Summary
El presente protocolo describe un modelo único y clínicamente relevante de enfermedad arterial periférica que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa para inducir gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB. La perfusión Intracardíaca DiI se utiliza para obtener imágenes tridimensionales de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie.
Abstract
La enfermedad arterial periférica (EAP) es una causa importante de morbilidad resultante de la exposición crónica a factores de riesgo ateroscleróticos. Los pacientes que sufren de su forma más grave, la isquemia crónica que amenaza las extremidades (CLTI), se enfrentan a deficiencias sustanciales en la vida diaria, incluido el dolor crónico, la distancia limitada para caminar sin dolor y las heridas no cicatrizantes. Se han desarrollado modelos preclínicos en varios animales para estudiar la EAP, pero la isquemia de las extremidades posteriores del ratón sigue siendo la más utilizada. Puede haber una variación significativa en la respuesta al insulto isquémico en estos modelos dependiendo de la cepa de ratón utilizada y el sitio, el número y los medios de interrupción arterial. Este protocolo describe un método único que combina la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS) para inducir de manera confiable la gangrena del footpad en ratones Friend Virus B (FVB) que se asemeja a la pérdida de tejido de CLTI. Si bien todavía se recomiendan los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión, como las imágenes de perfusión Doppler con láser (LDPI), se utiliza la perfusión intracardíaca del colorante lipofílico 1,1'-dioctadecil-3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) para etiquetar la vasculatura. La subscopía de barrido láser confocal de montaje completo permite la reconstrucción tridimensional (3D) de alta resolución de las redes vasculares de la almohadilla del pie que complementa los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión en modelos de isquemia de las extremidades posteriores.
Introduction
La enfermedad arterial periférica (EAP), caracterizada por una reducción del flujo sanguíneo a las extremidades debido a la aterosclerosis, afecta a 6,5 millones de personas en los Estados Unidos y a 200 millones de personas en todo el mundo1. Los pacientes con EAP experimentan una función reducida de las extremidades y calidad de vida, y aquellos con CLTI, la forma más grave de EAP, tienen un mayor riesgo de amputación y muerte con una tasa de mortalidad a 5 años cercana al 50%2. En la práctica clínica, se considera que los pacientes con índices tobillo-brazo (ABI) <0,9 tienen EAP, y aquellos con ABI <0,4 asociados con dolor en reposo o pérdida de tejido tienen CLTI3. Los síntomas varían entre los pacientes con ABI similares dependiendo de la actividad diaria, la tolerancia muscular a la isquemia, las variaciones anatómicas y las diferencias en el desarrollo colateral4. La gangrena de los dedos y las extremidades es la manifestación más grave de todas las enfermedades oclusivas vasculares que dan lugar a CLTI. Es una forma de necrosis seca que momifica los tejidos blandos. Además de la EAP aterosclerótica, también se puede observar en pacientes con diabetes, vasculitis como la enfermedad de Buerger y el fenómeno de Raynaud, o calcifilaxis en el contexto de la enfermedad renal terminal5,6.
Se han desarrollado varios modelos preclínicos para estudiar la patogénesis de PAD/CLTI y probar la eficacia de posibles tratamientos, el más común de los cuales sigue siendo la isquemia de las extremidades posteriores del ratón. La inducción de la isquemia de las extremidades posteriores en ratones se logra típicamente por la obstrucción del flujo sanguíneo de las arterias ilíacas o femorales, ya sea por ligadura de sutura, electrocoagulación u otros medios de constricción del vaso deseado7. Estas técnicas reducen drásticamente la perfusión a la extremidad posterior y estimulan la neovascularización en los músculos del muslo y la pantorrilla. Sin embargo, existen diferencias esenciales dependientes de la cepa murina en la sensibilidad a la lesión isquémica en parte debido a diferencias anatómicas en la distribución colateral8,9. Por ejemplo, los ratones C57BL / 6 son relativamente resistentes a la isquemia de las extremidades posteriores, lo que demuestra una función reducida de las extremidades, pero generalmente no hay evidencia de gangrena en la almohadilla del pie. Por otro lado, los ratones BALB / c tienen una capacidad inherentemente pobre para recuperarse de la isquemia y, por lo general, desarrollan la autoamputación del pie o la parte inferior de la pierna después de la ligadura de la arteria femoral sola. Esta respuesta grave a la isquemia estrecha la ventana terapéutica y puede impedir la evaluación longitudinal de la reperfusión y la función de las extremidades. Curiosamente, las diferencias genéticas en un único locus de rasgo cuantitativo localizado en el cromosoma murino 7 se han implicado en estas susceptibilidades diferenciales de ratones C57BL/6 y BALB/c a necrosis tisular y reperfusión de extremidades10.
En comparación con las cepas C57BL/6 y BALB/c, los ratones FVB demuestran una respuesta intermedia pero inconsistente a la ligadura de la arteria femoral sola. Algunos animales desarrollan gangrena en forma de uñas isquémicas negras o dedos momificados, pero otros sin signos manifiestos de isquemia11. La administración concomitante de clorhidrato de éster metílico de Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME), un inhibidor de la óxido nítrico sintasa (NOS)12, previene los mecanismos vasodilatadores compensatorios y aumenta aún más el estrés oxidativo en el tejido de las extremidades posteriores. En combinación con la ligadura o coagulación de la arteria femoral, este enfoque produce consistentemente una pérdida de tejido de la almohadilla del pie en ratones FVB que se asemeja a los cambios atróficos de CLTI, pero rara vez progresa a autoamputación de extremidades11. El estrés oxidativo es una de las características distintivas de PAD/CLTI y se propaga por disfunción endotelial y disminución de la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO)13,14. El NO es una molécula pluripotente que suele ejercer efectos beneficiosos sobre el flujo sanguíneo arterial y capilar, la adhesión y agregación plaquetaria, y el reclutamiento y activación de leucocitos13. También se ha demostrado que los niveles reducidos de NOS activan la enzima convertidora de angiotensina, que induce estrés oxidativo y acelera la progresión de la aterosclerosis15.
Una vez que se establece un modelo de isquemia de las extremidades posteriores, también se necesita monitorear la reperfusión posterior de las extremidades y el efecto terapéutico de cualquier tratamiento potencial. En el modelo de gangrena murina propuesto, el grado de pérdida de tejido se puede cuantificar primero utilizando la puntuación de Faber para evaluar la apariencia macroscópica del pie (0: normal, 1-5: pérdida de uñas donde la puntuación representa el número de uñas afectadas, 6-10: atrofia de los dígitos donde la puntuación representa el número de dígitos afectados, 11-12: atrofia parcial y completa del pie, respectivamente)9. Las mediciones cuantitativas de la perfusión de las extremidades posteriores se realizan típicamente utilizando LDPI, que se basa en las interacciones Doppler entre la luz láser y los glóbulos rojos para indicar la perfusión a nivel de píxeles en una región de interés (ROI)16. Si bien esta técnica es cuantitativa, no invasiva e ideal para mediciones repetidas, no proporciona detalles anatómicos granulares de la vasculatura de las extremidades posteriores16. Otras modalidades de imagen, como la tomografía microcomputarizada (micro-TC), la angiografía por resonancia magnética (ARM) y la microangiografía de rayos X, resultan costosas, requieren instrumentación sofisticada o son técnicamente desafiantes16. En 2008, Li et al. describieron una técnica para etiquetar los vasos sanguíneos dentro de la retina con el tinte lipofílico de carbocianina DiI17. DiI se incorpora a las células endoteliales y, por difusión directa, tiñe estructuras de membrana vascular como brotes angiogénicos y procesos seudópodos17,18. Debido a su entrega directa en las células endoteliales y la naturaleza altamente fluorescente del tinte, este procedimiento proporciona un marcado intenso y duradero de los vasos sanguíneos. En 2012, Boden et al. adaptaron la técnica de perfusión DiI al modelo de isquemia de las extremidades posteriores murinas a través de imágenes de montaje completo de los músculos aductores del muslo cosechados después de la ligadura de la arteria femoral19.
El método actual proporciona una forma relativamente económica y técnicamente factible de evaluar la neovascularización en respuesta a la isquemia de las extremidades posteriores y la terapéutica basada en genes o células. En una adaptación adicional, este protocolo describe la aplicación de la perfusión DiI para obtener imágenes de la vasculatura de la almohadilla del pie en alta resolución y 3D en un modelo murino de gangrena de las extremidades posteriores.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos en el protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Miami. Para el estudio se utilizaron ratones FVB, tanto machos como hembras, de 8 a 12 semanas de edad.
1. Preparación de la solución L-NAME
- En condiciones estériles en una campana de flujo laminar, prepare una solución madre L-NAME disolviendo 1 g de polvo L-NAME (consulte la Tabla de materiales) con 20 ml de agua estéril para hacer una solución de 50 mg / ml. Almacene la solución madre en alícuotas de 300-500 μL a -20 °C durante un máximo de 3 meses.
- Para hacer una solución L-NAME de trabajo, descongele una alícuota de solución madre L-NAME y diluya con PBS (1:4) en condiciones estériles para obtener una concentración final de 10 mg/ml.
- Para preparar PBS (pH 7.4), disuelva 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na2HPO4 y 0.23 g de NaH2PO4 en 800 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.4 con HCl. Agregue agua a un volumen total de 1,000 ml y filtre a través de un filtro superior de botella de 0.22 μm.
NOTA: La inyección intraperitoneal (IP) de 4 μL/g de solución de trabajo L-NAME es equivalente a la dosis deseada de 40 mg/kg de L-NAME. La solución de trabajo L-NAME debe mantenerse en hielo durante el uso, y se deben hacer nuevas diluciones diariamente utilizando alícuotas recién descongeladas de solución madre.
2. Inducción química y quirúrgica de la gangrena de las extremidades posteriores
- Obtener ratones FVB, de 8 a 12 semanas de edad, ya sea de un criador o criados en las instalaciones (ver Tabla de Materiales). 2 h antes de la cirugía, administrar una dosis IP de 40 mg/kg de L-NAME.
- Anestesiar ratones con inyección IP de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina (ver Tabla de Materiales) diluido en PBS. Confirme la sedación adecuada por la ausencia del reflejo de pellizco del dedo del pie y continúe monitoreando la frecuencia respiratoria durante el procedimiento.
- Retire el vello de las extremidades posteriores bilaterales y las ingles con tijeras y / o una crema depilatoria. Coloque al animal bajo un microscopio quirúrgico supino; extender y pegar con cinta adhesiva las extremidades en su lugar. Esterilizar el campo quirúrgico aplicando circunferencialmente la solución de povidona-yodo en el sitio quirúrgico.
- Con un aumento de 10-20x, use tijeras o un bisturí para hacer una incisión de 1 cm a lo largo del pliegue de la ingle justo inferior al ligamento inguinal. Use fórceps finos y un aplicador de punta de algodón estéril para diseccionar sin rodeos la almohadilla de grasa inguinal lateralmente del ligamento inguinal y exponer la vaina femoral subyacente para que la arteria femoral, la vena y el nervio estén claramente identificados (Figura 1).
- Usando fórceps finos, perfore la vaina femoral. Cepille cuidadosamente el nervio femoral lejos de la arteria femoral. Identificar el despegue de la rama circunfleja lateral de la arteria femoral (LCFA) profunda hasta el nervio femoral (Figura 1).
- Proceda con la electrocoagulación de la arteria femoral y la vena solo proximal al LCFA activando el dispositivo de cauterización (ver Tabla de materiales) y contactando suavemente los vasos con un movimiento de lado a lado, asegurando que el nervio femoral esté bien aislado y permanezca protegido de lesiones térmicas. Divida el segmento del vaso coagulado con tijeras.
- Proceda con la exposición de la arteria y vena femoral distal movilizando la almohadilla de grasa inguinal medialmente. Identificar la arteria epigástrica superficial y la unión safenopoplítea más distalmente.
- Perfore la vaina femoral entre estos dos lugares y diseccione cuidadosamente el nervio femoral lejos de los vasos femorales. Proceder con la coagulación y transección de la arteria y vena femoral como se describe en el paso 2.4.1.
- Irrigar el campo quirúrgico con una jeringa llena de PBS estéril. Obtenga hemostasia aplicando una presión suave con un aplicador de punta de algodón durante 3-5 minutos a cualquier área de sangrado.
- Proceda con el cierre de la incisión utilizando una sutura absorbible de 5-0 de manera simple y continua. Administrar una dosis subcutánea de 1 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida (ver Tabla de Materiales) para el alivio del dolor postoperatorio.
- Confirmar la pérdida de perfusión de la almohadilla del pie en la extremidad posterior ligada por LDPI (ver Tabla de Materiales). Mientras aún esté anestesiado, coloque al animal en una almohadilla de espuma oscura en una posición prona debajo de la máquina LDPI y use bucles de cinta eléctrica para asegurar los pies en su lugar.
- Proceda con LDPI de pies bilaterales. Una vez que se complete el escaneo, dibuje un ROI alrededor de cada almohadilla y obtenga los valores medios de flujo.
- Calcule el índice de perfusión como la relación entre los valores medios de flujo de la almohadilla del pie ligada a la no ligada. Asegúrese de que el índice de perfusión sea inferior a 0,1.
- Transfiera al animal de vuelta a una jaula limpia con una almohadilla térmica o una lámpara de techo para mantener la temperatura corporal central. Asegure la recuperación completa de la anestesia antes de transferir los ratones de regreso a la instalación de animales.
3. Administración postoperatoria de L-NAME y monitorización de la gangrena de las extremidades posteriores
- En los días postoperatorios 1-3, administrar una dosis adicional de 40 mg/kg IP de L-NAME a cada animal. Al mismo tiempo, evalúe cuidadosamente el pie de la extremidad isquémica.
- Cuantificar el grado de isquemia y gangrena de las extremidades posteriores utilizando la puntuación de isquemia de las extremidades posteriores de Faber9. Puntuaciones 1-5: número de uñas isquémicas; puntuaciones 6-10: 1-5 dígitos isquémicos; puntuaciones 11 y 12: atrofia parcial y completa del pie. Registre las puntuaciones de Faber en los días postoperatorios 1-3 y luego semanalmente.
4. Preparación de DiI y soluciones de trabajo para perfusión animal
- Para preparar la solución madre de DiI, disuelva 100 mg de cristales de DiI (ver Tabla de Materiales) en 16.7 mL de etanol 100%. Cubra con papel de aluminio y deje en una plataforma basculante durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Para preparar el diluyente, disuelva 50 g de glucosa en 1.000 ml de agua destilada para producir una solución de glucosa al 5%. Filtre a través de un filtro superior de botella de 0,22 μm. Mezcle PBS y soluciones de glucosa al 5% en una proporción de 1: 4 para preparar una solución de diluyente de trabajo.
5. Configuración del equipo y perfusión DiI
- Haga que la solución de trabajo DiI agregue 200 μL de solución madre DiI a 10 ml de la solución de diluyente de trabajo (preparada en el paso 4.2) inmediatamente antes de su uso. Agitar a mano para mezclar bien.
- Conecte dos o tres llaves de paso de 3 vías y una aguja de mariposa de 25 G en serie. Prepare jeringas de 10 ml con 4 ml de PBS, 10 ml de solución de DiI y 10 ml de formalina tamponada neutra al 10% (consulte la Tabla de materiales).
- Conecte la jeringa con formalina al puerto de entrada proximal e inyecte la solución para eliminar el aire de la línea; gire la llave de paso para cerrar el puerto. Repita el mismo procedimiento secuencialmente, conectando las jeringas con DiI y luego PBS a los puertos de entrada medio y distal, respectivamente, teniendo cuidado de eliminar todas las burbujas de aire a través del conjunto de la llave de paso.
NOTA: Asegúrese de que no haya burbujas de aire en ninguna parte del conjunto o tubo de la llave de paso. Las burbujas de aire pueden ocluir pequeñas arterias durante la perfusión, lo que resulta en una distribución intravascular deficiente de DiI y resultados de imágenes comprometidos. - Una vez que se complete la configuración, eutanasia al animal por sobredosis de CO2 en una cámara de inducción.
- Coloque al animal a perfundir en posición supina sobre una almohadilla absorbente y asegure las axilas y las extremidades inferiores con agujas.
- Usando tijeras, haga una incisión transversal para abrir la cavidad abdominal. Exponga y luego divida el diafragma izquierdo y derecho para acceder a la cavidad torácica.
- Corte la pared torácica a ambos lados del esternón desde las costillas inferiores hasta la primera o segunda costilla, evitando las arterias torácicas internas (mamarias) medialmente. Use un hemostático (ver Tabla de Materiales) para agarrar el extremo inferior del esternón y reflejarlo hacia la cabeza del animal para exponer la cavidad torácica.
- Identifique el ventrículo izquierdo, que parece de color más claro que el ventrículo derecho. Agarre suavemente el corazón con fórceps contundentes e inserte la aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo.
- Use tijeras o una aguja de 18 G para perforar la aurícula derecha, permitiendo que la sangre y las soluciones de perfusión regresen al corazón para drenar. Estabilice la aguja con una o dos manos, teniendo cuidado de no perforar inadvertidamente el ventrículo derecho y perfundir la circulación pulmonar en lugar de sistémica.
- Abra el puerto de la jeringa con PBS e inyecte manualmente 2-4 ml a una velocidad de 1-2 ml / min durante 1-2 minutos para eliminar la sangre del sistema vascular. Asegure una perfusión exitosa mediante la observación del sangrado de la aurícula derecha. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa PBS.
- Abra el puerto a la jeringa con DiI e inyecte 5-10 ml a una velocidad de 1-2 ml / min durante 5 min. Controle las orejas, la nariz y las palmas de las manos que deben volverse ligeramente rosadas con la inyección de solución de DiI. Después de la inyección, cierre el puerto de la jeringa DiI y espere 2 minutos para permitir la incorporación del tinte antes de la inyección del fijador.
- Abra el puerto a la jeringa con formalina e inyecte 5-10 ml a una velocidad de 1-2 ml / min durante 5 min. Después de la inyección, retire la aguja del ventrículo izquierdo y proceda a cosechar los tejidos de interés.
- Usando tijeras pesadas, disloque la tibia en el tobillo, separando completamente los pies izquierdo y derecho de la parte inferior de las piernas. Coloque los pies cosechados en una placa de 6 o 12 pocillos con 1-2 ml de solución de formalina al 10%. Envuelva el plato con papel de aluminio y guárdelo a 4 °C durante la noche.
6. Preparación de tejido de la almohadilla del pie para microscopía de barrido láser confocal
- Al día siguiente, reemplace la solución fijadora en una placa de 6 o 12 pocillos con 1-2 ml de PBS por pozo.
- Para despellejar el pie, primero, haga una incisión longitudinal con un bisturí en los aspectos plantar y dorsal del pie. Luego, usando pinzas dentadas y un pequeño hemostático, retire cuidadosamente toda la piel del pie y los dedos, sin dañar los tejidos blandos subyacentes.
- Proceda al montaje y la obtención de imágenes de los tejidos, preferiblemente dentro de los 1-2 días posteriores a la perfusión y la cosecha. Alternativamente, devuelva las almohadillas a placas de 6 o 12 pocillos con 1-2 ml de PBS; cubrir con papel de aluminio y conservar a 4 °C para mantener la fluorescencia hasta 1 mes.
- Para montar tejidos, coloque individualmente los pies entre dos portaobjetos de microscopio de vidrio con una almohadilla de biopsia de espuma doblada sobre sí misma (una o dos veces dependiendo del grosor del tejido) en cada extremo (consulte la Tabla de materiales). Utilice dos pequeños clips aglutinantes para comprimir las diapositivas de vidrio juntas en cada extremo (espesor final de aproximadamente 1 mm).
NOTA: Los tejidos más gruesos requerirán tiempos de escaneo más largos. La almohadilla para el pie con piel se puede comprimir entre portaobjetos de vidrio un día antes de la toma de imágenes para reducir el grosor del tejido.
7. Microscopía de barrido láser confocal
- Prepárese para la sesión de imágenes: encienda el sistema de imágenes e inicie el software de adquisición (consulte la Tabla de materiales). Utilice un objetivo de baja ampliación/baja apertura numérica (por ejemplo, x5/0.15) para capturar imágenes, ya que las lentes de menor aumento suelen tener distancias de trabajo más largas requeridas para este experimento.
- Haga clic en Sí en el cuadro de diálogo Activar escenario. Active el láser de 561 nm en la ficha Configuración. En la pantalla principal, active una trayectoria de haz visible haciendo clic en el botón Visible . Configure un detector en el rango de 570-600 nm haciendo clic en la casilla de verificación Activo correspondiente.
- Seleccione el icono Escaneo de mosaicos en la pestaña Adquirir > Adquisición y establezca la resolución deseada (512 x 512 o 1024 x 1024).
- Coloque una muestra de tejido montada en seco (sin agua ni PBS agregada) comprimida entre portaobjetos de vidrio en la etapa del microscopio y enfoque el tejido.
- Para establecer los límites de escaneo, desplácese hasta la esquina superior izquierda o derecha de la muestra. En la pestaña Adquisición, en el menú Escaneo de mosaicos, haga clic en el botón Marcar posición . Navegue a la esquina opuesta (abajo a la derecha o a la izquierda, respectivamente) y haga clic en el botón Marcar posición una vez más.
- Para establecer la profundidad de la pila Z, haga clic en el botón Live en la esquina inferior izquierda de la pantalla y navegue hasta el centro de la muestra. Utilice la perilla del eje Z para desplazarse hasta la parte inferior de la muestra.
- En la pestaña Adquisición, en el menú Z-Stack, haga clic en el botón Comenzar . Desplácese hasta la parte superior de la muestra y haga clic en el botón Finalizar . Haga clic en Tamaño del paso Z y configúrelo en el valor deseado (por ejemplo, 50 μm).
- En la esquina inferior derecha de la pantalla, haga clic en Iniciar para comenzar la adquisición de imágenes.
8. Análisis cuantitativo y reconstrucción 3D de la vascularización de la almohadilla del pie
- Descargue e instale la última versión de Fiji (ImageJ), así como el plugin Vessel Analysis20. Abra archivos de imagen de microscopía en Fiji, que combinarán series Z individuales en pilas Z que se pueden ver en el eje z utilizando el control deslizante en la parte inferior de la imagen.
- Seleccione la imagen compuesta de la pila Z y, a continuación, en el menú Imagen, elija Pilas > proyecto Z para crear una proyección bidimensional. A continuación, convierta la proyección Z a binaria en Proceso > binario > Hacer binario.
- Ejecute el complemento Densidad vascular en Complementos > Densidad vascular. Cuando se le solicite, use el cursor para rastrear un ROI alrededor del perímetro del footpad y los dígitos. Tome nota de la densidad de vasos que se informa, que se expresa como un porcentaje del ROI (fracción de área vascular).
- Para crear reconstrucciones 3D en Fiji, seleccione Pilas > proyecto 3D y establezca el eje de rotación, el ángulo y la velocidad deseados en el menú Imagen. Alternativamente, seleccione Volume Viewer en el menú Plugins para visualizar imágenes como segmentos o manipular la reconstrucción en los ejes deseados.
- Para una representación 3D más complicada, utilice un software alternativo de análisis y procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales). Convierta archivos al formato del software deseado y cose escaneos de mosaicos individuales utilizando la funcionalidad de costura de mosaicos.
- Después de unir escaneos de mosaicos individuales, abra el archivo compuesto y proceda con la representación de la superficie del volumen. Haga clic en Agregar nueva superficie para abrir el Asistente para creación de superficies y use las flechas para alternar a través de los menús, en particular estableciendo el ROI y la intensidad del umbral. Una vez satisfecho con la representación de la superficie, utilice la funcionalidad de animación para crear videos de la imagen procesada.
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Representative Results
Este protocolo detalla un medio confiable para inducir isquemia y pérdida de tejido en la almohadilla murina del pie utilizando una combinación de coagulación de la arteria femoral y la vena con la administración de L-NAME, un inhibidor de la óxido nítrico sintasa, en ratones FVB susceptibles. La Figura 1 detalla la anatomía de la vasculatura de las extremidades posteriores murinas e indica los sitios de la arteria femoral y la coagulación venosa (X amarilla), solo proximal a la arteria femoral circunfleja lateral (LCFA) y proximal a la unión safenopoplítea. El LCFA necesita ser identificado, y los sitios de coagulación respectivos a esta estructura se mantienen consistentes a lo largo de todos los procedimientos quirúrgicos. Como se describe, 2 h antes de los procedimientos quirúrgicos y en los días postoperatorios 1-3, a los ratones también se les administró 40 mg / kg IP de L-NAME para mantener niveles elevados de estrés oxidativo en los tejidos. La Figura 2 muestra la variación en la pérdida de tejido que se puede esperar de este modelo una semana después de la cirugía, con puntuaciones de Faber9 registradas en la esquina inferior derecha de cada imagen.
La perfusión DiI se realizó en ratones FVB a los 5 y 20 días después de la coagulación de la arteria femoral y la vena para evaluar la reperfusión de las extremidades posteriores después de la inducción de la isquemia. La Figura 3A ilustra la anatomía murina después de la disección para exponer la cavidad torácica. Se inserta una aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo para comenzar la perfusión cardíaca. Tenga en cuenta que el ventrículo izquierdo parece ligeramente más pálido en color que el ventrículo derecho. La Figura 3B muestra el equipo configurado con llaves de paso conectadas en serie y tres jeringas llenas de PBS, solución DiI y fijador. Después de la perfusión de DiI, los pies fueron cosechados, despellejados y comprimidos entre portaobjetos de microscopio como se muestra en la Figura 3C, D antes de obtener imágenes con un microscopio de escaneo láser confocal con un aumento de 5x. Las imágenes de microscopía de reconstrucción revelaron una anatomía vascular normal en la almohadilla de control no ligada (Figura 4A) en comparación con la perfusión severamente disminuida a la almohadilla del pie de la extremidad posterior ligada 5 días después de la cirugía (Figura 4B). Veinte días después de la cirugía, la perfusión a la almohadilla del pie mejoró significativamente (Figura 4C, D y Figura 5B), aunque no en la medida del control no ligado (Figura 4A y Figura 5A). La vascularización se cuantificó como se describió anteriormente utilizando el complemento Vessel Density en Fiji. La fracción vascular para el footpad de control fue del 28%. Cinco días después de la cirugía, la fracción vascular de la almohadilla del pie se redujo severamente al 2%, pero se recuperó gradualmente al 15% y al 18% en dos ratones separados a los 20 días después de la operación. Para visualizar la anatomía vascular de la almohadilla del pie en 3D, importamos una imagen de microscopía cosida en un software alternativo de análisis y procesamiento de imágenes para crear una representación de superficie como se describió anteriormente (Figura suplementaria 1). A continuación, se creó un vídeo de la representación de la superficie utilizando la funcionalidad de animación (vídeo 1).
Figura 1: Anatomía de la vasculatura de las extremidades posteriores murinas y sitios de la arteria femoral y la coagulación de la vena. La arteria ilíaca externa continúa como la arteria femoral (FA) distal al ligamento inguinal. Las primeras ramas de la arteria femoral incluyen la circunfleja lateral (LCFA) y las arterias femorales profundas (no en la imagen). Más distalmente, las arterias epigástricas caudales proximales (PCFA) y caudales superficiales (SCEA) se ramifican desde la FA proximal hasta la bifurcación de las arterias safena (SA) y poplítea (PA). El nervio femoral (FN) fluye junto a los vasos femorales y debe aislarse suavemente antes de la coagulación de los vasos femorales. Los sitios de coagulación de fa y vena femoral (FV) también están indicados (X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB con las puntuaciones de Faber correspondientes. El grado de cambios isquémicos inducidos por este modelo varía desde una o más uñas isquémicas (puntuaciones de Faber 1-5) hasta dedos gangrenosos (puntuaciones de Faber 6-10) y atrofia parcial o completa del pie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Disección animal y configuración del equipo para la perfusión DiI y montaje del pie de ratón para imágenes. (A) Fotografía anatómica de la anatomía murina durante la perfusión DiI. Las cavidades abdominal y torácica se abren, el esternón se refleja y las costillas se cortan a ambos lados del esternón. Una aguja de mariposa de 25 G conectada al conjunto de la llave de paso se inserta en el ventrículo izquierdo. (B) Tres llaves de paso de 3 vías están conectadas en serie. Tres jeringas de 10 ml se llenan con fijador, DiI y PBS y se conectan al conjunto de la llave de paso. Una aguja de mariposa de 25 G está conectada al puerto de salida de la llave de paso proximal. (C) Montaje del pie despellejado entre dos portaobjetos de microscopio con una almohadilla de biopsia de espuma doblada y un clip aglutinante en cada extremo para comprimir las diapositivas juntas. (D) Una vista alternativa del pie despellejado comprimido entre portaobjetos de microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas 5x obtenidas mediante microscopía de barrido láser confocal de la almohadilla del ratón después de la perfusión DiI con densidad de vasos cuantificada expresada como porcentaje del ROI. (A) Vasculatura normal de la almohadilla del pie. (B) La vasculatura de la almohadilla del pie 5 días después de la coagulación de la arteria femoral y la vena muestra una perfusión severamente reducida con una opacificación mínima de los vasos. (C) La vasculatura de la almohadilla del pie 20 días después de la coagulación de la arteria femoral y la vena demuestra cierta reconstitución del flujo distal a las arterias metatarsiana y digital. (D) Imagen de una almohadilla adicional de ratón obtenida 20 días después de la coagulación de la arteria femoral y la vena que muestra un vaso grande mínimo en comparación con la opacificación microvascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes ampliadas de la vasculatura de la almohadilla del pie. (A) Imágenes 5x y 20x de la vasculatura control de la almohadilla del pie que demuestran una perfusión intacta a través de las arterias metatarsiana y digital. (B) Imágenes 5x y 20x de la almohadilla del pie de la extremidad posterior ligada 20 días después de la operación que muestran una perfusión reducida a través de ramas arteriales metatarsianas más grandes, pero el desarrollo de una red capilar extensa y lujosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Animación de la representación de la superficie 3D de la vasculatura de la almohadilla del pie. El video que muestra una representación superficial de la vasculatura de la almohadilla del pie ilustra la resolución 3D alcanzable con el protocolo descrito. Haga clic aquí para descargar este video.
Figura complementaria 1: Pasos en la representación superficial de imágenes de perfusión DiI. (A) Imagen de perfusión Original DiI importada en software de análisis y procesamiento de imágenes. (B) Representación de superficie superpuesta a la imagen de perfusión DiI durante el ajuste de la intensidad del umbral. (C) Representación final de la superficie 3D de la imagen de microscopía de perfusión DiI. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Si bien la isquemia de las extremidades posteriores del ratón es el modelo preclínico más utilizado para estudiar la neovascularización en PAD y CLTI, existe una variación significativa en la gravedad y la recuperación de la isquemia dependiendo de la cepa específica del ratón utilizada y el sitio, el número y el método de interrupción arterial. La combinación de la ligadura de la arteria femoral y la administración IP de L-NAME puede inducir de manera confiable la gangrena de las extremidades posteriores en ratones FVB11. El mismo tratamiento da como resultado isquemia de las extremidades posteriores sin pérdida de tejido en ratones C57BL / 6, mientras que en ratones BALB / c, la autoamputación del pie o la pierna puede ser inducida solo por la ligadura de la arteria femoral. Como tal, la técnica descrita anteriormente de coagulación de la arteria femoral con administración concurrente de L-NAME en ratones FVB, que tienen una respuesta intermedia al insulto por isquemia, proporciona un modelo único y reproducible de gangrena en la almohadilla del pie similar al observado en la manifestación más grave de enfermedades que conducen a CLTI. El grado de pérdida de tejido observado con este modelo puede variar desde unas pocas uñas isquémicas hasta múltiples dedos gangrenosos, pero rara vez progresa a la autoamputación del pie o la pierna, lo que permite la evaluación longitudinal de la reperfusión y la función de las extremidades. A diferencia de los ratones BALB/c, en los que la aparición de gangrena es rápida con la autoamputación de extremidades que generalmente ocurre en menos de una semana, hay un inicio tardío de la pérdida de tejido en este modelo de gangrena de ratón FVB. La coagulación de la arteria femoral restringe agudamente el flujo sanguíneo a la extremidad posterior. Aún así, la acumulación de estrés oxidativo debido a la administración de L-NAME en los días postoperatorios 0-3 es más gradual, con cambios atróficos máximos observados entre 7-14 días. Por lo tanto, este modelo ofrece una ventana terapéutica mejorada para evaluar los efectos de una intervención particular sobre la apariencia del tejido grueso y el rescate de la pérdida de tejido, además de cuantificar la reperfusión y evaluar la función de las extremidades.
En cuanto a la técnica quirúrgica, se favorece la coagulación o ligadura tanto de la arteria femoral como de la vena debido a la relativa facilidad de esta operación frente al aislamiento de la arteria femoral. Si bien esta técnica puede conducir a trombosis venosa e insuficiencia, agrava el insulto isquémico y ayuda a inducir cambios gangrenosos de manera más confiable. Además, la insuficiencia venosa crónica (IVC) es altamente prevalente en la población general, con un 10%-30% de los adultos afectados. Consistentemente, aproximadamente el 20% de los pacientes con EAP, especialmente aquellos con insuficiencia arterial grave, también tienen CVI comórbida21,22. Independientemente de si uno decide ligar o coagular la vena femoral, es de vital importancia mantener constantes los sitios específicos de interrupción de la arteria femoral en todos los grupos experimentales. Las ligaduras más proximales, como la de la arteria ilíaca, conducen a la oclusión de colaterales adicionales aguas abajo y limitan la posibilidad de arteriogénesis8,16. Sin embargo, la angiogénesis en la parte distal de la extremidad, especialmente el músculo gastrocnemio, aún debe desencadenarse. En ratones FVB, la doble ligadura o coagulación de la arteria femoral solo proximal a la arteria femoral circunfleja lateral y proximal a la bifurcación safenopoplítea induce más consistentemente la gangrena que un solo sitio de ligadura o coagulación.
Cabe señalar que en pacientes con EAP y CLTI, la isquemia de las extremidades es causada por obstrucción aterosclerótica (un proceso crónico). Por el contrario, en modelos de ratón, la isquemia de las extremidades se induce quirúrgicamente (un proceso agudo). Aunque este modelo de gangrena de la extremidad posterior del ratón FVB tiene un inicio relativamente más lento de la gangrena con una gravedad máxima retardada de la pérdida de tejido, no es directamente comparable con la estenosis arterial crónica y progresiva característica de la EAP y la CLTI. Otros grupos han desarrollado técnicas de oclusión de la arteria femoral subaguda utilizando constrictores ameroides compuestos por una manga metálica externa y una capa interna de material absorbente de humedad que se autoexpande gradualmente. Se ha demostrado que esta técnica da como resultado una disminución de la expresión de marcadores inflamatorios, una menor recuperación del flujo sanguíneo a las 4-5 semanas y una reducción de la necrosis muscular23,24. Aparte de las diferencias en la agudeza de la isquemia, los modelos preclínicos que utilizan animales jóvenes y sanos tampoco logran replicar factores de riesgo como la diabetes, la hipertensión, la obesidad, la hiperlipidemia, el tabaquismo y la infección que contribuyen a los principales eventos adversos de las extremidades y la carga de la enfermedad vascular.
En la mayoría de los estudios de isquemia de las extremidades posteriores murinas, la restauración del flujo sanguíneo a la extremidad posterior isquémica se evalúa típicamente a través de LDPI24,25. Este método no es invasivo y repetible, pero puede estar influenciado por la temperatura corporal central, el uso de anestésicos, la presencia de vello y el posicionamiento de las extremidades posteriores26. La estandarización de estos procedimientos y el uso de la extremidad posterior no ligada como control interno pueden ayudar a mitigar cualquier variación. A diferencia de la LDPI, la micro-TC y la ARM proporcionan información anatómica 3D de alta resolución, pero tradicionalmente requieren la inyección de agente de contraste16. La microangiografía de rayos X también es invasiva y técnicamente desafiante16,27. Al igual que DiI, la perfusión con agentes de fundición de silicona radiopaca permite la reconstrucción 3D post mortem de la vasculatura periférica28. También se ha descrito la inyección intracardíaca o de la vena de la cola de lectina fluorescente para el etiquetado de la vasculatura tisular29. Después de la recolección de tejidos de interés, la tinción inmunohistoquímica con marcadores específicos endoteliales (por ejemplo, CD31, factor von Willebrand) se utiliza a menudo para cuantificar la densidad capilar30.
En comparación con las técnicas mencionadas anteriormente, la perfusión DiI proporciona varias ventajas. En primer lugar, los reactivos y materiales necesarios son relativamente baratos, siempre que se disponga de acceso a un microscopio de barrido láser confocal. Este método permite la reconstrucción en 3D de la vasculatura, que se puede cuantificar utilizando un software de análisis de imágenes. Si bien este protocolo se centra en la vasculatura de la almohadilla del pie, la obtención de imágenes de montaje completo de otros tejidos de las extremidades posteriores murinas, en particular los músculos gastrocnemio y aductor, también es factible y relevante para los estudios de angiogénesis y arteriogénesis19. Esta técnica se puede modificar para modelos animales más grandes, incluidas ratas y conejos, aumentando el volumen de soluciones de perfusión. Sin embargo, las restricciones de imagen con respecto al tamaño del tejido se describen a continuación.
Las partes críticas de la perfusión de DiI son las siguientes. Las burbujas de aire en el aparato pueden ocluir pequeños vasos y dificultar la distribución de DiI a través de la vasculatura, influyendo así en los resultados de las imágenes. Como tal, se debe tener cuidado de eliminar cualquier burbuja de aire en el aparato de llave de paso y el tubo antes de la perfusión. También se recomienda filtrar todas las soluciones excepto DiI a través de un filtro superior de botella de 0,22 μm para eliminar cualquier micropartícula. Durante la perfusión intracardíaca, controle cuidadosamente los pulmones. Si se agrandan y se vuelven de color rosa, esto es una señal de que la aguja de la mariposa ha penetrado a través del ventrículo derecho y debe retraerse ligeramente.
Una limitación importante de la perfusión diI es la naturaleza terminal del procedimiento, que no permite mediciones repetidas. Debido a que los malos resultados de la perfusión pueden reflejar insuficiencia arterial subyacente o error técnico, se recomienda la recolección y la obtención de imágenes de las extremidades posteriores no ligadas como un control interno. Con respecto a las imágenes, el grosor óptimo del tejido para la penetración del láser es de ~ 1 mm después de la compresión. En consecuencia, los tejidos más grandes requieren seccionarse en piezas más pequeñas para ser montados en portaobjetos y acomodados en el escenario del microscopio y tiempos de adquisición de imágenes proporcionalmente más largos.
En resumen, este protocolo describe un modelo preclínico único para el estudio de la EAP y la CLTI. Específicamente, la coagulación de la arteria femoral y la vena con la administración concurrente de L-NAME, un inhibidor de NOS, induce de manera confiable la pérdida de tejido en las almohadillas de los pies de ratones FVB. La perfusión Intracardíaca de DiI post mortem se utiliza para etiquetar la vasculatura fluorescentemente. Las imágenes posteriores de montaje completo de los pies cosechados con microscopía de escaneo láser confocal permiten la reconstrucción 3D de alta resolución de la vasculatura de la almohadilla del pie y la visualización de las redes arteriales y capilares que complementan los medios tradicionales de evaluación de la reperfusión en modelos de isquemia de las extremidades posteriores.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones a Z-J L y OC V de los Institutos Nacionales de Salud [R01HL149452 y VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. También agradecemos a la Instalación de Microscopía e Imágenes del Proyecto Miami para Curar la Parálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad de Miami por proporcionar acceso a su software de análisis y procesamiento de imágenes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binder clips (small) | Office supply store | ||
| Buprenorphine (sustained-release) | |||
| Butterfly needle (25 G with Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) | Invitrogen | D282 | |
| Electrocautery device | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Used version 2.1.0. Free download, no license required. | |
| Foam biopsy pads | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formalin (neutral buffered, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Used version 9.6.0. | |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusion imager | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Used moorLDI V5 software. |
| Microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Needles (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidone-iodine swabstick (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Surgical instruments | Roboz Surgical | Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended. | |
| Suture (5-0 absorbable) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Syringes (10 mL) | BD | 305482 | |
| Three-way stopcocks | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazine |
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