Summary
本プロトコルは、 P. americanaにおけるRNAi操作技術のための段階的なガイドラインを記載する。
Abstract
衛生害虫であるゴキブリは、その容易な摂食および半代謝特性のために、昆虫の発生および変成研究において必須種である。注釈付きのゲノム配列とともに、これらの利点により、アメリカのゴキブリ、 ペリプラネタアメリカーナ は重要な半代謝昆虫モデルとなっています。ノックアウト戦略の不足によって制限され、効果的なRNA干渉(RNAi)ベースの遺伝子ノックダウンは 、P. americanaの機能的遺伝子研究において不可欠な技術となっている。本プロトコールは、 P. americanaにおけるRNAi操作技術を記述する。このプロトコルには、(1)適切な発生段階での P.アメリカーナ の選択、(2)注射設定の準備、(3)dsRNA注射、および(4)遺伝子ノックダウン効率検出が含まれる。RNAiは、 P. americanaの強力な逆遺伝学的ツールです。 P. americana 組織の大部分は、細胞外dsRNAに感受性である。そのシンプルさにより、研究者は1回または複数の標的dsRNA注射で機能不全の表現型を迅速に取得でき、研究者は P. americana を発生および変成研究に有効に使用することができます。
Introduction
進化的に保存されたメカニズムであるRNA干渉(RNAi)は、アンドリュー・ファイアとクレイグ・メロ2が二本鎖RNA(dsRNA)媒介遺伝子沈黙戦略を開発して以来、多くの生物1で遺伝子発現を阻害するために徐々に不可欠な逆遺伝学的ツールになります。dsRNAは、21〜23ヌクレオチドの断片に切断され、小さな干渉RNA(siRNA)は、細胞内の酵素ダイサーによってRNAi経路を活性化する。その後、siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、標的mRNAに結合し、mRNA切断を引き起こし、最終的に遺伝子機能の喪失をもたらす3、4、5。昆虫種のうち、直翅目、錬翅目、半翅目、鞘翅目、神経翅目、双翅目、膜翅目、鱗翅目、およびブラットデア5、6、7、8など、多くの昆虫順でこれまでに多くの全身RNAi実験が報告されている。
ゴキブリ(Blattaria)は、急速な成長サイクル、環境への強い適応性、および高い発生可塑性を備えた発生および変成研究において不可欠な昆虫科である9。RNAiがゴキブリと互換性があることを発見する前は、以前の研究はゴキブリの遺伝子操作技術の不足のためにゴキブリの予防と制御にのみ焦点を当てていました。ゴキブリのオテカのユニークな構造は、CRISPR-Cas9システムで胚注入ベースの遺伝子ノックアウトを行うことを困難にしました。その上、ゴキブリのほとんどの組織(P. americanaなど)は、堅牢な全身RNAi応答を示し、1つ以上の標的dsRNAを注射することによって機能不全表現型の迅速な生成を可能にする9、10、11。これらの特徴により、RNAiはP. americanaの遺伝子機能研究に不可欠な技術となりました。
P. americanaの機能的遺伝子研究におけるRNAiの使用が報告されているにもかかわらず、詳細または段階的な説明は得られなかった。このレポートは、P. americanaのRNAiの段階的な運用ガイドラインを提供し、他のゴキブリの遺伝子機能研究に有用である。さらに、このガイドはBlattodeaに限定されず、軽微な変更を加えて他の多くの昆虫に適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
P.アメリカーナのラインは、当初、Huiling Hao博士によって提供されました。この種は30年間近親交配で維持されています9。
1. P.アメリカーナの孵化と給餌
- P. americanaの新鮮なオテカエ(産卵直後)を集め、25°C、湿度60%の暗所インキュベーターで約25日間孵化させます。その後、孵化の3日前に温度と湿度を30°Cと75%に上げます。
- 4mmの開口部を有するふるいを使用して、孵化したニンフをオテカエから分離する。
- ニンフを円筒形の容器(直径12cm、高さ10cm)に入れ、湿度70%の28°Cの暗闇に保管してください。ゴキブリが逃げるのを防ぐために、容器の内側の端をワセリンで磨く。ネズミの餌、水、避難所(卵トレイ)を提供する。ニンフの活動に注意を払い、定期的に糞便や破片をきれいにしてください。
2.適切な齢期のニンフの選択
- ガラス管を使って、脱皮したての P.アメリカーナ (体色は白)を選びます。それらを新しい容器に保管し、治療のための正しい段階を待つ。
注:上記の摂食条件下で〜19日後、3番目の インスターのニンフは注射のために利用可能になります。脱皮したばかりのゴキブリの色は白く、インスターは脱皮時間によって明確になります。
T7プロモーターによる標的断片の調製
- P.アメリカーナのcDNAを鋳型として用い、ペアプライマーを設計してPCRを行い、標的遺伝子9の300-800 bp DNA断片を得た。次に、PCR断片をpTOPOベクター(材料表を参照)にクローニングしてシーケンシングを行います。
- 標的断片DNAを鋳型として用いて、5'末端にT7プロモーター配列(5'-GGATCCTAATACGACTCACTTACATAGG-3')を有する1組の新しいプライマーを合成し、別のPCRを行い、両側にT7プロモーターを有する標的断片を得る9。
4. インビトロでのdsRNAの転写と合成
- 反応系に10 μLのT7 2X Buffer、2 μLの酵素ミックス、T7 Express(材料表を参照)、および2 μgのPCR産物(ステップ3.2で得られた)を加え、ddH 2Oで全量を20μLに加算します。 その後、ゆっくりと室温まで冷却する。
- RNase A溶液(4μg/μL)をddH2Oで1:200の比率で希釈する。次に、1 μL の RQ1 RNase フリー DNase (1 U/μL) と 1 μL の希釈 RNase A 溶液をシステムに加えます ( 材料表を参照)。
メモ: 現在、単一システムの容量は 22 μL です。 - 37°Cで30分間インキュベートする。次いで、酢酸ナトリウムの全容量の10%(N反応を同時に行う場合、全容量はN x 22μLである)およびイソプロパノールの全容量の3容量を加える。
- 手動で軽く逆さまに混ぜ、氷の上に5分間置き、13,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清をピペットで取り出し、残渣を75%エタノール(25%ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水)で洗浄し、13,000 x g で4°Cで5分間遠心分離した。
- 上清をもう一度取り除く。ペレットを室温で15分間風乾する。約 100 μL の DEPC 水を使用して dsRNA を溶解し、dsRNA を希釈して最後の 2 μg/μL にします。
注:dsRNAは-80°Cで6ヶ月間保存することができた。
5. dsRNA溶液をシリンジにロードする
- マイクロインジェクションポンプ( 材料表を参照)にプログラムを事前に設定して、各インジェクションの体積が一貫していることを確認します。シリンジを使用する前に、DEPC水を8〜10回充填してシリンジを清掃してください。
- マイクロインジェクションポンプに10 μLのシリンジを取り付け、ポンプを起動し、シリンジに10 μLのdsRNA溶液(ステップ4.6で調製)を充填します。1 μLのdsRNAを3齢の ニンフに注入し(ステップ2を参照)、体内に漏れないようにします。
6. P.アメリカーナへのdsRNAの注入
- ゴキブリがもう動かなくなるまで、容器内のCO2 濃度を高めてゴキブリを麻酔し、すぐに注射を進める。
- ピンセットでゴキブリを優しく拾い上げ、手でゴキブリを針に向かって届けます。次に、2つの腹部ソマイト間の隙間 を介して 針を表皮に対して水平に挿入する。インサートの深さについては、浅いほど良いです。
- 次に、dsRNA溶液をゴキブリに注入する。最後に、針先を引き出します。内臓を傷つけないように、針先が表皮にできるだけ近いことを確認してください。
注:注射は解剖顕微鏡下で行う必要があります。 - 注射されたゴキブリをきれいなバイオアッセイ容器に入れる。CO2の影響から回復するまで約10〜20分 待ちます。容器に注射日、dsRNAの種類と用量、 P.アメリカーナの年齢をラベル付けします。
- 注入されたゴキブリを28°C、湿度70%の暗い環境に置き、水、飼料、および避難所を提供し、ゴキブリの表現型の可能な変化を定期的に観察する。
7. ノックダウン確認と表現型解析
- 定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)やウェスタンブロッティングなどの利用可能な分子生物学技術を使用して、RNAiの効率を評価します。詳細なqRT-PCRおよびウェスタンブロッティング手順については、参考文献1,12を参照してください。
- RNAi関連の表現型を観察・解析するには、生きた動物に適した顕微鏡を使用してください。
注:RNAiは、ゴキブリの形態、行動、脱皮、四肢再生、およびその他の生理学的活動に影響を与える可能性があります。表現型の特定の頻度は、特定の条件に従って計算される。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1 は、成功した注入を示しています。マイクロ直径の針を備えたマイクロインジェクションシリンジは、ブースター上に水平に配置する必要があります(図1A)。針は、表皮に対して水平に2つの腹部ソマイト間の隙間 を介して 挿入される(図1B)。液体が P.アメリカーナ 腹部に入ることを確認します。針の角度が急すぎると内臓が損傷し(図1C)、不適切な注射はdsRNA溶液の腹部からの漏出につながります(図1D)。いずれかのdsRNAが漏れた場合、動物を捨てる必要があり、別の注射が行われる。 P.アメリカーナは 注射中に完全に麻酔をかける必要があります。
他の生物学的実験と同様に、RNAi処理が行われる場合、対照群が必要である。治療の違いは、dsRNAのオフターゲット効果、注射中の損傷、またはCO2麻酔に起因するのではなく、標的RNAiによって引き起こされることを確認する必要があります。ここでddc(ドーパ脱炭酸酵素)及びDpp(デカペンタプレッグス)遺伝子を2つの例として選択し、dsRNA注入後の脱皮ゴキブリの表現型を観察し、かつ陰性対照であるdsMock11を標的としない動物について、陰性対照として行い、qRT-PCRによりRNAi効率が検出された(図2)。dsDdcの注射を例にとると(図3A、B)、Ddc遺伝子をノックダウンしたアメリカーナ菌は、メラニン化が遮断されてから長期間にわたって白い表皮を有することになる(図3B)。四肢再生に必要なdsDpp注射の実験では、RNAiが四肢再生を破壊した(図4)。
図1:計器と正しい注射操作。 (A)マイクロインジェクション器具のシリンジ。(B)注射針の正しい位置;液体は出てこない。(c)注射針の角度が急すぎると内臓を損傷するおそれがある。(d)注射に失敗すると、dsRNA溶液または血リンパ液が流出する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:qRT-PCRにより検出されたRNAi効率。Ddc遺伝子およびDpp遺伝子のノックダウン効率をqRT-PCRにより検出し、dsMockを陰性対照として用いた。各処理に3つの反復を使用し、エラーバーは3つの反復の標準偏差を示す。差の有意性は、スチューデントのt検定によって分析された。*: P < 0.05, **: P < 0.01.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:P. americanaにおける表皮メラニン化の破壊に成功したRNAiの例。 (B)脱皮後のDdc RNAi媒介性白皮症P.アメリカーナ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:P. americana. (A) A P. americana. (A. A. americana.後肢はdsMock対照群(B)で再生されたが、Dpp(C)遺伝子がサイレンシングされたときには再生されなかった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この報告書は、 P. americanaにおける方法論的ステップバイステップRNAi戦略を説明した。注目すべきは、他のゴキブリ(例えば、Blattella germanica )や、小さな変化を伴う他の多くの昆虫にも適用することができる。しかし、RNAiの遺伝子サイレンシング効率は必ずしも十分に高いとは限らず、遺伝子ノックアウト戦略と比較して明らかな欠点がある13。遺伝子レベルの以下の残留効果は、実際の表現型を妨害する可能性がある。RNAi治療を確実に成功させるためには、動物の体調、対照群の選択、dsRNA分子の長さおよび濃度、オフターゲット効果(OTE)の可能性の回避、およびdsRNAに対する組織の異なる感受性を含む、いくつかの重要な条件を考慮する必要がある。
P.アメリカーナの体調
健康な動物は、 P. americanaにおけるRNAiおよび異なる遺伝子機能研究の成功の前提である。その上、実験の一貫性を保つために、同じ条件で飼育されたゴキブリだけが選ばれます。そして、若いニンフは体の大きさで注射するには小さすぎるので、3番目の 齢(孵化後約19日)より古いニンフだけを使うことができます。
制御グループの選択
dsMock11およびdsEGFPおよび同用量のゴキブリ生理食塩水6が陰性対照として使用された。ネガティブコントロールの標的配列は外因性であるべきであり、内因性遺伝子配列11と相同性を持たない。dsEGFPを使用すると、P. americanaの成長と発展がある程度遅れるため、dsMockが好まれました。
dsRNA の長さ
RNAiの効率は、dsRNA分子の長さによって影響される。より長いdsRNA断片は、おそらくより多くのsiRNAを産生するため、またはより短いdsRNA断片が細胞によってより効率的に取り込まれるため、mRNAサイレンシングにおいてより効果的である1。P. americanaおよびB. germanicaでは、300 bp~800 bpのdsRNAはRNAi実験6、9、10、14に理想的であると思われる。短いdsRNAは全身RNAi応答を誘導するには不十分であるかもしれないが、長いdsRNAはOTEリスク1を増加させる可能性がある。
dsRNA濃度
dsRNAの濃度はまた、RNAi1、15の効率に影響を与え得る。P. americanaの3齢ニンフの場合、1μgのdsRNAが妥当な量であるようであり、4〜6μgが成人6、9、14、16に適している。注射に使用される正確なdsRNA量は、P. americanaの遺伝子、組織、および体の大きさに基づいて調整することができる。
オフターゲット効果
RNAiのOTEは、完全に避けるのは難しい17,18。dsRNAの2つの非重複領域は、表現型5に対するOTEの効果を減少させるように設計され得る。2つの異なる領域を標的とするdsRNAが同じ効果を生み出す場合、OTE誘発偽陽性現象の可能性を排除することができる。
RNAi効率検出方法
表現型解析はRNAiを評価するための最も直感的なアプローチであり、qRT-PCRとウェスタンブロッティング解析はノックダウン効率を測定するための2つの黄金基準です。qRT-PCRは、mRNAレベル6、9、10での干渉効率を決定するための簡単な方法です。プライマーは、dsRNAターゲティング領域外に設計する必要があります。ウェスタンブロッティング分析は、タンパク質レベルの干渉を分析するための別の方法ですが、特定の抗体が必要です。しかしながら、高い消音効率(>90%)であっても、特定の表現型効果が観察されないことがある。この残留効果の1つの可能な説明は、ゴキブリにおける大規模な遺伝子ファミリーの拡大である。遺伝子の冗長性は、多くの特定の機能および表現型を制御する。別の可能な説明は、十分に機能するために必要な最小遺伝子発現レベルが極めて低いことである。これらは、十分に高いRNAi効率であっても特定の表現型を得ることの失敗につながる。
RNAi感受性に対する組織特異性
いくつかのゴキブリ組織(卵巣や付属腺など)の干渉効率は十分に高くなく、これはdsRNAの貫通障壁である可能性があります5,19。異なる昆虫種における異なるRNAi有効性も観察され、これは血リンパ15、20におけるdsRNAの酵素分解に依存する。p. americana 組織における RNAi 効率を改善するには、インビトロ21 で dsRNA を siRNA に消化すること、dsRNA の投与量と注入時間を長くすること、ナノ材料を送達用担体として使用することなど、いくつかのアイデアが妥当です。
結論として、RNAiの高効率と注釈付きのゲノム配列9 は、 P. americanaを 幅広い発生学的、生理学的、および行動学的研究において遺伝子機能を調査するための優れたモデルにしている。同様に、この報告は、dsRNAに感受性があり、ノックアウト変異を起こしにくい他の昆虫にとって貴重な参考資料となり得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号32070500、31620103917、31330072、および31572325からC.R.、Sh.L.まで)、広東省自然科学財団(助成金番号2021B1515020044および2020A1515011267からC.R.まで)、広東省科学技術部(助成金番号2019B090905003および2019A0102006)、広州科学技術部(助成金番号202102020110)の支援を受けました。 深セン科学技術プログラム(助成金番号。KQTD20180411143628272からSh.L.へ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
- Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi. PloS One. 7 (10), 47431 (2012).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications. Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).
- Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding. International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in Physiology. 6, 207 (2015).
- Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine. Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1 (2020).
- Immonen, E. V., et al. EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision. The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).
- Li, S., et al. The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach. Nature Communications. 9 (1), 1008 (2018).
- Zhao, Z., et al. Grainy head signaling regulates epithelium development and ecdysis in Blattella germanica. Insect Science. 28 (2), 485-494 (2021).
- Lozano, J., Belles, X. Conserved repressive function of Krüppel homolog 1 on insect metamorphosis in hemimetabolous and holometabolous species. Scientific Reports. 1, 163 (2011).
- Philip, B. N., Tomoyasu, Y. Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection. Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J). 772, 471-497 (2011).
- Zheng, Y., et al. CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain. Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
- Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference. Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).
- Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana. Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).
- Jackson, A. L., Linsley, P. S. Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs. Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).
- Patel, M., Peter, M. E. Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses. Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).
- Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches. iScience. 23 (12), 101778 (2020).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).
- Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. interfering RNA: A new tool for gene therapy. Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).
