Summary
Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.
Abstract
Der nichtkanonische Wnt-Signalweg reguliert die intrazelluläre Aktinfilamentorganisation und die polarisierte Migration von Vorläuferzellen während der Embryogenese. Dieser Prozess erfordert komplexe und koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen. Da diese Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Linien auftreten können, kann die In-vivo-Bewertung zellspezifischer Defekte eine Herausforderung darstellen. Die vorliegende Studie beschreibt eine hochreproduzierbare Methode zur Bewertung der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro. Dieses Protokoll wurde mit der Fähigkeit entwickelt, (1) funktionelle und molekulare Bewertungen der nicht-kanonischen Wnt-Signalübertragung zwischen zwei beliebigen Zelltypen von Interesse durchzuführen; (2) die Rolle von signalsendenden versus signalempfangenden Molekülen im nicht-kanonischen Wnt-Signalweg analysieren; und (3) phänotypische Rettungsexperimente mit molekularen oder pharmakologischen Standardansätzen durchführen.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung in Myoblasten zu bewerten. Das Vorhandensein von NCCs ist mit einer erhöhten Anzahl von Phalloidin-positiven zytoplasmatischen Filopodien und Lamellipodien in Myoblasten und einer verbesserten Myoblastenmigration in einem Wundheilungstest verbunden. Die Wnt5a-ROR2-Achse wurde als entscheidender nichtkanonischer Wnt-Signalweg zwischen NCC- und Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen des zweiten Herzfelds (SHF) identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies ein sehr gut handhabbares Protokoll ist, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalmechanismen in vitro zu untersuchen.
Introduction
Der nichtkanonische Wnt-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der die zelluläre Filamentorganisation und die gerichtete Migration reguliert. Dieser Signalweg wurde an mehreren biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der embryonalen Gewebemorphogenese 1,2,3, der lymphatischen und vaskulären Angiogenese4,5,6,7 und des Krebswachstums und der Metastasierung 8,9,10 . Auf zellulärer Ebene wird die nichtkanonische Wnt-Signalisierung durch koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen durchgeführt. Diese Wechselwirkungen treten häufig zwischen Zellen verschiedener Linien oder Typen auf und umfassen ein vielfältiges molekulares Netzwerk, das bis zu 19 Liganden und mehrere Rezeptoren, Co-Rezeptoren und nachgeschaltete Signaltransduktionseffektoren umfasst11. Frühere Studien haben gezeigt, dass Liganden-Rezeptor-Kombinationen kontext- und gewebeabhängig variieren können 12,13 und dass dieselben Quellliganden, die die nichtkanonische Wnt-Signalisierung in signalempfangenden Zellen antreiben, von mehreren signalsendenden Zelltypen produziert werden können 14,15 . Angesichts der zellulären und molekularen Komplexität, die mit der nichtkanonischen Wnt-Signalgebung verbunden ist, war die Fähigkeit, individuelle und klinisch relevante Mechanismen in vivo zu untersuchen, begrenzt.
Es wurden Versuche unternommen, die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung mit Zellkulturtechniken in vitro zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Wundheilungsassays, die in zellulären Monoschichten durchgeführt wurden, verwendet, um die zelluläre gerichtete Migration funktionell zu beurteilen 4,16,17,18,19. Immunfärbungstechniken wurden verwendet, um räumliche Analysen der Oberflächenproteinexpression durchzuführen, um nicht-kanonische Wnt-induzierte Veränderungen in der zellulären Morphologie 7,10, Architektur und asymmetrischen Polarisation18,19,20 zu bewerten. Obwohl diese Ansätze wichtige Werkzeuge zur Charakterisierung von Wnt-bezogenen Phänotypen in Signalempfangszellen geliefert haben, schränkt das Fehlen von signalsendenden Komponenten in diesen Protokollen ihre Fähigkeit ein, parakrine Signalmechanismen, die in vivo beobachtet wurden, genau zu modellieren. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an der Entwicklung von In-vitro-Systemen, die eine robuste und reproduzierbare Bewertung parakriner Signalwechselwirkungen zwischen signalsendenden und empfangenden Zellen des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, insbesondere zwischen Zellen verschiedener Zelltypen, ermöglichen.
Zu diesem Zweck war das primäre Ziel dieser Studie, ein Protokoll zur Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu erstellen. Wir entwickelten ein berührungsloses Kokultursystem, das signalsendende und signalempfangende Komponenten dieser Interaktionen rekapituliert und die Verwendung molekularer, genetischer oder pharmakologischer Standardansätze ermöglicht, um spezifische Ligandenrezeptormechanismen im nichtkanonischen Wnt-Signalweg unabhängig voneinander zu untersuchen. Mechanismen der NCC-vermittelten Wnt-Signalübertragung wurden in Myoblasten mit etablierten murinen Zelllinien untersucht. Als Beweis des Prinzips wurde dieses Modell verwendet, um Ergebnisse früherer In-vivo-Studien an Mäusen zu bestätigen, die die Wnt5a-ROR2-Achse als relevanten nicht-kanonischen Wnt-Signalweg zwischen NCCs21 und SHF-Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen 3,22,23 implizieren.
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Protocol
1. Präexperimentelle Expansion und Passaging von Zellen
- C2C12-Zellkultur:
- Bereiten Sie 500 ml C2C12-Kulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin kombinieren.
- Eine Durchstechflasche mit C2C12-Zellen im 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Während die C2C12-Zellen auftauen, fügen Sie 5 ml C2C12-Medium zu einem 15-ml-konischen Röhrchen hinzu. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen sofort mit einer P1000-Pipette in das 15-ml-Röhrchen.
HINWEIS: C2C12-Zellen sind murine Myoblastenzellen, die zuvor als primäre Zelllinie zur Modellierung von Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen verwendet und validiert wurden. - Mischen Sie C2C12-Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette in das konische Röhrchen. Dann wird das gesamte Volumen der aufgetauten Zellen in C2C12-Medium (6 ml) in einen 75 cm2-Kolben gegeben.
- 6 ml frisches C2C12-Medium in den Kolben geben, um ein Gesamtvolumen von 12 ml zu erhalten. Drehen Sie den Kolben vorsichtig so, dass die Zelle und die Medienlösung den gesamten Boden des Kolbens bedecken. Der Kolben wird in einen Zellkulturinkubator (37 °C, 5%CO2) gegeben, damit die Zellen anhaften können.
- Lassen Sie die Zellen im Inkubator expandieren, bis sie ~ 60% Konfluenz erreichen.
HINWEIS: Dies kann bestimmt werden, indem die Zellen regelmäßig aus dem Inkubator entnommen und ihr Zusammenfluss schnell unter einem Mikroskop überprüft werden. Achten Sie darauf, die Zeit zu minimieren, in der Zellen aus dem Inkubator entfernt werden.
- Passieren von C2C12-Zellen:
- Erwärmen Sie das C2C12-Medium, 500 ml 1x PBS und 0,25% Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad. Nachdem die Reagenzien erwärmt wurden, werden alle Reagenzien in die Zellkulturhaube überführt.
- Bringen Sie den Kolben mit den C2C12-Zellen in die Zellkulturhaube. Spülen Sie den Kolben mit den C2C12-Zellen zweimal vorsichtig mit warmem 1x PBS ab.
- Neigen Sie den Kolben in einem Winkel von 45° und saugen Sie das C2C12-Medium mit einer Glaspipette ab, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Unter Beibehaltung eines 45°-Winkels geben Sie vorsichtig 10 ml warmes 1x PBS mit einer serologischen Pipette in die Ecke des Kolbens. Legen Sie den Kolben flach auf die Oberfläche und bewegen Sie den Kolben vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass der 1x PBS über die gesamte Monoschicht der Zellen gewaschen wird.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die C2C12-Monoschicht beim Ansaugen des Mediums nicht zu stören.
- Neigen Sie den Kolben in einem Winkel von 45° und saugen Sie das C2C12-Medium mit einer Glaspipette ab, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Unter Beibehaltung eines 45°-Winkels geben Sie vorsichtig 10 ml warmes 1x PBS mit einer serologischen Pipette in die Ecke des Kolbens. Legen Sie den Kolben flach auf die Oberfläche und bewegen Sie den Kolben vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass der 1x PBS über die gesamte Monoschicht der Zellen gewaschen wird.
- Entfernen Sie das 1x PBS nach dem zweiten Waschgang. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben geben, den Kolben wie oben beschrieben vorsichtig bewegen, damit sich die Trypsin-EDTA-Lösung über so viel Monoschicht wie möglich verteilen kann, und den Kolben für 2 min in den Inkubator stellen.
- Nach 2-minütiger Inkubation den Kolben aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig darauf klopfen, um die verbleibenden Zellen zu lösen.
- 9 ml C2C12-Medium mit einer serologischen Pipette in den Kolben geben, um das Trypsin abzuschrecken. Spülen Sie die Zellen mit der serologischen Pipette vorsichtig mit dem Medium ab und sammeln Sie die 10 ml trypsinisierte Zellsuspension. 10 mL der Zellsuspension in ein frisches 15 ml konisches Röhrchen geben und bei 100 × g für 5 min zentrifugieren.
- Bringen Sie das konische Rohr zur Zellkulturhaube zurück und entfernen Sie den Überstand mit einer Glaspipette, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Achten Sie beim Absaugen des Überstands darauf, das Zellpellet am Boden des konischen Röhrchens nicht zu stören. Lassen Sie dazu ~0,2 ml des Überstands in der konischen Röhre. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml frischem C2C12-Medium.
- Für zusätzliches Passaging wird 1 ml der resuspendierten Zellen in einen 75 cm2-Kolben gegeben. 11 ml C2C12-Medium mit einer serologischen Pipette in den Kolben geben und den Kolben in den Inkubator geben.
- STO-Zellkultur:
- Bereiten Sie das STO-Kulturmedium vor, indem Sie 500 ml DMEM mit 7% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 nM L-Glutamin herstellen.
- Bereiten Sie 0,1% Gelatine vor, indem Sie 0,5 g Gelatinepulver in eine Flasche mit 500 ml gewebetauglichem oder autoklaviertem Wasser geben. 7 ml 0,1%ige Gelatinelösung in einen 75 cm2-Kolben geben. Der Kolben wird so gedreht, dass die Gelatinelösung den gesamten Boden des Kolbens bedeckt. Lassen Sie den Kolben 30 min bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube inkubieren.
- Nach 30-minütiger Inkubation entfernen Sie die überschüssige Gelatine mit einer Pipette, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Lassen Sie die Kolben vor Gebrauch weitere 30 Minuten im Inkubator stehen.
- Eine Durchstechflasche mit STO-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Mit einer P1000-Pipette werden die aufgetauten Zellen sofort in ein 15-ml-konisches Röhrchen überführt, das 5 ml frisch zubereitetes STO-Kulturmedium enthält.
HINWEIS: STO-Zellen sind murine embryonale Fibroblasten, die routinemäßig als Feederzellen in Zellkulturprotokollen verwendet werden. - Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette in der konischen Röhre. Das gesamte Volumen (6 ml) der Zellen wird in einen mit Gelatine beschichteten 75 cm2-Kolben gegeben. Drehen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension gut am Boden des Kolbens verteilt ist.
- 6 ml frisches STO-Medium in den Kolben geben, um ein Gesamtvolumen von 12 ml zu erhalten. Drehen Sie den Kolben wie oben beschrieben, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium gut am Boden des Kolbens verteilt sind. Der Kolben wird in den 37 °C-Inkubator gestellt, damit die Zellen anhaften können. Lassen Sie die Zellen im Inkubator vermehren, bis sie ~ 60-70% Konfluenz erreichen.
- Übergeben von STO-Zellen:
- Warmes STO-Zellmedium, 1xPBS und 0,25% Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Der Kolben mit den STO-Zellen wird wie in Schritt 1.2.2.1 beschrieben zweimal mit warmem 1x PBS vorsichtig abgespült.
- 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA mit einer P1000-Pipette in den Kolben geben. Der Kolben wird für 5 min in den 37 °C-Inkubator gestellt.
- Nach 5 Minuten Inkubation den Kolben aus dem Inkubator nehmen. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um alle anhaftenden Zellen zu lösen.
- 9 ml STO-Medium in den Kolben geben, um das Trypsin abzuschrecken, und die 10 ml trypsinisierte Zellsuspension wie oben beschrieben auffangen. 10 mL der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen geben und bei 100 × g für 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml STO-Medium wie oben beschrieben. Für zusätzliches Passaging wird 1 ml der resuspendierten Zellen in einen 75 cm2-Kolben gegeben. Fügen Sie 11 ml STO-Medium hinzu, drehen Sie den Kolben, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und des Mediums entlang des Kolbenbodens zu gewährleisten, und legen Sie den Kolben in den Inkubator.
- Inaktive STO-Zellkultur und O9-1-Zell-Basalmediumpräparation:
- Bereiten Sie das Basalkulturmedium O9-1 der Zelle vor, indem Sie 500 ml DMEM mit 15% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin, 2 nM L-Glutamin, mindestens 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 1 nM Natriumpyruvat und 55 μM Beta-Mercaptoethanol mischen.
- Bereiten Sie Mitomycin-C-Lösung in 1x PBS in einer Konzentration von 0,5 mg / ml vor, indem Sie 4 ml 1x PBS direkt in eine Durchstechflasche mit Mitomycin C geben. Pipetten Sie die Lösung mehrmals mit einer P1000-Pipette. Um das Mitomycin C in 1x PBS weiter aufzulösen, stellen Sie die Durchstechflasche für 45 min bis 1 h auf einen Vortex-Mixer oder Tischwippen.
- Inaktivieren Sie die STO-Zellen, indem Sie die STO-Platten mit einer Endkonzentration von 0,01 mg/ml Mitomycin C behandeln, die dem Standard-STO-Medium zugesetzt werden. Legen Sie die STO-Platten für 2 Stunden in den Inkubator und achten Sie darauf, den Kolben mit Mitomycin C vor Licht zu schützen, indem die Zeit außerhalb des Inkubators minimiert wird. Nach der Behandlung mit Mitomycin die Zellen zweimal in 1x PBS waschen, wie in Schritt 1.2.2.1 beschrieben.
HINWEIS: Mitomycin C hemmt die Proliferation von STO-Zellen, so dass sie verwendet werden können, um konditioniertes Medium über mehrere Tage zu erzeugen, ohne im Kolben überkonfluent zu werden. - Nach dem Entfernen des 1x PBS 12 mL O9-1 Basalkulturmedium in die inaktivierten STO-Zellkulturen geben und 24 h inkubieren. Sammeln Sie das konditionierte, inaktivierte Basalkulturmedium STO + O9-1 und legen Sie es in 50 ml konische Röhrchen, die in Folie eingewickelt sind, um es vor Licht zu schützen.
- Geben Sie 12 ml frisches O9-1-Basalkulturmedium wie oben beschrieben zu den inaktivierten STO-Zellkulturen. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie alle 24 h frisches O9-1-Basalkulturmedium zu denselben Flanken geben, die die inaktivierten STO-Zellen enthalten.
HINWEIS: Nach der Behandlung mit Mitomycin C können sich die inaktivierten STO-Zellen nicht vermehren; Daher können die Kolben mit den inaktivierten STO-Zellen wiederverwendet werden, um konditioniertes Medium zu erzeugen. - Lagern Sie die folienumwickelten 50 mL konischen Röhrchen mit konditioniertem, inaktiviertem STO + O9-1 Basalkulturmedium bei 4 °C, bis insgesamt 500 mL des Mediums gesammelt wurden.
- O9-1 Zellkultur:
- Bereiten Sie das O9-1-Zellwachstumskulturmedium unter Verwendung von 500 ml konditioniertem STO + O9-1-Basalmedium vor und fügen Sie 103 Einheiten Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und 25 ng / ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Basis-FGF) hinzu.
- 0,1%ige mit Gelatine überzogene Kolben werden wie in den Schritten 1.3.2-1.3.3 beschrieben hergestellt.
- Eine Durchstechflasche mit O9-1-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Die aufgetauten Zellen werden sofort in ein 15 ml konisches Röhrchen überführt, das 5 ml frisch zubereitetes O9-1-Wachstumsmedium enthält.
HINWEIS: Die O9-1-Zelllinie ist die einzige stabile, multipotente Neuralleistenzelllinie, die aus der Maus erzeugt wurde. Diese Zelllinie wird häufig in Neuralleisten-In-vitro-Experimenten verwendet. - Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette. Die gesamten 6 ml Zellen in einen mit Gelatine beschichteten 75 cm2-Kolben geben.
- 6 ml O9-1-Wachstumsmedium in den Kolben geben, um ein Gesamtvolumen von 12 ml zu erhalten. Der Kolben wird in den 37 °C-Inkubator gestellt, damit die Zellen anhaften können. Lassen Sie die Zellen im Inkubator vermehren, bis sie ~ 60-70% Konfluenz erreichen.
- Passieren von O9-1-Zellen:
- Warmes O9-1-Wachstumsmedium, 1x PBS und 0,25% Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Spülen Sie die Platte mit O9-1-Zellen vorsichtig zweimal mit warmem 1x PBS aus, wie in Schritt 1.2.2.1 beschrieben.
- 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben geben und 5 min in den 37 °C Inkubator stellen.
- Nach 5 Minuten Inkubation den Kolben aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig auf den Kolben klopfen, um alle anhaftenden Zellen zu lösen.
- 9 ml O9-1-Wachstumsmedium in den Kolben geben, um das Trypsin zu löschen. Sammeln Sie 10 ml der trypsinisierten Zellsuspension und geben Sie 10 ml dieser Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 × g für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml O9-1-Wachstumsmedium. Für zusätzlichen Durchgang wird 1 ml der resuspendierten Zellen in einen 75 cm2-Kolben gegeben. 11 ml O9-1-Wachstumsmedium zugeben und den Kolben mit den Zellen in 12 ml Medium in den 37 °C-Inkubator geben.
2. Plattierung von Zellen in einem Kokultursystem
- Beschichtung von C2C12-Zellkammern:
- Nach der Trypsinisierung (wie in Schritt 1.2 beschrieben) wird das C2C12-Zellpellet in 10 ml C2C12-Medium resuspendiert. Die Zellen werden im Verhältnis 1:20 in C2C12-Medium verdünnt, indem Sie 0,5 ml der resuspendierten C2C12-Zellen entfernen und in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen mit 9,5 ml frischem C2C12-Medium geben. Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette.
- Fügen Sie 1 ml der 1:20-verdünnten C2C12-Zellen mit einer P1000-Pipette in jede Vertiefung einer neuen 4-Kammer-Vertiefung hinzu und legen Sie die 4-Kammer-Vertiefung in den Inkubator.
- Beschichtung von O9-1 Zelleinsätzen:
- Nach der Trypsinisierung resuspendieren Sie das O9-1-Zellpellet in 10 ml O9-1-Wachstumsmedium. Die Zellen werden im Verhältnis 1:20 in O9-1-Wachstumsmedium verdünnt, indem Sie 0,5 ml der resuspendierten C2C12-Zellen entfernen und in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen geben, das 9,5 ml frisches O9-1-Wachstumsmedium enthält. Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette.
- Platzieren Sie einen einzelnen durchlässigen Einsatz (siehe Materialtabelle) in jeder Vertiefung eines neuen 4-Kammer-Brunnens, der mit 1 ml O9-1-Wachstumsmedium gefüllt ist.
HINWEIS: Diese 4-Kammer-Vertiefung sollte sich von der mit den C2C12-Zellen aus Schritt 2.1.3 unterscheiden. - Fügen Sie 300 μL der verdünnten O9-1-Zellsuspension mit einer P1000-Pipette zu jedem Einsatz hinzu. Stellen Sie sicher, dass der Boden jedes Einsatzes in die Vertiefung eingetaucht ist, die mit 1,3 ml O9-1-Wachstumsmedium gefüllt ist. Stellen Sie den Brunnen in den 37 °C heißen Inkubator.
- (Optional). Führen Sie einen siRNA-Knockdown in den O9-1-Zellen oder C2C12-Zellen durch.
- Führen Sie einen Gen-Knockdown durch siRNA 18-24 h nach der Beschichtung von O9-1-Zellinserts oder C2C12-Zellkammertöpfen durch.
- Verdünnen Sie die siRNA und das Transfektionsreagenz in reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und den gewünschten Konzentrationen für das Experiment. Mischen Sie vorsichtig die verdünnte siRNA und das Transfektionsreagenz (1:1) und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 7 min.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 50 nM-Konzentrationen verwendet, da diese siRNA-Konzentration bestimmt wurde, um zu einem ausreichenden Knockdown der Zielgenexpression zu führen. - Fügen Sie die siRNA-Lipidkomplexe entweder zu den O9-1-Zelleinsätzen oder den C2C12-Zellkammertöpfen hinzu, wie durch das experimentelle Design bestimmt, und inkubieren Sie die Zellen mit den siRNA-Lipidkomplexen für ~36-48 h.
- Verdünnen Sie die siRNA und das Transfektionsreagenz in reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und den gewünschten Konzentrationen für das Experiment. Mischen Sie vorsichtig die verdünnte siRNA und das Transfektionsreagenz (1:1) und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 7 min.
- Führen Sie einen Gen-Knockdown durch siRNA 18-24 h nach der Beschichtung von O9-1-Zellinserts oder C2C12-Zellkammertöpfen durch.
3. Durchführung von Wundtests und quantitative Bewertung der Myoblastenmigration
- Wundtest:
- Lassen Sie die O9-1-Zelleinsätze und C2C12-Zellkammermulden im Inkubator haften und sich vermehren, bis beide Zellen ~ 70-80% Konfluenz aufweisen, bevor Sie mit diesem Teil des Protokolls fortfahren. Wenn Zellen zu >90% konfluierend wachsen, fahren Sie nicht mit dem Kratztest fort, da sich die Zellen lediglich vom Bohrloch lösen.
- 1x PBS und C2C12 medium erwärmen, indem Sie sie in ein 37 °C warmes Wasserbad geben.
- Überstehendes Medium aus der C2C12-Kammer gut entfernen und die Zellen einmal mit 1x PBS waschen. Entfernen Sie das 1x PBS und kratzen Sie die Zellen sofort mit einer sterilen P10-Pipettenspitze.
- Führen Sie die sterile P10-Pipettenspitze fest in eine Richtung, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen (z. B. von rechts nach links, von oben nach unten). Achten Sie darauf, jede Vertiefung, die Zellen enthält, nur einmal zu zerkratzen.
HINWEIS: Um die Kratzergebnisse zu optimieren, kratzen Sie Vertiefungen verschiedener experimenteller Bedingungen auf einem ähnlichen Konfluenzniveau. Stellen Sie dazu sicher, dass jede 4-Kammer-Vertiefung Zellen für jede erforderliche experimentelle Bedingung hat (z. B. Bohrloch # 1 Negativkontrolle, Bohrloch # 2 Positivkontrolle). Verwenden Sie außerdem für jeden Kratzer eine neue sterile P10-Pipette und üben Sie jedes Mal eine ähnliche Kraft auf die Pipette aus. Versuchen Sie nicht, mehr als einen Kratzer in jedem Vertiefung zu erzeugen. - Nach dem Kratzen schnell 1 ml 1x PBS mit einer P1000-Pipettenspitze wieder in die Vertiefung geben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Bohrloch, das zerkratzt wird.
HINWEIS: Angesichts der Variabilität, die mit jedem Kratzer verbunden ist, wird empfohlen, mehrere Vertiefungen (n = 3) für die Wundbildung in jedem experimentellen Zustand zu verwenden. Arbeiten Sie schnell, da es wichtig ist, die Dauer zu minimieren, für die die Zellen während dieser Schritte ohne 1x PBS sind. Nach dem Entfernen von 1x PBS aus jedem Well sollte man nicht mehr als 5 s benötigen, um in jedem Well eine Wunde zu erzeugen.
- Führen Sie die sterile P10-Pipettenspitze fest in eine Richtung, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen (z. B. von rechts nach links, von oben nach unten). Achten Sie darauf, jede Vertiefung, die Zellen enthält, nur einmal zu zerkratzen.
- Nachdem Sie eine Wunde erzeugt und 1x PBS wieder in jede Vertiefung gegeben haben, bilden Sie den Kratzer mit einem hellfeldinversen Mikroskop ab und verwenden Sie dieses Bild als Basisgröße der Wunde (Zeit 0). So nehmen Sie Bilder auf:
- Schalten Sie den Computer und das Mikroskop ein (siehe Materialtabelle), indem Sie den Netzschalter drücken. Platzieren Sie den Kammerschieber auf der Bühne und drehen Sie das Objektivrad auf 5-fache Vergrößerung.
- Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Materialtabelle), indem Sie auf das Softwaresymbol auf dem Computer-Desktop doppelklicken. Klicken Sie auf dem Startbildschirm der Software auf die Registerkarte Kamera . Klicken Sie auf die Schaltfläche Live , um die Zellen auf der Registerkarte AxioCam IC zu visualisieren.
- Stellen Sie sicher, dass der Lichtfilter ganz herausgezogen ist, damit Licht auf die Kamera und den Computerbildschirm gelangen kann. Bewegen und/oder drehen Sie den Kammerschieber manuell, um den Wundbereich in der Mitte des Livebildes auf der AxioCam IC-Lasche zu positionieren.
- Um Bilder aufzunehmen, klicken Sie auf Ausrichten , um eine neue Registerkarte neben der Registerkarte AxioCam IC zu öffnen, die das Bild enthält.
- Um dieses Standbild zu speichern, klicken Sie oben links auf der Software-Startseite auf Datei, | speichern unter, | geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein. Speichern Sie die Figur im Carl Zeiss-Bildformat (*.czi) (Standardeinstellung) und wählen Sie Desktop in der linken Leiste, um die Datei als CZI-Datei auf dem Desktop zu speichern, die nur im Softwareprogramm Zen lite 2012 geöffnet werden kann.
- Um das Bild als .tiff zu speichern, klicken Sie auf Datei | Speichern unter, | geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein. Speichern Sie die Abbildung als getaggte Bilddatei (*.tiff), indem Sie auf die Schaltfläche Dateityp klicken und *.tiff aus dem Dropdown-Menü auswählen.
HINWEIS: Das .tiff Format kann in jeder Bildbearbeitungssoftware geöffnet werden. - Positionieren Sie den Kammerschieber manuell, um 2-3 weitere Bilder an anderen Stellen der Wunde in derselben Vertiefung aufzunehmen.
HINWEIS: Insgesamt ergibt dies 3-4 nicht überlappende, stark vergrößerte Bilder der Wunde in jedem Brunnen.
- Entfernen Sie das 1x PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie 1 ml C2C12-Medium hinzu.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu aggressiv zu pipettieren, wenn Sie nach der Wundbildung Lösungen aus der Kammer entfernen oder hinzufügen, da sich dies dazu führen kann, dass sich Zellen von der Kammermulde lösen. Neigen Sie außerdem die Kammer gut, so dass das Absaugen und Wiedereinführen von Lösungen an den Ecken jeder Vertiefung erfolgen kann, um die Zerstörung der Zellmonoschicht zu minimieren. - Setzen Sie das Kokultursystem zusammen, indem Sie die Einsätze mit den O9-1-Zellen manuell in jede Vertiefung der Kammermulde legen. Drücken Sie die Einsätze vorsichtig in die Vertiefung, so dass der Boden des Inserts knapp über den darunter liegenden C2C12-Zellen sitzt. Geben Sie die Vertiefungskonstrukte in den Inkubator zurück.
HINWEIS: Lassen Sie nicht zu, dass die Unterseite des Einsatzes die darunter liegenden C2C12-Zellen physisch berührt und mechanisch stört. - Lassen Sie die Zellen insgesamt 9-12 h wandern. Um die optimale Migrationszeit zu bestimmen, überprüfen Sie die Zellen 6 h nach der Wundbildung, danach alle 2-3 Stunden. Beenden Sie das Experiment, wenn die Zellen unter Kontroll- oder Positivkontrollbedingungen beginnen, die Wunde vollständig zu bedecken.
HINWEIS: Aufgrund der berührungslosen Natur des Konstrukts muss der darüber liegende Einsatz nicht aus den Vertiefungen entfernt werden, wenn der Verlauf der Intervallmigration überprüft wird. Die Migrationsvariabilität wird in Abhängigkeit von Faktoren wie den in diesem Assay verwendeten Zelltypen, der Zelldichte zum Zeitpunkt der Wundbildung, der Breite der erzeugten Wunde und den experimentellen Bedingungen manipulierter Zellen (z. B. Gen-Knockdown, rekombinante Proteinaddition) beobachtet. Die Konzentrationen dieser Reagenzien sollten experimentell unter Anleitung der Herstellerempfehlungen bestimmt werden.
4. Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung wandernder Myoblasten
- Beendigung des Migrationstests und Dekonstruktion des Bohrlocheinfügesystems:
- Entfernen Sie die O9-1-Zelleinsätze nach einer Migrationsperiode von 9-12 h (oder einer alternativen Zeit, die durch experimentelle Bedingungen bestimmt wird). Saugen Sie das C2C12-Medium vorsichtig mit einer P1000-Pipette ab. Fügen Sie 0,5 ml 1x PBS in die Kammermulden hinzu und machen Sie endgültige Bilder der Zellen nach der Migration.
- Saugen Sie vorsichtig alle 0,5 ml 1x PBS gemischt mit Medium ab und entfernen Sie die Kunststoffkammern aus den Kammertöpfen unter Verwendung der Kit-Anweisungen, wobei der darunter liegende Objektträger die C2C12-Zellen enthält.
HINWEIS: Achten Sie darauf, die C2C12-Zellen, die am Objektträger haften, nicht zu stören, wenn Sie die Kammermulden entfernen.
- Durchführung der Immunfärbung:
- Legen Sie den Objektträger sofort in einen Objektträgerhalter mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie die 4% PFA aus und geben Sie 0,1% Triton X-100-enthaltende 1x PBS (1x PBST) in den Objektträgerhalter, um den Objektträger 15 Minuten bei Raumtemperatur zu waschen. Gießen Sie das 1x PBST aus und geben Sie 1x PBS in den Diahalter, um das Dia 10 min bei Raumtemperatur zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal für insgesamt zwei 1x PBS-Wäschen.
- Entfernen Sie das Dia aus dem Diahalter. Zeichnen Sie die äußeren Kanten des Objektträgers mit einem hydrophoben Stift nach, um eine hydrophobe Grenze um den Objektträger zu erstellen, um zu verhindern, dass Lösungen vom Objektträger verschüttet werden. Achten Sie darauf, die adhärenten Zellen nicht zu stören.
- Geben Sie 1% Rinderserumalbumin (BSA) blockierende Lösung (verdünnt in 1x PBS) zum Objektträger (~ 0,5 ml pro Objektträger). Stellen Sie sicher, dass die Lösung innerhalb der in Schritt 4.2.4 erstellten hydrophoben Grenze enthalten ist. Inkubieren Sie den Objektträger für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Objektträgerkammer.
HINWEIS: Obwohl eine BSA-Blockierung für die Phalloidin-Immunfärbung nicht erforderlich ist, ermöglicht dieser Schritt im Protokoll die Kopplung mit der Fluoreszenz-Antikörperfärbung. - Nach dem Blockieren für 1 h gießen Sie die blockierende Lösung aus dem Objektträger, geben Phalloidin-Antikörper (verdünnt auf 1:200 in 1% BSA-Blockierungslösung durch Zugabe von 5 μL des Antikörpers zu 995 μL BSA-Lösung) zum Objektträger und inkubieren bei 4 °C über Nacht. Stellen Sie erneut sicher, dass die Lösung innerhalb der in Schritt 4.2.4 erstellten hydrophoben Grenze enthalten ist. Da der Phalloidin-Antikörper mit Alexa Fluor-488-Farbstoff konjugiert ist, minimieren Sie die Lichtexposition des Antikörperreagenzes vor und nach dem Hinzufügen zum Objektträger.
- Am nächsten Tag legen Sie das Dia in einen Diahalter, der vor Lichteinwirkung geschützt ist (z. B. wickeln Sie den Diahalter in Folie ein oder verwenden Sie einen undurchsichtigen Diahalter). Waschen Sie die Zellen im Objektträgerhalter mit 1x PBS für 10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt drei 10-minütige Wäschen.
- Fügen Sie ein 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-haltiges Montagemedium hinzu und montieren Sie die Objektträger mit Glasdeckgläsern. Stellen Sie die Zellen, die migriert sind, mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop ab.
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Representative Results
Auswirkungen von NCCs auf die Migrationsfähigkeit von murinen Myoblasten
Dieser Assay wurde zuerst angewendet, um den Einfluss von NCCs auf die Migrationskapazität von Myoblasten zu bewerten. Abbildung 1 zeigt das schematische Modell des Assays. Um diese Wirkung zu testen, wurden Kratztests mit Myoblasten durchgeführt, die isoliert (ohne NCC-Einsätze) im Vergleich zu denen in Gegenwart von Einsätzen gezüchtet wurden. Als Positivkontrolle wurden 500 ng/mL rekombinantes Wnt5a (rWnt5a) in Kammervertiefungen mit NCC-Einsätzen gegeben. Diese Konzentration von rWnt5a wurde durch eine Dosis-Wirkungs-Analyse in C2C12-Zellen bestimmt (ergänzende Abbildung S1). Repräsentative Bilder von NCC-Einsätzen sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt, die zeigen, dass die NCCs zu diesem Zeitpunkt gesund sind. Die Immunfluoreszenz zeigt einen robusten Knockdown von Wnt5a auf Proteinebene nach Inkubation mit 50 nM Wnt5a siRNA (ergänzende Abbildung S3). Nach einer 9-stündigen Migrationsperiode wurde festgestellt, dass das Vorhandensein von NCCs die Migrationskapazität von Myoblasten im Vergleich zu Myoblasten, die ohne NCC-Inserts untersucht wurden, signifikant erhöhte (72,6% verwundetes wiederbesiedeltes Gebiet vs. 59,1% verwundetes wiederbesiedeltes Gebiet, p = 0,033). Die Zugabe von rWnt5a zu Kokulturbohrungen beschleunigte die Myoblastenmigration, wobei einige Wundbereiche eine vollständige Erholung bis zum 9-Stunden-Zeitpunkt zeigten, wie in Abbildung 2 gezeigt. Wie erwartet, zeigten wandernde Myoblasten unter allen drei Bedingungen eine normale wandernde Zellmorphologie, einschließlich gut geformter und hervorstehender Filopodien und Lamellopodien und asymmetrischer Polarisation von Aktin-Zytoskelettprojektionen (Abbildung 2C).
Bedeutung von NCC-abgeleitetem Wnt5a für polarisierte Migration von Myoblasten
Um die parakrine Wirkung von NCC-abgeleitetem Wnt5a auf die Myoblastenmigration zu bewerten, wurden Wundheilungstests in Myoblasten nach dem siRNA-vermittelten Knockdown von Wnt5a in NCCs durchgeführt. Zunächst wurde die Wnt5a-Knockdown-Effizienz in NCCs durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion in Echtzeit validiert. Es wurde festgestellt, dass die Behandlung mit 50 nM siRNA gegen Wnt5a die Wnt5a-Genexpression um 64% im Vergleich zu negativer (verschlüsselter) siRNA reduziert (Abbildung 3A). Unter Verwendung dieser Konzentration wurden O9-1-Zellinserts entweder mit Kontroll-siRNA oder Wnt5a siRNA 48 h vor dem Aufbau der Kokultur transfiziert. C2C12-Zellen wurden unter normalen Bedingungen gezüchtet, und Wunden wurden am entsprechenden Zusammenfluss gebildet. Unmittelbar nach der Wundgenerierung wurden jedem Bohrloch Negativkontroll- oder Wnt5a-Knockdown-NCC-Einsätze hinzugefügt. Nach einer 10-stündigen Migrationsperiode wurde festgestellt, dass der Knockdown von Wnt5a in NCCs die zugrunde liegende Myoblasten-Migrationskapazität im Vergleich zu Myoblasten, die mit Kontroll-NCCs untersucht wurden, signifikant reduzierte (39,1% verwundetes wiederbesiedeltes Gebiet vs. 74,8% verwundetes wiederbesiedeltes Gebiet, p < 0,001). Darüber hinaus zeigten Myoblasten, die in Gegenwart von NCCs mit Knockdown von Wnt5a untersucht wurden, eine abnormale zytologische Morphologie durch Immunfärbung, einschließlich reduzierter zytoplasmatischer Bereiche und weniger Aktin-Zytoskelettprojektionen (Abbildung 3D). Um die Myoblastenmigration zu retten, wurde eine exogene Supplementierung von 500 ng/ml rWnt5a zu Kokulturbrunnen hinzugefügt, die Wnt5a-Knockdown-Einsätze enthielten. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von exogenem rWnt5a wandernde und morphologische Defekte, die in diesen Myoblasten beobachtet wurden, vollständig rettet (Abbildung 3C,D).
Wnt5a-Signalisierung durch ROR2 in Myoblasten als Treiber polarisierter Migration
Um die signalempfangenden Zellmechanismen in diesem parakrinen Modell besser zu verstehen, wurde der Assay nach dem Knockdown des ROR2-Rezeptors in Myoblasten wiederholt. In diesem Experiment wurden Myoblasten vor der Wundbildung mit 50 nM ROR2 siRNA ~40 h transfiziert, was sich als ausreichend erwies, um die ROR2-Genexpression um 54% zu senken (Abbildung 4A). Während dieser Zeit wurden NCC-Einsätze unter normalen Bedingungen parallel angebaut. Nachdem die Myoblasten eine geeignete Konfluenz erreicht hatten, wurden Kratztests durchgeführt und Kokulturbrunneneinsätze zusammengestellt. Nach einer 10-stündigen Migrationsperiode in Gegenwart von NCC-Inserts zeigten ROR2-Knockdown-Myoblasten eine reduzierte Migrationskapazität im Vergleich zu Myoblasten, die mit negativer Kontroll-siRNA behandelt wurden (48,1% Wund-wiederbesiedeltes Gebiet vs. 75,7% Wund-wiederbesiedeltes Gebiet, p = 0,019) (Abbildung 4B,C). Die Zugabe von 500 ng/ml rWnt5a konnte die Migrationskapazität der Myoblasten nach dem ROR2-Knockdown nicht retten, was darauf hindeutet, dass die ROR2-Erschöpfung die Fähigkeit von Myoblasten stört, Wnt5a-Signale zu empfangen (Abbildung 4B,C). Die Immunfärbung für Phalloidin bestätigte die Migrationsdaten und zeigte, dass eine Reduktion der Phalloidin-positiven Lamellopodien und Filopodien in ROR2-Knockdown-Myoblasten durch supplementale rWnt5a nicht wiederhergestellt wurde (Abbildung 4D).
Abbildung 1: Schematisches Modell des Assays. Schritt 1 umfasst die in vitro Expansion von C2C12-Myoblasten und NCCs unter Verwendung von STO-Feederzellen. Schritt 2 beinhaltet die Beschichtung von NCCs und C2C12-Zellen im Kokultursystem. Schritt 3 umfasst den Wundtest, der in darunter liegenden C2C12-Zellen durchgeführt wird, um die zelluläre Migrationskapazität zu bewerten. Schritt 4 beinhaltet die Immunfärbung für Phalloidin, um die zytologische Architektur und Morphologie migrierter Zellen zu bewerten. Abkürzungen: NCCs = Neuralleistenzellen; Ab = Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Das Vorhandensein von Neuralleistenzellen erhöht die Migrationskapazität der Myoblasten. (A) Das Vorhandensein von Neuralleistenzellen (NCC) zum Zeitpunkt der Wundbildung führt zu einer verbesserten Myoblastenmigration. Die Zugabe von exogenem rekombinantem Wnt5a (rWnt5a) zu NCC-C2C12-Kokulturen hat den stärksten positiven Effekt auf die Myoblastenmigration. (B) Quantifizierung des durchschnittlichen Myoblasten-Wiederbesiedlungsgebiets um 9 h nach Wundbildung (Fehlerbalken zeigen Standardabweichung). (C) Phalloidin-Färbung von Myoblasten an der Wundgrenze 9 h nach Wundbildung. Gestrichelte Rechtecke zeigen Phalloidin-gefärbte Myoblasten an der Migrationsfront. Für jede in B quantifizierte Versuchsbedingung wurden insgesamt n = 3 Proben verwendet. Maßstabsbalken = 200 μm (für A und C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Neuralleistenzell-abgeleitetes Wnt5a ist für die Migration von Myoblasten notwendig. (A) Relative mRNA-Expression von Wnt5a zur Validierung des siRNA-vermittelten Knockdowns in NCCs. (B) Die Migration von C2C12-Myoblasten ist nach Wnt5a-Knockdown in NCCs signifikant reduziert. Die Zugabe von exogenem rWnt5a reicht aus, um dieses Migrationsdefizit in Myoblasten zu retten. (C) Quantifizierung des durchschnittlichen Myoblasten-wiederbesiedelten Gebiets nach 10 h nach Wundbildung (Fehlerbalken zeigen Standardabweichung). (D) Phalloidin-Färbung von Myoblasten an der Wundgrenze 10 h nach der Wundbildung. Gestrichelte Rechtecke zeigen Phalloidin-gefärbte Myoblasten an der Migrationsfront. Für jede in C quantifizierte Versuchsbedingung wurden insgesamt n = 3 Proben verwendet. Maßstabsbalken = 200 μm (für B und D). Abkürzungen: NCCs = Neuralleistenzellen; siRNA = small interfering RNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Wnt5a-Signale durch ROR2-Rezeptoren in Myoblasten, um die Migration voranzutreiben. (A) Relative mRNA-Expression von ROR2 zur Validierung des siRNA-vermittelten Knockdowns in C2C12-Zellen. (B) Der Knockdown von ROR2 in Myoblasten reduziert ihre Migrationskapazität trotz des Vorhandenseins von NCCs. Exogenes rWnt5a kann die Myoblastenmigration nach ROR2-Knockdown nicht retten. (C) Quantifizierung des durchschnittlichen Myoblasten-wiederbesiedelten Gebiets nach 10 h nach Wundbildung (Fehlerbalken zeigen Standardabweichung). (D) Phalloidin-Färbung von Myoblasten an der Wundgrenze 10 h nach der Wundbildung. Gestrichelte Rechtecke zeigen Phalloidin-gefärbte Myoblasten an der Migrationsfront. Für jede in C quantifizierte Versuchsbedingung wurden insgesamt n = 3 Proben verwendet. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzungen: NCCs = Neuralleistenzellen; siRNA = small interfering RNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung S1: Dosisabhängige Analyse für rekombinante Wnt5a-Supplementierung. Die dosisabhängige Analyse für rekombinante Wnt5a-Supplementierungstests von 0 ng/ml, 100 ng/ml und 500 ng/ml ergab, dass 500 ng/ml exogenes rWnt5a die optimale Konzentration sind, um die Myoblastenmigration und die zytoarchitektonischen Veränderungen des Phalloidins während einer 12-stündigen Migrationsperiode in vitro voranzutreiben. Maßstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Repräsentative Bilder von Bohrlocheinsätzen. Hellfeldbilder von Well-Inserts, die O9-1-Neuralleistenzellen enthalten, die mit (A) 50 nM negativer Kontroll-siRNA und (B) 50 nM Wnt5a siRNA behandelt wurden. Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: siRNA = small interfering RNA. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Repräsentative Bilder der Wnt5a-Proteinexpression in O9-1-Zellen nach siRNA-vermitteltem Wnt5a-Knockdown. Immunfluoreszenzfärbung des Wnt5a-Proteins in Zellkulturtöpfen, die O9-1-Neuralleistenzellen enthalten, die mit (A) 50 nM negativer siRNA und (B) 50 nM Wnt5a siRNA behandelt wurden. Maßstabsbalken = 20 μM. Abkürzungen: siRNA = small interfering RNA; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der nichtkanonische Wnt/Planarzellpolaritäts-Signalweg (PCP) ist ein kritisch wichtiger zellulärer Signalweg, der an multiplen Entwicklungsprozessen 24,25 und Krankheitsprozessen 24,26 beteiligt ist. Während der embryonalen Entwicklung beinhaltet die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung ein ausgedehntes Netzwerk molekularer Signale von signalsendenden Zellen, die letztendlich Veränderungen in der Morphologie, asymmetrischen Organisation und gerichteten Migration in Signalempfangszellen induzieren11. Frühere Studien haben gezeigt, dass die spezifischen Ligandenrezeptorwege, die diese Signalübertragung antreiben, vielfältig und kontextabhängig sind und oft zwischen den Zelltypenvariieren 12,13,14,15. Aufgrund dieser molekularen Komplexität war die Fähigkeit, parakrine nichtkanonische Wnt-Signalwechselwirkungen mit konventionellen genetischen Rekombinationsmethoden in vivo zu bewerten, begrenzt. Während In-vitro-Systeme zunehmend als alternativer Ansatz zur Untersuchung nicht-kanonischer Wnt-Zellphänotypen verwendet wurden, konzentrieren sich die verfügbaren Protokolle ausschließlich auf nachgeschaltete Signalempfangsaspekte des Signalwegs und modellieren die interzelluläre und parakrine Natur dieser Signalereignisse nicht ausreichend. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, ein Protokoll für ein berührungsloses Kokultursystem zu entwickeln, das parakrine Wnt-Interaktionen in vitro rekapituliert. Der Schwerpunkt dieses Protokolls lag auf der Modellierung von zwei charakteristischen Aspekten der funktionellen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro, einschließlich der Organisation intrazellulärer Filamentproteine und polarisierter Migrationskapazität.
Als Proof of Concept wurde dieses Protokoll angewendet, um parakrine Mechanismen im Kontext der Herzentwicklung zu untersuchen. Während der Kardiogenese sind reziproke Signalereignisse zwischen kardialen NCCs und SHF-Vorläuferzellen entscheidend für die entsprechende Reifung des kardialen Ausflusstraktes (OFT)27,28,29. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass während der Herzentwicklung der Maus eine NCC-vermittelte Wnt/PCP-Signalisierung in pharyngealen SHF-Zellen für den Einbau von SHF-Vorläuferzellen in die sich entwickelnde OFT und für die normale OFT-Ausrichtung erforderlich ist21. Schleiffarth et al. und andere haben gezeigt, dass der genetische Knockout des Gens, das für den Wnt/PCP-Liganden Wnt/PCP-Liganden Wnt5 kodiert, nachweislich die Organisation und Migrationsfähigkeit der SHF-Vorläuferzellen stört, was zu einem verkürzten und falsch ausgerichteten kardialen OFT22,23,30 führt. Mit etablierten murinen NCC (O9-1)31 und Myoblasten (C2C12) Zelllinien zeigt dieses Protokoll, dass die Kokultur mit NCCs mit erhöhten Phalloidin-positiven zytoplasmatischen Filopodien und Lamellipodien assoziiert ist und die Migrationskapazität von Myoblasten in einem Wundheilungsassay verbessert. Diese molekularen und funktionellen Endpunkte in vitro bauen auf zuvor veröffentlichten Protokollen für die NCC-Manipulation31 auf und modellieren genau die in vivo phänotypischen Veränderungen, die in Wnt5a global knockout mice beschrieben wurden, was den Nutzen dieses Modells bestätigt.
Um den spezifischen molekularen Signalweg zu bestimmen, der die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung zwischen NCCs und Myoblasten antreibt, wurden parallele zellspezifische Knockdown-Experimente für die Gene durchgeführt, die für den Kandidatenliganden Wnt5a in NCCs und den entsprechenden Rezeptor ROR2 in Myoblasten kodieren. Wie erwartet, hat der Knockdown von Molekülen sowohl in signalsendenden (Wnt5a in NCCs) als auch in signalempfangenden (ROR2 in Myoblasten) Zellen unabhängig voneinander Wnt/PCP-assoziierte Aktin-zytoarchitektonische Veränderungen gestört und die Myoblastenmigration gehemmt. Wichtig ist, dass eine phänotypische Rettung mit rekombinantem Wnt5a nur in der NCC-Wnt5a-Knockdown-Bedingung beobachtet wurde, die einen Mechanismus unterstützt, bei dem NCC-abgeleitetes Wnt5a die PCP-Signalisierung in Myoblasten durch ROR2-Rezeptoren aktiviert. Diese Ergebnisse stimmen mit Daten aus genetischen Studien der Maus überein, die die Wnt5a-ROR2-Achse als entscheidende Wnt/PCP-Signalachse zwischen NCCs und SHF-Zellen während der embryonalen Herzentwicklung identifizieren 3,21. Obwohl in diesem Protokoll nicht experimentell getestet, bleibt unklar, ob SHF-abgeleitetes Wnt5a über ROR2-Rezeptoren reziproke parakrine Signale an die Neuralleiste liefert. Diese Hypothese könnte mit diesem Protokoll getestet werden, indem die Experimente mit C2C12-Zellen auf der Oberseite und O9-1-Zellen auf der Unterseite des Bohrloch-Insert-Konstrukts wiederholt werden. Wenn SHF-abgeleitetes Wnt5a ein reziprokes parakrines Signal durch NCC-ROR2 liefert, dann würde man erwarten, dass der Knockdown von Wnt5a in C2C12-Zellen die Migrationskapazität und die Aktinpolymerisation der darunter liegenden O9-1-Zellen hemmt.
Es gibt mehrere einzigartige Stärken dieses Protokolls. Erstens handelt es sich um ein berührungsloses Well-Insert-System, das den sequentiellen Einsatz von Wundheilungsassays und Immunfärbungstechniken zur Bewertung funktioneller und molekularer Wnt/PCP-Eigenschaften in derselben Population von Signalempfangszellen beinhaltet. Dies bietet nicht nur einen robusten Ansatz zur Phänotypisierung nicht-kanonischer Wnt-induzierter intrazellulärer Filamentorganisation und polarisierter Migrationsänderungen in vitro , sondern ermöglicht auch granularere Bewertungen von Signaltransduktionsmechanismen. Während dieses Protokoll einen prinzipiellen Beweis für Wnt5a-ROR2-Moleküle liefert, eignet sich das Modell auch leicht für die Bewertung der Auswirkungen anderer Liganden und Rezeptoren im nicht-kanonischen Wnt-Signalweg. Man kann das Immunfärbungsprotokoll weiter anpassen, um die Expression mehrerer potenzieller nachgeschalteter Effektorproteine (z. B. RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) zu bewerten, von denen gezeigt wurde, dass sie nicht-kanonische Wnt-Signale in vivo transduzieren. Darüber hinaus können Proteinspiegel dieser verschiedenen Effektormoleküle entweder mit Migrations- oder Aktin-Zytoarchitektur-Phänotypen korreliert werden. Zweitens ermöglicht die berührungslose Natur des Kokultursystems die unabhängige Manipulation spezifischer signalsendender gegenüber signalempfangender Moleküle im Wnt/PCP-Signalweg. In diesen repräsentativen Ergebnissen wurde entschieden, einen zellspezifischen siRNA-Knockdown durchzuführen. Dieses Protokoll ist jedoch auch für die Verwendung von pharmakologischen Inhibitoren oder genetisch veränderten Zelllinien geeignet, um mögliche Ligandenrezeptorwege für die klinische Anwendung zu bewerten. In ähnlicher Weise kann man phänotypische Rettungsexperimente durchführen, indem man dem Kokulturmedium molekulare oder pharmakologische Verbindungen hinzufügt, wie mit rekombinantem Wnt5a gezeigt wurde. Das Targeting dieser Verbindungen zur selektiven Rettung von Signalsende- gegenüber Signalempfangsstörungen validiert parakrine mechanistische Signalwege auf eine Weise, die mit aktuellen In-vivo-Modellsystemen nicht zulässig ist.
Es gibt viele kritische Schritte dieses Protokolls. Erstens ist es wichtig sicherzustellen, dass Primärzellen während des gesamten Protokolls erweitert und am richtigen Zusammenfluss gehalten werden. Wenn C2C12-Myoblasten zu 100% Konfluenz vermehren können, beginnen sie zu verschmelzen und sich von Myoblasten zu Myotuben zu differenzieren. Daher müssen diese Zellen wie beschrieben mit der entsprechenden Dichte durchgelassen werden. Zweitens, da STO-Feeder-Zellen benötigt werden, um konditioniertes Medium zu erzeugen, um O9-1-Zellen zu züchten, ist es unerlässlich, dass man STO-Zellen mit Mitomycin C angemessen inaktiviert und ausreichend (mindestens 500 ml) O9-1-Wachstumsmedium unter Verwendung inaktivierter STO-Zellen vor dem Auftauen und Plattieren von O9-1-Zellen herstellt. Der vielleicht kritischste Schritt in diesem Protokoll ist die Erzeugung geeigneter Kratzer mit einheitlicher Geometrie und Breite in der Myoblasten-Monoschicht32,33. Schritt 3.1.4 enthält einige Tipps zur Optimierung dieses Teils des Protokolls. Trotz dieser Empfehlungen sollte anerkannt werden, dass die Variabilität, die mit Standard-2D-Kratztests verbunden ist, eine technische Herausforderung und eine Einschränkung dieses Protokolls darstellt. Daher ist es notwendig, mehrere technische Replikationen jeder experimentellen Bedingung zu haben.
Obwohl die hier vorgestellten Ergebnisse mit murinen NCCs und Myoblasten generiert wurden, kann dieses Protokoll prinzipiell angepasst werden, um jede signalsendende und signalempfangende Zelle von Interesse einzubeziehen. Infolgedessen hat dieses System nicht nur Anwendungen, um grundlegende Mechanismen der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalisierung in einer Vielzahl von Entwicklungskontexten voranzutreiben, sondern es kann auch verwendet werden, um therapeutische Mechanismen für Wnt / PCP-bezogene Krankheitsprozesse zu testen. Beispiele sind das pharmakologische Screening auf Medikamente, die die Wnt/PCP-induzierte Migrationskapazität bösartiger Zellen hemmen oder die gerichtete Migration von patientenabgeleiteten terminalen Zelltypen mit defekter PCP-Signalkapazität zu Studienbeginn wiederherstellen. Über den nichtkanonischen Wnt-Signalweg hinaus kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um andere parakrine Signalmechanismen und Signalwege zwischen zwei Zelltypen zu untersuchen. Zum Beispiel kann siRNA-vermittelter Knockdown von bekannten sekretorischen Molekülen in anderen Signalwegen (z. B. Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) in O9-1-Zellen mit einer Immunfärbung von proliferativen, differenzierenden oder apoptotischen Markern in darunter liegenden Myoblasten gekoppelt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein neuartiges und hochgradig handhabbares experimentelles Protokoll zur Untersuchung von Mechanismen der nichtkanonischen Wnt-bezogenen intrazellulären Filamentorganisation und polarisierten Migration in vitro etabliert. Die hier beschriebenen Methoden verbessern bestehende Techniken, indem sie die interzelluläre und parakrine Natur der Wnt-Interaktionen beibehalten und die unabhängige Bewertung von signalsendenden versus signalempfangenden Komponenten dieses Signalwegs ermöglichen. Dieses Protokoll kann breit angewendet werden, um grundlegende parakrine Wnt/PCP-Signalmechanismen zwischen zwei Zelltypen zu untersuchen und nach neuen therapeutischen Verbindungen zu suchen, die auf Wnt/PCP-bezogene Krankheitsprozesse abzielen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Auszeichnungen F30HL154324 an O.T. und K08HL121191 und R03HL154301 an S.R.K. unterstützt. Die Autoren möchten anerkennen, dass das Schema in Abbildung 1 in diesem Manuskript mit biorender.com erstellt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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