nM Wnt5a siRNA (supplerende figur S3). Etter en migrasjonsperiode på 9 timer ble det funnet at tilstedeværelsen av NCC signifikant økte migrasjonskapasiteten til myoblaster sammenlignet med myoblaster analysert i fravær av NCC-innlegg (72,6% sårbefolket område vs 59,1% sårbefolket område, p = 0,033). Tilsetningen av rWnt5a til kokulturbrønner akselererte myoblastmigrasjonen, med noen sårområder som demonstrerte fullstendig gjenoppretting innen 9 timers tidspunkt, som vist i figur 2. Som forventet viste migrerende myoblaster ved alle tre tilstander normal migrerende cellulær morfologi, inkludert velformet og utstående filopodi og lamellopodi og asymmetrisk polarisering av aktincytoskeletale projeksjoner (figur 2C).
Betydningen av NCC-avledet Wnt5a for polarisert migrasjon av myoblaster
For å evaluere den parakrine effekten av NCC-avledet Wnt5a på myoblastmigrasjon, ble sårhelingsanalyser utført i myoblaster etter siRNA-mediert knockdown av Wnt5a i NCC. Først ble Wnt5a knockdown-effektivitet validert i NCC-er ved sanntidskvantitativ polymerasekjedereaksjon. Behandling med 50 nM siRNA mot Wnt5a ble funnet å redusere Wnt5a genuttrykk med 64% sammenlignet med negativ kontroll (kryptert) siRNA (figur 3A). Ved hjelp av denne konsentrasjonen ble O9-1 celleinnlegg transfisert med enten kontroll siRNA eller Wnt5a siRNA 48 timer før montering av kokulturen. C2C12-celler ble dyrket under normale forhold, og sår ble opprettet ved riktig sammenløp. Umiddelbart etter sårgenerering ble negativ kontroll eller Wnt5a knockdown NCC-innlegg lagt til hver brønn. Etter en 10 timers migrasjonsperiode ble det funnet at knockdown av Wnt5a i NCC signifikant reduserte underliggende myoblastmigrasjonskapasitet sammenlignet med myoblaster analysert med kontroll-NCC (39,1% sårbefolket område mot 74,8% sårbefolket område, p < 0,001). Videre viste myoblaster analysert i nærvær av NCC med knockdown av Wnt5a unormal cytologisk morfologi ved immunfarging, inkludert reduserte cytoplasmatiske områder og færre aktincytoskeletale projeksjoner (figur 3D). For å redde myoblastmigrasjon ble eksogent tilskudd av 500 ng / ml rWnt5a lagt til kokulturbrønner som inneholder Wnt5a knockdown-innlegg. Tillegg av eksogen rWnt5a ble funnet å fullstendig redde migrerende og morfologiske defekter observert i disse myoblastene (figur 3C, D).
Wnt5a signaliserer gjennom ROR2 i myoblaster som en driver for polarisert migrasjon
For bedre å forstå signalmottakscellemekanismene i denne parakrine modellen, ble analysen gjentatt etter knockdown av ROR2-reseptoren i myoblaster. I dette eksperimentet ble myoblaster transfisert med 50 nM ROR2 siRNA ~ 40 timer før sårgenerering, noe som ble vist å være tilstrekkelig til å slå ned ROR2-genuttrykk med 54% (figur 4A). I løpet av denne tiden ble NCC-innsatser dyrket parallelt under normale forhold. Etter at myoblaster nådde passende sammenløp, ble det utført skrapeanalyser, og kokulturbrønninnsatser ble satt sammen. Etter en 10 timers migrasjonsperiode i nærvær av NCC-innsatser, viste ROR2 knockdown myoblaster redusert migrasjonskapasitet sammenlignet med myoblaster behandlet med negativt kontroll-siRNA (48,1% sårbefolket område vs 75,7% sårbefolket område, p = 0,019) (figur 4B, C). Tillegget av 500 ng / ml rWnt5a klarte ikke å redde myoblastmigrasjonskapasiteten etter ROR2-knockdown, noe som tyder på at ROR2-uttømming forstyrrer myoblasts evne til å motta Wnt5a-signaler (figur 4B, C). Immunfarging for phalloidin bekreftet migrasjonsdataene og viste at en reduksjon i phalloidin-positiv lamellopodi og filopodi i ROR2 knockdown myoblaster ikke ble gjenopprettet av supplerende rWnt5a (figur 4D).
Figur 1: Skjematisk modell av analysen. Trinn 1 inkluderer in vitro-utvidelse av C2C12-myoblaster og NCC-er ved bruk av STO-materceller. Trinn 2 innebærer plating av NCC-er og C2C12-celler i kokultursystemet. Trinn 3 inkluderer såranalysen utført i underliggende C2C12-celler for å evaluere cellulær migrasjonskapasitet. Trinn 4 innebærer immunostaining for phalloidin for å evaluere cytologisk arkitektur og morfologi av migrerte celler. Forkortelser: NCCs = nevrale kamceller; Ab = antistoff. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tilstedeværelse av nevrale kamceller øker myoblastmigrasjonskapasiteten . (A) Tilstedeværelsen av nevrale kamcelleinnlegg (NCC) på tidspunktet for sårgenerering fører til forbedret myoblastmigrasjon. Tilsetningen av eksogene rekombinante Wnt5a (rWnt5a) til NCC-C2C12-kokulturer har den sterkeste positive effekten på myoblastmigrasjon. (B) Kvantifisering av gjennomsnittlig myoblast befolket område ved 9 timer etter sårgenerering (feilfelt viser standardavvik). (C) Phalloidinfarging av myoblaster ved sårgrensen 9 timer etter sårgenerering. Stiplede rektangler viser falloidinfargede myoblaster ved migrasjonsfronten. Totalt n = 3 prøver ble brukt for hver eksperimentell tilstand kvantifisert i B. Skala barer = 200 μm (for A og C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Nevralcelleavledet Wnt5a er nødvendig for myoblastmigrasjon. (A) Relativt mRNA-uttrykk for Wnt5a for å validere siRNA-mediert knockdown i NCC. (B) Migrasjon av C2C12-myoblaster reduseres betydelig etter Wnt5a-knockdown i NCC-er. Tillegg av eksogen rWnt5a er tilstrekkelig til å redde dette migrasjonsunderskuddet i myoblaster. (C) Kvantifisering av gjennomsnittlig myoblast-befolket område ved 10 timer etter sårgenerering (feilfelt viser standardavvik). (D) Phalloidinfarging av myoblaster ved sårgrensen 10 timer etter sårgenerering. Stiplede rektangler viser falloidinfargede myoblaster ved migrasjonsfronten. Totalt n = 3 prøver ble brukt for hver eksperimentell tilstand kvantifisert i C. Skala barer = 200 μm (for B og D). Forkortelser: NCCs = nevrale kamceller; siRNA = lite forstyrrende RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Wnt5a-signaler gjennom ROR2-reseptorer i myoblaster for å drive migrasjon. (A) Relativt mRNA-uttrykk for ROR2 for å validere siRNA-mediert knockdown i C2C12-celler. (B) Knockdown av ROR2 i myoblaster reduserer deres migrasjonskapasitet til tross for tilstedeværelsen av NCCs. Eksogen rWnt5a klarer ikke å redde myoblastmigrasjon etter ROR2 knockdown. (C) Kvantifisering av gjennomsnittlig myoblast-befolket område ved 10 timer etter sårgenerering (feilfelt viser standardavvik). (D) Phalloidinfarging av myoblaster ved sårgrensen 10 timer etter sårgenerering. Stiplede rektangler viser falloidinfargede myoblaster ved migrasjonsfronten. Totalt n = 3 prøver ble brukt for hver eksperimentell tilstand kvantifisert i C. Skala barer = 200 μm. Forkortelser: NCCs = nevrale kamceller; siRNA = lite forstyrrende RNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur S1: Doseavhengig analyse for rekombinant Wnt5a-tilskudd. Doseavhengig analyse for rekombinant Wnt5a-tilskuddstesting 0 ng / ml, 100 ng / ml og 500 ng / ml fant at 500 ng / ml eksogen rWnt5a var den optimale konsentrasjonen for å drive myoblastmigrasjon og phalloidin cytoarkitektoniske endringer i løpet av en 12 timers trekkperiode in vitro. Skala barer = 200 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Representative bilder av brønninnlegg. Brightfield-bilder av brønninnsatser som inneholder O9-1 nevrale kamceller behandlet med (A) 50 nM negativ kontroll siRNA og (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Skala barer = 200 μm. Forkortelse: siRNA = lite forstyrrende RNA. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S3: Representative bilder av Wnt5a-proteinuttrykk i O9-1-celler etter siRNA-mediert Wnt5a knockdown. Immunfluorescensfarging av Wnt5a-protein i cellekulturbrønner som inneholder O9-1 nevrale kamceller behandlet med (A) 50 nM negativ kontroll siRNA og (B) 50 nM Wnt5a siRNA. Skala barer = 20 μM. Forkortelser: siRNA = lite forstyrrende RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ikke-kanoniske Wnt / plane cellepolaritet (PCP) signalveien er en kritisk viktig cellulær signalvei som har vært involvert i flere utviklingsmessige 24,25 og sykdomsprosesser 24,26. Under embryonal utvikling innebærer ikke-kanonisk Wnt-signalering et ekspansivt nettverk av molekylære signaler fra signalsendende celler som til slutt induserer endringer i morfologi, asymmetrisk organisasjon og retningsmigrasjon i signalmottakende celler11. Tidligere studier har vist at de spesifikke ligandreseptorveiene som driver denne signaleringen er forskjellige, kontekstavhengige og ofte varierer mellom celletyper12,13,14,15. På grunn av denne molekylære kompleksiteten har evnen til å vurdere parakrine ikke-kanoniske Wnt-signalinteraksjoner ved bruk av konvensjonelle genetiske rekombinasjonsmetoder in vivo vært begrenset. Mens in vitro-systemer i økende grad har blitt brukt som en alternativ tilnærming til å studere ikke-kanoniske Wnt-cellulære fenotyper, fokuserer tilgjengelige protokoller utelukkende på nedstrøms signalmottaksaspekter av banen og klarer ikke å tilstrekkelig modellere den intercellulære og parakrine naturen til disse signalhendelsene. Derfor var målet med denne studien å utvikle en protokoll for et ikke-kontakt kokultursystem som rekapitulerer parakrine Wnt-interaksjoner in vitro. Fokuset i denne protokollen var å modellere to karakteristiske aspekter ved funksjonell ikke-kanonisk Wnt-signalering in vitro, inkludert organisering av intracellulære filamentproteiner og polarisert migrasjonskapasitet.
Som et bevis på konseptet ble denne protokollen brukt til å studere parakrine mekanismer i sammenheng med hjerteutvikling. Under kardiogenese er gjensidige signalhendelser mellom hjerte-NCC og SHF-stamceller avgjørende for riktig modning av hjertets utstrømningskanal (OFT)27,28,29. Tidligere arbeid har vist at under musehjerteutvikling er NCC-mediert Wnt / PCP-signalering i pharyngeal SHF-celler nødvendig for SHF-stamcelleinkorporering i den utviklende OFT og for normal OFT-justering21. Schleiffarth og medarbeidere og andre har vist at genetisk knockout av genet som koder for Wnt/PCP-liganden, Wnt5, har vist seg å forstyrre SHF-stamcelleorganisasjonen og migrasjonskapasiteten, noe som resulterer i en forkortet og feiljustert hjerte-OFT22,23,30. Med etablerte murine NCC (O9-1) 31 og myoblast (C2C12) cellelinjer, viser denne protokollen at kokultur med NCC er assosiert med økt phalloidin-positiv cytoplasmisk filopodi og lamellipodi og forbedrer myoblastmigrasjonskapasiteten i en sårhelingsanalyse. Disse molekylære og funksjonelle endepunktene in vitro bygger på tidligere publiserte protokoller for NCC-manipulasjon31 og modellerer tett in vivo fenotypiske endringer beskrevet i Wnt5a globale knockoutmus, og validerer nytten av denne modellen.
For å bestemme den spesifikke molekylære banen som driver ikke-kanonisk Wnt-signalering mellom NCC og myoblaster, ble parallelle cellespesifikke knockdown-eksperimenter for gener som koder for kandidatliganden, Wnt5a, i NCC og dens tilsvarende reseptor, ROR2, i myoblaster utført. Som forventet forstyrret knockdown av molekyler i både signalsending (Wnt5a i NCCs) og signalmottakende (ROR2 i myoblaster) celler uavhengig Wnt / PCP-relaterte aktincytoarkitektoniske endringer og hemmet myoblastmigrasjon. Det er viktig at fenotypisk redning med rekombinant Wnt5a bare ble observert i NCC-Wnt5a knockdown-tilstanden, som støtter en mekanisme der NCC-avledet Wnt5a aktiverer PCP-signalering i myoblaster gjennom ROR2-reseptorer. Disse resultatene er i samsvar med data fra musegenetiske studier som identifiserer Wnt5a-ROR2-aksen som en avgjørende Wnt/PCP-signalakse mellom NCC-er og SHF-celler under embryonal hjerteutvikling 3,21. Selv om det ikke er eksperimentelt testet i denne protokollen, er det fortsatt uklart om SHF-avledet Wnt5a gir gjensidige parakrine signaler til nevrale kammen gjennom ROR2-reseptorer. Denne hypotesen kan testes ved hjelp av denne protokollen ved å gjenta forsøkene med C2C12-celler på toppen og O9-1-celler på bunnen av brønninnsatskonstruksjonen. Hvis SHF-avledet Wnt5a gir et gjensidig parakrint signal gjennom NCC-ROR2, vil man forvente at knockdown av Wnt5a i C2C12-celler hemmer migrasjonskapasitet og aktinpolymerisering av de underliggende O9-1-cellene.
Det er flere unike styrker ved denne protokollen. For det første er det et ikke-kontakt brønninnsatssystem som inkorporerer sekvensiell bruk av sårhelingsanalyser og immunostaining-teknikker for å evaluere funksjonelle og molekylære Wnt / PCP-egenskaper i samme populasjon av signalmottaksceller. Dette gir ikke bare en robust tilnærming til fenotyping av ikke-kanonisk Wnt-indusert intracellulær filamentorganisasjon og polariserte migrasjonsendringer in vitro , men tillater også mer granulære vurderinger av signaltransduksjonsmekanismer. Selv om denne protokollen gir prinsippbevis angående Wnt5a-ROR2-molekyler, gir modellen seg også lett til å evaluere effekten av andre ligander og reseptorer i den ikke-kanoniske Wnt-signalveien. Man kan videre tilpasse immunostaining-protokollen for å evaluere uttrykket av flere potensielle nedstrøms effektorproteiner (f.eks. RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) som har vist seg å transdusere ikke-kanoniske Wnt-signaler in vivo. I tillegg kan proteinnivåer av disse forskjellige effektormolekylene korreleres med enten migrerende eller aktincytoarkitekturfenotyper. For det andre tillater kokultursystemets ikke-kontaktende natur uavhengig manipulering av spesifikke signalsende- versus signalmottaksmolekyler i Wnt / PCP-banen. I disse representative resultatene ble det valgt å utføre cellespesifikk siRNA-knockdown. Imidlertid er denne protokollen også egnet til bruk av farmakologiske hemmere eller genetisk modifiserte cellelinjer for å evaluere kandidatligand-reseptorveier for klinisk anvendelse. På samme måte kan man utføre fenotypiske redningseksperimenter ved å tilsette molekylære eller farmakologiske forbindelser til kokulturmediet, som vist med rekombinant Wnt5a. Målretting av disse forbindelsene for selektivt å redde signalsending versus signalmottaksforstyrrelser validerer ytterligere parakrine mekanistiske veier på måter som ikke er tillatt ved bruk av nåværende in vivo modellsystemer.
Det er mange kritiske trinn i denne protokollen. For det første er det viktig å sikre at primære celler utvides og opprettholdes ved riktig sammenløp gjennom protokollen. Hvis C2C12 myoblaster får lov til å spre seg til 100% sammenløp, vil de begynne å smelte sammen og skille fra myoblaster til myotuber. Derfor må disse cellene passeres med riktig tetthet som beskrevet. For det andre, gitt at STO-materceller er nødvendige for å generere betinget medium for å vokse O9-1-celler, er det viktig at man på riktig måte inaktiverer STO-celler med mitomycin C og lager tilstrekkelig (minst 500 ml) O9-1 vekstmedium ved bruk av inaktiverte STO-celler før tining og plating av O9-1-celler. Kanskje det mest kritiske trinnet i denne protokollen er generering av passende riper med jevn geometri og bredde i myoblastmonolaget32,33. Trinn 3.1.4 beskriver flere tips for å optimalisere denne delen av protokollen. Til tross for disse anbefalingene, bør det erkjennes at variabiliteten knyttet til standard 2D-skrapeanalyser fortsatt er en teknisk utfordring og en begrensning av denne protokollen. Derfor er det nødvendig å ha flere tekniske repliker av hver eksperimentell tilstand.
Til slutt, selv om resultatene som presenteres her ble generert ved hjelp av murine NCC og myoblaster, kan denne protokollen i prinsippet tilpasses for å inkludere enhver signalsendings- og signalmottakscelle av interesse. Som et resultat har dette systemet ikke bare applikasjoner for å fremme grunnleggende mekanismer for parakrin ikke-kanonisk Wnt-signalering i en rekke utviklingskontekster, men det kan også brukes til å teste terapeutiske mekanismer for Wnt / PCP-relaterte sykdomsprosesser. Eksempler er farmakologisk screening for legemidler som hemmer Wnt/PCP-indusert migrasjonskapasitet for maligne celler eller gjenoppretter retningsbestemt migrasjon av pasientavledede terminalcelletyper med defekt PCP-signalkapasitet ved baseline. Utover den ikke-kanoniske Wnt-signalveien, kan denne protokollen også tilpasses for å studere andre parakrine signalmekanismer og veier mellom to celletyper. For eksempel kan siRNA-mediert knockdown av kjente sekretoriske molekyler i andre veier (f.eks. Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) i O9-1-celler kombineres med immunostaining av proliferative, differensiering eller apoptotiske markører i underliggende myoblaster.
Avslutningsvis etablerer denne protokollen en ny og svært håndterbar eksperimentell protokoll for å studere mekanismer for ikke-kanonisk Wnt-relatert intracellulær filamentorganisasjon og polarisert migrasjon in vitro. Metodene beskrevet her forbedrer eksisterende teknikker ved å opprettholde den intercellulære og parakrine naturen til Wnt-interaksjoner og tillate uavhengig vurdering av signalsending versus signalmottakskomponenter i denne banen. Denne protokollen kan brukes bredt for å undersøke grunnleggende parakrine Wnt / PCP-signalmekanismer mellom to celletyper og skjerme for nye terapeutiske forbindelser rettet mot Wnt / PCP-relaterte sykdomsprosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH-tildelinger F30HL154324 til O.T. og K08HL121191 og R03HL154301 til S.R.K. Forfatterne vil gjerne erkjenne at skjemaet i figur 1 i dette manuskriptet ble opprettet med biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al.
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al.
