Summary
Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde in diesem Protokoll eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen Drosophila TRP-Kanal zu reinigen.
Abstract
Die Drosophila-Phototransduktion ist einer der schnellsten bekannten G-Protein-gekoppelten Signalwege. Um die Spezifität und Effizienz dieser Kaskade zu gewährleisten, bindet der Calcium (Ca2+)-permeable Kationenkanal, das transiente Rezeptorpotential (TRP), fest an das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) und bildet einen großen Signalproteinkomplex mit augenspezifischer Proteinkinase C (ePKC) und Phospholipase Cβ/No Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA). Die biochemischen Eigenschaften des Drosophila TRP-Kanals bleiben jedoch unklar. Basierend auf dem Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes wurde eine modifizierte Affinitätsreinigung plus Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den endogenen TRP-Kanal zu reinigen. Zuerst wurde das gereinigte Histidin (His)-markierte NORPA 863-1095-Fragment an Ni-Perlen gebunden und als Köder verwendet, um den endogenen INAD-Proteinkomplex aus Drosophila-Kopfhomogenaten abzuziehen. Dann wurde den Ni-Perlen ein übermäßig gereinigtes Glutathion-S-Transferase (GST)-markiertes TRP 1261-1275-Fragment hinzugefügt, um mit dem TRP-Kanal zu konkurrieren. Schließlich wurde der TRP-Kanal im Überstand durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen TRP 1261-1275-Peptid getrennt. Diese Methode ermöglicht es, den Gating-Mechanismus des Drosophila TRP-Kanals sowohl aus biochemischer als auch aus struktureller Sicht zu untersuchen. Die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten Drosophila TRP-Kanälen können auch in Zukunft gemessen werden.
Introduction
Phototransduktion ist ein Prozess, bei dem absorbierte Photonen in elektrische Codes von Neuronen umgewandelt werden. Es leitet ausschließlich Opsine und die folgende G-Protein-gekoppelte Signalkaskade sowohl bei Wirbeltieren als auch bei Wirbellosen weiter. In Drosophila organisiert das Gerüstprotein Inactivation-No-after-potential D (INAD) unter Verwendung seiner fünf PDZ-Domänen einen supramolekularen Signalkomplex, der aus einem transienten Rezeptorpotential (TRP)-Kanal, Phospholipase Cβ/No-Rezeptorpotential A (PLCβ/NORPA) und einer augenspezifischen Proteinkinase C (ePKC)1 besteht. Die Bildung dieses supramolekularen Signalkomplexes garantiert die korrekte subzelluläre Lokalisation, hohe Effizienz und Spezifität der Drosophila-Phototransduktionsmaschinerie. In diesem komplexen Komplex wirken lichtempfindliche TRP-Kanäle als nachgeschaltete Effektoren von NORPA und vermitteln den Kalziumeinstrom und die Depolarisation von Photorezeptoren. Frühere Studien zeigten, dass die Öffnung des Drosophila TRP-Kanals durch Protonen, Störung der lokalen Lipidumgebung oder mechanische Kraft 2,3,4 vermittelt wird. Der Drosophila TRP-Kanal interagiert auch mit Calmodulin5 und wird durch Calcium sowohl durch positive als auch durch negative Rückkopplung 6,7,8 moduliert.
Bisher basierten elektrophysiologische Studien über den Gating-Mechanismus von Drosophila TRP und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanälen auf ausgeschnittenen Membranpflastern, Ganzzellaufzeichnungen von dissoziierten Wildtyp-Drosophila-Photorezeptoren und heteroexprimierten Kanälen in S2-, SF9- oder HEK-Zellen 2,9,10,11,12,13, aber nicht auf gereinigten Kanälen. Die Strukturinformationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge bleiben ebenfalls unklar. Um die elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigtem Protein in einer rekonstituierten Membranumgebung zu untersuchen und strukturelle Informationen des Drosophila-TRP-Kanals in voller Länge zu gewinnen, ist die Gewinnung gereinigter TRP-Kanäle in voller Länge der notwendige erste Schritt, ähnlich den Methoden, die in den TRP-Kanalstudien von Säugetieren verwendet werden 14,15,16,17.
Kürzlich wurde auf der Grundlage des Montagemechanismus des INAD-Proteinkomplexes18,19,20 erstmals eine Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie entwickelt, um den TRP-Kanal von Drosophila-Kopfhomogenaten durch Streptavidin-Perlen5 zu reinigen. In Anbetracht der geringen Kapazität und der teuren Kosten von Streptavidin-Perlen wird hier ein verbessertes Reinigungsprotokoll eingeführt, das His-getaggtes Köderprotein und entsprechende kostengünstige Ni-Perlen mit viel höherer Kapazität verwendet. Die vorgeschlagene Methode wird dazu beitragen, den Gating-Mechanismus des TRP-Kanals aus strukturellen Winkeln zu untersuchen und die elektrophysiologischen Eigenschaften des TRP-Kanals mit gereinigten Proteinen zu messen.
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Protocol
1. Reinigung von GST-markierten TRP- und His-markierten NORPA-Fragmenten
- Reinigen Sie das TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Tag
- Wandeln Sie das pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 Plasmid 10 in Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml Luria Bertani (LB) Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml Aussaatkultur in 1 L LB-Medium bei 37 ° C.
- Nachdem die optische Dichte (OD600) der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 °C ab und fügen Sie 0,1 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; Endkonzentration) hinzu, um die Überexpression des Zielproteins zu induzieren, und inkubieren Sie bei 16 °C für 18 h.
- Nach Überexpression 1 l kultivierte Zellen durch Zentrifugation bei 3.993 × g für 20 min pelletieren und in 40 ml phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) Puffer resuspendieren.
- Laden Sie die resuspendierten Zellen in einen bei 4 °C vorgekühlten Hochdruckhomogenisator. Erhöhen Sie den Homogenisatordruck langsam auf 800 bar. Öffnen Sie den Einlasshahn und lassen Sie die resuspendierten Zellen kreisförmig durch ein Ventil mit sehr schmalen Schlitzen gehen.
HINWEIS: Die Zellen werden durch die hohen Scherkräfte, die durch einen großen Druckabfall und Kavitation verursacht werden, homogenisiert. - Laden Sie 5 ml Glutathionperlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie die Perlen insgesamt dreimal mit 50 ml PBS-Puffer.
- Zentrifugieren Sie das Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48.384 x g. Den Überstand des zentrifugierten Zelllysats (40 ml) zu den ausgleichenden Glutathionperlen in der Schwerkraftsäule geben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Glutathionperlen alle 10 Minuten aus.
- Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen. Verwerfen Sie den Durchflussbruch. Spülen Sie die restlichen Glutathionperlen zweimal mit 50 ml PBS-Puffer ab.
- Fügen Sie 15 ml Elutionspuffer zu den Glutathionperlen hinzu und inkubieren Sie für 30 min. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.
- Nach 30 min Inkubation eluieren Sie das GST-markierte TRP 1261-1275-Fragment in einem konischen 50-ml-Rohr und beladen Sie es in einer Größenausschlusssäule (Präparationsgrad), die mit 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) Puffer ausgeglichen wird.
- Halten Sie die Elutionsdurchflussrate der Größenausschlusssäule auf 3 ml/min. Sammeln Sie die eluierten Proteine mit einer Rate von 5 ml / Röhrchen.
- Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins in der Größenausschlussspalte, indem Sie die UV-Absorptionssignale bei 280 nm analysieren und durch SDS-PAGE-Gelanalyse überprüfen (Elektrophoreseparameter: 150 V für das Stapelgel; 200 V für das auflösende Gel). Färben Sie das Gel mit Coomassie blue R250.
- Konzentrieren Sie das gereinigte TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Kennzeichnung von der Größenausschlusssäule auf 1 ml mit einer 15 ml Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert ist, in einer Kühlzentrifuge auf dem Schreibtisch.
- Bestimmen Sie die Konzentration des konzentrierten Proteins mit dem Bier-Lambert-Gesetz. Messen Sie die UV-Absorption des GST-markierten TRP 1261-1275-Fragments bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
- Erhalten Sie den Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, indem Sie die Proteinsequenzen in das Protparam-Programm (https://web.expasy.org/protparam/) importieren. Typischerweise ergibt 1 L Kultur von GST-markiertem TRP 1261-1275 1 ml 600 μM Protein (6 x 10-7 mol). Die benötigten Materialien sind Tabelle 1 zu entnehmen.
- Reinigung des NORPA 863-1095 Fragments mit seinen Tags
- Wandeln Sie das pETM.3C NORPA 863-1095 Plasmid20 in E. coli BL21 (DE3) Zellen mit der CaCl2 Hitzeschock-Transformationsmethode21 um. Beimpfen Sie eine einzelne Kolonie in 10 ml LB-Medium und wachsen Sie über Nacht bei 37 ° C. Dann verstärken Sie die 10 ml Aussaatkultur in 1 L LB-Medium bei 37 ° C.
- Nachdem der OD600 der Zellen 0,5 erreicht hat, kühlen Sie die Zellen auf 16 °C ab und fügen Sie 0,1 mM IPTG (Endkonzentration) hinzu, um die Überexpression des Zielproteins zu induzieren, und inkubieren Sie bei 16 °C für 18 h.
- Nach der Überexpression pelletieren Sie 1 L kultivierte Zellen durch Zentrifugation bei 3.993 x g für 20 min und resuspendieren Sie in 40 ml Bindungspuffer. Als nächstes werden die resuspendierten Zellen in einem Hochdruckhomogenisator bei 4 °C gelyst, wie in Schritt 1.1.4 beschrieben.
- Laden Sie 5 ml Ni-Perlen in eine Schwerkraftflusssäule und waschen Sie sie dreimal mit 50 ml Bindungspuffer.
- Zentrifugieren Sie das Zelllysat aus dem Hochdruckhomogenisator bei 48.384 x g. Fügen Sie den Überstand des zentrifugierten Zelllysats zu den gleichgestellten Ni-Beads in der Schwerkraftsäule hinzu und inkubieren Sie für 30 min bei 4 °C. Setzen Sie die Ni-Perlen alle 10 Minuten auf.
- Öffnen Sie nach 30 Minuten Inkubation den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen. Entsorgen Sie die Durchflussfraktion und waschen Sie die verbleibenden Ni-Perlen zweimal mit 50 ml Waschpuffer.
- 15 ml Elutionspuffer zu den Ni-Beads geben und 30 min inkubieren. Setzen Sie die Ni-Perlen alle 10 Minuten auf.
- Nach 30 Minuten Inkubation das eluierte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment in einem konischen 50-ml-Rohr sammeln und in eine Größenausschlusssäule (Präparationsgrad) laden, die mit 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) ausgeglichen wird.
- Halten Sie die Elutionsdurchflussrate der Größenausschlusssäule auf 3 ml/min. Sammeln Sie das eluierte Protein mit einer Rate von 5 ml / Röhrchen.
- Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins in der Größenausschlussspalte, indem Sie die UV-Absorptionssignale bei 280 nm analysieren und durch SDS-PAGE-Gelanalyse überprüfen (Elektrophoreseparameter: 150 V für das Stapelgel; 200 V für das auflösende Gel). Färben Sie das Gel mit Coomassie blue R250.
- Konzentrieren Sie das gereinigte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment aus der Größenausschlusssäule auf 1 ml mit einer 15-ml-Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C zentrifugiert ist, in einer gekühlten Tischzentrifuge.
- Bestimmen Sie die Konzentration des konzentrierten Proteins mit dem Bier-Lambert-Gesetz. Messen Sie die UV-Absorption des mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragments bei 280 nm mit einem Spektralphotometer.
- Erhalten Sie den Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, indem Sie die Proteinsequenzen in das Protparam-Programm (https://web.expasy.org/protparam/) importieren. Typischerweise ergibt die 1-L-Kultur des His-markierten NORPA 863-1095-Fragments 1 ml 600 μM Protein (6 x 10-7 mol). Die benötigten Materialien sind Tabelle 2 zu entnehmen.
2. Vorbereitung von Drosophila-Köpfen
- Sammeln Sie erwachsene Fliegen in konischen 50-ml-Zentrifugationsröhrchen mit der CO 2-Anästhesiemethode22,23; sofort in flüssigem Stickstoff für 10 min einfrieren und in einem -80°C Gefrierschrank lagern.
- Nachdem Sie eine ausreichende Anzahl von Fliegen gesammelt haben, schütteln Sie die gefrorenen 50 ml konischen Schläuche von Hand kräftig, um die Beine, Köpfe, Flügel und Körper der Fliegen zu trennen. Die Mischung auf drei nacheinander gestapelte vorgekühlte Edelstahlsiebe (jeweils 20/30/40 Maschen) geben und die Siebe schütteln.
- Da die Köpfe das 40-Mesh-Sieb nicht passieren können, streichen Sie die Fliegenköpfe mit einer Bürste vom 40-Mesh-Sieb, übertragen Sie sie in konische 50-ml-Rohre und lagern Sie sie bei -80 ° C.
- Sammeln Sie die Fliegen und ihre Köpfe kontinuierlich ein und lagern Sie sie in einem -80 ° C Gefrierschrank, bis sie die erforderliche Menge für das Experimentieren (0,5 g) erreichen. Um 0,5 g Köpfe zu sammeln, werden typischerweise 35 ml Fliegen in einem 50 ml konischen Schlauch benötigt. Die benötigten Materialien sind Tabelle 3 zu entnehmen.
3. Drosophila TRP-Kanalreinigung
- Insgesamt 0,5 g Köpfe wiegen und mit einem vorgekühlten Mörserstößel vollständig in flüssigem Stickstoff homogenisieren. Die homogenisierten Köpfe werden in einem 10x V/W-Lysepuffer (5 ml) aufgelöst, in einem Shaker bei 4 °C für 20 min inkubiert und dann bei 20.817 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Sammeln Sie den Spin-down-Überstand ("20817 g S", Abbildung 4) und zentrifugieren Sie ihn bei 100.000 x g für 60 min bei 4 °C. Verwenden Sie den Spin-down-Überstand ("100.000 g S", Abbildung 4) für den folgenden Pulldown-Assay.
- Geben Sie 1 ml Ni-Perlen in die Schwerkraftsäule und waschen Sie die Perlen mit 10 ml doppelt destilliertem H 2 O (ddH2O) bei 4 ° Cfür insgesamt drei Mal. Die Perlen mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer dreimal bei 4 °C ausgleichen.
- 500 μL 600 μM gereinigtes His-markiertes NORPA 863-1095 Protein (3 x 10-7 mol) in die Ni-Säule geben und 30 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.
- Öffnen Sie den Säulenauslasshahn, um die Perlen und den Durchflussanteil zu trennen. Nehmen Sie den Durchflussanteil für die SDS-PAGE-Analyse (NORPA F, Abbildung 4). In diesem Abschnitt werden die Köderproteine auf den Ni-Perlen immobilisiert.
- Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer (10 ml) bei 4 °C und bewahren Sie die Waschfraktion für die SDS-PAGE-Analyse auf (Wash 1, Abbildung 4A). Wiederholen Sie die obigen Schritte und bewahren Sie die Probe für die SDS-PAGE-Analyse auf (Wash 2, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die überschüssigen Köderproteine auf den Ni-Perlen entfernt.
- Fügen Sie den Überstand des Drosophila-Kopfhomogenats nach 100.000 x g Zentrifugation in die Ni-Säule bei 4 °C hinzu, wo das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment immobilisiert wurde.
- Den Überstand mit den Ni-Perlen bei 4 °C für 30 min inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf. Öffnen Sie dann den Säulenauslasshahn, um die Perlen und die Durchflussfraktion zu trennen.
- Sammeln Sie den Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Drokopflyse F, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die INAD-Proteinkomplexe (INAD/TRP/ePKC) in den Kopfhomogenaten von den immobilisierten NORPA 863-1095-Fragmenten auf den Ni-Perlen eingefangen.
- Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Lysepuffer (10 ml) bei 4 °C und halten Sie den Überstand aus Schwerkraftniederschlag für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 3, Abbildung 4A). Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Überstand für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 4, Abbildung 4A). In diesem Abschnitt werden die ungebundenen Proteine auf den Ni-Perlen entfernt.
- 500 μL 600 μM GST-markiertes TRP 1261-1275-Protein (3 x 10-7 mol) in die Ni-Perlen geben und 20 min bei 4 °C inkubieren. Setzen Sie die Perlen alle 10 Minuten auf.
- Sammeln Sie den eluierten Anteil aus der Schwerkraftsäule (TRP E1, Abbildung 4B), die den endogenen Drosophila TRP-Kanal enthält. Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Elutionsanteil (TRP E2, Abbildung 4B). In diesem Schritt werden unter Verwendung der GST-getaggten TRP 1261-1275-Fragmente als Konkurrenten die TRP-Kanäle aus den eingefangenen INAD-Proteinkomplexen (INAD/TRP/ePKC) auf den Ni-Perlen eluiert.
- Waschen Sie die Ni-Beads mit 10 Säulenvolumina Bindungspuffer (10 ml; Tabelle 1) bei 4 °C und sammeln Sie die Waschfraktion für die SDS-PAGE-Analyse (Wash 5, Abbildung 4B).
- 500 μL Elutionspuffer (Tabelle 1) in die Ni-Beads geben und 20 min bei 4 °C inkubieren. Sammeln Sie den Elutionsanteil aus der Schwerkraftflusssäule (NORPA E1, Abbildung 4B). Wiederholen Sie die obigen Schritte und sammeln Sie den Elutionsanteil (NORPA E2, Abbildung 4B).
- Mit dem Elutionspuffer das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment zusammen mit den INAD/ePKC-Proteinkomplexen eluieren. Als nächstes suspendieren Sie die Ni-Beads in 500 μL Bindungspuffer.
- Nehmen Sie die resuspendierten Ni-Perlen, um die SDS-PAGE (gefärbt durch Coomassie blue R250) auszuführen, um die Effizienz der Elution zu analysieren und zu bewerten, ob der Elutionspuffer funktioniert (Perlen, Abbildung 4B). Die benötigten Materialien sind Tabelle 4 zu entnehmen.
4. Größenausschlusssäulenreinigung des Drosophila TRP-Kanals
- Installieren Sie eine Größenausschlusssäule (analytische Qualität) auf dem Proteinreinigungssystem. Ausgleich der Säule mit dem Säulenpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), der durch einen 0,45 μm Filter gefiltert wird.
- Konzentrieren Sie die TRP E1- und E2-Fraktion aus Schritt 3.14 mit einer 4-ml-Ultrafiltrationsspinsäule, die bei 3.000 x g bei 4 °C in einer gekühlten Zentrifuge zentrifugiert wird.
- Spülen Sie die Probenschleife mit dem Spaltenpuffer und laden Sie die Probe in die Probenschleife. Injizieren Sie die Probe in die Größenausschlusssäule und eluieren Sie die Proteine mit einer geeigneten Durchflussrate (0,5 ml/min).
- Identifizieren Sie den Peak des Zielproteins durch Absorption bei 280 nm und lassen Sie ein SDS-PAGE-Gel laufen, um den gereinigten endogenen Drosophila-TRP-Kanal nachzuweisen (Abbildung 5). Die benötigten Materialien sind Tabelle 5 zu entnehmen.
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Representative Results
In diesem Artikel wird eine Proteinreinigungsmethode zur Reinigung des endogenen Drosophila-TRP-Kanals demonstriert (Abbildung 1).
Zuerst werden rekombinante Proteinexpression und -reinigung angewendet, um die Köder- und Konkurrenzproteine zu erhalten. Dann wird ein GST-markiertes TRP 1261-1275-Fragment in E. coli BL21 (DE3)-Zellen in LB-Medium exprimiert und mit Glutathionkügelchen und einer Größenausschlusssäule gereinigt (Abbildung 2). Die Proben wurden mittels SDS-PAGE-Analyse mit Coomassie-blauer R250-Färbung verifiziert. Bei der SDS-PAGE-Probenvorbereitung werden 30 μL Proteinprobe mit 10 μL 4x Belastungsfarbstoff gemischt und bei 100 °C für 10 min gekocht. Dann werden 15 μL gekochte Probe einzeln in jede Vertiefung geladen. Das mit His-markierten NORPA 863-1095-Fragment wird auch in ähnlicher Weise in E. coli BL21 (DE3)-Zellen in LB-Medium exprimiert und durch Ni-Perlen und Größenausschlusssäule gereinigt (Abbildung 3). Die gereinigten GST-markierten TRP 1261-1275 und His-tagged NORPA 863-1095 sind für die Reinigung des endogenen Drosophila TRP-Kanals konzentriert.
Zweitens werden Drosophila-Köpfe gesammelt und in flüssigem Stickstoff mit einem vorgekühlten Mörserstößel homogenisiert und dann in einem 10-fachen v/w-Lysepuffer gelöst (Tabelle 4). Das gelöste Kopfhomogenat wird in einem Shaker bei 4 °C für 20 min inkubiert und bei 20.817 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Spin-Down-Überstand (20817 g S, Abbildung 4A) wird gesammelt und bei 100.000 x g für 60 min bei 4 °C weiter zentrifugiert. Der zweite Spin-Down-Überstand (100.000 g S, Abbildung 4A) wird für den anschließenden Pull-Down-Assay verwendet.
Schließlich wird auf der Grundlage der Prinzipien des Pulldown- und Wettbewerbstests die Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie verwendet, um den endogenen TRP-Kanal zu reinigen. Das gereinigte His-markierte NORPA 863-1095-Fragment ist an Ni-Perlen gebunden und wird als Köder verwendet, um die endogenen INAD-Proteinkomplexe aus Drosophila-Kopfhomogenaten abzubauen. Dann wird ein übermäßig gereinigtes GST-markiertes TRP 1261-1275-Fragment hinzugefügt, um um den TRP-Kanal von den erfassten INAD-Komplexen auf den Ni-Perlen zu konkurrieren (TRP E1, TRP E2, Abbildung 4B). Am Ende wird der eluierte TRP-Kanal durch Größenausschlusschromatographie vom übermäßigen GST-markierten TRP 1261-1275-Peptid getrennt (Abbildung 5). Bei der SDS-PAGE-Probenvorbereitung werden 30 μL Proteinprobe mit 10 μL 4x Belastungsfarbstoff gemischt und bei 100 °C für 10 min gekocht. Dann werden die 15 μL Probe einzeln in jede Vertiefung geladen. Als Nebenprodukt können die INAD-ePKC-NORPA 863-1095-Komplexe auch durch Eluieren der Ni-Beads nach TRP 1261-1275-Peptidkonkurrenz erhalten werden (NORPA E1, NORAP E2, Figure 4B). Bei dieser Methode beträgt die typische Ausbeute des endgereinigten Drosophila TRP-Kanals aus 0,5 g Fliegenköpfen 50 μL 3 μM TRP-Protein (1,5 x 10-10 mol). Wenn mehr gereinigte TRP-Kanäle benötigt werden, erhöhen Sie die Anzahl der Fliegenköpfe, Ni-Perlen, Köderprotein und des Konkurrenten entsprechend.
Abbildung 1: Das schematische Diagramm zur Reinigung des endogenen Drosophila-TRP-Kanals. (A) Gereinigte His-markierte NORPA 863-1095 Proteine werden auf den Ni-Perlen immobilisiert. (B) Drosophila-Köpfe werden homogenisiert und der Spin-Down-Überstand nach 100.000 x g Zentrifugation wird zu den NORPA-gebundenen Ni-Beads hinzugefügt, wobei das NORPA 863-1095-Protein als Köder zum Einfangen der endogenen INAD-Proteinkomplexe (INAD/TRP/ePKC) dient. (C) Das mit GST gekennzeichnete TRP 1261-1275-Fragment wird hinzugefügt, um um den endogenen Drosophila TRP-Kanal aus den eingefangenen INAD-Proteinkomplexen zu konkurrieren. (D) Das eluierte TRP-Protein wird durch eine Größenausschlussspalte weiter gereinigt, um das übermäßige TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Kennzeichnung zu trennen. Die roten Pfeile markieren die Elutionspositionen des TRP-Kanals bzw. des GST-markierten TRP 1261-1275-Fragments. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Reinigung des GST-markierten TRP-CT 1261-1275-Proteins durch Glutathionkügelchen und Größenausschlusschromatographie. (A) Reinigungsprofil des GST-markierten TRP-CT 1261-1275-Proteins in einer Größenausschlussspalte (Zubereitungsgrad). Die Fraktionen werden bei 5 ml/Tube gesammelt. Die Fraktionen an der Pfeilposition (Röhrchen 44-48) werden gesammelt und für die anschließende Reinigung des endogenen TRP-Kanals konzentriert. (B) Coomassie blau R250 gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das das mit GST gekennzeichnete TRP 1261-1275-Fragment in der Glutathion-Perlen-Affinitätsreinigung und der anschließenden Reinigung der Größenausschlusssäule zeigt. Der Pfeil zeigt die Position des GST-getaggten TRP 1261-1275 Fragments im SDS-PAGE Gel. Abkürzungen: P: Pellet aus E. coli. BL21 (DE3)-Zelllysat nach Homogenisierung im PBS-Puffer und Zentrifugation bei 48.384 x g; S: Überstand von E. coli. BL21 (DE3) Zelllysat nach Homogenisierung und Zentrifugation bei 48.384 x g; F: Durchflussfraktion nach vorheriger S-Fraktion, inkubiert mit Glutathionperlen für 30 min bei 4 °C; W1 und W2: die erste und zweite Waschfraktion um 10 Säulenvolumina des PBS-Puffers; B: Unelutiertes Protein auf den resuspendierten Glutathionperlen wird mit SDS-PAGE-Gel analysiert, um die Elutionseffizienz zu bewerten; E: Elutionsfraktion aus Glutathionperlen durch Elutionspuffer. Das Pufferrezept für die GST-markierte Proteinreinigung ist in Tabelle 1 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Reinigung des His-tagged NORPA 863-1095 Proteins durch Ni-Perlen und Größenausschlusschromatographie. (A) Reinigungsprofil des NORPA 863-1095-Proteins mit seiner Kennzeichnung in einer Spalte mit Größenausschluss. Durchfluss = 3 ml/min. Die Fraktionen werden bei 5 ml/Tube gesammelt. Die Fraktionen an der Pfeilposition (Rohre 44-49) werden gesammelt und für die anschließende Reinigung des endogenen TRP-Kanals konzentriert. (B) Coomassie blue R250 gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das das mit His-markierte NORPA 863-1095-Protein in der Ni-Säulenreinigung und anschließenden Größenausschlusssäulenreinigung zeigt. Der Pfeil zeigt die Position des mit His-Tags markierten NORPA 863-1095-Proteins im SDS-PAGE-Gel. Abkürzungen: P: Pellet aus E. coli. BL21 (DE3)-Zelllysat nach Homogenisierung im Bindungspuffer und Zentrifugation bei 48.384 x g; S: Überstandanteil von E. coli. BL21 (DE3) Zelllysat nach Homogenisierung und Zentrifugation bei 48.384 x g; F: Durchflussfraktion, nachdem die vorherige S-Fraktion 30 min bei 4 °C mit Ni-Perlen inkubiert wurde; W1 und W2: die erste und zweite Waschfraktion um 10 Säulenvolumina Waschpuffer; B: Nicht eluiertes Protein auf den resuspendierten Ni-Perlen nach der Elution; E: Elutionsfraktionen aus Ni-Beads durch den Elutionspuffer. Das Pufferrezept für die His-getaggte Proteinreinigung ist in Tabelle 2 aufgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Reinigung des endogenen Drosophila TRP-Kanals. Die gesammelten Proben aus jedem Schritt werden von SDS-PAGE analysiert und mit Coomassie-blauem R-250-Farbstoff gefärbt. (A) 20817 g S: überstehende Fraktion der Kopfhomogenate nach 20,817 x g Zentrifugation; NORPA F: Durchflussfraktion von Ni-Perlen nach His-markierter NORPA 863-1095 Fragmentbindung; Wash1 und Wash2: die erste und zweite Waschfraktion von Ni-Perlen durch Lysepuffer nach der His-markierten NORPA 863-1095-Bindung; 100.000 g S: der bisherige 20.817 g S-Überstand wird bei 100.000 x g weiter zentrifugiert und der Überstand für SDS-PAGE gesammelt; Drokopflyse F: Durchflussfraktion von Ni-Beads nach Inkubation mit der 100.000 g S-Probe; Wash3 und Wash4: Waschen von Fraktionen von Ni-Perlen durch Lysepuffer nach Inkubation mit 100.000 g S-Probe. (B) TRP E1 und E2: die ersten und zweiten eluierten TRP-Kanalfraktionen durch das TRP 1261-1275-Fragment mit GST-Kennzeichnung; Wash5: Waschen von Fraktionen von Ni-Beads durch Bindepuffer nach Wettbewerb durch GST-getaggtes TRP 1261-1275; NORPA E1 und E2: die erste und zweite Elutionsfraktion von His-markierten NORPA 863-1095-Fragmenten mit erfassten INAD/ePKC-Komplexen; Perlen: uneluiertes Protein, das nach der Elutionspufferbehandlung in den resuspendierten Ni-Perlen verbleibt. Das Pufferrezept für die endogene Drosophila TRP-Kanalreinigung ist in Tabelle 4 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Reinigung des endogenen Drosophila TRP-Kanalproteins durch Größenausschlusschromatographie. (A) Reinigungsprofil des endogenen Drosophila TRP-Kanalproteins in der Größenausschlussspalte. Durchfluss = 0,5 ml/min. Die Fraktionen wurden bei 0,5 ml/Tube gesammelt. Die Fraktionen an der Pfeilposition (1E8-1F2) wurden gesammelt und konzentriert. (B) Coomassie blaues R-250 gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das das endogene Drosophila TRP-Kanalprotein nach der Reinigung der Größenausschlusssäule zeigt. Die Position des gereinigten endogenen Drosophila TRP-Kanalproteins wird durch den roten Pfeil hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Materialien, die für die Reinigung des TRP 1261-1275-Fragments mit GST-Tag benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Materialien, die für die Reinigung des mit His-Tags versehenen NORPA 863-1095-Fragments benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Materialien, die für die Herstellung von Drosophila-Köpfen benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Materialien, die für die Reinigung des Drosophila TRP-Kanals benötigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: Benötigte Materialien für die Reinigung der Drosophila-TRP-Kanäle mit Größenausschlusssäulen . Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
INAD, das fünf PDZ-Domänen enthält, ist der Hauptorganisator der Drosophila-Fototransduktionsmaschinerie. Frühere Studien zeigten, dass INAD PDZ3 mit exquisiter Spezifität (KD = 0,3 μM) an den TRP-Kanal C-Terminal Tail bindet18. Das INAD PDZ45 Tandem interagiert mit NORPA 863-1095 Fragment mit extrem hoher Bindungsaffinität (KD = 30 nM). Diese Ergebnisse liefern eine solide biochemische Grundlage für die Entwicklung der Affinitätsreinigungs- und Wettbewerbsstrategie, die es ermöglicht, das NORPA CC-PBM-Fragment als Pulldown-Köder zu verwenden, während der TRP C-terminale Schwanz (Fragment 1261-1275) als kompetitives Reagenz fungiert. Daher besteht der erste kritische Punkt für diese Methode darin, den Montagemechanismus des INAD-Komplexes zu verstehen und genügend NORPA- und TRP-Fragmente zu erhalten. Da der TRP-Kanal das Membranprotein ist, das aus der Membran extrahiert und in Lösung stabilisiert werden muss, ist die Verwendung von Reinigungsmittel der zweite kritische Punkt dieser Methode. Als beliebtes Waschmittel für strukturelle und funktionelle Untersuchungen von TRP-Kanälen24,25 wird bei dieser Methode n-Dodecyl-B-D-Maltosid (DDM) verwendet. Wenn die Reinigungsergebnisse unbefriedigend sind, müssen die Eigenschaften des Köderproteins, des Konkurrenzproteins und des Waschmittels sorgfältig überprüft werden. Darüber hinaus kann die Extraktionseffizienz der TRP-Kanäle durch Western Blot mit dem TRP-Antikörper verfolgt werden.
In einer früheren Studie5 wurden teure Streptavidin-Perlen verwendet, um den TRP-Kanal von Fliegenkopfextrakten zu reinigen, was die routinemäßige Reinigung im Labor einschränkt. Daher wurde die Methode durch die Verwendung eines mit His-Tags versehenen NORPA 863-1095-Fragments in Verbindung mit Ni-Perlen verbessert, um die Kosten zu senken und den Ertrag zu steigern. Derzeit reichen die Ausbeuten des gereinigten TRP-Kanals in der verbesserten Methode aus, um ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) negatives Färbeexperiment durchzuführen, bei dem die gereinigten TRP-Kanäle Tetramere bilden (Daten nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass der Reinigungsprozess die Tetramerbildung von TRP-Kanälen nicht stört. Daher wird dieses Protokoll möglicherweise für zukünftige Kryo-EM- und Elektrophysiologie-Experimente geeignet sein.
Da die in den Experimenten verwendeten Konkurrenten (NORPA 863-1095-Fragment, TRP 1261-1275-Fragment) jedoch ähnliche Bindungsaffinitäten mit Wildtypproteinen aufweisen, besteht die Einschränkung dieser Methode darin, dass massive konkurrierende Proteine und Perlen verwendet werden müssen, um das Zielprotein herunterzuziehen. Es wird nicht bequem für Labore sein, die den Köder nicht in großem Maßstab reinigen können.
Eine mögliche zukünftige Anwendung dieser Methode wird darin bestehen, die strukturellen Informationen des Drosophila-TRP-Kanals mit Hilfe von Kryo-EM-Techniken zu untersuchen. Darüber hinaus ist auch die Messung der elektrophysiologischen Eigenschaften von gereinigten endogenen TRP-Kanälen in der künstlichen zweischichtigen Lipidmembran möglich. Darüber hinaus wird es in diesem rekonstituierten Modellsystem interessant sein, die elektrophysiologischen Eigenschaften gereinigter endogener TRP-Kanäle durch Modulation der INAD-Komplexzusammensetzung und Lipidzusammensetzung zu charakterisieren. Schließlich können in Kombination mit Strukturinformationen und elektrophysiologischen Eigenschaften die Gating- und Regulationsmechanismen des TRP-Kanals in Zukunft sorgfältig untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) und der Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (Nr. 2021A1515010796) an W. L. unterstützt. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für die sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
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