Summary
이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.
Abstract
계측 및 이미지 처리 소프트웨어의 최근 발전으로 인해 단일 입자 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 구조 생물 학자들이 다양한 거대 분자의 고해상도 구조를 결정하는 데 선호되는 방법이되었습니다. 이미지 처리 및 구조 계산을 위해 신규 및 전문 사용자가 여러 소프트웨어 제품군을 사용할 수 있으며, 이는 동일한 기본 워크플로우를 간소화합니다: 현미경 검출기로 획득한 동영상은 빔 유도 동작 및 콘트라스트 전달 기능(CTF) 추정을 위해 보정을 거칩니다. 다음으로, 반복적인 2D 및 3D 분류를 위해 평균화된 무비 프레임에서 파티클 이미지를 선택하고 추출한 다음, 3D 재구성, 구체화 및 검증이 이어집니다. 다양한 소프트웨어 패키지가 서로 다른 알고리즘을 사용하고 작동하려면 다양한 수준의 전문 지식이 필요하기 때문에 생성되는 3D 맵은 종종 품질과 해상도가 다릅니다. 따라서 사용자는 최적의 결과를 위해 다양한 프로그램간에 정기적으로 데이터를 전송합니다. 이 백서에서는 사용자가 널리 사용되는 소프트웨어 패키지인 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3에서 워크플로를 탐색하여 아데노 관련 바이러스(AAV)의 거의 원자 분해능 구조를 얻을 수 있는 가이드를 제공합니다. 먼저 cryoSPARC v3를 사용하여 이미지 처리 파이프라인을 자세히 설명하는데, 효율적인 알고리즘과 사용하기 쉬운 GUI를 통해 사용자가 3D 맵에 빠르게 도착할 수 있기 때문입니다. 다음 단계에서는 PyEM 및 사내 스크립트를 사용하여 cryoSPARC v3에서 얻은 최고 품질의 3D 재구성에서 RELION-3 및 Scipion 3으로 입자 좌표를 변환 및 전송하고 3D 맵을 다시 계산합니다. 마지막으로, RELION-3 및 Scipion 3의 알고리즘을 통합하여 결과 구조를 더욱 구체화하고 검증하기 위한 단계를 간략하게 설명합니다. 이 기사에서는 세 가지 처리 플랫폼을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위해 다양한 데이터 세트에 적용 할 수있는 강력하고 강력한 단일 워크 플로우를 만드는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
Cryo-electron microscopy (cryo-EM) 및 single-particle analysis (SPA)는 수화 상태에서 다양한 생체 분자 어셈블리의 구조 결정을 가능하게하여 원자 세부 사항에서 이러한 거대 분자의 역할을 조명하는 데 도움이됩니다. 현미경 광학, 컴퓨터 하드웨어 및 이미지 처리 소프트웨어의 개선으로 2 Å1,2,3 이상의 해상도에서 생체 분자의 구조를 결정할 수있었습니다. 2020년에 2,300개 이상의 cryo-EM 구조물이 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 기탁되었으며, 이는 20144년의 192개 구조물과 비교하여, cryo-EM이 많은 구조 생물학자들이 선택하는 방법이 되었음을 나타냅니다. 여기서는 고해상도 구조 결정을 위해 세 가지 SPA 프로그램을 결합하는 워크플로에 대해 설명합니다(그림 1).
SPA의 목표는 현미경 검출기로 기록된 시끄러운 2D 이미지에서 대상 시편의 3D 볼륨을 재구성하는 것입니다. 탐지기는 동일한 시야각의 개별 프레임을 가진 동영상으로 이미지를 수집합니다. 샘플을 보존하기 위해, 프레임은 낮은 전자 선량으로 수집되고, 따라서 불량한 신호 대 잡음비(SNR)를 갖는다. 추가적으로, 전자 노출은 유리화된 cryo-EM 격자 내의 움직임을 유도할 수 있고, 이로 인해 이미지 블러링이 발생할 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해 프레임은 빔 유도 모션을 보정하도록 정렬되고 평균화되어 SNR이 증가한 현미경 사진을 생성합니다. 이 현미경은 현미경에 의해 부과 된 초점 저하 및 수차의 효과를 설명하기 위해 대비 전달 함수 (CTF) 추정을 거칩니다. CTF 보정 현미경 사진에서 개별 입자를 선택, 추출 및 유리체 얼음에서 시편에 채택 된 다양한 방향을 나타내는 2D 클래스 평균으로 분류됩니다. 결과적인 균질 입자 세트는 거친 모델 또는 모델을 생성하기 위해 ab initio 3D 재구성을 위한 입력으로 사용되며, 이 패턴은 하나 이상의 고해상도 구조를 생성하기 위해 반복적으로 정제됩니다. 재구성 후, cryo-EM 맵의 품질과 해상도를 더욱 향상시키기 위해 구조 개선이 수행됩니다. 마지막으로, 원자 모델이 맵에서 직접 파생되거나 맵에 다른 곳에서 얻은 원자 좌표가 장착되어 있습니다.
Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 등을 포함하여 위에서 설명한 작업을 수행하기 위해 다양한 소프트웨어 패키지를 사용할 수 있습니다. 이러한 프로그램은 유사한 처리 단계를 따르지만 입자를 선택하고, 초기 모델을 생성하고, 재구성을 구체화하는 등 다양한 알고리즘을 사용합니다. 또한 이러한 프로그램은 작동하기 위해 다양한 수준의 사용자 지식과 개입이 필요하며, 일부는 새로운 사용자에게 장애물 역할을 할 수있는 매개 변수의 미세 조정에 달려 있습니다. 이러한 불일치로 인해 플랫폼 전반에 걸쳐 품질과 해상도가 일관되지 않은 맵이 생기는 경우가 많으며14, 많은 연구자가 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 개선하고 검증해야 합니다. 이 기사에서는 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3을 사용하여 유전자 치료에 널리 사용되는 벡터 인 AAV의 고해상도 3D 재구성을 얻습니다15. 앞서 언급 한 소프트웨어 패키지는 학술 사용자에게 무료입니다. cryoSPARC v3 및 Scipion 3에는 라이선스가 필요합니다.
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Protocol
1. 새로운 cryoSPARC v3 프로젝트 만들기 및 데이터 가져오기
참고 : 데이터는 포틀랜드의 오레곤 보건 과학 대학 (OHSU)에서 팔콘 3 직접 전자 검출기가 장착 된 300kV Titan Krios 전자 현미경을 사용하여 획득되었습니다. 이미지는 129개의 프레임에 걸쳐 28.38 e-/Å2의 총 투여량과 -0.5 μm 내지 -2.5 μm의 디포커스 범위, EPU를 사용하여 1.045 Å의 픽셀 크기로 카운팅 모드에서 수집되었다. AAV-DJ의 샘플은 OHSU의 직원에 의해 제공되었다.
- 웹 브라우저에서 cryoSPARC v3을 열고 프로젝트 헤더를 클릭합니다. + 추가를 선택하여 새 프로젝트를 만듭니다. 그에 따라 프로젝트의 제목을 지정하고 작업 및 데이터가 저장될 기존 디렉터리의 경로를 제공합니다.
- 프로젝트를 열고 + 추가를 클릭한 다음 새 작업공간을 선택하여 프로젝트의 작업공간을 만듭니다. 작업 공간의 제목을 지정하고 만들기를 클릭하십시오.
- 새 작업 영역으로 이동하여 오른쪽 패널에서 작업 작성기를 엽니다. 이 탭에는 cryoSPARC v3에서 사용할 수 있는 모든 기능이 표시됩니다. 영화 가져오기 를 클릭하고 동영상 경로를 제공하고, 참조 파일 경로를 얻고, 다음과 같이 획득 파라미터를 설정합니다: 원시 픽셀 크기 1.045 Å, 가속 전압 300 kV, 구형 수차 2.7 mm, 총 노출 선량 28.38 e-/Å^2.
- 대기열을 클릭하고 작업 및 작업 영역을 실행할 차선을 선택한 다음 만들기를 클릭하십시오.
참고: 수집 파라미터는 샘플 및 현미경에 따라 다릅니다.
2. CryoSPARC v3 - 영화 정렬 및 CTF 추정
- 패치 동작 보정(멀티)을 엽니다. 이 작업을 수행하려면 1.3단계에서 가져온 동영상을 입력으로 사용해야 합니다. 작업공간에서 동영상 가져오기 작업 카드를 열고 Imported_movies 출력을 새 작업의 동영상 자리 표시자로 끕니다. 작업을 큐에 넣습니다.
참고: 이 문서에 설명된 cryoSPARC 방법에 대한 자세한 내용은 cryoSPARC 자습서16을 참조하십시오. - CTF 추정을 수행하려면 패치 CTF 추정(다중)을 엽니다. 2.1단계에서 생성된 현미경 사진을 입력하고 작업을 큐 에 넣습니다.
- 평균 및 CTF 보정 현미경 사진을 검사하고 추가 처리를 위한 하위 집합을 선택하려면 큐레이트 노출을 열고 2.2단계에서 얻은 노출을 입력합니다. 작업을 큐 에 넣습니다.
- 작업이 대기 모드로 전환되면 작업 카드에서 상호 작용 탭을 클릭하고 매개 변수 임계값을 조정한 다음 추가 처리를 위해 개별 현미경 사진을 수락하거나 거부합니다. 잘 일치하는 추정 및 실험 CTF가 있는 현미경 사진(그림 2)을 수락하고 난시가 높고, CTF 적합성이 좋지 않으며, 얼음이 두꺼운 것을 버립니다.
- 현재 데이터를 처리하는 동안 난시의 상한값을 400 Å로, CTF 적합 분해능을 5 Å로, 상대 얼음 두께를 2로 설정합니다. 완료 를 클릭하여 다운스트림 처리를 위한 현미경 사진을 선택합니다.
3. CryoSPARC v3 - 수동 및 템플릿 기반 입자 피킹
- 수동 선택기를 열고 2.4-2.5단계에서 허용된 노출을 입력한 다음 작업을 큐에 넣습니다. 대화식 탭을 클릭하고 상자 크기(px)를 300으로 설정한 다음 여러 현미경 사진에서 수백 개의 파티클을 클릭하고 겹치는 파티클을 선택하지 않도록 합니다. 여기에서, 29개의 현미경 사진에 걸쳐 340개의 입자가 선택되었다. 완료되면 완료 피킹을 클릭하십시오! 입자를 추출하십시오.
참고: 이 프로토콜은 수동 파티클 피킹을 사용하여 자동 선택을 위한 템플릿을 생성합니다. 그러나, 다른 방법들도 이용가능하다17. - 자동화된 입자 선택을 위한 템플릿을 생성하려면 2D 분류 를 클릭하고 3.1단계에서 생성된 파티클 픽을 입력합니다. 2D 클래스 수를 10으로 변경하고 작업을 큐 에 넣습니다.
- 2D 클래스 선택을 엽니다. 3.2단계에서 얻은 파티클과 클래스 평균을 입력하고 대화식 탭을 클릭합니다. 좋은 SNR을 가진 대표적인 2D 클래스를 선택하고 완료를 클릭하십시오.
참고: 클래스 평균은 서로 다른 파티클 뷰를 반영합니다. 각 뷰를 반영하는 클래스 평균을 선택합니다. 목표는 자동 피킹을 위해 시편의 다양한 뷰를 나타내는 잘 정의 된 템플릿을 생성하는 것입니다. - 템플릿 선택기를 열고 3.3단계에서 선택한 2D 클래스와 2.4-2.5단계의 현미경 사진을 입력합니다. 입자 지름(Å)을 220 Å로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다.
- 자동화된 피킹을 검사하려면 파티클 픽 선택을 열고 3.4단계에서 생성된 파티클 및 현미경 사진을 입력한 다음 작업을 큐 에 넣습니다.
- 파티클 선택 작업 카드에서 대화형 탭을 클릭하고 상자 크기(px)를 300으로 설정합니다. 개별 현미경 사진을 클릭하고 파티클이 명확하게 표시될 때까지 저역통과 필터를 조정한 다음 NCC(정규화된 교차 상관 관계) 임계값을 0.41로, 전력 임계값을 54000에서 227300 사이로 설정합니다.
- 여러 현미경 사진을 검사하고 필요한 경우 임계값을 조정하여 대부분의 입자가 오탐을 포함하지 않고 선택되도록 합니다. 완료되면 피킹 완료를 클릭합니다! 입자를 추출하십시오.
참고: 트루 파티클은 일반적으로 높은 NCC 및 전력 스코어를 가지며, 이는 템플릿과 유사하고 각각 높은 SNR을 가짐을 나타냅니다. - 현미경 사진에서 추출을 열고 3.7 단계에서 현미경 사진과 입자를 입력하십시오. 추출된 상자 크기(px)를 300으로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다.
4. CryoSPARC v3 - 2D 분류
- 2D 분류를 클릭하고 3.8단계에서 추출된 입자를 입력합니다. 2D 클래스 수를 50으로 설정하고 작업을 큐에 넣습니다.
- 추가 처리에 가장 적합한 2D 클래스를 선택하려면 2D 클래스 선택을 엽니다. 단계 4.1에서 얻은 입자와 클래스 평균을 입력합니다. 대화식 탭을 클릭하고 해상도와 클래스의 파티클 수에 따라 2D 클래스를 선택합니다(그림 3). 아티팩트가 포함된 클래스를 선택하지 마십시오. 선택한 후 완료를 클릭하십시오.
참고: 일반적으로 입자를 제거하려면 여러 라운드의 2D 분류가 필요하며, 이 파티클은 뚜렷하고 잘 정의된 클래스로 수렴되지 않습니다. 데이터 세트에서 이러한 파티클을 제거하기 위해 필요한 만큼의 2D 분류 라운드를 실행합니다(그림 3).
5. CryoSPARC v3 - ab-initio 재구성 및 균질 정제
- 초기 3D 볼륨을 생성하려면, Ab-initio 재구성을 열고 단계 4.2 또는 최종 2D 분류로부터 수득된 입자를 입력한다. 대칭 을 icosahedral으로 조정하십시오. 작업을 큐 에 넣습니다.
참고: 대칭은 샘플에 따라 다르므로 그에 따라 변경해야 합니다. 알 수 없는 경우 C1 대칭을 사용합니다. - 개방 균질 정제. 단계 5.1의 부피와 4.2 또는 최종 2D 분류의 입자를 입력합니다. 대칭 을 변경하고 작업을 큐 에 넣습니다. 작업이 완료되면 푸리에 셸 상관 관계(FSC) 곡선을 검사하고 볼륨을 다운로드하여 UCSF Chimera18에서 검사합니다.
6. cryoSPARC v3에서 입자 좌표를 내보내고 PyEM을 사용하여 RELION-3으로 가져 오기
참고: 입자 좌표는 각 현미경 사진에서 개별 입자의 위치에 대한 정보를 전달합니다. 파티클 스택 대신 좌표를 RELION-3으로 전송하면 다른 방법으로는 사용할 수 없는 구체화 단계를 실행할 수 있습니다. 예를 들어, 파티클 폴리싱은 초기 필름 프레임에 액세스해야 합니다. 따라서 입자 좌표를 cryoSPARC v3에서 RELION-3으로 내보내기 전에 RELION-3에서 동영상을 가져오고 동작 보정 및 CTF 추정을 수행합니다. 자세한 내용은 RELION-3 자습서19를 참조하십시오.
- RELION-3 프로젝트 디렉토리로 이동하여 RELION-3을 시작합니다.
- 작업 유형 브라우저에서 가져오기 를 열고 1.3단계와 같이 동영상 및 획득 매개 변수에 대한 경로를 지정합니다.
- 모션 보정을 수행하려면 RELION-3 GUI를 통해 UCSF MotionCor220을 사용하고 모션 보정 을 열고 UCSF MotionCor2 매뉴얼21에서와 같이 기본 파라미터를 설정합니다. 6.2단계에서 가져온 동영상의 경로를 입력합니다. 동작 탭에서 motioncor2 실행 파일의 경로를 지정합니다.
참고: MotionCor2는 여러 GPU를 사용하여 병렬로 실행할 수 있습니다. - RELION-3 GUI를 통해 CTFFIND-4.122를 사용하여 CTF 추정을 수행합니다. CTF 추정을 열고 6.3단계에서 생성된 현미경 사진.star를 입력합니다. CTFFIND-4.1 탭에서 CTFFIND-4.1 실행 파일의 경로를 지정하고 RELION-3.1 자습서19에서와 같이 매개 변수를 설정합니다.
- cryoSPARC v3에서 RELION-3으로 파티클 스택을 가져오려면 먼저 cryoSPARC v3에서 내보내야 합니다. cryoSPARC v3에서 4.2단계에서 2D 클래스 선택 작업 또는 최종 2D 분류의 작업 카드를 엽니다. 세부 정보 탭에서 작업 내보내기를 클릭합니다. 내보내기 작업은 particles_exported.cs 파일을 출력합니다.
- cryoSPARC v3에서 RELION-3으로 입자 좌표를 가져오기 전에 6.5단계에서 particles_exported.cs 파일을 .star 형식으로 변환해야 합니다. PyEM23을 사용하여 다음 명령을 실행하여 particles_exported.cs 파일을 .star 형식으로 변환합 csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
- RELION-3에서 수동 피킹 탭을 클릭하고 I/O 탭에서 6.4단계에서 설명한 CTF 구체화의 현미경 사진을 입력합니다. 디스플레이 탭에서 다음 매개 변수를 입력합니다: 입경(A): 220, 저역통과 필터(A): -1, CTF 이미지의 배율: 0.5. 작업을 실행합니다. ManualPick이라는 디렉토리가 RELION-3 홈 폴더에 생성됩니다.
참고: 이 단계는 RELION-3에서 수동 선택 폴더 구조를 만들기 위해 수행됩니다. 수동 피킹을 실행하는 동안 RELION-3 GUI에서 피킹하는 데 사용되는 각 평균 현미경 사진에 대해 선택된 파티클의 좌표를 포함하는 단일 .star 파일이 생성됩니다. - 6.6단계에서 particles_exported.star 파일이 들어 있는 폴더로 이동하여 cryo-SPARC v3 입자를 선택하는 데 사용되는 각 평균 현미경 사진에 대해 단일 manualpick.star 파일을 생성하는 자체 작성 스크립트를 실행하여 6.5단계에서 내보낸 최종 2D 분류에 기여했습니다. 결과 좌표 파일은 ManualPick/Movies 폴더에 저장됩니다.
- RELION-3으로 돌아가서 수동 피킹 작업을 다시 엽니다. 계속을 클릭하십시오. 그러면 RELION-3 GUI의 cryoSPARC v3에서 이전에 선택한 입자가 표시됩니다. 몇 가지 현미경 사진을 검사하여 입자 좌표의 전달이 완료되었는지 그리고 입자가 제대로 선택되었는지 확인합니다.
7. RELION-3 - 입자 추출 및 2D 분류
- 입자 추출을 클릭하십시오. I/O 탭에서 6.4단계의 CTF 보정된 현미경 사진과 6.9단계의 좌표를 입력합니다. 추출 탭을 클릭하고 입자 상자 크기 (pix)를 300으로 변경하십시오. 작업을 실행합니다.
- 2D 분류를 수행하여 cryoSPARC v3에서 생성된 입자 세트를 추가로 청소하여 고분해능 재구성을 달성하십시오. 2D 분류를 클릭하고 I/O 탭에서 7.1단계에서 생성된 particles.star 파일을 입력합니다. 최적화 탭에서 클래스 수를 50으로, 마스크 직경(A) 을 280으로 설정합니다. 작업을 실행합니다 .
참고: 마스크는 전체 파티클을 포함해야 합니다. - 최상의 2D 클래스를 선택하려면 하위 집합 선택 메서드를 클릭하고 7.2단계에서 _model.star 파일을 입력한 다음 작업을 실행합니다 . 4.2단계에서 설명한 대로 클래스를 선택합니다.
- 7.2단계와 7.3단계를 반복하여 수렴되지 않는 입자를 제거합니다.
8. RELION-3 - 3D 개선, 마스크 생성 및 후처리
- cryoSPARC v3(5.2단계)에서 생성된 맵을 RELION-3의 3D 구체화를 위한 초기 모델로 사용합니다. 가져오기 방법을 선택하고 I/O 탭에서 다음 매개 변수를 설정합니다. 원시 동영상/ 현미경 사진 가져오기: 아니요, 원시 입력 파일: 동영상/*.mrc.
- MTF 파일을 제공하고 1.3단계에서 설명한 대로 동영상 획득 파라미터를 입력합니다. 기타 탭에서 cryoSPARC v3 맵을 입력 파일로 선택하고 노드 유형을 3D 참조(.mrc)로 변경한 다음 작업을 실행합니다 .
- 3D 자동 구체화를 선택하고 I/O 탭에서 입력 이미지를 7.3단계 또는 마지막 선택 작업의 particles.star 파일로 설정합니다. cryoSPARC v3 재구성을 참조 맵으로 제공하십시오. 참조 탭을 클릭하고 초기 저역 통과 필터 (Å)를 50으로, 대칭을 icosahedral으로 변경하십시오. 최적화 탭에서 마스크 지름(Å)을 280으로 변경하고 작업을 실행합니다.
- 실행이 끝나면 UCSF 키메라에서 run_class001.mrc를 엽니 다.
- UCSF 키메라에서 도구를 클릭하고 볼륨 데이터에서 볼륨 뷰어를 선택하십시오. 그러면 볼륨 설정을 조정할 수 있는 새 창이 열립니다. 스 텝 을 1로 변경하고 맵에 노이즈가 없는 레벨 값에 도달할 때까지 슬라이더를 조정합니다. 이 값은 다음 단계에서 마스크 생성에 사용되므로 기록합니다.
- 자동 미세 조정으로 생성된 맵은 주변 솔벤트의 노이즈가 분해능을 낮추기 때문에 실제 FSC를 반영하지 않습니다. 후처리 전에 시편을 용매 영역과 구별하기 위해 마스크를 만듭니다.
- 마스크 생성을 클릭하고 8.3 단계에서 run_class001.mrc를 입력하십시오.
- 마스크 탭을 클릭하고 다음과 같이 매개 변수를 조정합니다. 저역통과 필터 맵(Å): 10, 픽셀 크기(Å): 1.045, 초기 쌍나화 임계값: 8.5단계에서 얻은 레벨 값, 이 많은 픽셀의 이진 맵 확장: 3, 이 많은 픽셀의 소프트 에지 추가: 3. 작업을 실행합니다.
- UCSF 키메라에서 마스크를 검사하십시오. 마스크가 너무 꽉 조이면 이 많은 픽셀을 이진 맵 확장 및/또는 이 많은 픽셀의 소프트 에지 추가를 늘리십시오. 날카로운 마스크로 인해 과적합이 발생할 수 있으므로 가장자리가 부드러운 마스크를 만드는 것이 중요합니다.
- 사후 처리를 클릭하고 I/O 탭에서 8.3단계에서 만든 하프 맵을 입력하고 8.6에서 마스크를 입력합니다. 보정된 픽셀 크기를 1.045 Å로 설정합니다. 선명한 탭에서 다음을 입력합니다: B 요인 자동 추정?: 예, 자동 B 적합에 대한 최저 해상도(A): 10, 자신의 B 요인 사용?: 아니요. 필터 탭에서 Fsc-가중치 건너뛰기?를 아니요로 설정합니다. 작업 실행.
9. RELION-3 - 연마 훈련 및 입자 연마
- 파티클당 빔 유도 동작을 수정하기 전에 먼저 훈련 모드를 사용하여 데이터 세트에 대한 최적의 동작 트랙을 식별합니다. 베이지안 폴리싱을 열고 I/O 탭에서 6.3단계의 동작 보정 현미경 사진, 8.3단계의 파티클, 8.8단계의 포스트프로세스 .star 파일을 입력합니다. 훈련 탭을 클릭하고 다음 매개변수를 설정합니다: 최적 파라미터 학습 : 예, 테스트를 위한 푸리에 픽셀의 분수: 0.5, 이 많은 파티클 사용: 5000. 작업을 실행합니다 .
참고: 이 스크립트는 다음 단계opt_params_all_groups.txt 실행하는 데 필요한 최적화된 연마 매개 변수를 포함하는 RELION-3 폴란드어 폴더에 파일을 생성합니다. - 교육 작업이 완료되면 베이지안 연마를 클릭하십시오. 교육 탭을 클릭하고 최적 매개 변수 학습? 을 아니요로 설정합니다. 폴란드 어 탭을 선택하고 최적화된 매개변수 파일에서 9.1단계의 opt_params_all_groups.txt 파일의 경로를 지정합니다. 실행을 클릭하십시오.
- 연마된 입자 세트로 3D 미세 처리(단계 8.3) 및 후처리(단계 8.8)를 반복합니다.
10. 릴리온-3 - CTF 및 입자당 정제
- 더 높은 차수의 수차를 추정하려면 CTF 구체화를 열고 파티클 아래의 I/O 탭에서 최근 구체화된 3D 작업(run_data.star)에서 연마 된 파티클이 포함된 .star 파일의 경로를 선택합니다.
- 포스트프로세스 스타 파일 아래에서 최신 후처리 작업의 출력 경로를 설정합니다(단계 9.3).
- 적합(Fit) 탭을 선택하고 다음 매개변수를 설정합니다: 추정(이방성 배율): 아니요, CTF 매개변수 피팅을 수행하시겠습니까? 아니요, 빔틸트 추정: 예, 트레포일도 추정합니까? 예, 4차 수차 추정? 예. 작업을 실행합니다.
- 이전 작업(particles_ctf_refine.star)에서 생성된 입력 파티 클(Refine3D 에서)을 사용하여 10.1단계를 반복합니다. 적합(Fit ) 탭에서 추정치(이방성 배율) 를 예로 변경하고 작업을 실행합니다 .
- 이전 작업(particles_ctf_refine.star)에서 생성된 입력 파티 클(Refine3D 에서)을 사용하여 10.2단계를 반복합니다. 적합 탭에서 다음 매개 변수를 설정합니다. 추정(이방성 배율): 아니요, CTF 매개변수 피팅 수행?: 예, 디포커스 맞춤?: 입자당, 난 시 적합? 현미경 사진, B 요인 적합?: 아니요, 위상 이동 적합: 아니요, 빔틸트 추정?: 아니요, 4차 수차 추정?: 아니요. 실행 하십시오.
참고: 파티클의 대비가 충분하면 난시 적합 탭을 파티클별로 설정할 수 있습니다. 이 데이터 세트의 경우, 입자별 난시 개선은 맵의 품질과 해상도를 향상시키지 못했습니다. - 10.3단계의 파티클에 대해 3D 미세 조정을 반복하고 I/O 탭에서 솔벤트 플랫attened FSC 사용?을 yes로 설정합니다. 실행이 완료되면 후처리 작업을 실행하고(단계 8.8) UCSF 키메라에서 맵을 검사합니다(단계 5.2).
11. RELION-3 입자 좌표와 3D 맵을 Scipion 3으로 전송
- RELION-3 맵을 더 구체화하고 유효성을 검사하려면 먼저 마지막 후처리 작업(단계 10.4)에서 Scipion 3으로 볼륨과 파티클을 가져옵니다. Scipion 3을 시작하고 새 프로젝트를 만듭니다.
- 왼쪽 프로토콜 패널에서 가져오기 드롭다운 을 선택하고 파티클 가져오기를 클릭합니다. 다음 매개 변수를 변경합니다. 가져오기 위치: RELION-3, 별 파일: postprocess.star, 1.3단계와 같이 획득 매개 변수를 지정합니다. 실행을 클릭하십시오.
- 가져오기 드롭다운 을 클릭하고 볼륨 가져오기를 선택합니다. 가져오기에서 RELION-3 맵으로 가는 경로를 지정합니다. 픽셀 크기 (샘플링 속도) Å / px 를 1.045로 변경하고 실행하십시오.
12. Scipion 3 - 고해상도 정제
- 먼저 전역 정렬을 수행합니다. 프로토콜 패널에서 구체화 드롭다운을 선택하고 Xmipp3 - highres24를 클릭합니다. 11.2단계와 11.3단계에서 가져온 입자와 볼륨을 각각 전체 크기 이미지 및 초기 볼륨으로 입력하고 대칭 그룹을 icosahedral으로 설정합니다. 각도 할당 아래의 이미지 정렬 탭에서 글로벌을 선택하고 최대 대상 해상도를 3 Å로 설정하고 작업을 실행합니다.
- 작업이 완료되면 결과 분석을 클릭합니다. 새 창에서 UCSF 키메라 아이콘을 클릭하여 세련된 볼륨을 검사합니다. 또한 FSC (디스플레이 해상도 플롯) 를 클릭하여 구체화 후 FSC가 어떻게 변경되었는지 확인하고, 각도 변경이 있는 플롯 히스토그램 을 클릭하여 오일러 각도 할당이 변경되었는지 확인합니다.
참고: 입력 RELION-3 구조의 해상도에 따라 각도 할당 탭의 최대 대상 해상도에 대해 설정된 다른 값으로 이 단계를 여러 번 반복할 수 있습니다. 자세한 내용은 Scipion 자습서25를 참조하십시오. - 로컬 정렬을 사용하여 12.1단계를 반복합니다. 이전 작업을 복사하고 이전 실행 선택을 Xmipp3 - 고해상도 글로벌로 변경합니다. 각도 할당 탭에서 이미지 정렬을 로 컬로 변경합니다. 최대 대상 해상도 를 2.1 Å로 설정합니다.
- UCSF 키메라에서 정제된 맵을 검사하고 FSC 및 각도 할당의 변화를 분석합니다(단계 12.2). 해상도가 향상되지 않고 각도 할당이 수렴될 때까지 로컬 구체화를 반복하여 필요에 따라 최대 대상 해상도 를 조정합니다.
- Scipion 3의 출력 맵은 Phenix26에서 밀도를 추가로 수정하고 선명하게 할 수 있습니다.
13. Scipion 3 - 맵 유효성 검사
- Xmipp3 - highres에서 생성된 최종 맵의 로컬 해상도를 검사합니다. Xmipp - 로컬 MonoRes27을 열고 이전 작업의 최종 볼륨과 8.6단계에서 생성된 마스크를 입력합니다. 해상도 범위를 0.1 Å 간격으로 1 ~ 6 Å로 설정하고 작업을 실행합니다.
- 실행이 완료되면 결과 분석을 클릭하고 해상도별로 색상이 지정된 해상도 히스토그램 및 볼륨 슬라이스를 검사합니다.
- 파티클이 잘 정렬되어 있는지 확인하려면 다중 참조 정렬성28 을 열고 12.3단계에서 파티클과 부피를 입력합니다. 결과 분석을 클릭하여 유효성 검사 플롯을 표시합니다. 이상적으로 모든 점은 (1.0,1.0) 주위에 클러스터링되어야합니다.
- Xmipp3 열기 - 과적합의 유효성을 검사합니다. 12.3 단계에서 입자와 부피를 입력하십시오. 실행이 완료되면 결과를 분석하고 과적합 플롯을 검사합니다. 정렬된 가우시안 잡음과 정렬된 입자 곡선의 교차는 과적합을 나타냅니다.
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Representative Results
우리는 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3의 세 가지 처리 플랫폼을 사용하여 고해상도 구조를 얻기 위해 포괄적 인 SPA 파이프 라인을 제시했습니다. 그림 1과 그림 4는 일반적인 처리 워크플로를 요약하고 표 1에서는 구체화 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 AAV의 2.3 Å 구조를 개선하는 동안 사용되어 Nyquist 해상도에 근접했습니다.
영화는 먼저 cryoSPARC v3로 가져온 후 모션 및 CTF를 수정하여 평균 현미경 사진을 생성했습니다. 추가 처리를 위해 현미경 사진을 선택할 때는 품질이 낮은 현미경 사진을 포함하면 이후 처리 단계를 방해하여 분해능 재구성이 낮아질 수 있으므로 CTF 적합도가 좋고 난시가 낮은 사진을 선택하는 것이 중요합니다 (그림 2). 이어서, 27,364개의 입자를 골라서 선택된 현미경 사진으로부터 추출하였다. AAV의 직경은 약 220 Å이고 픽셀 크기는 1.045 Å이므로 300px의 상자 크기가 사용되었습니다. 다음으로, 반복적 인 2D 분류를 사용하여 아티팩트 및 안정적인 클래스로 수렴하지 않는 입자를 제거했습니다. 선택 및 제외된 2D 클래스 평균의 예가 그림 3에 나와 있습니다. 또한 시편의 다양한 형태를 반영하는 클래스 평균은 여러 3D 재구성을 위해 별도로 정제되어야한다는 점에 유의해야합니다. 이러한 경우, 다수의 ab initio 시작 볼륨이 계산되어야 합니다. 여기서, 26,741개의 입자를 선택하여 ab initio 모델링 및 단일 2.9 Å 구조의 균질한 정제를 위해 사용하였다.
cryoSPARC v3에서 선택한 입자의 좌표를 RELION-3으로 전송한 후 데이터 세트가 안정적인 2D 클래스로 수렴될 때까지 네 차례의 2D 분류 라운드를 추가로 수행했습니다. 전술한 2D 분류는 데이터 세트로부터 추가적인 3,154개의 입자를 제거하였다. cryoSPARC v3에서 생성된 구조를 초기 모델로 사용하여 RELION-3의 3D 미세화는 2.95 Å의 거의 동등한 분해능을 가진 구조를 생성했습니다. 입자당 모션 보정 및 CTF 미세화를 포함한 후속 구조 미세화는 분해능을 2.61 Å로 증가시켰습니다. 우리가 수행 한 구체화의 전체 목록은 표 1에 나와 있습니다. RELION-3에서 계산된 부피는 여러 라운드의 고해상도 정제(Xmipp3 - highres)를 사용하여 Scipion 3에서 더욱 정교화되었습니다. 후속 정제 라운드에서 추가 3,186개의 입자가 데이터 세트에서 제거되어 20,401개의 입자가 최종 세트로 생성되어 AAV의 2.3Å 재구성이 이루어졌습니다(그림 5 및 그림 6). 따라서 픽셀 크기가 1.045 Å 인 경우 개선 사항은 나이퀴스트 한계에 거의 도달했습니다. 각 프로그램을 사용하여 계산된 구조를 나타내는 FSC 곡선은 도 6에 도시되어 있다. 이러한 FSC 곡선은 워크플로우 전체에서 분해능이 증가했음을 나타냅니다. 해상도는 맵 내의 지점마다 다를 수 있기 때문에, FSC 곡선으로부터 단일 기준(예를 들어, 0.143 기준)에 따른 단일 해상도 추정치를 보고하기보다는 맵 내에 로컬 해상도 추정치의 분포를 제시하는 것이 더 적절하다. 따라서 Scipion 3의 Xmipp - MonoRes를 사용하여 이러한 분석을 수행했습니다. 그림 7은 cryoSPARC v3 및 Scipion 3으로 얻은 맵에 대한 로컬 해상도 추정치의 비교를 보여줍니다. 구조를 통해 네 개의 서로 다른 조각에서의 해상도 추정치(그림 7A,B) 및 분해능 히스토그램(그림 7C)은 워크플로 전체에서 맵 간의 로컬 해상도가 점진적으로 향상되었음을 명확하게 보여줍니다. 프로그램 Xmipp3를 사용하여 계산된 FSC 곡선 - Scipion 3의 고해상도는 나이퀴스트 한계에 도달했음을 나타내며(그림 6), 이는 분해능 추정치가 언더샘플링29에 의해 제한될 가능성이 매우 높음을 시사합니다. 그러나, 도 7C에 제시된 MonoRes 분석과 함께 AAV의 원자 좌표를 갖는 EM 맵 및 맵 피팅에 대한 신중한 분석(도 5)은 맵에 대한 보다 적절한 분해능 추정치가 2.3 Å임을 시사한다. FSC와 MonoRes 해상도 추정치를 조정하는 유사한 전략이 이전에 제시되었습니다.24,25. 해상도 추정치는 구체화 단계에서 사용되는 마스크의 영향을 받을 수 있으므로 마스크가 밀도의 어떤 부분도 제외하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 본 연구에서 사용된 마스크가 3D 재구성과 겹쳐져 도 7D에 제시되어 있다. 제시된 워크플로우에서 해상도가 점진적으로 증가함에 따라 여러 SPA 소프트웨어 패키지의 알고리즘을 활용하여 고품질 및 고해상도 3D 재구성을 달성할 수 있다는 이점이 강조됩니다.
현장 모델을 구축하거나 기존 원자 모델로 맵을 피팅하면 계산된 구조에 대한 품질 검사 역할을 할 수 있습니다. 우리는 UCSF 키메라에서 최종 맵을 시각화하고 이전에 발표 된 원자 모델 (PDB ID : 7kfr) 30으로지도를 장착했습니다. 도 5는 AAV의 원자 좌표가 장착된 cryo-EM 지도의 영역을 보여준다. 잘 정의 된 EM 밀도는 개별 아미노산, 물 분자 및 마그네슘 이온의 측쇄를 피팅하고 원자 모델과의 cryo-EM 맵의 일치를 확인합니다.
그림 1: cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 및 Phenix 1.18에서 SPA 워크플로우를 완료합니다. cryoSPARC v3, RELION-3, Scipion 3 및 Phenix 1.18에서 완료된 단계는 각각 보라색, 주황색, 녹색 및 회색 상자로 표시됩니다. 8개의 GPU, 40개의 CPU 및 750GB의 RAM이 장착된 처리 서버를 사용하여 각 단계를 완료하는 데 필요한 시간이 각 개별 상자에 지정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: cryoSPARC v3에서 다운스트림 처리를 위한 현미경 사진 선택. (A) 잘 일치하는 추정 및 실험적 Thon 링을 가진 현미경 사진은 추가 처리를 위해 사용되었고, 난시가 높고 적합성이 좋지 않은 현미경 사진은 폐기되었다. CTF-적합도가 5 Å 이상, 난시가 400 Å 이상, 상대 얼음 두께가 2 미만인 현미경 사진을 추가 처리, 즉 70/395 현미경 사진에서 제거하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 2D 클래스 선택 잘 정의된 클래스를 포함하는 2D 클래스 평균이 선택되고(A), 저분해능, 잡음 및 부분 파티클이 있는 클래스가 거부됩니다(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3에서 AAV 처리에 대한 워크플로우 및 대표 결과. cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3에서 완료된 단계는 각각 자주색, 주황색 및 녹색 화살표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: AAV의 고해상도 구조는 서로 다른 이차 구조 요소 및 개별 아미노산 측쇄를 나타내는 잘 정의된 EM 밀도를 보여줍니다. (A) AAV의 최종지도. (B) AAV (PDB ID: 7KFR)30의 원자 좌표가 장착된 베타 시트를 나타내는 맵의 일부. (C) 개별 아미노산을 나타내는 지도 밀도. 왼쪽에서 오른쪽으로: 아르기닌, 페닐알라닌, 트립토판. (D) 지도의 고해상도 특징은 적색으로 제시된 물 분자와 녹색 구체로서 제시된 마그네슘 이온을 포함한다. 도면에 표시된 Mg2+ 이온은 히스티딘(왼쪽)과 아르기닌 잔기에 의해 배위된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3의 FSC 곡선은 워크플로우 전체에서 증가하는 분해능을 보여줍니다. 프로그램 Xmipp3 - Scipion 3의 고해상도 프로그램을 사용하여 계산된 FSC 곡선은 나이퀴스트 한계에 도달했음을 나타내는 반면, 해상도 추정치가 undersampling29에 의해 제한됨을 시사하는 반면, 맵 해상도에 대한 보다 적절한 분석이 도 7에 제시되고 대표 결과 섹션 24,25에서 논의된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: Xmipp - MonoRes를 사용하여 Scipion 3의 최종 재구성 검증 맵의 해상도는 FSC 곡선의 단일 기준에 따라 단일 해상도 추정치가 아닌 로컬 해상도 분포를 제시하여 더 잘 설명됩니다. (A-B) 패널 A와 B는 각각 cryoSPARC v3 및 Scipion 3에서 생성된 맵과 다른 슬라이스를 보여줍니다. (C) cryoSPARC v3 (분홍색 막대) 및 Scipion 3 (파란색 막대)로 계산된지도에 대한 로컬 해상도의 체계적인 증가를 보여주는 히스토그램. (D) 로컬 해상도 계산에 사용되는 마스크(회색)는 두 프로그램 모두에서 정제된 AAV 밀도의 모든 부분을 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프로그램 | 구체화 유형 | 각본 | |||
| 냉동 SPARC v3 | 균질한 정제 | 균질한 정제 | |||
| 불균일 한 세련미 | 불균일 한 세련미 | ||||
| 이기종 정제 | 이기종 정제 | ||||
| 입자당 동작 보정 | 로컬 동작 보정 | ||||
| 릴리온-3 | 3D 구체화 | 구체화3D | |||
| 후처리 - B 요인 선명화, MTF 보정 | 구체화3D | ||||
| 입자 연마 | 베이지안 연마 | ||||
| CTF 개선 - 빔 기울기 | CtfRefine | ||||
| CTF 구체화 - 이방성 배율 | CtfRefine | ||||
| CTF 정제 - 입자당 디포커스, 입자당/현미경 난시 | CtfRefine | ||||
| Ewald 구 곡률 보정 | Relion_reconstruct | ||||
| 시피온 3 | 고해상도 개선 | Xmipp3 - 고해상도 | |||
| 페닉스 1.18 | 밀도 수정 및 선명화 | 리졸브크료엠 | |||
표 1: 워크플로 전반에 걸쳐 구현된 구체화 사항. 특정 구체화가 특정 프로젝트에 적용되는지 여부는 데이터 품질 및 수집 매개 변수에 따라 다릅니다. 예를 들어, Ewald 구체 곡률 보정은 이미 고해상도를 갖는 맵에 적용될 수 있다.
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Discussion
이 기사에서는 고해상도 3D 재구성을 달성하기 위해 다양한 소프트웨어 플랫폼에서 cryo-EM 데이터 처리를 위한 강력한 SPA 워크플로우를 제시합니다(그림 1). 이 워크플로우는 다양한 생물학적 거대분자에 적용할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 단계는 무비 전처리, 입자 채집 및 분류, 구조 미세화를 위한 여러 방법(표 1) 및 검증을 포함하여 그림 4에 요약되어 있습니다. cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3의 처리 단계와 소프트웨어 패키지 간에 데이터를 전송하는 방법이 제시되었습니다. 우리는 프로토콜 전체에서 얻은 중간 구조를 해상도가 증가하는 것으로 보여주었습니다 (그림 4, 그림 6 및 그림 7).
이 원고에 설명 된 방법은 다른 단백질 및 생물학적 어셈블리의 구조 결정에 사용될 수 있지만, AAV는 cryo-EM 및 SPA에 의한 고해상도 구조 결정을위한 이상적인 후보이며, 큰 크기는 현미경에서 높은 대비를 생성하고 icosahedral 대칭은 60 배 서브 유닛 중복성을 가진 입자를 산출하기 때문입니다. 고분해능 재구성을 얻는 것은 작은(즉, 100kD 미만), 동적 및 이기종 샘플의 경우 점점 더 어려워진다. 이 프로토콜을 성공적으로 실행하려면 처리를 위해 많은 고품질 영화를 수집하는 것이 중요합니다. 품질이 좋지 않은 원시 데이터에서는 고해상도 및 고품질 재구성을 얻을 수 없습니다. 예를 들어, 얼음 두께가 구조 결정에 최적이 아니거나 입자가 얼음-물 계면에 부착되거나 바람직한 배향을 나타내는 경우, 격자 동결 조건을 다시 방문하십시오.
워크플로우에서 또 다른 중요한 단계는 입자 채취 및 추출입니다. 입자 피킹 중에 상자 크기는 파티클의 가장 긴 축보다 약 1.4-2.5배 더 커야 하는데, 이는 디포커스로 인해 확산된 고해상도 정보를 캡처하기 위해 충분한 박스 크기가 필요하기 때문입니다. 그러나 상자 크기가 클수록 입자 추출 중에 생성되는 파일의 크기가 증가하기 때문에 처리 시간이 길어집니다. 상자 크기를 선택할 때는 입자 직경과 픽셀 크기를 고려하십시오. 많은 입자와 함께, 사용자는 초기 처리를 위해 추출 중에 입자를 빈 한 다음 최종 정제를 위해 전체 크기의 입자를 다시 추출하기를 원할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수동 파티클 피킹을 사용하여 자동 선택을 위한 템플릿을 생성합니다. 그러나 cryoSPARC v3은 또한 딥 러닝을 사용하여 이전 픽을 기반으로 파티클을 선택하는 Blob 기반 피커 및 Topaz 래퍼를 포함한 완전 자동화된 피킹 방법을 제공합니다. 이러한 알고리즘은 매우 강력하지만 나중에 2D 및 3D 분류로 상당한 수의 픽을 제거해야 합니다.
중요한 단계에는 방사선 손상 입자와 같은 아티팩트를 제거하고 샘플에 존재하는 시편의 다양한 구조적 형태를 분리하는 데 사용되는 2D 및 3D 분류도 포함됩니다. 사용자가 설정한 2D 클래스의 수는 현미경 사진에서 추출한 입자의 수, 대비 및 이질성에 따라 달라져야 하며, 목표는 입자의 각 개별 뷰를 별도의 2D 클래스로 분리하는 것입니다. 일반적으로 100개의 파티클마다 2D 클래스를 추가하고, 많은 수의 파티클로 새 샘플을 처리하는 경우 100개의 클래스가 좋은 출발점입니다. 2D 및 3D 분류의 여러 라운드 후에도 낮은 해상도 또는 중간 해상도를 얻을 수 있는 경우 더 큰 상자 크기의 입자를 다시 추출하여 더 많은 구조 정보를 얻을 수 있는지 확인합니다. 최종 재구성의 해상도를보고하는 동안 금 표준 방법에 따라 얻은 FSC 곡선을 현지 해상도 추정치와 맵 밀도에 대한 신중한 검사 및 원자 모델과의 일치와 함께 분석해야합니다.
바이러스 구조의 개선을 위해 RELION-3에 구현된 Ewald 구체 곡률 보정은 고해상도31에서 향상된 성능을 입증했습니다. 동적 다중 단백질 복합체의 구조를 정제하는 경우 RELION-3에서 구현된 3D 다체 구체화 또는 RELION-3 및 cryoSPARC v3에서 구현된 이미지 뺄셈을 사용하여 집중 분류를 시도하십시오. 이질성이 계산적으로 해결될 수 없다면, 샘플 준비 조건32를 재검토할 필요가 있다. 순도가 불충분하거나 단백질 분해를 초래하는 부적절한 준비는 3D 재구성의 품질을 방해합니다. 추가적으로, 단백질을 불안정하게 하거나 응집을 촉진하는 완충 조건은 구조 계산에 사용될 수 있는 잘 정의된 입자의 수를 심각하게 제한한다. 따라서, 여기에 제시된 방법을 가장 효과적으로 활용하기 위해서는, 샘플 안정성을 위한 최적의 조건을 동정하는 것이 필수적이다. 우리는 cryo-EM 전에 샘플을 스크리닝하기 위해 네거티브 염색 전자 현미경을 사용하는 것이 좋습니다.
cryo-EM이 점점 더 많은 구조 생물학자들에게 선호되는 3D 구조 결정 방법이 됨에 따라, 이미지 처리 및 구조 결정을 위한 통합적이고 견고한 워크플로우의 필요성이 더욱 분명해지고 있습니다. CryoSPARC는 사용하기 쉬운 웹 기반 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공하여 모든 경험 수준의 사용자가 신속하게 데이터를 처리하고 3D 구조를 계산할 수 있도록 합니다. 특히, CryoSPARC는 확률적 그라디언트 하강을 사용하여 ab initio 3D 재구성을 수행합니다. 또한, 이 소프트웨어는 빠른 3D 맵 구체화를 위해 분기 및 바운드 우도 최적화 알고리즘을 사용합니다7. 이 문서에서 설명하는 처리 파이프라인은 cryoSPARC v3을 사용하여 초기 3D 맵을 생성합니다. 그런 다음 3D 재구성은 경험적 베이지안 접근 방식을 사용하여 사용자의 데이터 세트를 기반으로 중요한 매개 변수를 추정하는 인기있는 패키지 인 RELION-3에서 개선되어 프로그램 작동에 대한 전문 지식의 필요성을 줄입니다10. 특히, 베이지안 폴리싱을 사용하여 입자당 동작 보정을 수행하고 CTF 개선을 통해 분해능을 개선합니다. 마지막으로, 결과 구조는 Xmipp13, EMAN28, SPIDER12 및 기타를 포함한 여러 플랫폼의 알고리즘을 지원하는 통합 Python 쉘 인 Scipion 311에서 더욱 정교하고 검증됩니다. cryo-EM 사용자가 사용할 수 있는 다양한 소프트웨어 패키지가 있지만, 현재 현장에서 사용할 수 있는 범용 SPA 플랫폼은 없습니다. SPA 워크플로는 이 문서에서 설명하는 세 가지 소프트웨어 패키지 중 하나에서 완전히 실행될 수 있지만 알고리즘에 따라 다양한 결과가 나올 수 있습니다. 따라서 데이터의 샘플 및 품질에 따라 개별 단계를 사용자 정의해야 합니다. 예를 들어, 현재 데이터 세트의 경우 RELION-3의 3Drefine은 3D 재구성의 해상도를 증가시켰고, cryoSPARC v3의 불균일 미세화로 인해 해상도가 약간 감소했습니다. 따라서 다양한 프로그램을 활용하여 구조를 재계산하여 최적의 품질과 해상도를 달성하고 재구성의 검증을 용이하게하는 것이 크게 유익합니다. Scipion 3에는 cryoSPARC v3 및 RELION-3의 수많은 알고리즘이 포함되어 있지만 이러한 프로그램의 최신 구현은 Scipion에서 즉시 사용할 수 없습니다. 예를 들어,이 원고에서 활용 된 프로그램 중 RELION-3 만이 스크립트 Relion_reconstruct을 통해 Ewald Sphere 곡률 보정을 제공합니다. 이 문서에 제시된 파이프라인은 신규 사용자와 숙련된 사용자 모두가 cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3으로 구현된 알고리즘을 성공적으로 사용하여 원자 분해능에 가까운 3D 구조를 계산할 수 있는 가이드를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
Scipion3 설치에 도움을 주신 Carlos Oscar Shorzano와 Kilian Schnelle과 Arne Moeller에게 서로 다른 처리 플랫폼 간의 데이터 전송에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구의 일부는 NIH 보조금 U24GM129547에 의해 지원되었으며 OHSU의 PNCC에서 수행되었으며 생물 및 환경 연구 사무소가 후원하는 DOE 과학 사용자 시설 사무소 인 EMSL (grid.436923.9)을 통해 액세스했습니다. 이 연구는 Rutgers University에서 Arek Kulczyk에 대한 창업 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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