Summary
Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.
Abstract
Birincil sicim, hücre yüzeyinden sarkıt sinyali veren Kirpi (Hh) ileten hemen hemen her hücrede bulunan kritik bir sinyal organıdır. Granül hücre öncüsünde (GCP), birincil sicim, Hh sinyal yolunu modüle ederek öncü hücre çoğalmasını düzenleyen önemli bir sinyal merkezi görevi görür. Birincil sicime bağımlı Hh sinyal makinelerinin araştırılması, birincil sicime dinamik lokalizasyonlarını görselleştirmek için yol bileşenlerinin in vitro genetik manipülasyonu ile kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, GCP'lerin birincil kültürlerinde transgenlerin şu anda bilinen elektroporasyon yöntemlerini kullanarak transeksiyonu genellikle maliyetlidir ve genellikle düşük hücre canlılığı ve istenmeyen transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Bu makale, ~%80-90 arasında yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum hücre canlılığı gösteren verimli, uygun maliyetli ve basit bir elektroporasyon protokolü sürmektedir. Bu, birincil GCP kültürlerinde birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yolunun incelenmesi için geçerli olan basit, tekrarlanabilir ve verimli bir genetik modifikasyon yöntemidir.
Introduction
Serebellar GCP'ler, yüksek bollukları ve vivo1,2,3,4'teki Hh sinyal yoluna karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle nöronal progenitör hücre tiplerinde Hh sinyal yolunun makinelerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. GCP'lerde, birincil eksiyum öncü hücrelerin çoğalmasını düzenleyen önemli bir Hh sinyal transdüksiyon merkezi5 görevi görür6,7,8. Birincil sicim üzerindeki Hh sinyal bileşenlerinin in vitro görselleştirmesi, düşük endojen bazal seviyeleri nedeniyle genellikle zordur. Bu nedenle, protein ekspresyon seviyelerinin transgene modifikasyonu ve ilgi geninin florofor etiketlemesi moleküler çözünürlükte yolu incelemek için yararlı yaklaşımlardır. Bununla birlikte, lipozom bazlı transfeksiyon yaklaşımları kullanılarak GCP birincil kültürlerinin genetik manipülasyonu genellikle düşük transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır ve daha fazla moleküler araştırmayı engeller9. Elektroporasyon verimliliği artırır, ancak genellikle fahiş satıcıya özgü ve hücre tipi kısıtlı elektroporasyon reaktifleri gerektirir10.
Bu makale, GCP birincil kültürlerindeki Hh sinyal yolu bileşenlerini manipüle etmek için yüksek verimli ve uygun maliyetli bir elektroporasyon yöntemi sönmektedir. Bu modifiye elektroporasyon protokolü kullanılarak, yeşil floresan protein (GFP) etiketli Yumuşatılmış transgene (pEGFP-Smo) GCP'lere verimli bir şekilde teslim edildi ve yüksek hücre sağkalım ve transfeksiyon oranlarına (%80-90) ulaşıldı. Ayrıca, immünosimyasal lekelemenin kanıt ettiği gibi, transfected GCP'ler, EGFP-Smo'yu birincil cilia'ya aktararak Hh sinyal yolunun yumuşatılmış agonist kaynaklı aktivasyonuna karşı yüksek hassasiyet göstermiştir. Bu protokol, insan ve kemirgen birincil hücre kültürleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreler gibi transfect edilmesi zor hücre türlerinin in vitro genetik modifikasyonu içeren deneyler için doğrudan uygulanabilir ve faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, hayvan taşıma yönergelerine ve Hong Kong Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanan protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Hayvan (Deneylerin Kontrolü) Yönetmeliğini (Cap. 340) takip eden hayvan deney lisansları Hong Kong Hükümeti Sağlık Bakanlığı'ndan alınmıştır. Hayvan çalışmaları HKBÜ Araştırma Ofisi ve Laboratuvar Güvenliği Komitesi tarafından onaylanan hayvan güvenliği etiğine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Deneyim öncesi hazırlık
- Kültür medyası ve tamponların hazırlanması
- Serumsuz ortam (SFM)
- 50 mL SFM hazırlamak için 500 μL 100x L-glutamin ikamesi, 500 μL Penisilin-Streptomisin, 1 mM sodyum piruvat ve 1 M KCl (son 250 μM) ila 49 mL Nörobasal ortam ekleyin.
- SFM'yi 50 mL konik tüplerde 10 mL ve 40 mL'lik 2 aliquot'a bölün ve bir aya kadar 4 °C'de saklayın.
- Sindirim engelleme ortamı: SFM'de %10 FBS
- Sindirim engelleme ortamını hazırlamak için 10 mL'lik SFM aliquot'una 1,1 mL ısı inaktive FBS ekleyin.
- GCP kültür ortamı: B27 ile SFM
- GCP kültür ortamını hazırlamak için, 40 mL'lik bir SFM aliquot'una 800 μL serumsuz B-27 takviyesi ekleyin.
NOT: B-27 takviyeli SFM, 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir. Bununla birlikte, yeni hazırlanmış medya en uygun sonuçları üretir.
- GCP kültür ortamını hazırlamak için, 40 mL'lik bir SFM aliquot'una 800 μL serumsuz B-27 takviyesi ekleyin.
- Diseksiyon tamponu: Glikoz + HEPES ile EBSS
- 10 mM HEPES (4-(2-hidroksetil)-1-piperazineethanesulfonic asit) içeren kalsiyum ve magnezyum içermeyen Earle's Balanced Salt Solution'a (EBSS) 6 g/L glikoz ekleyin.
- Çözeltiyi 0,2 μm şırınd süzgecinden geçirerek sterilize edin ve uzun süreli depolama için 4 °C'de saklayın.
- Sindirim Arabelleği
NOT: Kullanmadan önce yeni bir şekilde hazırlayın.- 2-4 serebellar dokunun sindirimi için 2 mL, 4-10 doku için 4 mL sindirim tamponu hazırlayın. 4 mL sindirim tamponu hazırlamak için, 4 mL EBSS'de 1,5 mg L-sistein (son konsantrasyon 200-400 μg / mL) çözün. Toz tamamen çözünene kadar tüpü tekrar tekrar ters çevirin.
- Çözeltiyi 0,2 μm şırınna filtresi ve 5 mL şırınna kullanarak sterilize edin ve çözeltiyi steril 35 mm hücre kültürü çanağına aktarın.
- 4 μL papain (20 birim/mg stok konsantrasyonundan 1:1.000 seyreltme) ve 40 μL DNase I (0.1 mg/mL'lik son konsantrasyon için 10 mg/mL'lik bir stoktan 1:100 seyreltme) ekleyin.
- Çözeltiyi 37 °C'de bir CO2 inkübatörde en az 30 dakika veya kullanıma kadar kuluçkaya yatırın.
NOT: Bu adım papaini etkinleştirmek için kritik öneme sahiptir. Optimum sonuçlar için, kullanmadan önce 37 °C'de 45 dakikayı aşmayın. Çözeltinin şeffaf hale döndüğünden ve kullanımdan önce beyaz çökeltmeden önce beyaz çökeltmeden emin olun.
- Serumsuz ortam (SFM)
- Kapak örtülerini önceden kaplama
- Kapakları hücre bağlanmasına hazırlamak için, 100 μg/mL poli-D-lizin (PDL, steril dH2O'da 1 mg/mL) ile 12 mm'lik otomatik kapatılmış cam kapakları 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya yaslanın. Kapakları kullanıma kadar aynı PDL çözeltisinde 4 °C'de tutun.
- Birincil hücre kültürü gününde, PDL'yi temiz bir konik tüpte toplayın ve artık PDL'yi çıkarmak için kapakları steril dH2O ile üç kez iyice durulayın.
NOT: PDL yeniden kullanılmak üzere 4 °C'de saklanabilir. - PDL kaplı cam kapak kapaklarını her kuyuya bir kapak kılıfı yerleştirerek 24 kuyulu bir tabağa aktarın.
- Fazla suyu çıkarın ve kapakları tamamen kapatmak için 200-300 μL Matrigel ekleyin (serumsuz DMEM-F12'deki ürün veri çizelgesindeki talimatlara göre yeniden inşa edilmiştir).
- Matrigel'deki kapakları CO2 inkübatöründe 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Hücre tohumlamadan önce Matrigel'i çıkarın. Bu Matrigel, birden fazla yeniden kullanım için 4 °C'de toplanabilir ve saklanabilir.
- Ön plaka kültür yemeğinin hazırlanması
- 60 mm hücre kültürü çanağına 2 mL 100 μg/mL PDL (steril dH2O'da 1 mg/mL PDL stok çözeltisini yeniden inşa edin) 1 saat boyunca 37 °C'de inkübasyon yaparak kaplayın.
- Hücre tohumlamadan hemen önce, kullanılmış PDL'yi temiz bir konik tüpte çıkarın ve toplayın ve birden fazla yeniden kullanım için 4 °C'de saklayın. PDL kaplı kabı steril dH2O ile üç kez durulayın ve yıkayın.
- En fazla 2 tam beyincik dokusundan elde edilen tohum hücreleri için bir adet 60 mm hücre kültürü çanağı kullanın.
- Ek beyincikler için ek kültür yemekleri hazırlayın.
NOT: Ön plaka kültür yemeğinin kullanımı için 2.1.18 ve 2.1.19 adımlarına bakın.
2. Deneysel gün 0
- Fare birincil GCP'lerinin yalıtıcılığı ve kültasyonu
NOT: GCP kültür yöntemi standart bir protokolden değiştirilmiştir ve kısa protokol önceki çalışmamızda kısaca açıklanmıştır.6,11,12. Optimum GCP verimi için, GCP izolasyonu için doğum sonrası (P) gün 6 veya P7 yavrularını kullanın. En iyi hücre canlılığı için aşağıdaki diseksiyon adımları 2.1.6-2.1.10'u mümkün olan en kısa sürede tamamlayın.- Diseksiyon sırasında 37 °C'de prewarm SFM, sindirim engelleme ortamı, kültür ortamı ve Opti-MEM.
- Temiz bir bankta, dezenfeksiyon için tüm diseksiyon aparatlarını% 70 etanolde önsoak.
- 60 mm hücre kültürü çanağını 2-3 mL diseksiyon tamponu ile doldurun ve buz üzerinde soğutun.
- Bölüm 1.1.5'te açıklandığı gibi taze sindirim tamponu hazırlayın ve 37 °C'de sıcak tutun.
- Dezenfeksiyon için yavrunun başını silmek için% 70 etanol kullanın.
- Anestezi olmadan yavrunun kafasını koparın. Başı tutmak için önps kullanın ve yavrunun kafasını kesmek için kafatasının arkasından kesmek için sterilize edilmiş cerrahi makas kullanın. Beyneps kullanarak beyni ortaya çıkarmak için cildi ve kafatasını dikkatlice çıkarın.
- Beyinciği kıstırmak için ön ayak kullanın ve 2.1.3 adımında hazırlanan önceden soğutulmuş diseksiyon tamponunda hızla ıslatın.
- Diseksiyon tamponunda bir diseksiyon mikroskobu altında batırılmış beyincik ile menenjitleri çıkarın. Kan damarı ile zenginleştirilmiş menenjitler, diseksiyon mikroskobu altında pembemsi görünmelidir.
- Tüm menenjitleri teksir kullanarak çıkarın.
NOT: Menenjitsiz bir beyincik beyazımsı bir görünüme sahip olmalıdır. - Görünür orta beyin dokularını ve koroid pleksusunu beyincikten çıkarın.
- Serebellumu, 2.1.4 adımında hazırlanan ılık sindirim tamponu ile önceden doldurulmuş 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın. Fazla diseksiyon arabelleği aktarmaktan kaçının. Beyincikleri mümkün olduğunca çabuk mikrospring makası kullanarak ince parçalara ayırın.
- Kıyılmış beyincikleri 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe 15 dakika boyunca hemen kuluçkaya yatırın. 4'ten fazla beyincik işlenecekse kuluçka süresini 20 dakikaya uzatın.
NOT: Kuluçkadan sonra doku bir araya gelecektir. - Sindirilen dokuyu hemen sindirim engelleme ortamına sahip bir P1000 pipet ucu kullanarak yeni bir steril 15 mL santrifüj tüpünün dibine aktarın (sindirim tamponunun aktarılmasından kaçının).
- Sindirimi sonlandırmak için uygun miktarda sindirim engelleme ortamı (1 beyincik için 1 mL) ekleyin ve dokuyu tek hücreli bir süspansiyona daha fazla ayrıştırmak için bir P1000 mikropipette kullanarak 30 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Hava kabarcığı oluşumundan kaçının.
- Hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 μm hücre süzgeçten yeni bir steril santrifüj tüpüne hafifçe geçirin.
- Hücre süzgecinden kalan hücreleri toplamak için hücre süzgecinden ilave 1 mL taze sindirim engelleme ortamı geçirin.
- Filtratı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjlayın. Üstnatantı çıkarın ve peletin 1 mL SFM ile yeniden süzülür. Bu adımı iki kez yineleyin. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
- Peleti 2 mL GCP kültür ortamının son hacminde yeniden atın ve hücre süspansiyonunu 1.3 adımda hazırlanan PDL kaplı 60 mm ön plaka kültür çanağına aktarın. Co2 inkübatörde 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır.
NOT: 20 dakikayı aşmayın. - Kuluçkadan sonra, gevşek yapışan GCP hücrelerini yerinden çıkarmak için kültür kabına yandan dokunun. Bir P1000 pipet kullanarak hafif pipetleme yaparak, yapışan GCP hücrelerini kültür ortamında toplayın. Bu GCP süspansiyonu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne toplayın. 60 mm'lik tabağı atın.
NOT: Güçlü yapışan astroglia ve fibroblast hücreleri 60 mm'lik çanak tabanına bağlı kalacak ve bu adımda ayrılacaktır. Bu adımın atılması GCP kültürünün saflığını tehlikeye atacaktır. - Hücreleri sayın ve hemen elektroporasyona geçin.
- Gün in vitro (DIV) 0: Hh reseptör transgene overexpression için elektroporasyon: pEGFP-Smo
- 2 mm boşluklu cuvette kullanarak elektroporasyon için, elektroporasyonun her reaksiyonu için aşağıdaki plazmid hücreli elektroporasyon karışımını hazırlayın: 100 μL'de 1.2 × 106 hücre ve 10 μg pEGFP-mSmo (DNA stok konsantrasyonunu Tris-EDTA tamponunda veya steril dH2O'da ~2-5 μg/ μL'ye ayarlayın) Opti-MEM'in 100 μL'sinde.
NOT: Hücreler yetersizse toplam hücre sayısını azaltın (ancak bu elektroporasyon verimliliğini azaltabilir). Ancak, cuvette başına kullanılan plazmid miktarını veya opti-MEM'in toplam hacmini ayarlamayın. Deney için gereken toplam hücre sayısı 1,5 × 106 hücreyi aşarsa, elektroporasyon karışımını buna göre ölçeklendirin ve birden fazla elektroporasyon reaksiyonunu ayrı ayrı gerçekleştirin. Cuvette 5 kata kadar yeniden kullanılabilir. - Kaplamalı kapaklar içeren 24 kuyulu kültür plakasının her kuyusuna 0,5 mL kültür ortamı ekleyerek (adım 1,2'den itibaren) elektroporasyon sonrası hücre tohumlama plakasını hazırlayın ve bir CO2 inkübatörde 37 °C'de sıcak tutun.
- Adım 2.1.20'den itibaren, gerekli sayıda hücreyi steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetle atın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 × g'da döndürün. Tüpte artık kültür ortamı olmadığından emin olmak için bu adımı Opti-MEM ile iki kez tekrarlayın
NOT: 24 kuyulu bir plakanın her kuyusu/kapağı için, kültürün ertesi gününde ~%70-75 hücre izdiahını elde etmek için elektroporat ve tohum 1.2-1.3 × 106 hücre/kuyu. - Tablo 1'de gösterildiği gibi elektroporasyon parametrelerini ayarlayın.
- Elektroporasyon reaksiyonunu nazikçe karıştırarak iyice karıştırın ve karışımın 100 μL'lik tam hacmini 2 mm boşluk cuvette'e aktarmak için uzun bir P200 ucu kullanın. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
- Cuvette'i cuvette odasına yerleştirin.
- Elektroporatör Ω düğmesine basın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve ~30-35 olması gereken empedans değerini not edin. Elektrik empedans değerinin Ω 30-35 aralığına düşmesini sağlamak için 100 μL'lik hassas bir hacme uyun.
- Nabzı başlatmak için başlat düğmesine basın.
- Okuma çerçevesinde gösterilen ölçülen akım ve joules değerlerini kaydedin.
- Cuvette'i cuvette odasından çıkarın.
- Hemen cuvette içine 100 μL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin ve 2-3 kez yukarı ve aşağı hafif pipetleme ile yeniden dürtmek. Hücre süspansiyonu derhal adım 2.2.2'de hazırlanan 24 kuyu plakasına aktarın.
NOT: Hücre ölümünü en aza indirmek için, elektroporasyondan hemen sonra hücreleri tohumlayın. - Hücreleri 37 °C'de bir CO2 inkübatöründe kuluçkaya yatırın. Hücre ayrılmasını önlemek için hücreleri 3 saat boyunca bozulmadan bırakın.
- 3 saat sonra tohumlama, hafifçe aspire ve yüzen ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak ve aynı miktarda önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirmek için süpernatant ortamın yarısını atın.
- Hücreleri CO2 inkübatöründe 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve her gün ortamın yarısını yeniler.
- Ertesi gün floresan mikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin, yani Smo aşırı ifadenin verimliliğini belirlemek için GFP sinyali için DIV1 (Şekil 1).
- Ortamın yarısını yeniledikten sonra DIV 1'deki Hh sinyal yolunun uyarılması için, kontrole eşit miktarda DMSO eklerken hücrelere 0,2 μM Yumuşatılmış agonist (SAG) ekleyin. Hücre fiksasyonu öncesinde 24 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: DMSO/SAG'nin ses düzeyini mümkün olduğunca düşük tutun. Burada kuyu başına 500 μL orta başına 0,5 μL DMSO veya 0,5 μL SAG eklendi, bu da 1:1.000 seyreltme oranıdır.
- 2 mm boşluklu cuvette kullanarak elektroporasyon için, elektroporasyonun her reaksiyonu için aşağıdaki plazmid hücreli elektroporasyon karışımını hazırlayın: 100 μL'de 1.2 × 106 hücre ve 10 μg pEGFP-mSmo (DNA stok konsantrasyonunu Tris-EDTA tamponunda veya steril dH2O'da ~2-5 μg/ μL'ye ayarlayın) Opti-MEM'in 100 μL'sinde.
3. DIV 2: Birincil cilia'nın görselleştirilmesi ve Hh sinyal yolunun araştırılması
- Hücre fiksasyonu
- Tedavi sonrası 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri yerinden çıkarmaktan kaçınırken tek kullanımlık bir Pasteur pipet kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) ile hücreleri 2-3 kez durulayın.
- %4 paraformaldehitin ~400 μL'sini ekleyerek hücreleri sabitle (PBS'de hazırlanır) ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Tek kullanımlık pastör pipet kullanarak PBS ile 2-3 kez durulayın ve yıkayın.
- PBS'de 4 °C'de 2 aya kadar saklayın veya immün yetmeye devam edin.
- GCP'lerin ve primer sicim belirtecinin immünostokimyasal boyanma
- 24 kuyulu bir tabakta, pbs'de hücreleri her seferinde 5 dakika hafifçe sallayarak iki kez yıkayın.
- Hücreye 0,5 mL 100 mM amonyum klorür ekleyin ve fiksatifi söndürmek için RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Bir kez durulayın ve PBS ile her seferinde 10 dakika hafifçe sallanarak 2-3 kez yıkayın.
- Hafifçe pipet 30 μL blokaj tamponu (BB: %0,1 Triton X-100, %1 BSA, PBS'de %2 ısı inaktive at serumu) hava kabarcıkları olmadan bir damlacık oluşturmak için bir parafilm parçasına.
- Kapak kapağını kuyudan bb damlasına yavaşça aktarın ve hücre tohumlu taraf aşağı bakacak şekilde aktarın. Rt'de 1 saat boyunca nemli bir odada BB ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Birincil antikor karışımını Malzeme Tablosunda gösterildiği gibi BB'de hazırlayın. Birincil antikor içeren hücreleri araştırmak için, BB'yi birincil antikor karışımıyla değiştirerek 3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını tekrarlayın. RT'de 2 saat boyunca birincil antikor ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
- Tokmakları kullanarak, kapakları hücre tohumlu tarafı yukarı bakacak şekilde 24 kuyu plakasına geri aktarın. Hücreleri bir kez durulayın ve PBS'de her seferinde 10 dakika hafif sallanarak 3-4 kez yıkayın.
- malzeme tablosunda gösterildiği gibi ikincil antikor karışımını BB'de hazırlayın. Hücreleri ikincil antikorla kuluçkaya yatırmak için, BB'yi ikincil antikor karışımıyla değiştirerek 3.2.4 ve 3.2.5 adımlarını tekrarlayın. RT'de 1 saat karanlıkta kuluçkaya yaslanın.
- İkincil antikor inkübasyon yıkama için 3.2.7 adımını tekrarlayın.
- Kapak kapağını montaj ortamını kullanarak temiz bir mikroskobik cam kaydırağa monte edin.
- Slaytı bir gecede karanlıkta havayla kurulayın ve konfokal görüntülemeye geçin13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opti-MEM'i ( Bkz. Malzeme Tablosu) evrensel reaktif olarak kullanarak, önerilen bu elektroporasyon metodolojisi ~%80-90 oranında sürekli olarak yüksek elektroporasyon verimliliği elde edebilir (Şekil 1). Smo-EGFP vektörün elektroporasyon verimliliği, tüm eşleştirilmiş kutu protein-6 (Pax6) ifade eden GCP hücrelerindeki yeşil floresan pozitif hücrelerin yüzdesinin ölçülmesiyle DIV 2 post electroporation'da belirlendi. DMSO ve SAG ile işlenmiş grupların elektroporasyon verimliliği karşılaştırılabilir göründü (Şekil 1 ve Tablo 2).
Ek olarak, birincil siliyum işaretleyici Arl13b'nin immünostainasyonu, kültürün DIV 2'sinde GCP'nin siliasyon oranının hem araç hem de SAG ile tedavi edilen gruplarda ~% 18 olduğunu göstermektedir (DMSO: % 17.35 ±% 0.59; SAG: %18,24 ± %0,88). Siliasyon oranı, DIV 2 post elektroporasyonunda (Şekil 2 ve Tablo 3) hücre yüzeyinde birincil siliyum (Arl13b-pozitif) taşıyan Pax6 eksprese edici GCP'lerin yüzdesi olarak gösterilmiştir.
Birincil sicime bağımlı Hh sinyal yolunu çözmek için, Smo'nun bir agonisti olan SAG, Hh sinyal yolunu etkinleştirmek için kullanıldı. Hh yolu aktivasyonunda, Smo reseptörü birincil cilium14'ün aksonumlarında zenginleştirilir. Sonuçlarımız, SAG tedavisi sonrası 24 saat (Şekil 3, önceki çalışmalardan değiştirilen nicelik verileri6) Pax6 eksprese edici GCP hücrelerinin birincil sicim aksonum akoneminde önemli ölçüde artmış Smo-EGFP lokalizasyonunu göstermektedir ve birincil selyum bağımlı Hh sinyal yolunun derin bir aktivasyonunu göstermektedir.
Şekil 1: Elektroporasyon kurulumu ve GCP'lerin elektroporasyon verimliliği. (A) Elektroporasyon kurulumu. Doğru, siyah ok ucu elektroporasyon cuvette anlamına geliyor. (B, C) Temsili görüntüler, tüm Pax6 ekspresyonlu GCP hücrelerindeki GFP pozitif hücrelerin yüzdesinin ölçülmesiyle belirlenen Smo-EGFP vektörün elektroporasyon verimliliğini gösterir (Tablo 2). Temsili görüntüler, (B) DMSO ve (C) SAG ile 24 saat tedaviden sonra DIV 2 post elektroporasyondaki Pax6 ekspresyonlu (mor) GCP hücrelerindeki yeşil floresan sinyallerini tasvir eder. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmişti. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: GCP'ler = granül hücre öncülleri; GFP = yeşil floresan protein; Pax6 = eşleştirilmiş kutu protein-6; DIV = gün in vitro; DMSO = dimetil sülfit; SAG = Yumuşatılmış agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GCP birincil kültürünün DIV 2'sinde iklimlenme yüzdesi. (A, B) Temsili görüntüler, GCP birincil kültürünün DIV 2'sinde siliasyon yüzdesini tasvir ediyor. Temsili görüntüler, (A) DMSO ve (B) SAG ile 24 saat tedaviden sonra DIV 2 post elektroporasyondaki Pax6 ifadeli (kırmızı) GCP hücrelerinde birincil cilia (yeşil) tasvirini salmıştır. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmişti. Birincil eksiyum (yeşil) beyaz ok uçları ile gösterilir. Ölçek çubukları = 20 μm. (C) Grafik, 4 bağımsız deneyin nicelik verilerini gösterir. İstatistiksel analiz, Eşleşmeyen Öğrenci'nin t testi. Hata çubukları ±SEM. Kısaltmaları: GCP = granül hücre öncüsü; Pax6 = eşleştirilmiş kutu protein-6; DIV = gün in vitro; DMSO = dimetil sülfit; SAG = Yumuşatılmış agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole; n.s. = Önemli değil; SEM = ortalamanın standart hatası; Arl13b = ADP ribosilasyon faktörü benzeri protein 13B . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SAG tedavisi üzerine Pax6 ekspresyonlu GCP hücrelerinin birincil silyumunda artan Smo lokalizasyonu. (A) Temsili görüntüler, DMSO ve SAG ile 24 h tedaviden sonra DIV 2 post elektroporasyonda Pax6 ekspresyonlu (mor) GCP hücrelerinde birincil siçyum (kırmızı, beyaz kare kutu) üzerinde Smo-EGFP lokalizasyonunu (yeşil) tasvir ediyor. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmişti. Ölçek çubukları = 5 μm. (B) Grafik, 4 bağımsız deneyin nicelik verilerini gösterir. İstatistiksel analiz, eşleşmeyen öğrenci t testi. P ≤ 0.001. Hata çubukları ± SEM'i tasvir edin. DMSO grubu için toplam n = 97, SAG grubu için toplam n = 130. Şekil 3B 6'dan değiştirildi. Kısaltmalar: GCP = granül hücre öncüsü; Smo = Yumuşatılmış; Pax6 = eşleştirilmiş kutu protein-6; DIV = gün in vitro; DMSO = dimetil sülfit; SAG = Yumuşatılmış agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole; SEM = ortalamanın standart hatası; Arl13b = ADP ribosilasyon faktörü benzeri protein 13B . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Poring Darbe Ayarı | Darbe Ayarını Aktar | |||
| Fare Birincil GCP'leri | Birincil nöronlar | Fare Birincil GCP'leri | Birincil nöronlar | |
| Gerilim | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| Uzunluk | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Ara | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Hayır. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| D oranı | 10% | 10% | 40% | 40% |
| Po -larite | + | + | ± | ± |
Tablo 1: Süper Elektroporatör NEPA21 TIP II kullanan fare birincil GCP'lerinin ve birincil nöronların elektroporasyon parametreleri. Kısaltma: GCP = granül hücre öncüsü.
| Elektroporasyon verimliliği | Eks. 1 (n = 486) | Eks. 2 (n = 1314) | Eks. 3 (n = 704) | Eks. 4 (n = 476) | Ortalama |
| DMSO ile işlenmiş grup | 90.57% ± 10.12% | 96.62% ± 3.09% | 98.89% ± 0.97% | 90.72% ± 11.31% | 94.02% ± 1.36% |
| SAG ile işlenmiş grup | 91.8% ± 8.69% | 79.97% ± 2.77% | 89.35% ± 5.67% | 88.59% ± 13.54% | 87.42% ± 1.71% |
| Ortalama Elektroporasyon verimliliği | 91.31% ± 7.99% | 88.27% ± 10.81% | 94.12% ± 6.36% | 89.65% ± 11.21% | 90.84% ± 0.84% |
Tablo 2: Tüm Pax6 ekspresyel GCP hücrelerinde GFP pozitif hücrelerin rekoltesinin Smo-EGFP vektörüdeterminedquantification elektroporasyon verimliliği. Dört bağımsız deneyin verileri (Exp.) gösterilir. (Toplam n = 2980). Kısaltmalar: Smo = Yumuşatılmış; GFP = yeşil floresan protein; GCP = granül hücre öncüsü; Pax6 = eşleştirilmiş kutu protein-6.
| Eks. 1 | Eks. 2 | Eks. 3 | Eks. 4 | ortalama | |
| Siliasyon oranı - DMSO | 18.88% ± 3.61% | 19.58% ± 7.42% | 16.60% ± 1.48% | 14.35% ± 7.99% | 17.35% ± 0.59% |
| Siliasyon oranı - SAG | 13.93% ± 3.39% | 17.30% ± 2.15% | 22.19% ± 10.35% | 19.56% ± 1.15% | 18.24% ± 0.88% |
Tablo 3: GCP birincil kültürünün DIV 2'deki iklimlenme yüzdesi. Dört bağımsız deneyin verileri (Exp.) gösterilir. (DMSO grubu için toplam n = 1169, SAG grubu için toplam n = 816). Kısaltmalar: GCP = granül hücre öncüsü; DIV = gün in vitro; DMSO = dimetil sülfit; SAG = Yumuşatılmış agonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birincil GCP kültüründeki transjenlerin elektroporasyon yöntemi ile transeksiyonu tipik olarak düşük hücre canlılığı ve zayıf transeksiyon verimliliği9,10 ile ilişkilidir. Bu makale, yüksek verimlilik ve canlılık gösteren uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir elektroporasyon protokolü salamıştır. Ek olarak, birincil GCP hücrelerinde birincil sicime bağımlı Hh sinyal yolunu incelemek için basit bir yöntem de gösteriyoruz.
Diğer yaygın elektroporasyon yöntemleri genellikle belirli üreticilerden satın alınması gereken maliyetli hücre tipine özgü elektroporasyon reaktifleri gerektirir. Burada açıklanan yöntem, farklı hücre tipleri için ortak ve ekonomik bir elektroporasyon reaktifi kullandığı için olumlu kabul edilir. Ayrıca, bu veriler elektroporasyon verimliliğinin ~ 80-90% 'e ulaştığını ve bunun diğer elektroporasyon ve transfeksiyon yöntemlerine kıyasla oldukça verimli olduğunu göstermiştir9,10.
Daha yüksek hücre canlılığını korumak için, dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır. Beyincik diseksiyonu ve dissosilasyon işlemleri mümkün olan en kısa sürede 1-2 saat içinde tamamlanmalıdır. Bir diğer kritik adım, elektroporasyon sırasında darbelerden önce plazmid hücreli elektroporasyon karışımında kabarcık oluşumunu önlemektir. Bakliyatlardan sonra, cuvettes ve hücrelere mümkün olduğunca çabuk tohumlanan ön ısıtmalı kültür ortamı hemen eklenmelidir. Hücreler ilk 3 saat hücre sonrası tohumlamada bozulmamalıdır. Yukarıda belirtilen önlemler, kültürün ikinci gününde hücre canlılığını yaklaşık% 70-80'e kadar artıracaktır.
Birincil kültür platformunda birincil siliumu incelemenin önemli bir sınırlaması, kültürlü hücrelerdeki siliasyon oranının genellikle in vivo olarak gözlemlenenden daha düşük olmasıdır. Önceki veriler 6 , GCP'de hem E15.5 hem de P15'te in vivo siliasyon oranının yaklaşık% 60-80 olduğunu gösterdi. Buna karşılık primer GCP kültüründe in vitro siliasyon oranı ~%20 6 idi. Bununla birlikte, bu, in vitro ve in vivo çalışmalar arasındaki siliasyon oranını karşılaştırırken çoğu (hepsi olmasa da) hücre tiplerinde ayırt edilebilir genel bir fenomendir.
Özellikle, bu yöntem, elektroporasyon parametresinin değiştirilmesiyle elde edilebilen nöral progenitör hücreler ve kortikal ve hipokampal nöron kültürü gibi diğer birincil kültürler için de geçerlidir, yani darbe voltajını, uzunluğunu ve darbe sayısını incelemek. Bu protokolün uygulanmasını daha geniş bir çalışma alanına genişletmek için, birincil nöronlar için önerilen elektroporasyon parametreleri Tablo 1'de verilmiştir. Buna ek olarak, bu protokolde kullanılan evrensel elektroporasyon reaktifi, yani Opti-MEM, reaktif uyumluluğu açısından optimizasyon gerektiren diğer elektroporasyon protokollerine kıyasla ek sıkıcı optimizasyon çabalarını önlemeye de yardımcı olur. Birincil GCP kültürlerinde primer sekiyum ve Hh sinyalinin araştırılması için bu optimize edilmiş, uygun maliyetli elektroporasyon protokolü, birincil kültürler kullanılarak diğer birincil eksiyum ile ilgili çalışmalar için referans prosedürü olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma HKBU Tohum Fonu ve Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) tarafından C.H.H. Hor'a desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
