Summary
Bu çalışma, in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal olaylarını incelemek için oldukça tekrarlanabilir ve izlenebilir bir yöntemi özetlemektedir. Bu protokol, parakrin Wnt5a sinyallemesinin murin nöral krest hücrelerinde ve miyoblastlarda etkisini değerlendirmek için uygulandı.
Abstract
Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu, embriyogenez sırasında hücre içi aktin filament organizasyonunu ve progenitör hücrelerin polarize göçünü düzenler. Bu süreç, sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasında karmaşık ve koordineli parakrin etkileşimler gerektirir. Bu etkileşimlerin farklı soylardan çeşitli hücre tipleri arasında meydana gelebileceği göz önüne alındığında, hücreye özgü kusurların in vivo değerlendirilmesi zor olabilir. Bu çalışmada in vitro parakrin kanonik olmayan Wnt sinyallemesini değerlendirmek için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, (1) ilgilenilen herhangi iki hücre tipi arasında kanonik olmayan Wnt sinyallemesinin fonksiyonel ve moleküler değerlendirmelerini yapma yeteneği ile tasarlanmıştır; (2) kanonik olmayan Wnt sinyal yolundaki sinyal gönderen ve sinyal alan moleküllerin rolünü incelemek; ve (3) standart moleküler veya farmakolojik yaklaşımlarla fenotipik kurtarma deneyleri yapmak.
Bu protokol, miyoblastlarda nöral krest hücresi (NCC) aracılı kanonik olmayan Wnt sinyallemesini değerlendirmek için kullanıldı. NCC'lerin varlığı, miyoblastlarda artan sayıda faloidin-pozitif sitoplazmik filopodi ve lamellipodi ve yara iyileştirici bir tahlilde miyoblast göçünün artmasıyla ilişkilidir. Wnt5a-ROR2 ekseni, NCC ve ikinci kalp alanı (SHF) kardiyomiyoblast progenitörleri arasında çok önemli bir kanonik olmayan Wnt sinyal yolu olarak tanımlandı. Sonuç olarak, bu parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal mekanizmalarını in vitro olarak incelemek için oldukça uzun süreli bir protokoldür.
Introduction
Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu, hücresel filament organizasyonunu ve yönlü göçü düzenleyen evrimsel olarak korunmuş bir yoldur. Bu yolak, embriyonik doku morfogenezi 1,2,3, lenfatik ve vasküler anjiyogenez 4,5,6,7 ve kanser büyümesi ve metastazı 8,9,10 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte rol oynamıştır. . Hücresel düzeyde, kanonik olmayan Wnt sinyali, sinyal gönderen ve sinyal alan hücreler arasındaki koordineli parakrin etkileşimler yoluyla gerçekleştirilir. Bu etkileşimler sıklıkla farklı soylardan veya tiplerden hücreler arasında meydana gelir ve 19 ligand'a kadar ve çoklu reseptörler, ko-reseptörler ve aşağı akış sinyal iletim efektörleri11'i içeren çeşitli bir moleküler ağı içerir. Bu sinyalleme sürecini daha da karmaşıklaştıran önceki çalışmalar, ligand-reseptör kombinasyonlarının bağlam ve dokuya bağımlı bir şekilde değişebileceğini göstermiştir 12,13 ve sinyal alan hücrelerde kanonik olmayan Wnt sinyalini yönlendiren aynı kaynak ligandları, çoklu sinyal gönderen hücre tipleri tarafından üretilebilir 14,15 . Kanonik olmayan Wnt sinyalizasyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler karmaşıklık göz önüne alındığında, in vivo olarak bireysel ve klinik olarak ilgili mekanizmaları inceleme yeteneği sınırlı kalmıştır.
In vitro hücre kültürü tekniklerini kullanarak kanonik olmayan Wnt sinyallemesini incelemek için girişimlerde bulunulmuştur. Örneğin, hücresel monokatmanlarda yapılan yara iyileştirici testler, hücreselyönlü göçü 4,16,17,18,19 olarak işlevsel olarak değerlendirmek için kullanılmıştır. İmmünoboyama teknikleri, hücresel morfoloji 7,10, mimari ve asimetrik polarizasyondaki kanonik olmayan Wnt kaynaklı değişiklikleri değerlendirmek için yüzey protein ekspresyonunun mekansal analizlerini yapmak için kullanılmıştır18,19,20. Bu yaklaşımlar, sinyal alan hücrelerde Wnt ile ilişkili fenotipleri karakterize etmek için önemli araçlar sağlamış olsa da, bu protokollerde sinyal gönderen bileşenlerin eksikliği, in vivo olarak gözlemlenen parakrin sinyal mekanizmalarını doğru bir şekilde modelleme yeteneklerini sınırlar. Sonuç olarak, kanonik olmayan Wnt yolunun sinyal gönderen ve alan hücreleri, özellikle de farklı hücre tiplerindeki hücreler arasındaki parakrin sinyal etkileşimlerinin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesine izin veren in vitro sistemlerin geliştirilmesine kritik bir ihtiyaç vardır.
Bu amaçla, bu çalışmanın temel amacı, parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerini in vitro olarak modellemek için bir protokol oluşturmaktır. Bu etkileşimlerin sinyal gönderme ve sinyal alma bileşenlerini özetleyen ve kanonik olmayan Wnt yolundaki spesifik ligand-reseptör mekanizmalarını bağımsız olarak incelemek için standart moleküler, genetik veya farmakolojik yaklaşımların kullanılmasına izin veren temassız bir kokültür sistemi geliştirdik. NCC aracılı Wnt sinyalizasyonunun mekanizmaları, yerleşik murin hücre hatları kullanılarak miyoblastlarda incelendi. İlkenin kanıtı olarak, bu model, Wnt5a-ROR2 eksenini, NCC'ler 21 ve SHF kardiyomiyoblast progenitörleri 3,22,23 arasındaki ilgili kanonik olmayan Wnt sinyal yolu olarak ima eden farelerde yapılan önceki in vivo çalışmaların bulgularını doğrulamak için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücrelerin deney öncesi genişlemesi ve geçişi
- C2C12 hücre kültürü:
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamını (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile birleştirerek 500 mL C2C12 kültür ortamı hazırlayın.
- C2C12 hücrelerinden oluşan bir şişeyi 37 °C su banyosunda eritin. C2C12 hücreleri çözülürken, 15 mL'lik bir konik tüpe 5 mL C2C12 ortamı ekleyin. Çözülmüş hücreleri hemen bir P1000 pipet kullanarak 15 mL tüpe aktarın.
NOT: C2C12 hücreleri, daha önce kardiyomiyoblast progenitörlerini modellemek için birincil hücre hattı olarak kullanılmış ve doğrulanmış murin miyoblast hücreleridir. - Serolojik pipet kullanarak konik tüpteki C2C12 hücrelerini nazikçe karıştırın. Ardından, çözülmüş hücrelerin tüm hacmini C2C12 ortamında (6 mL) 75cm2'lik bir şişeye ekleyin.
- Toplam 12 mL hacim için şişeye 6 mL taze C2C12 ortamı ekleyin. Şişeyi, hücre ve ortam çözeltisi şişenin tüm tabanını kaplayacak şekilde yavaşça döndürün. Şişeyi, hücrelerin yapışmasına izin vermek için bir hücre kültürü inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin.
- Hücrelerin inkübatörde ~% 60 akıcılığa ulaşana kadar genişlemesine izin verin.
NOT: Bu, hücreleri periyodik olarak inkübatörden çıkararak ve mikroskop altında akıcılıklarını hızlı bir şekilde kontrol ederek belirlenebilir. Hücrelerin inkübatörden çıkarılma süresini en aza indirdiğinizden emin olun.
- Pasajcı C2C12 hücreleri:
- C2C12 ortamını, 500 mL 1x PBS'yi ve% 0.25 tripsin-EDTA'yı 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın. Reaktifler ısıtıldıktan sonra, tüm reaktifleri hücre kültürü başlığına aktarın.
- C2C12 hücrelerini içeren şişeyi hücre kültürü başlığına getirin. C2C12 hücrelerini içeren şişeyi iki kez ılık 1x PBS ile nazikçe durulayın.
- Şişeyi 45° açıyla eğin ve vakum emişine bağlı bir cam pipetle C2C12 ortamını aspire edin. 45° açıyı korurken, serolojik pipet kullanarak şişenin köşesine dikkatlice 10 mL sıcak 1x PBS ekleyin. Şişeyi yüzeye düz bir şekilde yerleştirin ve 1x PBS'nin tüm tek katmanlı hücreleri yıkadığından emin olmak için şişeyi dairesel hareketlerle yavaşça hareket ettirin.
NOT: Ortamı aspire ederken C2C12 tek katmanını bozmamaya dikkat edin.
- Şişeyi 45° açıyla eğin ve vakum emişine bağlı bir cam pipetle C2C12 ortamını aspire edin. 45° açıyı korurken, serolojik pipet kullanarak şişenin köşesine dikkatlice 10 mL sıcak 1x PBS ekleyin. Şişeyi yüzeye düz bir şekilde yerleştirin ve 1x PBS'nin tüm tek katmanlı hücreleri yıkadığından emin olmak için şişeyi dairesel hareketlerle yavaşça hareket ettirin.
- İkinci yıkamadan sonra 1x PBS'yi çıkarın. Şişeye 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin, tripsin-EDTA çözeltisinin tek katmanın mümkün olduğunca fazlasına yayılmasına izin vermek için şişeyi yukarıda açıklandığı gibi yavaşça hareket ettirin ve şişeyi 2 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.
- 2 dakikalık inkübasyondan sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın ve kalan hücreleri ayırmak için hafifçe dokunun.
- Tripsini söndürmek için serolojik pipetle şişeye 9 mL C2C12 ortamı ekleyin. Serolojik pipeti kullanarak, hücreleri ortamla nazikçe durulayın ve 10 mL tripsinize hücre süspansiyonunu toplayın. 15 mL'lik taze bir konik tüpe 10 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın.
- Konik tüpü hücre kültürü davlumbazına geri döndürün ve süpernatantı vakum emişine bağlı bir cam pipetle çıkarın. Süpernatanı aspire ederken, konik tüpün altındaki hücre peletini bozmamaya dikkat edin. Bunu yapmak için, konik tüpte süpernatantın ~ 0.2 mL'sini bırakın. Hücreleri 10 mL taze C2C12 ortamında yeniden askıya alın.
- Ek pasaj için, 75cm2'lik bir şişeye 1 mL yeniden askıya alınmış hücreler ekleyin. Serolojik pipetle şişeye 11 mL C2C12 ortamı ekleyin ve şişeyi inkübatöre yerleştirin.
- STO hücre kültürü:
- % 7 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 2 nM L-glutamin ile 500 mL DMEM yaparak STO kültür ortamını hazırlayın.
- 500 mL doku sınıfı veya otoklavlanmış su içeren bir şişeye 0.5 g jelatin tozu ekleyerek% 0.1 jelatin hazırlayın. 75cm2'lik bir şişeye 7 mL% 0.1 jelatin çözeltisi ekleyin. Şişeyi, jelatin çözeltisi şişenin tüm tabanını kaplayacak şekilde döndürün. Şişenin hücre kültürü davlumbazındaki oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
- 30 dakikalık inkübasyondan sonra, vakum emişine bağlı bir pipet kullanarak fazla jelatini çıkarın. Şişelerin kullanımdan önce inkübatörde 30 dakika daha kalmasına izin verin.
- 37 °C su banyosunda bir şişe STO hücresi çözün. Bir P1000 pipet kullanarak, çözülmüş hücreleri derhal 5 mL taze hazırlanmış STO kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
NOT: STO hücreleri, hücre kültürü protokollerinde besleyici hücreler olarak rutin olarak kullanılan murin embriyonik fibroblastlardır. - Konik tüpteki hücreleri serolojik bir pipet kullanarak yavaşça karıştırın. Tüm hücre hacmini (6 mL) jelatin kaplı 75cm2'lik bir şişeye ekleyin. Hücre süspansiyonunun şişenin tabanı boyunca iyi dağıldığından emin olmak için şişeyi döndürün.
- Toplam 12 mL hacim için şişeye 6 mL taze STO ortamı ekleyin. Şişenin ve ortamın şişenin dibi boyunca iyi dağıldığından emin olmak için şişeyi yukarıda açıklandığı gibi döndürün. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için şişeyi 37 °C inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin inkübatörde ~% 60-70 akıcılığa ulaşana kadar çoğalmasına izin verin.
- Pasör STO hücreleri:
- 37 °C su banyosunda ılık STO hücre ortamı, 1xPBS ve %0,25 tripsin-EDTA.
- STO hücreleri içeren şişeyi, adım 1.2.2.1'de açıklanandan iki kat daha sıcak 1x PBS ile nazikçe durulayın.
- P1000 pipet kullanarak şişeye 1 mL %0,25 tripsin-EDTA ekleyin. Şişeyi 37 °C inkübatöre 5 dakika boyunca yerleştirin.
- 5 dakikalık inkübasyondan sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın. Yapışkan hücreleri ayırmak için şişeye hafifçe dokunun.
- Tripsini söndürmek ve yukarıda açıklandığı gibi 10 mL tripsinizli hücre süspansiyonunu toplamak için şişeye 9 mL STO ortamı ekleyin. 15 mL'lik bir konik tüpe 10 mL hücre süspansiyonu ekleyin ve 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve hücreleri yukarıda açıklandığı gibi 10 mL STO ortamında yeniden askıya alın. Ek pasaj için, 75cm2'lik bir şişeye 1 mL yeniden askıya alınmış hücreler ekleyin. 11 mL STO ortamı ekleyin, şişenin dibi boyunca hücrelerin ve ortamın eşit dağılımını sağlamak için şişeyi döndürün ve şişeyi inkübatöre yerleştirin.
- İnaktif STO hücre kültürü ve O9-1 hücre bazal ortam preparasyonu:
- 500 mL DMEM'i% 15 FBS,% 1 penisilin / streptomisin, 2 nM L-glutamin, 0.1 mM minimum esansiyel olmayan amino asitler, 1 nM sodyum piruvat ve 55 μM beta-merkaptoetanol ile karıştırarak O9-1 hücreli bazal kültür ortamını hazırlayın.
- Doğrudan bir mitomisin C şişesine 4 mL 1x PBS ekleyerek 0.5 mg / mL konsantrasyonda 1x PBS'de mitomisin C çözeltisi hazırlayın. Solüsyonu P1000 pipetle birden çok kez pipetleyin. Mitomisin C'yi 1x PBS'de daha fazla çözmek için, şişeyi 45 dakika ila 1 saat boyunca bir vorteks karıştırıcısına veya tezgah üstü rocker'a yerleştirin.
- STO plakalarını standart STO ortamına eklenen 0.01 mg / mL mitomisin C nihai konsantrasyonu ile tedavi ederek STO hücrelerini etkisiz hale getirin. STO plakalarını inkübatörün içine 2 saat boyunca yerleştirin, inkübatörün dışında geçirilen süreyi en aza indirerek mitomisin C içeren şişeyi ışıktan korumaya özen gösterin. Mitomisin tedavisini takiben, hücreleri adım 1.2.2.1'de tarif edilenin iki katı 1x PBS'de yıkayın.
NOT: Mitomisin C, STO hücrelerinin çoğalmasını engeller, böylece şişede aşırı akışkan hale gelmeden birkaç gün boyunca şartlandırılmış ortam oluşturmak için kullanılabilirler. - 1x PBS'yi çıkardıktan sonra, inaktive edilmiş STO hücre kültürlerine 12 mL O9-1 bazal kültür ortamı ekleyin ve bunları 24 saat boyunca inkübe edin. Şartlandırılmış, inaktive edilmiş STO + O9-1 bazal kültür ortamını toplayın ve ışıktan korumak için folyoya sarılmış 50 mL konik tüplere yerleştirin.
- Yukarıda tarif edildiği gibi inaktive edilmiş STO hücre kültürlerine 12 mL taze O9-1 bazal kültür ortamı ekleyin. Her 24 saatte bir inaktive edilmiş STO hücrelerini içeren aynı kanatlara taze O9-1 bazal kültür ortamı ekleyerek bu adımı tekrarlayın.
NOT: Mitomisin C tedavisini takiben, inaktive edilmiş STO hücreleri çoğalamaz; Bu nedenle, inaktive edilmiş STO hücrelerini içeren şişeler, şartlandırılmış ortam oluşturmak için yeniden kullanılabilir. - Kondisyonlu, inaktive edilmiş STO + O9-1 bazal kültür ortamı içeren folyo sarılı 50 mL konik tüpleri, toplam 500 mL ortam toplanana kadar 4 °C'de saklayın.
- O9-1 hücre kültürü:
- 500 mL şartlandırılmış STO + O9-1 bazal ortam kullanarak O9-1 hücre büyüme kültürü ortamını hazırlayın ve 103 birim lösemi inhibitör faktör (LIF) ve 25 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bazik-FGF) ekleyin.
- 1.3.2-1.3.3 adımlarında açıklandığı gibi %0,1 jelatin kaplı şişeler hazırlayın.
- 37 °C su banyosunda bir şişe O9-1 hücresi çözün. Çözülmüş hücreleri derhal 5 mL taze hazırlanmış O9-1 büyüme ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
NOT: O9-1 hücre çizgisi, fareden üretilen tek kararlı, çok güçlü nöral tepe hücre hattıdır. Bu hücre hattı in vitro deneylerde nöral krest yaygın olarak kullanılır. - Serolojik pipet kullanarak hücreleri nazikçe karıştırın. 6 mL hücrenin tamamını jelatin kaplı 75cm2 şişeye ekleyin.
- Toplam 12 mL hacim için şişeye 6 mL O9-1 büyüme ortamı ekleyin. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için şişeyi 37 °C inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin inkübatörde ~% 60-70 akıcılığa ulaşana kadar çoğalmasına izin verin.
- Pasajlı O9-1 hücreleri:
- 37 °C su banyosunda ılık O9-1 büyüme ortamı, 1x PBS ve% 0.25 tripsin-EDTA.
- O9-1 hücreleri içeren plakayı, adım 1.2.2.1'de açıklanandan iki kat daha fazla ılık 1x PBS ile nazikçe durulayın.
- Şişeye 1 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin.
- 5 dakikalık inkübasyondan sonra, şişeyi inkübatörden çıkarın ve yapışkan hücreleri ayırmak için şişeye hafifçe dokunun.
- Tripsini söndürmek için şişeye 9 mL O9-1 büyüme ortamı ekleyin. Tripsinizli hücre süspansiyonunun 10 mL'sini toplayın ve bu hücre süspansiyonunun 10 mL'sini 15 mL'lik bir konik tüpe ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 100 × g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve hücreleri 10 mL'lik O9-1 büyüme ortamında yeniden askıya alın. Ek pasaj için, 75cm2'lik bir şişeye 1 mL yeniden askıya alınmış hücreler ekleyin. 11 mL O9-1 büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri içeren şişeyi 37 °C inkübatörde 12 mL ortama yerleştirin.
2. Bir kokültür sistemindeki hücrelerin kaplanması
- Kaplama C2C12 hücre odaları:
- Tripsinizasyonu takiben (adım 1.2'de açıklandığı gibi), C2C12 hücre peletini 10 mL C2C12 ortamında yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan C2C12 hücrelerinin 0,5 mL'sini çıkararak ve bunları 9,5 mL taze C2C12 ortamı içeren yeni bir 15 mL konik tüpe ekleyerek hücreleri C2C12 ortamında 1:20 oranında seyreltin. Süspansiyonu nazikçe serolojik bir pipetle karıştırın.
- P1000 pipet kullanarak yeni bir 4 odacıklı kuyunun her bir kuyucuğuna 1:20 seyreltilmiş C2C12 hücrelerinin 1 mL'sini ekleyin ve 4 odacıklı kuyuyu inkübatöre yerleştirin.
- Kaplama O9-1 hücre ekleri:
- Tripsinizasyonu takiben, O9-1 hücre peletini 10 mL'lik O9-1 büyüme ortamında yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan C2C12 hücrelerinin 0,5 mL'sini çıkararak ve bunları 9,5 mL taze O9-1 büyüme ortamı içeren yeni bir 15 mL konik tüpe ekleyerek hücreleri O9-1 büyüme ortamında 1:20 oranında seyreltin. Süspansiyonu nazikçe serolojik bir pipetle karıştırın.
- 1 mL O9-1 büyüme ortamı ile doldurulmuş yeni bir 4 odacıklı kuyunun her bir kuyucuğunun içine tek bir geçirgen kesici uç yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Bu 4 odacıklı kuyu, adım 2.1.3'teki C2C12 hücrelerini içerenden farklı olmalıdır. - P1000 pipet kullanarak her bir kesici uca 300 μL seyreltilmiş O9-1 hücre süspansiyonu ekleyin. Her bir kesici ucun tabanının, 1,3 mL O9-1 büyüme ortamı ile doldurulmuş kuyuya batırıldığından emin olun. Kuyuyu 37 °C inkübatöre yerleştirin.
- (İsteğe bağlı). O9-1 hücrelerinde veya C2C12 hücrelerinde siRNA knockdown gerçekleştirin.
- O9-1 hücre eklerini veya C2C12 hücre odası kuyularını kapladıktan sonra siRNA 18-24 saat gen nakavtı gerçekleştirin.
- SiRNA ve transfeksiyon reaktifini, üreticilerin tavsiyelerine ve deney için istenen konsantrasyonlara göre indirgenmiş serum ortamında seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız). Seyreltilmiş siRNA ve transfeksiyon reaktifini (1:1) nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 7 dakika inkübe edin.
NOT: Bu protokolde, bu siRNA konsantrasyonunun hedef gen ekspresyonunun yeterli şekilde yıkılmasıyla sonuçlandığı belirlendiği için 50 nM konsantrasyonu kullanılmıştır. - SiRNA-lipid komplekslerini, deneysel tasarımın belirlediği gibi O9-1 hücre eklerine veya C2C12 hücre odası kuyularına ekleyin ve hücreleri ~ 36-48 saat boyunca siRNA-lipid kompleksleri ile inkübe edin.
- SiRNA ve transfeksiyon reaktifini, üreticilerin tavsiyelerine ve deney için istenen konsantrasyonlara göre indirgenmiş serum ortamında seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız). Seyreltilmiş siRNA ve transfeksiyon reaktifini (1:1) nazikçe karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 7 dakika inkübe edin.
- O9-1 hücre eklerini veya C2C12 hücre odası kuyularını kapladıktan sonra siRNA 18-24 saat gen nakavtı gerçekleştirin.
3. Yara tahlilinin yapılması ve miyoblast göçünün kantitatif olarak değerlendirilmesi
- Yara tahlili:
- Protokolün bu kısmına geçmeden önce O9-1 hücre eklerinin ve C2C12 hücre odası kuyularının, her iki hücre de ~% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar inkübatöre yapışmasına ve çoğalmasına izin verin. Hücreler% >90 oranında birleşirse, çizik testine devam etmeyin, çünkü hücreler sadece kuyudan ayrılacaktır.
- 1x PBS ve C2C12 ortamlarını 37 °C su banyosuna yerleştirerek ısıtın.
- Süpernatant ortamı C2C12 odasından iyice çıkarın ve hücreleri bir kez 1x PBS ile yıkayın. 1x PBS'yi çıkarın ve steril bir P10 pipet ucuyla hücreleri hemen çizin.
- Steril P10 pipet ucunu, tek katmanlı hücrenin tüm uzunluğunu veya genişliğini (ör. sağdan sola, yukarıdan aşağıya) yaymak için tek bir yönde sıkıca geçirin. Hücreleri içeren her kuyuyu yalnızca bir kez çizdiğinizden emin olun.
NOT: Tırmalama sonuçlarını optimize etmek için, farklı deney koşullarındaki kazıma kuyularını benzer bir akıcılık seviyesinde çizin. Bunu yapmak için, her 4 odacıklı kuyunun, gerekli her deneysel koşul için hücrelere sahip olduğundan emin olun (örneğin, kuyu # 1 negatif kontrol, iyi # 2 pozitif kontrol). Ayrıca, her çizik için yeni bir steril P10 pipet kullanın ve her seferinde pipete benzer miktarda kuvvet uygulayın. Her kuyucukta birden fazla çizik oluşturmaya çalışmayın. - Çizdikten sonra, bir P1000 pipet ucu kullanarak kuyuya hızlı bir şekilde 1 mL 1x PBS ekleyin. Çizilecek her kuyucuk için bu işlemi tekrarlayın.
NOT: Her çizik ile ilişkili değişkenlik göz önüne alındığında, her deneysel durumda yara oluşumu için birden fazla kuyucuğun (n = 3) kullanılması önerilir. Bu adımlar sırasında hücrelerin 1x PBS'siz kaldığı süreyi en aza indirmek kritik önem taşıdığından hızlı bir şekilde çalışın. Her kuyudan 1x PBS çıkarıldıktan sonra, her kuyucukta bir yara oluşturmak için 5 s'den fazla zaman almamalıdır.
- Steril P10 pipet ucunu, tek katmanlı hücrenin tüm uzunluğunu veya genişliğini (ör. sağdan sola, yukarıdan aşağıya) yaymak için tek bir yönde sıkıca geçirin. Hücreleri içeren her kuyuyu yalnızca bir kez çizdiğinizden emin olun.
- Bir yara oluşturduktan ve her bir kuyucuğa 1x PBS ekledikten sonra, parlak alan ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak çiziği görüntüleyin ve bu görüntüyü temel yara boyutu olarak kullanın (zaman 0). Görüntü çekmek için aşağıdaki adımları uygulayın:
- Güç düğmesine basarak bilgisayarı ve mikroskobu açın ( Malzeme Tablosuna bakın). Oda kızağını sahne alanına yerleştirin ve objektif kadranı 5x büyütmeye döndürün.
- Bilgisayarın masaüstündeki yazılım simgesini çift tıklatarak görüntüleme yazılımını açın (Malzeme Tablosu'na bakın). Yazılım ana ekranındaki Kamera sekmesini tıklatın. AxioCam IC sekmesindeki hücreleri görselleştirmek için Canlı düğmesini tıklatın.
- Işığın fotoğraf makinesine ve bilgisayar ekranına geçmesine izin vermek için ışık filtresinin tamamen dışarı çekildiğinden emin olun. AxioCam IC sekmesindeki canlı görüntünün ortasındaki yara alanını konumlandırmak için hazne kızağını manuel olarak hareket ettirin ve/veya döndürün.
- Görüntü çekmek için, görüntüyü içeren AxioCam IC sekmesinin yanında yeni bir sekme açmak üzere tuttur'u tıklatın.
- Bu durağan görüntüyü kaydetmek için, yazılım giriş sayfasının sol üst köşesindeki dosya'yı tıklatın | farklı kaydedin | dosya adı kutusuna dosya adını girin. Şekli Carl Zeiss görüntü (*.czi) biçiminde (varsayılan ayar) kaydedin ve dosyayı masaüstüne yalnızca Zen lite 2012 yazılım programında açılabilen bir .czi dosyası olarak kaydetmek için soldaki çubuktan masaüstünü seçin.
- Resmi .tiff olarak kaydetmek için, Dosya | Farklı kaydet'i tıklatın | dosya adı kutusuna dosya adını girin. Kayıt türü düğmesini tıklatıp açılır menüden *.tiff öğesini seçerek şekli etiketli resim dosyası (*.tiff) olarak kaydedin.
NOT: .tiff formatı herhangi bir görüntü işleme yazılımında açılabilir. - Aynı kuyucuktaki yaranın diğer noktalarında 2-3 görüntü daha çekmek için oda kızağını manuel olarak yeniden konumlandırın.
NOT: Toplamda, bu, her bir kuyucuktaki yaranın 3-4 üst üste binmeyen, yüksek büyütmeli görüntüsüyle sonuçlanacaktır.
- Her bir kuyucuktan 1x PBS'yi çıkarın ve 1 mL C2C12 ortamı ekleyin.
NOT: Yara oluşumunu takiben odacığı çıkarırken veya odaya solüsyon eklerken çok agresif bir şekilde pipet yapmamaya dikkat edin, çünkü bu, hücrelerin odadan iyi ayrılmasına neden olabilir. Ek olarak, odayı iyice eğin, böylece hücre tek katmanlı bozulmasını en aza indirmek için her bir kuyucuğun köşelerinde çözeltilerin aspirasyonu ve yeniden yerleştirilmesi yapılabilir. - O9-1 hücrelerini içeren kesici uçları haznenin her bir kuyucuğuna manuel olarak yerleştirerek kuyu kesici uç kokültür sistemini monte edin. Kesici uçları, alt kısım alttaki C2C12 hücrelerinin hemen üzerine oturacak şekilde yavaşça kuyucuğun içine doğru itin. Kuyu ekleme yapılarını inkübatöre geri döndürün.
NOT: Kesici ucun alt kısmının altta yatan C2C12 hücrelerine fiziksel olarak dokunmasına ve mekanik olarak bozmasına izin vermeyin. - Hücrelerin toplam 9-12 saat boyunca göç etmesine izin verin. En uygun migrasyon süresini belirlemek için, hücreleri yara oluşumundan sonraki 6 saatte, daha sonra her 2-3 saatte bir kontrol edin. Kontrol altındaki hücreler veya pozitif kontrol koşulları yarayı tamamen örtmeye başladığında deneyi sonlandırın.
NOT: Yapının temassız doğası göz önüne alındığında, aralıklı geçiş ilerlemesini kontrol ederken üstteki kesici ucun kuyulardan çıkarılması gerekmez. Bu tahlilde kullanılan hücre tipleri, yara oluşumu sırasındaki hücresel yoğunluk, oluşturulan yaranın genişliği ve manipüle edilmiş hücrelerin deneysel koşulları (örneğin, gen nakavtı, rekombinant protein ilavesi) gibi faktörlere bağlı olarak göçmen değişkenliği gözlenecektir. Bu reaktiflerin konsantrasyonları, üretici önerilerinin rehberliğinde deneysel olarak belirlenmelidir.
4. İmmünofloresan boyama ve göç eden miyoblastların görüntülenmesi
- Geçiş testinin sonlandırılması ve kuyu ekleme sisteminin yapısökülmesi:
- O9-1 hücre eklerini 9-12 saatlik bir migrasyon periyodundan (veya deneysel koşullar tarafından belirlenen alternatif zamandan) sonra çıkarın. P1000 pipet kullanarak C2C12 ortamını dikkatlice aspire edin. Oda kuyularına 0,5 mL 1x PBS ekleyin ve göçü takiben hücrelerin son görüntülerini alın.
- Ortamla karıştırılmış 0,5 mL'lik 1x PBS'nin tamamını dikkatlice aspire edin ve kit talimatlarını kullanarak plastik odaları oda kuyucuklarından çıkarın ve C2C12 hücrelerini içeren altta yatan slaytı bırakın.
NOT: Oda kuyucuklarını çıkarırken kızağa yapışan C2C12 hücrelerini bozmamaya dikkat edin.
- İmmünoboyama yapmak:
- Slaytı hemen% 4 paraformaldehit (PFA) içeren bir slayt tutucuya yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. %4 PFA'yı dökün ve kızağı oda sıcaklığında 15 dakika yıkamak için kızak tutucuya %0,1 Triton X-100 içeren 1x PBS (1x PBST) ekleyin. 1x PBST'yi dökün ve kızağı oda sıcaklığında 10 dakika yıkamak için slayt tutucuya 1x PBS ekleyin. Toplam iki adet 1x PBS yıkama için bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Slaytı slayt tutucusundan çıkarın. Çözeltilerin slayttan dökülmesini önlemek amacıyla kızağın etrafında hidrofobik bir sınır oluşturmak için kızağın dış kenarlarını hidrofobik bir kalemle izleyin. Yapışkan hücreleri bozmamaya dikkat edin.
- Slayta %1 sığır serum albümini (BSA) bloke edici solüsyon (1x PBS'de seyreltilmiş) ekleyin (slayt başına ~0,5 mL). Çözeltinin, adım 4.2.4'te oluşturulan hidrofobik sınır içinde bulunduğundan emin olun. Slaytı nemlendirilmiş bir slayt odasında oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Falloidin immün boyama için BSA blokajı gerekli olmamasına rağmen, protokoldeki bu adım floresan antikor boyama ile birleşmeye izin verir. - 1 saat boyunca bloke ettikten sonra, bloke edici çözeltiyi slayttan dökün, falloidin antikoru ekleyin (995 μL BSA çözeltisine 5 μL antikor eklenerek % 1 BSA bloke edici çözeltide 1:200'e seyreltilir) ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Yine, çözeltinin adım 4.2.4'te oluşturulan hidrofobik sınır içinde bulunduğundan emin olun. Falloidin antikorunun Alexa Fluor-488 boyasına konjuge olduğu göz önüne alındığında, slayta eklemeden önce ve sonra antikor reaktifinin ışığa maruz kalmasını en aza indirin.
- Ertesi gün, slaytı ışığa maruz kalmaktan korunan bir slayt tutucuya yerleştirin (örneğin, slayt tutucuyu folyoya sarın veya şeffaf olmayan bir slayt tutucu kullanın). Slayt tutucudaki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1x PBS ile yıkayın. Yıkamayı toplam üç adet 10 dakikalık yıkama için tekrarlayın.
- 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren montaj ortamı ekleyin ve slaytları cam kapaklarla monte edin. Standart bir floresan mikroskobu kullanarak göç eden hücreleri görüntüleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NCC'lerin murin miyoblastlarının göç kapasitesi üzerine etkileri
Bu tahlil ilk olarak NCC'lerin miyoblastların göç kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için uygulanmıştır. Şekil 1 , tahlilin şematik modelini özetlemektedir. Bu etkiyi test etmek için, çizik testleri, eklerin varlığında yetiştirilenlere kıyasla, izolasyonda (NCC ekleri olmadan) yetiştirilen miyoblastlarla gerçekleştirildi. Pozitif kontrol olarak, NCC uçları ile hazne kuyularına 500 ng/mL rekombinant Wnt5a (rWnt5a) ilave edildi. Bu rWnt5a konsantrasyonu, C2C12 hücrelerinde yapılan bir doz-yanıt analizi ile belirlendi (Ek Şekil S1). NCC uçlarının temsili görüntüleri, NCC'lerin bu zaman noktasında sağlıklı olduğunu gösteren Ek Şekil S2'de gösterilmiştir. İmmünofloresan, 50 nM Wnt5a siRNA ile inkübasyonu takiben protein seviyesinde Wnt5a'nın sağlam bir şekilde parçalandığını göstermektedir (Ek Şekil S3). 9 saatlik bir migrasyon periyodunu takiben, NCC'lerin varlığının, NCC eklerinin yokluğunda test edilen miyoblastlara kıyasla miyoblastların göç kapasitesini anlamlı derecede arttırdığı bulunmuştur (%72.6 yara repopüle edilen alan ile %59.1 yara repopülasyonu yapılan alan, p = 0.033). RWnt5a'nın kokültür kuyularına eklenmesi, miyoblast göçünü hızlandırdı, bazı yara alanları Şekil 2'de gösterildiği gibi 9 saatlik zaman noktasında tam iyileşme gösterdi. Beklendiği gibi, her üç koşulda da göçmen miyoblastlar, iyi biçimlendirilmiş ve çıkıntılı filopodia ve lamellopodia ve aktin sitoiskelet projeksiyonlarının asimetrik polarizasyonu dahil olmak üzere normal göçmen hücresel morfolojiyi sergilemiştir (Şekil 2C).
Miyoblastların polarize göçü için NCC türevi Wnt5a'nın önemi
NCC kaynaklı Wnt5a'nın miyoblast göçü üzerindeki parakrin etkisini değerlendirmek için, NCC'lerde Wnt5a'nın siRNA aracılı nakavtını takiben miyoblastlarda yara iyileşmesi testleri yapıldı. İlk olarak, Wnt5a knockdown verimliliği NCC'lerde gerçek zamanlı-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu ile doğrulandı. Wnt5a'ya karşı 50 nM siRNA ile tedavinin, Wnt5a gen ekspresyonunu negatif kontrol (karıştırılmış) siRNA'ya kıyasla% 64 oranında azalttığı bulunmuştur (Şekil 3A). Bu konsantrasyon kullanılarak, O9-1 hücre ekleri, kokültürün montajından önce kontrol siRNA veya Wnt5a siRNA 48 h ile transfekte edildi. C2C12 hücreleri normal şartlar altında yetiştirildi ve uygun temas noktasında yaralar oluşturuldu. Yara oluşumundan hemen sonra, her bir kuyucuğa negatif kontrol veya Wnt5a knockdown NCC uçları eklendi. 10 saatlik bir migrasyon periyodundan sonra, NCC'lerde Wnt5a'nın nakavtının, kontrol NCC'leri ile test edilen miyoblastlara kıyasla altta yatan miyoblast göç kapasitesini önemli ölçüde azalttığı bulunmuştur (% 39.1 yara yeniden nüfuslu alan% 74.8 yara yeniden nüfuslu alan, p < 0.001). Ayrıca, Wnt5a'nın yıkılmasıyla NCC'lerin varlığında test edilen miyoblastlar, azaltılmış sitoplazmik alanlar ve daha az aktin sitoiskelet projeksiyonu da dahil olmak üzere immün boyama yoluyla anormal sitolojik morfoloji göstermiştir (Şekil 3D). Miyoblast göçünü kurtarmak için, Wnt5a knockdown uçları içeren kokültür kuyularına 500 ng / mL rWnt5a'nın eksojen takviyesi eklendi. Eksojen rWnt5a ilavesinin bu miyoblastlarda gözlenen göç ve morfolojik defektleri tamamen kurtardığı bulunmuştur (Şekil 3C,D).
Wnt5a, polarize göçün bir sürücüsü olarak miyoblastlarda ROR2 üzerinden sinyal veriyor
Bu parakrin modeldeki sinyal alıcı hücre mekanizmalarını daha iyi anlamak için, miyoblastlarda ROR2 reseptörünün yıkılmasının ardından tahlil tekrarlandı. Bu deneyde, miyoblastlar, yara oluşumundan önce 50 nM ROR2 siRNA ~ 40 saat ile transfekte edildi ve bu da ROR2 gen ekspresyonunu% 54 oranında düşürmek için yeterli olduğu gösterildi (Şekil 4A). Bu süre zarfında, NCC kesici uçları normal koşullar altında paralel olarak yetiştirildi. Miyoblastlar uygun akıcılığa ulaştıktan sonra çizik tahlilleri yapıldı ve kokültür kuyusu ekleri monte edildi. NCC eklerinin varlığında 10 saatlik bir migrasyon periyodundan sonra, ROR2 knockdown miyoblastları, negatif kontrol siRNA ile tedavi edilen miyoblastlara kıyasla göç kapasitesinin azaldığını göstermiştir (% 48.1 yara repopüle edilmiş alana% 75.7 yara repopüle edilmiş alan, p = 0.019) (Şekil 4B, C). 500 ng / mL rWnt5a'nın eklenmesi, ROR2 nakavtını takiben miyoblast göç kapasitesini kurtaramadı, bu da ROR2 tükenmesinin miyoblastların Wnt5a sinyallerini alma yeteneğini bozduğunu düşündürmektedir (Şekil 4B, C). Phalloidin için immün boyama göç verilerini doğrulamış ve ROR2 knockdown miyoblastlarında falloidin-pozitif lamellopodia ve filopodia'da bir azalmanın ek rWnt5a ile restore edilmediğini göstermiştir (Şekil 4D).
Şekil 1: Tahlilin şematik modeli. Adım 1, STO besleyici hücreleri kullanarak C2C12 miyoblastlarının ve NCC'lerin in vitro genişlemesini içerir. Adım 2, kokültür sistemindeki NCC'lerin ve C2C12 hücrelerinin kaplanmasını içerir. Adım 3, hücresel göç kapasitesini değerlendirmek için altta yatan C2C12 hücrelerinde yapılan yara tahlilini içerir. Adım 4, göç eden hücrelerin sitolojik mimarisini ve morfolojisini değerlendirmek için faloidin için immünoboyamayı içerir. Kısaltmalar: NCC'ler = nöral tepe hücreleri; Ab = antikor. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nöral krest hücrelerinin varlığı miyoblast migrasyon kapasitesini arttırır. (A) Yara oluşumu sırasında nöral krest hücresi (NCC) eklerinin varlığı miyoblast göçünün iyileşmesine yol açar. NCC-C2C12 kokültürlerine eksojen rekombinant Wnt5a'nın (rWnt5a) eklenmesi, miyoblast migrasyonu üzerinde en güçlü olumlu etkiye sahiptir. (B) Yara oluşumunu takiben 9 saatte ortalama miyoblast repopüle edilen alanın nicelleştirilmesi (hata çubukları standart sapmayı gösterir). (C) Miyoblastların yara oluşumundan 9 saat sonra yara sınırında falloidin boyanması. Kesikli dikdörtgenler, göç cephesinde falloidin lekeli miyoblastları gösterir. B'de nicelleştirilmiş her deneysel koşul için toplam n = 3 örnek kullanılmıştır. Ölçek çubukları = 200 μm (A ve C için). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nöral krest hücresinden türetilmiş Wnt5a, miyoblast göçü için gereklidir. (A) NCC'lerde siRNA aracılı nakavtı doğrulamak için Wnt5a'nın göreceli mRNA ekspresyonu. (B) NCC'lerde Wnt5a nakavtını takiben C2C12 miyoblastlarının göçü önemli ölçüde azalır. (C) Yara oluşumunu takiben 10 saatte ortalama miyoblast repopüle edilen alanın miktarının belirlenmesi (hata çubukları standart sapmayı gösterir). (D) Yara oluşumunu takiben 10 saat sonra yara sınırındaki miyoblastların falloidin boyaması. Kesikli dikdörtgenler, göç cephesinde falloidin lekeli miyoblastları gösterir. C'de nicelleştirilmiş her deneysel koşul için toplam n = 3 örnek kullanılmıştır. Ölçek çubukları = 200 μm (B ve D için). Kısaltmalar: NCC'ler = nöral tepe hücreleri; siRNA = küçük müdahale eden RNA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Wnt5a, göçü yönlendirmek için miyoblastlardaki ROR2 reseptörleri aracılığıyla sinyal verir. (A) C2C12 hücrelerinde siRNA aracılı nakavtı doğrulamak için ROR2'nin göreceli mRNA ekspresyonu. (B) Miyoblastlarda ROR2'nin yıkılması, NCC'lerin varlığına rağmen göç kapasitelerini azaltır. Eksojen rWnt5a, ROR2 nakavtından sonra miyoblast göçünü kurtaramaz. (C) Yara oluşumunu takiben 10 saatte ortalama miyoblast repopüle edilen alanın miktarının belirlenmesi (hata çubukları standart sapmayı gösterir). (D) Yara oluşumunu takiben 10 saat sonra yara sınırındaki miyoblastların falloidin boyaması. Kesikli dikdörtgenler, göç cephesinde falloidin lekeli miyoblastları gösterir. C'de nicelleştirilmiş her deneysel koşul için toplam n = 3 örnek kullanılmıştır. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltmalar: NCC'ler = nöral tepe hücreleri; siRNA = küçük müdahale eden RNA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Rekombinant Wnt5a takviyesi için doza bağımlı analiz. Rekombinant Wnt5a takviyesi testi 0 ng / mL, 100 ng / mL ve 500 ng / mL için doza bağımlı analiz, 500 ng / mL'lik eksojen rWnt5a'nın, in vitro 12 saatlik bir göç periyodu sırasında miyoblast migrasyonunu ve faloidin sitomimari değişikliklerini yönlendirmek için en uygun konsantrasyon olduğunu buldu. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Kuyu eklerinin temsili görüntüleri. (A) 50 nM negatif kontrol siRNA ve (B) 50 nM Wnt5a siRNA ile tedavi edilen O9-1 nöral krest hücrelerini içeren kuyu eklerinin parlak alan görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltma: siRNA = küçük müdahale eden RNA. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: SiRNA aracılı Wnt5a nakavtını takiben O9-1 hücrelerinde Wnt5a protein ekspresyonunun temsili görüntüleri. (A) 50 nM negatif kontrol siRNA ve (B) 50 nM Wnt5a siRNA ile tedavi edilen O9-1 nöral krest hücrelerini içeren hücre kültürü kuyularında Wnt5a proteininin immünofloresan boyanması. Ölçek çubukları = 20 μM. Kısaltmalar: siRNA = küçük müdahale eden RNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanonik olmayan Wnt/düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyal yolu, çoklu gelişimsel 24,25 vehastalık süreçleri 24,26'da rol oynayan kritik öneme sahip bir hücresel sinyal yoludur. Embriyonik gelişim sırasında, kanonik olmayan Wnt sinyali, sinyal gönderen hücrelerden gelen ve sonuçta morfolojide, asimetrik organizasyonda ve sinyal alan hücrelerde yönlü göçte değişikliklere neden olan geniş bir moleküler sinyal ağını içerir11. Önceki çalışmalar, bu sinyallemeyi yönlendiren spesifik ligand-reseptör yollarının çeşitli, bağlama bağlı olduğunu ve genelliklehücre tipleri 12,13,14,15 arasında değiştiğini göstermiştir. Bu moleküler karmaşıklık nedeniyle, geleneksel genetik rekombinasyon yöntemlerini in vivo kullanarak parakrin kanonik olmayan Wnt sinyal etkileşimlerini değerlendirme yeteneği sınırlı kalmıştır. İn vitro sistemler, kanonik olmayan Wnt hücresel fenotiplerini incelemek için alternatif bir yaklaşım olarak giderek daha fazla kullanılırken, mevcut protokoller yalnızca yolun aşağı akış sinyal alma yönlerine odaklanmakta ve bu sinyal olaylarının hücreler arası ve parakrin doğasını yeterince modelleyememektedir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, parakrin Wnt etkileşimlerini in vitro olarak özetleyen temassız bir kokültür sistemi için bir protokol geliştirmekti. Bu protokolün odak noktası, hücre içi filament proteinlerinin organizasyonu ve polarize göç kapasitesi de dahil olmak üzere fonksiyonel kanonik olmayan Wnt sinyallemesinin in vitro olarak iki karakteristik yönünü modellemekti.
Kavramın bir kanıtı olarak, bu protokol kalp gelişimi bağlamında parakrin mekanizmaları incelemek için uygulandı. Kardiyogenez sırasında, kardiyak NCC'ler ve SHF progenitör hücreleri arasındaki karşılıklı sinyal olayları, kardiyak çıkış yolunun (OFT) uygun şekilde olgunlaşması için çok önemlidir 27,28,29. Önceki çalışmalar, fare kardiyak gelişimi sırasında, faringeal SHF hücrelerinde NCC aracılı Wnt / PCP sinyalizasyonunun, SHF progenitör hücresinin gelişmekte olan OFT'ye dahil edilmesi ve normal OFT hizalaması21 için gerekli olduğunu göstermiştir. Schleiffarth ve ark. ve diğerleri, Wnt / PCP ligandı Wnt5'i kodlayan genin genetik nakavtının, SHF progenitör hücre organizasyonunu ve göç kapasitesini bozduğunu, bunun sonucunda kısaltılmış ve yanlış hizalanmış bir kardiyak OFT 22,23,30 ile sonuçlandığını göstermiştir. Yerleşik murin NCC (O9-1)31 ve miyoblast (C2C12) hücre hatları ile bu protokol, NCC'lerle kokültürün artmış falloidin-pozitif sitoplazmik filopodia ve lamellipodia ile ilişkili olduğunu ve yara iyileştirici bir tahlilde miyoblast göç kapasitesini geliştirdiğini göstermektedir. Bu moleküler ve fonksiyonel son noktalar in vitro olarak NCC manipülasyonu31 için daha önce yayınlanmış protokollere dayanır ve Wnt5a küresel nakavt farelerinde açıklanan in vivo fenotipik değişiklikleri yakından modelleyerek bu modelin faydasını doğrular.
NCC'ler ve miyoblastlar arasında kanonik olmayan Wnt sinyallemesini yönlendiren spesifik moleküler yolu belirlemek için, NCC'lerde aday ligand, Wnt5a ve miyoblastlarda karşılık gelen reseptör ROR2'yi kodlayan genler için paralel hücreye özgü nakavt deneyleri yapıldı. Beklendiği gibi, hem sinyal gönderen (NCC'lerde Wnt5a) hem de sinyal alan (miyoblastlarda ROR2) hücrelerdeki moleküllerin yıkılması, Wnt / PCP ile ilişkili aktin sitomimari değişikliklerini bağımsız olarak bozdu ve miyoblast göçünü inhibe etti. Önemli olarak, rekombinant Wnt5a ile fenotipik kurtarma sadece NCC-Wnt5a knockdown koşulunda gözlenmiştir, bu da NCC kaynaklı Wnt5a'nın ROR2 reseptörleri aracılığıyla miyoblastlarda PCP sinyallemesini aktive ettiği bir mekanizmayı desteklemektedir. Bu sonuçlar, embriyonik kalp gelişimi sırasında Wnt5a-ROR2 eksenini NCC'ler ve SHF hücreleri arasında önemli bir Wnt / PCP sinyal ekseni olarak tanımlayan fare genetik çalışmalarından elde edilen verilerle tutarlıdır 3,21. Bu protokolde deneysel olarak test edilmemiş olsa da, SHF kaynaklı Wnt5a'nın ROR2 reseptörleri aracılığıyla nöral tepeye karşılıklı parakrin sinyaller sağlayıp sağlamadığı belirsizliğini korumaktadır. Bu hipotez, bu protokol kullanılarak, kuyu eki yapısının üstündeki C2C12 hücreleri ve altındaki O9-1 hücreleri ile yapılan deneyler tekrarlanarak test edilebilir. SHF kaynaklı Wnt5a, NCC-ROR2 aracılığıyla karşılıklı bir parakrin sinyal sağlıyorsa, C2C12 hücrelerinde Wnt5a'nın yıkılmasının, göç kapasitesini ve altta yatan O9-1 hücrelerinin aktin polimerizasyonunu inhibe etmesi beklenir.
Bu protokolün birkaç benzersiz güçlü yönü vardır. İlk olarak, aynı sinyal alıcı hücre popülasyonunda fonksiyonel ve moleküler Wnt / PCP özelliklerini değerlendirmek için yara iyileştirici testlerin ve immün boyama tekniklerinin sıralı kullanımını içeren temassız bir kuyu ekleme sistemidir. Bu sadece kanonik olmayan Wnt-kaynaklı hücre içi filament organizasyonunu ve in vitro polarize göç değişikliklerini fenotiplemek için sağlam bir yaklaşım sağlamakla kalmaz, aynı zamanda sinyal iletim mekanizmalarının daha ayrıntılı değerlendirmelerine de izin verir. Bu protokol, Wnt5a-ROR2 molekülleri ile ilgili ilkenin kanıtını sağlarken, model aynı zamanda kanonik olmayan Wnt sinyal yolundaki diğer ligandların ve reseptörlerin etkilerini değerlendirmek için de kolayca kendini ödünç verir. Kanonik olmayan Wnt sinyallerini in vivo olarak dönüştürdüğü gösterilen çoklu potansiyel aşağı akış efektör proteinlerinin (örneğin, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) ekspresyonunu değerlendirmek için immün boyama protokolü daha da uyarlanabilir. Ek olarak, bu çeşitli efektör moleküllerin protein seviyeleri, göçmen veya aktin sitomimari fenotipleri ile ilişkilendirilebilir. İkincisi, kokültür sisteminin temassız doğası, Wnt / PCP yolundaki sinyal alıcı moleküllere karşı spesifik sinyal gönderen moleküllerin bağımsız manipülasyonuna izin verir. Bu temsili sonuçlarda, hücreye özgü siRNA nakavtı yapmak üzere seçildi. Bununla birlikte, bu protokol, klinik uygulama için aday ligand-reseptör yollarını değerlendirmek için farmakolojik inhibitörlerin veya genetiği değiştirilmiş hücre hatlarının kullanımına da uygundur. Benzer şekilde, rekombinant Wnt5a ile gösterildiği gibi, kokültür ortamına moleküler veya farmakolojik bileşikler ekleyerek fenotipik kurtarma deneyleri yapılabilir. Bu bileşiklerin sinyal gönderme ve sinyal alma düzensizliklerini seçici olarak kurtarmak için hedeflemek, mevcut in vivo model sistemleri kullanılarak izin verilmeyen şekillerde parakrin mekanik yolları daha da doğrular.
Bu protokolün birçok kritik adımı vardır. İlk olarak, birincil hücrelerin protokol boyunca uygun akıcılıkta genişletilmesini ve korunmasını sağlamak önemlidir. C2C12 miyoblastlarının% 100 akıcılığa kadar çoğalmasına izin verilirse, miyoblastlardan miyotüplere kaynaşmaya ve farklılaşmaya başlarlar. Bu nedenle, bu hücreler tarif edildiği gibi uygun yoğunlukta geçirilmelidir. İkincisi, O9-1 hücrelerini büyütmek için şartlandırılmış ortam üretmek için STO besleyici hücrelere ihtiyaç duyulduğu göz önüne alındığında, birinin STO hücrelerini mitomisin C ile uygun şekilde inaktive etmesi ve O9-1 hücrelerini çözmeden ve kaplamadan önce inaktive edilmiş STO hücrelerini kullanarak yeterli (en az 500 mL) O9-1 büyüme ortamı yapması zorunludur. Belki de bu protokoldeki en kritik adım, miyoblast monolayer32,33'te düzgün geometri ve genişliğe sahip uygun çiziklerin oluşturulmasıdır. Adım 3.1.4, protokolün bu bölümünü optimize etmek için birkaç ipucunu ayrıntılarıyla açıklar. Bu önerilere rağmen, standart 2D çizik testleri ile ilişkili değişkenliğin teknik bir zorluk ve bu protokolün bir sınırlaması olmaya devam ettiği kabul edilmelidir. Bu nedenle, her deneysel koşulun birden fazla teknik kopyasına sahip olmak gerekir.
Son olarak, burada sunulan sonuçlar murin NCC'ler ve miyoblastlar kullanılarak üretilmesine rağmen, bu protokol, prensip olarak, ilgilenilen herhangi bir sinyal gönderme ve sinyal alma hücresini içerecek şekilde uyarlanabilir. Sonuç olarak, bu sistem sadece çeşitli gelişimsel bağlamlarda parakrin kanonik olmayan Wnt sinyallemesinin temel mekanizmalarını ilerletmek için uygulamalara sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda Wnt / PCP ile ilişkili hastalık süreçleri için terapötik mekanizmaları test etmek için de kullanılabilir. Örnekler arasında, malign hücrelerin Wnt/PCP kaynaklı göç kapasitesini inhibe eden veya başlangıçta kusurlu PCP sinyal kapasitesine sahip hasta kaynaklı terminal hücre tiplerinin yönlü göçünü geri kazandıran ilaçlar için farmakolojik tarama yer almaktadır. Kanonik olmayan Wnt sinyal yolunun ötesinde, bu protokol iki hücre tipi arasındaki diğer parakrin sinyal mekanizmalarını ve yollarını incelemek için de uyarlanabilir. Örneğin, O9-1 hücrelerinde bilinen salgı moleküllerinin diğer yollarda (örneğin, Notch, Bmp / Tgf-β, Fgf) siRNA aracılı nakavtı, altta yatan miyoblastlarda proliferatif, farklılaşma veya apoptotik belirteçlerin immün boyaması ile birleştirilebilir.
Sonuç olarak, bu protokol, kanonik olmayan Wnt ile ilişkili hücre içi filament organizasyonu ve in vitro polarize migrasyon mekanizmalarını incelemek için yeni ve oldukça izlenebilir bir deneysel protokol oluşturmaktadır. Burada açıklanan yöntemler, Wnt etkileşimlerinin hücreler arası ve parakrin doğasını koruyarak mevcut teknikleri geliştirir ve bu yolun sinyal gönderen ve sinyal alan bileşenlerinin bağımsız olarak değerlendirilmesine izin verir. Bu protokol, iki hücre tipi arasındaki temel parakrin Wnt / PCP sinyal mekanizmalarını araştırmak ve Wnt / PCP ile ilişkili hastalık süreçlerini hedefleyen yeni terapötik bileşikleri taramak için geniş çapta uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen NIH ödülleri F30HL154324 tarafından O.T. ve K08HL121191 ve R03HL154301 S.R.K. tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu makaledeki Şekil 1'deki şemanın biorender.com ile oluşturulduğunu kabul etmek istemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al.
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, Suppl_3 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al.
