Summary
수정 된 고정 후 절차는 조직에서 글리코겐 입자의 대비를 증가시킵니다. 이 논문은 조직을 처리하고, 이미징을 수행하고, 입체 학적 방법을 사용하여 골격근에서 섬유 유형 별 세포 내 글리코겐 분포에 대한 편향되지 않은 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
투과 전자 현미경을 사용하면 개별 근육 섬유를 포함하는 고정 샘플의 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 이것은 부피 분율, 표면적 대 부피비, 형태학 및 상이한 아세포 구조의 물리적 접촉 부위와 같은 초구조적 측면의 정량화를 가능하게 한다. 1970년대에는 세포에서 글리코겐의 강화된 염색을 위한 프로토콜이 개발되었고, 투과 전자 현미경을 이용한 글리코겐 및 글리코겐 입자 크기의 세포내 국소화에 관한 일련의 연구를 위한 길을 열었다. 대부분의 분석은 글리코겐이 근육 섬유 내에 균질하게 분포되어 있는 것처럼 해석하고 단 하나의 값(예를 들어, 평균 농도)만을 제공하는 반면, 투과 전자 현미경 검사는 글리코겐이 별개의 세포 하부 구획에 위치한 분리된 글리코겐 입자로서 저장된다는 것을 밝혀냈다. 여기서, 조직 수집으로부터 개별 골격근 섬유의 별개의 세포내 구획에서 글리코겐의 부피 분획 및 입자 직경의 정량적 결정을 위한 단계별 프로토콜이 기재되어 있다. 1) 조직 표본 수집 및 얼룩 방법, 2) 이미지 분석 및 데이터 처리 수행, 3) 추정치의 정밀도 평가, 4) 근섬유 유형 차별, 5) 방법론적 함정 및 한계에 대한 고려 사항이 포함됩니다.
Introduction
글리코겐 입자는 포도당과 다양한 관련 단백질1의 분지형 중합체로 구성되며 높은 대사 요구시 중요한 연료를 구성합니다2. 널리 인식되지는 않지만, 글리코겐 입자는 또한 국소 연료를 구성하며, 일부 세포 하부 공정은 혈장 글루코스 및 지방산과 같은 다른 더 오래 지속되는 연료의 가용성에도 불구하고 글리코겐을 우선적으로 이용한다3,4.
글리코겐을 세포내 특이적 국부적 연료로서 저장하는 것의 중요성은 여러 리뷰5,6에서 논의되었으며, 주로 투과 전자 현미경(TEM)7,8에 의한 글리코겐의 세포하 분포에 대한 초기 문서 중 일부에 기초한다. 첫 번째 연구는 조직 화학 염색 기술에서 음성 및 양성 염색에 이르기까지 글리코겐의 대비를 높이기 위해 다른 프로토콜을 사용했습니다.9,10. 중요한 방법론 적 개발은 칼륨 페로시아나이드 환원 osmium11,12,13,14를 사용한 정제 된 사후 고정 프로토콜이었으며, 이는 글리코겐 입자의 대비를 크게 향상 시켰습니다. 이 세련된 프로토콜은 운동으로 인한 글리코겐 고갈에 대한 선구적인 연구15에는 사용되지 않았지만 그레이엄과 동료들에 의해 다시 도입되었습니다16,17.
2차원 이미지에 기초하여, 글리코겐의 세포하 분포는 가장 흔히 세 개의 풀에 위치한 글리코겐 입자로서 기술된다: 아사르콜렘말(표면막 바로 아래), 인터미오피브릴라(myofibrils 사이), 또는 근오피브릴라(myofibrils 내). 그러나, 글리코겐 입자는 또한 예를 들어, 사르코플라스마 망상7 또는 nuclei18과 관련된 것으로 기술될 수 있다. 세포내 분포에 더하여, TEM-추정된 글리코겐 함량의 이점은 또한 단일 섬유 수준에서 정량화가 수행될 수 있다는 것이다. 이를 통해 섬유 대 섬유 변동성을 조사하고 미토콘드리아와 지질 방울과 같은 섬유 유형 및 세포 구성 요소와의 상관 관계 분석을 수행 할 수 있습니다.
여기에서, 골격근 섬유에서 TEM-추정된 섬유 유형-특이적 용적 함량에 대한 프로토콜은 골격근 섬유에서 글리코겐의 세 가지 공통 서브 세포 풀(subsarcolemmal, intermyofibrillar, and intramyofibrillar)에 대해 기술된다. 상기 방법은 인간19, rats20, 및 mice21로부터의 골격근에 적용되었다; 새와 물고기뿐만 아니라22; 및 래트로부터의 심근세포23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
인간 생검된 골격근 샘플을 사용하는 본 프로토콜은 남부 덴마크를 위한 건강 연구 윤리에 관한 지역 위원회(The Regional Committees on Health Research Ethics for Southern Denmark, S-20170198)에 의해 승인되었다. 근육 생검은 국소 마취 후 흡입과 함께 베르그스트롬 바늘을 사용하여 혈관측방 근으로부터 피부 절개를 통해 얻어졌으며 피하로 주어졌다(절개당 리도카인 1-3 mL 2%). 분리된 전체 래트 근육이 사용되면, 덴마크 오덴세 대학 병원의 동물 윤리위원회의 지침에 따라 근육 생검이 얻어지기 전에 자궁 경부 탈구에 의해 동물을 희생시켰다.
1. 1차 고정, 사후 고정, 임베딩, 단면화 및 대조
- 2 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 1.6 mL의 1차 고정 용액(0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 7.3) 중 2.5% 글루타르알데히드)을 준비한다. 최대 14 일 동안 5 °C에서 보관하십시오.
- 근육 생검 또는 전체 근육에서 어떤 방향으로든 최대 직경이 1mm이고 단면보다 세로 섬유 방향으로 약간 더 긴 작은 표본을 분리하십시오 (방향 목적).
- 시편을 차가운 일차 고정 용액이 들어있는 튜브에 넣으십시오. 5°C에서 24시간 동안 보관한다.
- 시편을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액 (pH 7.3)에서 네 번 (각 세척 사이에 15분) 세척한다. 전사 피펫을 사용하여 튜브에서 사용 된 버퍼를 제거하고 시편을 그대로 둔 다음 신선한 버퍼를 추가하십시오.
참고: 최종 세척 후, 시편은 수개월 동안 5°C의 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액에 저장될 수 있다11. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 4°C에서 120분 동안 0.1 M 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 7.3)에 1% 오스뮴 테트록사이드(OsO4) 및 1.5% 포타슘 페로시아나이드(K4Fe(CN)6)를 사용한 후술어.
참고: 1.5% 칼륨 페로시아나이드(K4Fe(CN)6)의 사용은 글리코겐 입자11,12,13의 최적 대비를 위해 필수적입니다. - 실온에서 이중 증류수(RT)로 두 번 헹구십시오.
- RT에서 등급화된 일련의 알코올(에탄올)에 침수하여 탈수시켜 다음 농도를 사용한다: 70%(10분), 70%(10분), 95%(10분), 100%(10분), 및 100%(10분).
참고 : 각 단계에서 시편은 에탄올에 잠겨 시편의 건조를 피하기 위해 부분적으로 만 제거됩니다. 마지막으로, 남은 에탄올은 버려진다. - 다음 부피비(프로필렌 옥사이드/에포시드 수지)를 사용하여 RT에서 프로필렌 옥사이드와 에포시드 수지의 등급화된 혼합물로 침윤: 1/0 (10 분), 1/0 (10 분), 3/1 (45 분), 1/1 (45 분), 1/3 (45 분), 0/1 (하룻밤). 다음날, 시편을 몰드의 100% 신선한 에포시드 수지에 내장하고 60°C에서 48시간 동안 중합한다.
참고: 이 등급이 매겨진 방법은 이전 프로토콜11,12에 따른 것입니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 세로 방향 섬유의 초박형 (60-70nm) 섹션을 자르고 다음과 같이 한 구멍 구리 그리드에 수집하십시오.
- 초미세 전극 홀더에 시편 블록을 장착하십시오.
- 조직의 수준에 도달하기 위해 면도날로 표면의 블록을 트림하십시오.
- 샘플 앞에 다이아몬드 나이프(울트라컷 45)를 장착하고 샘플 표면을 나이프에 평행하게 정렬합니다.
- 샘플의 방향을 확인하기 위해 다이아몬드 나이프로 반박형(1 μm) 섹션을 제작합니다. 가벼운 현미경으로 관찰하기 위해 톨루이딘 블루로 반 얇은 부분을 얼룩지게하십시오.
- 적절한 초박형 섹션을 얻기 위해 관심 영역을 줄이기 위해 블록을 더 트리밍하십시오.
- 초박형 (60-70nm) 섹션을 두 번째 다이아몬드 나이프 (울트라 컷 45)로 자릅니다.
- 퍼펙트 루프를 사용하여 원홀 구리 그리드에 1-2개의 섹션을 수집합니다.
참고 : 원 홀 구리 그리드에는 Formvar 지원 멤브레인이있는 중간에 단일 구멍이 있습니다.
- 절편을 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트와 대조하여 상기 격자를 우라닐 아세테이트 용액 (이중 증류수 중 0.5 %)에 20 분 동안 침지시킨 다음 납 시트레이트 용액 (이중 증류수 중 1 %)에서 15 분 동안 침지시킨다. 두 얼룩 사이의 두 번 증류수로 그리드를 씻으십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
2. 이미징
- 투과 전자 현미경(80kV의 가속 전압에서 작동), 컴퓨터 및 이미지 녹화 소프트웨어를 켭니다. 디지털 슬로우 스캔 2k x 2k CCD 카메라 및 관련 이미징 소프트웨어로 디지털 이미지를 녹화합니다.
- 현미경 단계에서 여러 섹션이있는 그리드를 삽입하십시오.
- 초기에 그리드를 낮은 배율(예: x100)로 스크린하여 섹션(즉, 지지 멤브레인의 구멍, 파편 등)의 품질을 결정하고 최상의 품질의 섹션을 선택합니다. 낮은 배율에서 근육 섬유의 방향을 결정하십시오.
- 다음으로, 단면의 주변 섬유를 중심으로 빔을 사용하여 배율을 높입니다. 30k 이상의 배율로 이미지를 집중하여 이미지에 충분한 미세한 디테일을 보장하고, 가능한 경우 실시간 고속 푸리에 변환으로 안내합니다. 마지막으로, 원하는 배율로 1 초 노출 시간으로 이미지를 녹화하십시오.
- 무작위로 선택된 섬유의 총 24개의 이미지, 즉 myofibrillar 공간의 12개의 이미지와 10k와 40k 사이의 배율로 근자 하부 공간의 12개의 이미지를 획득한다. 이미지가 무작위화되었지만 체계적인 순서로 섬유의 길이와 너비에 걸쳐 분포되어 편향되지 않은 결과를 얻을 수 있는지 확인하십시오 (그림 1A).
참고: 최적의 배율은 사용 가능한 카메라 해상도와 현미경 사진의 크기에 따라 다릅니다. 목표는 최종 분해능을 달성하는 것이며, 여기서 글리코겐 입자 직경은 1 nm 단계 내에서 측정될 수 있고, 적어도 70 μm2의 myofibrillar 영역의 전체 면적 및 적어도 25 μm의 섬유의 총 길이가 섬유당 근피브릴라 공간의 12개의 이미지 및 섬유당 아석자 공간의 12개의 이미지로 분포되고, 각각. 섬유당 24개의 이미지는 인간, 래트 및 마우스 골격근으로부터의 개별 섬유에서 0.1 내지 0.2 사이의 글리코겐의 상이한 풀의 체적 함량의 정밀도(오차 계수)를 제공할 가능성이 가장 높다(도 2E). - 총 6-10개의 섬유가 이미징될 때까지 2.4단계와 2.5단계를 반복합니다. 필요한 경우 추가 단면을 절단하고(이미 이미징된 섬유의 겹침을 피하기 위해 최소 150μm로 분리) 1.9-2.5단계를 반복합니다.
3. 이미지 분석
- 파일 > 열기를 클릭하여 이미지를 ImageJ로 가져옵니다.
- 분석 > 배율 설정을 클릭하여 이미지의 원래 크기와 일치하도록 전역 배율을 설정합니다.
- 이미지 > 확대 / 축소를 클릭하여 100 % 확대>십시오.
- 도구 메뉴의 직선 도구를 사용하여 myofibrillar 공간의 이미지당 하나의 Z-디스크 두께(섬유당 12개)를 측정합니다(그림 1D). 각 6-10 섬유의 평균 Z 디스크 두께를 계산하십시오.
- 가장 두꺼운 평균 Z 디스크를 가진 2-3 섬유를 유형 1 섬유로, 가장 얇은 평균 Z 디스크를 가진 2-3 섬유를 유형 2 섬유로 정의하십시오. 추가 분석을 위해 중간 2-4 섬유를 무시하십시오 (그림 1E).
참고: 다음 단계는 샘플의 4-6개 섬유 각각에 대해 반복됩니다. 글리코겐 부피 분획은 다른 곳에서 설명된 바와 같이 포인트 카운팅에 의해 추정된다25,26. 격자의 크기는 추정치의 만족스러운 높은 정밀도를 얻기 위해 선택됩니다. 이것은 종종 250 히트를 달성함으로써 얻어지며, 이는 필요한 총 포인트 수와 포인트 당 면적을 결정합니다. - 세그먼트 선 도구를 사용하여 아사르콜렘말 영역 바로 아래에 보이는 최외곽 근피브릴의 길이를 측정합니다(그림 2A).
참고: 이 길이는 표면적 당 아유육종 글리코겐을 발현하는데 사용된다 (즉, 최외곽 근피브릴의 길이에 절편(60 nm)의 두께를 곱한 값; 단계 4.5 참조). 따라서, 이 길이로 표현되는 아사르콜렘말 영역만이 분석에 포함된다. - 그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 그리드> 삽입하고 포인트당 면적을 32,400nm2로 설정합니다. 12개의 아사르콜렘말 이미지에서 사용 가능한 길이 내의 히트 수를 계산하며, 여기서 교차는 아사르콜렘말 글리코겐에 부딪칩니다(그림 2A). 히트는 십자가의 오른쪽 위 모서리에 존재하는 글리코겐 입자로 정의됩니다.
- 그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 그리드> 삽입하고 포인트당 영역을 160,000nm2로 설정합니다. 십자가가 myofibrillar 내부 공간에 닿는 12개의 myofibrillar 이미지에서 히트 수를 계산합니다(그림 2B).
- 그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 격자선을 삽입하고 점당 영역> 3,600nm2로 설정합니다. 12개의 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산하고, 여기서 크로스가 myofibrillar 내 글리코겐에 부딪칩니다(그림 2C).
- 그리드에서 > 도구 분석을 클릭하여 그리드> 삽입하고 포인트당 면적을 32,400nm2로 설정합니다. 12개의 myofibrillar 이미지에서 히트의 수를 계산하고, 여기서 크로스가 인터미오피브릴라 글리코겐에 부딪칩니다(그림 2D).
- 직선 도구를 사용하여 12 개의 이미지 각각에 대해 각 풀의 무작위로 선택된 다섯 개의 글리코겐 입자의 직경을 측정하여 섬유당 풀당 평균 60개의 입자를 얻습니다.
참고: 평균 60개의 입자는 섬유 내의 변화를 크게 커버합니다(그림 2F).
4. 계산
- 근피브릴라 공간 당 근시브릴라 공간의 겉보기 면적 분율(AA)을 12개의 이미지로부터의 모든 점들의 합으로 나눈 모든 히트의 합으로서 계산한다(단계 3.8로부터).
- 이미지 영역 당 근오피브릴라 글리코겐의 겉보기 영역 분율, 근피브릴라 면적 당 근교골 글리코겐, 및 이미지 영역 당 근자렘 아글리코겐의 겉보기 영역 분율을 12개의 이미지로부터의 모든 점의 합으로 나눈 모든 히트의 합으로서 계산한다(단계 3.7, 3.9, 및 3.10에서).
- myofibrillar, intermyofibrillar 및 subsarcolemmal 글리코겐의 체적 분율 (VV)을 각각 겉보기 면적 분율 (AA)에서 표면 밀도 (SV)의 곱을 뺀 부분 두께 (t)로 계산하십시오. 여기서 표면 밀도는 평균 입자 표면을 곱한 입자의 수치 밀도입니다.
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
어디
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0.06 μm
H = 입자의 평균 직경(μm)
참고: 체적 분율은 슬라이스 바깥쪽에 중심을 둔 입자로부터의 캡의 기여로 인해 겉보기 영역 분율보다 작습니다25. - 근오피릴라 공간 당 근오피릴라 글리코겐을 발현시키기 위해, 근오피릴라 글리코겐의 면적 분획을 근피브릴라 공간의 영역 분획으로 분할한다(단계 4.2). 인터미오피브릴라 글리코겐은 이전 단계에서 계산된 바와 같이 근피브릴라 공간 당 발현된다(단계 4.3).
- 섬유(VS)의 표면적(최외곽 myofibril) 당 아사르콜렘 글리코겐을 발현시키기 위해, 글리코겐의 부피 분율을 이미지의 부피(면적 및 단면 두께의 생성물)와 곱하고 평균 이용가능한 길이(단계 3.6부터)의 곱과 단면 두께(t)로 나눔으로써 절대량으로 변환한다.
- 다음과 같이 단계 4.1, 4.4, 및 4.5로부터의 값을 사용하여 총 용적 글리코겐 함량을 추정한다:
Myofibrillar 글리코겐 = Intermyofibrillar 글리코겐 + (myofibrillar 글리코겐 · 자궁내 근피브릴라 공간의 면적 분율)
평균 섬유 반경을 40 μm27로 가정하면 부피 대 표면 비율은 20 : 1이므로 총 글리코겐은 다음과 같습니다.
총 글리코겐 (VV) = 미오피브릴라 글리코겐 + (아사르콜렘말 글리코겐 (VS) / 20)
참고: 20:1의 부피 대 표면 비율은 실제 섬유 크기와 아사르콜렘 영역의 크기에 따라 섬유마다 다를 수 있습니다. 이것은 현재 프로토콜과 함께 고려되지 않습니다. - 이로부터, 각 풀로부터의 상대적 기여는 총 글리코겐의 분획으로서 계산된다:
인터미오피브릴라 글리코겐 / 총 글리코겐 = 인터미오피브릴라 글리코겐 / 총 글리코겐
Intramyofibrillar glycogen / Total glycogen = (Intramyofibrillar glycogen · intramyofibrillar space의 면적 분율) / Total glycogen
비단절하글리코겐 / 총 글리코겐 = 아사르콜렘말의 글리코겐 / 20 / 총 글리코겐 - 각 글리코겐 풀에 대해, 이미지 수(n), 각 이미지에서의 총 십자가 수(x), 및 각 이미지(y)에서 관련 풀에서 글리코겐을 치는 십자가의 수를 기준으로 섬유 수준에서 글리코겐 추정치의 불확실성을 표현하는 오차 계수(CE)를 계산하면 다음과 같습니다28:
세륨 = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜을 사용하면 글리코겐 입자가 검고 뚜렷하게 나타납니다 (그림 1 및 그림 2). 글리코겐의 정상 값은 도 3에 묘사되어 있다. 이 데이터는 다른 이전 연구에서 수집 된 41 명의 건강한 젊은 남성의 총 362 섬유를 기반으로합니다.19,24,29,30,31. 여기서, 근오피브릴라 글리코겐 값이 정상에 가깝게 분포되어 있는 반면, 근교내 글리코겐과 아사르콜렘말의 글리코겐 모두 비뚤어진 분포를 보이며, 섬유는 때때로 과도한 양의 글리코겐을 가지고 있음을 알 수 있다. 정상 크기의 근육 섬유 (직경 60-80 μm)에서 intermyofibrillar 글리코겐은 총 글리코겐 함량의 약 80 %를 구성하는 가장 큰 풀입니다. Intramyofibrillar 및 subsarcolemmal 글리코겐은 각각 전체 함량의 약 10 %를 구성합니다.
그림 1: 이미징 및 파이버 타이핑 . (A) 각 섬유는 무작위화된 체계적인 순서로 이미징됩니다. (b) 아사르콜렘 공간으로부터의 이미지의 예. (c) myofibrillar 공간으로부터의 이미지의 예. (D) 각 myofibrillar 이미지에서, 하나의 Z-디스크의 폭이 측정된다 (빨간 선). 총 12개의 Z-디스크(이미지당 하나씩)를 측정하면 약 0.03의 오차 계수가 제공됩니다. (e) 10개의 생검 각각의 6-10개의 섬유에서 평균 섬유 Z-디스크 폭의 전형적인 분포. 각 생검에서, 2-3 섬유는 생검 내 분포에 기초하여 유형 1 및 2로 정의된다. 이미지는 이전 연구에 포함 된 파워 리프터의 m. vastus lateralis 의 생검에서 비롯된 것입니다.29. m: 미토콘드리아와 Z: Z-디스크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 글리코겐 분석. (A) 표면적 당 비단절 글리코겐 부피는 최외곽 근피브릴의 길이와 이 길이에 수직인 아사르콜렘 영역 (파란색 점선)에 의해 정의된 영역 내에서 180 nm x 180 nm의 격자 크기를 사용하여 점 계수에 의해 추정된다. (b) myofibrillar 부피 분율은 400 nm x 400 nm의 그리드 크기를 사용하는 포인트 카운팅에 의해 추정된다. (c) myofibrillar 글리코겐의 부피 분율은 60 nm x 60 nm의 그리드 크기를 사용하는 포인트 카운팅에 의해 추정된다. (d) 인터미오피브릴라 글리코겐의 부피 분율은 180 nm x 180 nm의 그리드 크기를 사용하는 포인트 카운팅에 의해 추정된다. A-D에서 빨간색 원은 히트 (글리코겐 입자에 부딪히는 십자가)를 나타냅니다. (e) 분석된 영상 2 내지 12개에 대한 입체학적 비 추정치24에 대한 추정된 오차 계수. 오차 계수는 카운트 수에 따라 추정되므로 글리코겐 농도에 따라 샘플마다 다릅니다. 글리코겐 함량이 높을 때 종종 상대적으로 낮고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. (f) 2-99 입자 측정 후의 글리코겐 입자 직경의 변동 계수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 골격근에서 글리코겐의 3개의 세포하 풀의 정상 값. 바이올린 플롯은 41 명의 건강한 청년 (18-39 세)의 362 섬유를 기반으로합니다. 섬유는 이전 연구로부터 기원되었으며, 여기서 휴지 또는 대조군 조건에서 m. vastus lateralis로부터의 생검이 얻어졌다19,24,29,30,31. 값은 중앙값에 대한 마커와 사분위수 범위를 나타내는 상자가 있는 상자 플롯으로 표시됩니다. 선은 인접한 위쪽 및 아래쪽 값을 나타냅니다. 상자는 커널 밀도 플롯으로 겹쳐집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 방법의 중요한 단계는 고정 후 동안 칼륨 페로시아나이드에 의해 환원 된 오스뮴을 사용하는 것입니다. 글리코겐 검출을 위한 이 변형된 고정제의 선택성은 화학에 의해 완전히 설명될 수 없지만, 글리코겐이 없는 것으로 알려진 조직 또는 세포외 공간에서11에서 그러한 입자의 검출이 없음을 입증하는 실험 발견도 포함한다.
중요한 파라미터는 추정치의 정밀도와 섬유-섬유 변동입니다. 이미징을 위한 본 프로토콜에 따라, 섬유당 글리코겐의 상이한 풀의 추정치의 0.1 내지 0.2 사이의 오차 계수가 얻어진다. 이 오류 수준은 개별 섬유 간의 변동보다 훨씬 낮습니다(그림 3). 글리코겐의 체적 함량을 추정 할 때 그러한 정밀 추정치를보고하는 것이 좋습니다. 제시된 섬유 타이핑 방법은 미오신 ATPase isoform29에 대해 검증된다. Z-디스크 두께 및 미토콘드리아 부피 분율은 또한 섬유 유형을 나타내기 위해 조합하여 사용될 수 있지만, 미토콘드리아 부피 분율 단독으로는 사용할 수 없다32.
이 방법의 주요 한계는 매우 작은 글리코겐 입자를 검출할 수 없고 글리코겐 입자의 프로파일이 투사된 이미지28에서 겹칠 수 있다는 것이다. 첫 번째 제한은 평균 입자 크기의 실제 측정값을 무효화합니다. 이는 글리코겐 입자가 높은 대사 요구시 분해될 때 심각한 편향이 되는 반면, 글리코겐 재합성 또는 수퍼 보상 동안 글리코겐 입자가 배지에서 더 큰 크기로 성장할 때 편향은 중요하지 않을 수 있다. 이것은 낮은 글리코겐 수준에서 평균 글리코겐 입자 크기의 추정에 큰 영향을 미칠 수 있지만, 작고 관찰되지 않은 글리코겐 입자가 전체 글리코겐 함량에 거의 기여하지 않기 때문에 부피 글리코겐 농도의 추정치는 강력합니다. 두 번째 한계는 글리코겐 입자가 절편의 두께보다 훨씬 작은 조건에서 비롯됩니다. 이러한 편향은 대부분 매우 높은 글리코겐 농도에서 존재하며, 상이한 두께를 갖는 절편의 글리코겐 부피 분획을 비교함으로써 조사될 수 있었다. 더 두꺼운 섹션이 높은 글리코겐 부피 분획에 의해 평행하지 않으면, 가장 두꺼운 섹션에서 더 겹치는 입자로 인한 과소 평가로 인한 것이어야합니다. 이전 연구에서, 글리코겐 부피 분획은 입자의 뚜렷한 중첩이 없음을 나타내는 50 내지 600 mmol kg dw-1 범위 내의 글리코겐 농도와 상관관계가 있다. 그러나, 글리코겐 농도가 이 수준 이상으로 증가하면, 중첩33을 나타내는 인터미오피브릴라 글리코겐의 증가는 없다. 이는 더 낮은 글리코겐 농도에서의 글리코겐 부피 분획과 농도 사이의 관계를 외삽함으로써 해결될 수 있다.
TEM에 의해 제공된 nm 분해능에 기초하여, 이 프로토콜은 현재 글리코겐의 세포내 분포를 추정하는 유일한 방법이다. 또한, 방법론은 또한 단일 섬유 수준에서 정량적 값을 얻을 수있는 대규모 정량적 접근법 (여기에 설명 된대로)을 허용합니다. 이것은 글리코겐 의존성 피로 메커니즘이 일부 섬유에서만 발생하는 다양한 유형의 운동 중에 섬유 모집에서 높은 이질성을 가진 골격근에서 매우 중요합니다.2. 이 방법은 또한 심근 세포와 같은 다른 흥분성 조직에 대한 잠재력을 가지고 있으며, 글리코겐은 정상적인 심장 기능에 필수적이며 허혈 중에 중요한 것으로 알려져 있습니다23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 스웨덴 올림픽 위원회의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
