Summary
本方案描述了 美洲蚴中RNAi操作技术的分步指南。
Abstract
蟑螂是一种卫生害虫，由于其易于觅食和半代谢特性，是昆虫发育和变质研究中必不可少的物种。加上注释良好的基因组序列，这些优势使得美洲蟑螂， 美洲角行星， 成为重要的半代谢昆虫模型。受敲除策略不足的限制，基于有效RNA干扰（RNAi）的基因敲低成为 美洲桫椤功能基因研究中不可或缺的技术。本方案描述了 美洲猪笼草的RNAi操作技术。该方案包括（1）在适当的发育阶段选择 美洲疟原虫 ，（2）注射设置的准备，（3）dsRNA注射和（4）基因敲低效率检测。RNAi是 美洲猪笼草中一种强大的反向遗传工具。大多数 美洲疟原虫 组织对细胞外dsRNA敏感。它的简单性使研究人员能够在一次或多次靶向dsRNA注射下快速获得功能失调的表型，使研究人员能够更好地利用 美洲疟原虫 进行发育和变质研究。
Introduction
RNA干扰（RNAi）是一种进化保守的机制，自Andrew Fire和Craig Mello2开发出双链RNA（dsRNA）介导的基因沉默策略以来，逐渐成为抑制许多生物体1中基因表达的重要反向遗传工具。dsRNA被细胞中的DsRNA切割成21-23个核苷酸的片段，小干扰RNA（siRNA），由细胞中的Dicer酶激活RNAi途径。然后将siRNA掺入RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，该复合物与靶mRNA偶联，导致mRNA裂解，最终导致基因功能丧失3，4，5。在昆虫物种中，到目前为止，许多系统RNAi实验已经在许多昆虫目中报道，例如直翅目，等翅目，半翅目，鞘翅目，神经翅目，双翅目，膜翅目，鳞翅目和Blattodea5，6，7，8。
蟑螂（Blattaria）是发育和变质研究中必不可少的昆虫家族，其生长周期快，对环境适应性强，发育可塑性高9。在发现RNAi与蟑螂兼容之前，由于蟑螂遗传操纵技术的稀缺，以前的研究仅关注蟑螂的预防和控制。蟑螂卵子的独特结构使得使用CRISPR-Cas9系统进行基于胚胎注射的基因敲除具有挑战性。此外，蟑螂中的大多数组织（如美洲猪笼草）表现出强大的全身RNAi反应，允许通过注射一个或多个靶向dsRNA9，10，11来快速产生功能失调的表型。这些特征使RNAi成为美洲猪笼草基因功能研究中不可或缺的技术。
尽管已经报道了RNAi在 美洲猪 笼草功能基因研究中的应用，但没有详细或逐步的描述。本报告为 美洲蟑螂中的RNAi提供了一个分步操作指南，可用于其他蟑螂的基因功能研究。此外，本指南不仅限于Blattodea，还可以应用于许多其他昆虫，只需稍作修改即可。
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Protocol
P. americana的系列最初由Huiling Hao博士提供。该物种已经进行了30年的近亲繁殖9。
1. 美洲鹦鹉的孵化和投饲
- 收集美洲 鹦 鹉的新鲜卵母（产卵后立即），并在25°C和60%湿度的黑暗培养箱中孵育约25天。然后在孵化前3天将温度和湿度提高到30°C和75%。
- 使用具有4毫米孔径的筛子将孵化的若虫与卵形目分开。
- 将若虫保存在圆柱形容器（直径12厘米，高10厘米）中，在28°C，70%湿度的黑暗中。用凡士林刷容器的内边缘，以防止蟑螂逸出。提供老鼠的食物，水和住所（蛋盘）。注意若虫的活动，定期清理粪便和碎屑。
2. 选择适当幼虫的若虫
- 使用玻璃管挑出新鲜蜕皮 的美洲猪笼 草（体色为白色）。将它们保存在新的容器中，等待正确的处理阶段。
注意：在上述喂养条件下约19天后，3龄 的若虫将可用于注射。刚蜕皮的蟑螂的颜色是白色的，蟑螂通过蜕皮时间澄清了幼虫。
3.用T7启动子制备靶片段
- 以 美洲猪笼草 的cDNA为模板，设计成对的引物进行PCR，得到靶基因9的300-800 bp DNA片段。然后将PCR片段克隆到pTOPO载体中（参见 材料表）进行测序。
- 使用靶片段DNA作为模板，在5'末端合成一对具有T7启动子序列（5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3'）的新引物，并进行另一轮PCR以获得每侧9上具有T7启动子的靶片段。
4. dsRNA的体外转录和合成
- 在反应体系中加入10μLT7 2X缓冲液，2μL酶混合物，T7表达（参见 材料表）和2μgPCR产物（在步骤3.2中获得），并将总体积加起来为20μL，ddH2O.手动轻轻倒置混合并在37°C下孵育30分钟和70°C孵育10分钟， 然后慢慢冷却到室温。
- 以1：200的比例用ddH2O稀释RNase A溶液（4μg/ μL）。然后向体系中加入1μLRQ1 RNase-free脱氧核糖核酸酶（1 U / μL）和1μL稀释的RNase A溶液（参见 材料表）。
注意：现在，单个系统的体积为 22 μL。 - 在37°C孵育30分钟。然后加入总体积的10%（同时进行N反应时，总体积为N×22μL）乙酸钠和三体积的总体积的异丙醇。
- 手动轻轻倒置混合，放在冰上5分钟，并在4°C下以13，000× g 离心10分钟。
- 用移液管除去上清液，用75%乙醇（用25%焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水）洗涤残留物，然后在4°C下以13，000× g 离心5分钟。
- 再次取出上清液。在室温下风干沉淀15分钟。使用约100μLDEPC水溶解dsRNA，然后将dsRNA稀释至最终的2μg/ μL。
注意：dsRNA可以在-80°C下储存6个月。
5. 将 dsRNA 溶液上样到注射器中
- 提前在微量注射泵中设置程序（见 材料表），以确保每次注射的体积一致。在使用注射器之前，用DEPC水填充注射器8-10次来清洁注射器。
- 将10μL注射器安装在微量注射泵上，启动泵，并用10μLdsRNA溶液填充注射器（在步骤4.6中制备）。将1μLdsRNA注入3龄 若虫（见步骤2），并确保它不会泄漏到体内。
6. 将 dsRNA 注射到 美洲猪笼草中
- 用容器中增加的CO2 浓度麻醉蟑螂，直到蟑螂不再移动，然后立即进行注射。
- 用镊子轻轻拿起蟑螂，用手将蟑螂送到针上。接下来， 通过 两个腹部索米特之间的间隙水平插入针头，以对抗表皮。关于插入深度，越浅越好。
- 然后，将dsRNA溶液注入蟑螂体内。最后，拔出针尖。确保针尖尽可能靠近表皮，以避免损伤内脏器官。
注意：注射应在解剖显微镜下进行。 - 将注射的蟑螂放入干净的生物测定容器中。等待约10-20分钟，让它们从CO2 效应中恢复过来。用注射日期，dsRNA的类型和剂量以及 美洲猪笼草的年龄标记容器。
- 将注射的蟑螂置于28°C，70%湿度的黑暗环境中，提供水，饲料和庇护所，并定期观察蟑螂表型的可能变化。
7. 敲低确认和表型分析
- 使用任何可用的分子生物学技术（如定量实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 和蛋白质印迹）评估 RNAi 的效率。有关详细的 qRT-PCR 和蛋白质印迹程序，请参见参考文献1，12。
- 要观察和分析RNAi相关表型，请使用适用于活体动物的显微镜。
注意：RNAi可能会影响蟑螂的形态，行为，蜕皮，肢体再生和其他生理活动。表型的比频是根据具体条件计算的。
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Representative Results
图1 显示了成功的注射。带有微直径针头的显微注射注射器应水平放置在加强器上（图1A）。针 通过 两个腹部索米特之间的间隙水平插入表皮（图1B）。确保液体进入 美洲猪笼 草腹部。针头太陡峭的角度会损害内脏器官（图1C），注射不当导致dsRNA溶液从腹部泄漏出来（图1D）。如果有任何dsRNA泄漏出来，则需要丢弃动物，并进行另一次注射。美洲 猪笼草 在注射过程中需要完全麻醉。
像其他生物实验一样，在进行RNAi治疗时需要对照组。治疗差异需要确认是由靶向RNAi引起的，而不是由于dsRNA的脱靶效应，注射过程中的损伤或CO2麻醉引起的。这里选取Ddc（多巴脱羧酶）和Dpp（十五变性）基因作为两个实例，观察dsRNA注射后蟑螂蟑螂的表型，并将动物中没有靶标的阴性对照dsMock11作为阴性对照，通过qRT-PCR检测RNAi效率（图2）。以注射ds Ddc为例（图3A，B），由于黑色素化被阻断，具有敲低Ddc基因的美洲疟原虫将长期具有白色表皮（图3B）。在肢体再生所必需的dsDpp注射实验中，RNAi破坏了肢体再生（图4），这是先前报道的9。
图1：仪器和正确的注射操作。 （A）显微注射器械上的注射器。（二）注射针的正确位置;没有液体出来。（C）注射针角度太陡，可能会损害内脏器官。（D）注射失败导致dsRNA溶液或血淋巴液流出。 请点击此处查看此图的大图。
图2：通过qRT-PCR检测RNAi效率。 采用qRT-PCR检测 Ddc 和 Dpp 基因的敲低效率，以dsMock 为阴性对照。每次处理使用三个重复，误差线表示三个重复的标准偏差。通过学生的t检验分析了差异的意义。*： P < 0.05， **： P < 0.01。 请点击此处查看此图的大图。
图3：成功RNAi破坏美洲猪笼草表皮黑化的例子（A）注射dsMock后正常蟑螂具有正常黑色化。（B）Ddc RNAi介导的白化病性美洲猪笼草蜕皮后。请点击此处查看此图的大图。
图4：成功破坏美洲猪笼草肢体再生的实例。（A）后腿截肢的美洲猪（B-C）美洲猪在RNAi治疗和蜕皮后成功破坏肢体再生的例子。后腿在dsMock对照组（B）中再生，但当Dpp（C）基因沉默时没有。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该报告描述了 美洲猪笼草的方法学循序渐进的RNAi策略;值得注意的是，它也可以应用于其他蟑螂（例如Blattella germanica ）和许多其他变化很小的昆虫。然而，RNAi的基因沉默效率并不总是足够高，与基因敲除策略13相比，存在明显的劣势。基因水平的以下残留效应可能会干扰真正的表型。为了确保RNAi治疗的成功，需要考虑几个基本条件，包括动物的身体状况，对照组的选择，dsRNA分子的长度和浓度，避免脱靶效应（OTE）的可能性，以及组织对dsRNA的不同敏感性。
美洲猪笼草的身体状况
健康的动物是RNAi和 美洲猪笼草不同基因功能研究成功的前提。此外，为了保持实验的一致性，只选择在相同条件下饲养的蟑螂。只有比3龄 龄（孵化后约19天）的若虫才能使用，因为年轻的若虫在体型上太小而无法注射。
对照组的选择
dsMock11 和dsEGFP 以及相同剂量的蟑螂盐水6 已被用作阴性对照。阴性对照的靶序列应该是外源性的，与内源性基因序列11没有同源性。dsMock 是首选，因为使用dsEGFP 会在一定程度上延迟 美洲猪笼草 的生长和发育。
dsRNA 长度
RNAi的效率受dsRNA分子长度的影响。较长的dsRNA片段在mRNA沉默时更有效，可能是因为它产生更多的siRNA，或者较短的dsRNA片段被细胞吸收效率较低 1。在P. americana 和 B. germanica中，300 bp至800 bp之间的dsRNA似乎是RNAi实验6，9，10，14的理想选择。短的dsRNA可能不足以诱导全身RNAi反应，而长dsRNA可能会增加OTE风险1。
dsRNA浓度
dsRNA的浓度也会影响RNAi1，15的效率。对于美洲猪笼草的3龄若虫，1μg的dsRNA似乎是一个合理的量，4-6μg适用于成体的6，9，14，16。用于注射的精确dsRNA量可以根据美洲猪笼草的基因，组织和体型进行调整。
脱靶效应
RNAi的OTE总共很难避免17，18。可以设计dsRNA的两个非重叠区域来减少OTE对表型5的影响。如果靶向两个不同区域的dsRNA产生相同的效果，则可以排除OTE诱导的假阳性现象的可能性。
一种RNAi效率检测方法
表型分析是评估RNAi的最直观方法，qRT-PCR和蛋白质印迹分析是测量敲低效率的两个黄金标准。qRT-PCR是测定mRNA水平6，9，10干扰效率的直接方法。引物应设计在dsRNA靶向区域之外。蛋白质印迹分析是分析蛋白质水平干扰的另一种方法，但需要特异性抗体。然而，有时没有观察到特定的表型效应，即使具有很高的沉默效率（>90%）。这种残留效应的一种可能的解释是蟑螂的基因家族大规模扩张;基因的冗余控制着许多特定的功能和表型。另一种可能的解释是，功能足够多所需的最低基因表达水平极低。这些导致即使具有足够高的RNAi效率也无法获得特定的表型。
RNAi 敏感性的组织特异性
一些蟑螂组织（如卵巢和副腺）的干扰效率不够高，这可能是dsRNA5，19的穿透屏障;还观察到不同昆虫物种中不同的RNAi功效，这取决于血淋巴15，20中dsRNA的酶降解。一些想法对于提高 美洲疟原 虫组织中的RNAi效率是合理的，例如 在体外21中将dsRNA消化成siRNA，增加dsRNA剂量和注射时间，以及使用纳米材料作为递送载体。
总之，RNAi的高效率以及注释良好的基因组序列9 使 P. americana 成为在广泛的发育，生理和行为研究中研究基因功能的良好模型。同样，这份报告可以作为其他对dsRNA敏感且难以进行敲除突变的昆虫的宝贵参考。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
本研究由国家自然科学基金（32070500、31330072 31620103917、31572325、广东省自然科学基金（批准号：2021B1515020044和2020A1515011267）、广东省科学技术厅（批准号：2019B090905003和2019A0102006）、广州市科学技术厅（批准号：202102020110号）资助， 获深圳市科技计划（助学金编号：KQTD20180411143628272 to Sh.L.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
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