Summary
본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.
Abstract
게놈 복구 메카니즘에 기초한 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템은 전통적인 상동성 재조합에 비해 유전자 변형된 마우스 모델을 보다 빠르고 쉽게 생성할 수 있게 한다. CRISPR-Cas9 시스템은 단일 점 돌연변이가 필요할 때 특히 매력적입니다. 갭 접합 단백질인 Connexin 43 (Cx43)은 유전자 Gja1에 의해 코딩되며, 유전자 Gja1은 단일 코딩 엑손을 가지며 접합될 수 없다. 그러나 Gja1은 전장 Cx43 단백질뿐만 아니라 내부 번역으로 알려진 과정에 의해 최대 여섯 개의 N 말단 절단 이소형을 생산하며, 이는 내부 AUG (메티오닌) 시작 부위에서 리보솜 번역 개시의 결과입니다. GJA1-20k는 Gja1 mRNA의 위치 213에서 AUG 코돈에서 개시되는 Cx43의 가장 일반적으로 생성된 절단된 이소형이다. 잔기 213은 Cx43의 마지막 막횡단 도메인의 끝에서 발생하기 때문에, GJA1-20k는 독립적인 단백질로서 Cx43의 20 kDa C 말단 꼬리이다. 이전의 연구자들은 세포에서 GJA1-20k의 중요한 역할이 원형질막으로의 전장 Cx43 갭 접합 반원로의 밀매를 촉진하는 것임을 확인했다. 생체내에서 이러한 현상을 조사하기 위해, 잔기 213에서 ATG(메티오닌)를 TTA(류신, M213L 돌연변이)로 대체하는 Gja1 점 돌연변이를 갖는 돌연변이 마우스가 생성되었다. M213L의 결과는 Gja1 mRNA와 전장 Cx43이 여전히 생성되지만 Gja1-20k의 번역은 현저히 감소한다는 것이다. 이 보고서는 하나의 아미노산 돌연변이 (Gja1M213L / M213L) 마우스 모델을 개발하기 위해 제한 효소 부위를 선택하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 시스템에 의한 유전자 변형 마우스와 PCR 및 제한 효소 처리를 결합하여 신속한 유전자형을 기술한다.
Introduction
전장 코넥신 43 (Cx43) 및 N 말단 절단된 이소형, GJA1-20k는 동일한 GJA1 mRNA에 의해 코딩되지만 번역을 개시하기 위해 상이한 시작 코돈1을 이용한다. Cx43 번역은 제1 AUG 개시 코돈에서 발생하는 반면, GJA1-20k 번역은 잔기 213에서 AUG에서 개시된다. GJA1-20k는 전장 Cx43 밀매, 액틴 안정화 및 시험관 내 미토콘드리아 형태학의 조절에 필수적인 역할을한다는 것이 이전에 발견되었습니다 1,2,3.
생체내에서 GJA1-20k의 역할을 이해하기 위해, 전장 Cx43을 생성하는 능력을 유지하는 GJA1-20k "녹아웃" 마우스 모델이 생성되었다. 접근법은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 213의 단일 잔기를 메티오닌 (M)에서 류신 (L) (Gja1M213L / M213L)4로 대체하는 것이 었습니다. 내부 M 내지 L 돌연변이는 내부 번역이 발생할 가능성을 극적으로 감소시키면서도 전장 단백질4의 번역 및 기능을 유지한다. 야생형(WT)과 돌연변이된 대립유전자는 크기가 동일하고 mRNA 산물이 거의 동일하기 때문에, 마우스에서 유전자형을 확인하는 데 상당한 어려움이 있다. DNA 시퀀싱은 돌연변이를 확인할 수 있지만 일상적인 사용에는 너무 비싸고 시간이 많이 걸립니다. 일반적으로, 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 미니시퀀싱-라이게이션, 고분해능 용융 분석, 및 테트라-프라이머 증폭 난 치성 돌연변이 시스템 PCR(ARMS-PCR)5,6,7,8과 같은 몇 가지 더 빠른 지노타이핑 방법이 확립되었다. 그러나 이러한 대안적인 방법에는 비특이적 PCR 산물을 유도할 수 있는 여러 단계, 고유한 자원 및/또는 몇 가지 특정 프라이머 세트가 필요합니다.
이 프로토콜은 단일 아미노산 돌연변이를 만들기 위해 CRISPR-Cas9에 의한 상세한 유전자 표적화 및 편집 접근법을 소개하고, 돌연변이를 확인하기 위해 신속한 지노타이핑이 제시된다. 유전자형 동정은 표적 유전자를 확인하기 위해 단 하나의 프라이머 세트만을 활용하는 제한 효소의 창조적 사용을 포함한다. 독자는 1 잔기 Gja1M213L / M213L 치환 돌연변이로 인한 갑작스런 심장 사망의 심오한 전기 생리 학적 효과를 관찰하기 위해 참조4를 참조합니다.이 돌연변이는 여전히 전장 단백질을 생성하지만 더 작은 내부 번역 절단 이소형을 생성하지 못합니다. 이 프로토콜은 다른 마우스 모델이 내인성 전장 단백질의 발현을 유지하면서 관심있는 이소형의 내부 번역을 줄이기 위해 점 돌연변이를 사용하도록 하는 데 도움이 될 것이다.
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Protocol
"모든 동물 관리 및 연구 프로토콜은 Cedars-Sinai Medical Center와 University of Utah의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 8-9주령에 상업적 공급원으로부터 얻은 C57BL/6J 암컷 마우스( 표 자료 참조)를 실험에 사용하였다.
1. 유전자 표적화를 위한 준비
- CRISPOR 웹 알고리즘 4,9,10을 사용하여 M213을 코딩하는 표적화된 돌연변이 부위 주위의 가이드 표적 서열을 선택하십시오(자료의 표 참조).
참고: GJA1 코딩 서열로부터의 반대 가닥에 있는 20-염기 가이드 서열(ATTCAGAGCGAGAGAGACACCA)을, MIT 스코어11 의 62로 돌연변이될 코돈(ATG)의 하류의 16개 염기 이후에 잠재적인 절단 부위가 위치하는 것을 선택하였다(도 1; 전체 crRNA 서열은 표 1에 도시됨). - Cas9와 상호작용하는 crRNA 및 tracrRNA를 가이드 RNA12로서 합성한다.
참고: 가이드 RNA의 MIT 스코어는 62이지만, PAM으로부터 12개 이상의 염기 떨어져 있는 네 개의 미스매치를 갖는 단 하나의 잠재적인 오프 타겟 돌연변이가 있다. 따라서, 이러한 가이드 RNA는 안전한 것으로 간주된다. - 가이드 서열에 상보적인 올리고노어 설계는 단일 아미노산 치환(ATG를 TTA로; M213L)을 각각 5'- 및 3'-측에 60 및 48개의 염기 상동성 암을 갖는다.
참고: 이러한 공여체 올리고는 침묵 돌연변이(TCC를 TCG에 도입함)를 도입함으로써 PAM(AGG 내지 ACG)의 파괴를 위한 점 돌연변이를 포함한다. S217S) 후 CRISPR 상동성 지시 복구(HDR)13 후 의도된 돌연변이의 도입을 위한 재편집을 피한다(도 1 및 표 1). - NaCl (200 mM 최종 농도)을 사용하여 10 μg의 올리고를 침전시켜 염의 운반을 전핵 미세주입 완충액 (10 mM의 Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 mM의 EDTA, 및 스페르민 및 스페르미딘14가 없는 100 mM의 NaCl)으로 운반하는 것을 최소화한다.
참고 : 펠렛이 용액에 용해 될 수 있으므로 DNA 펠렛을 70 % 에탄올로 씻지 마십시오. - 50 ng/μL의 공여체 올리고, 60 ng/μL의 crRNA/tracrRNA 믹스(1:1 몰비)(단계 1.2부터) 및 50 ng/μL의 eSpCas9 단백질(물질 표 참조)을 혼합하여 최종 부피 20μL 의 CRISPR 혼합물을 만듭니다(표 2). 높은 독성이 관찰되는 경우 기증자 올리고의 농도를 감소시키십시오 (예를 들어, 25 ng / μL).
2. 과배란 유도, 계란 수확, CRISPR 믹스의 전핵 미세 주사 및 배반포 스크리닝
참고: 이 절차는 이전에 게시된 일반 프로토콜14를 따릅니다.
- 100 μL의 멸균수에 5 IU의 PMSG (임신 한 mare의 혈청 성선 자극 호르몬) ( 물질 표 참조)를 약 3:00 p.m.에서 복강 내 접근에 의해 8 주령의 5-10 마우스에게 주사하십시오 (1 일째).
- PMSG 주사 후 46-48 h 후에 복강내 접근에 의해 난자 공여자에게 100 μL의 멸균수에 hCG (인간 융모 성 성선 자극 호르몬) 5 IU를 주입하십시오 (3 일째). 스터드 수컷과 함께 1:1 번식을 설정하십시오.
- 히알루로니다아제로 M2 배지에서 수정란을 수확하고, 100 μL의 M2 배지에서 10:00 a.m.에 3회 세척한 다음, mWM15 또는 KSOM16 배지(4일째) 에 보관한다(표 참조).
- CRISPR 혼합물(단계 1.3)을 플라스틱 접시에 파라핀 오일로 덮인 M2100 μL의 전핵 미세주입에 의해 마우스로부터 수확한 1-세포 단계 배아 내로 조만간 내지 늦은 오후에 대조-증강 광학 장치를 갖는 거꾸로 현미경 상에 도입한다(비디오 1).
주: CRISPR 혼합물의 전핵 미세주입은 14-16 h 후코이툼에서 1-세포 단계 배아 상에서 수행되었다 (p.c.). 주입된 배아를 5%CO2 인큐베이터에서 몇 시간 동안 배양하고, 같은 날 아침 18-20 h p.c.에서 외과적으로 복사플러그를 갖는 수용자 ICR 마우스로 옮겼다. - 20-30개의 2-세포 배아를 각 수용자 내로 옮겨 재조합 동물을 생산한다.
참고: 일반적인 프로토콜14 에 따르거나 이들 배아를 mWM 또는 KSOM 배지에서 4일 동안 배양하여 효율을 검증하고 독성을 검사한다. CRISPR 혼합물의 독성은 주입된 배아의 적어도 삼분의 일이 그들 사이에 다수의 재조합체와 함께 완전히 팽창된 배반포 단계에 일찍 도달할 때 허용가능하다. 동시에, 조작되지 않은 배아의 90 % 이상이 평행 배양에서 동일한 배반포 단계에 도달합니다. 배낭 스크리닝을 위해 2.6-2.9 단계를 따르십시오.이 단계는 필수적이지는 않지만 HDR의 성공률을 정량화하는 데 선호되는 경우 수행 할 수 있습니다. - 마이크로피펫터가 있는 플러그형 미세 피펫 팁을 사용하여 2 μL의 배양 배지로 완전히 팽창된 배반포를 단일 PCR 튜브로 개별적으로 조기에 픽업한다(8일째; 비디오 2).
- 용해물 배반포를 8 μL의 소화 혼합물 (단계 3.2와 동일함; 표 표 참조)에 처리하고, 75°C에서 10분 동안, 95°C에서 5분 동안 처리하고, 이어서 저장을 위해 4°C로 냉각시킨다. 총 15 μL PCR 혼합물에서 2 μL의 용해물을 PCR용 주형으로 사용한다(단계 3).
- NlaIII로 제한 소화한 후 PCR 샘플의 아가로스 겔 전기영동에 의해 HDR의 효능 을 조사한다(단계 3-5).
- 돌연변이의 완전성을 확인하기 위해 설립자 및 후속 자손에서 668 bp 앰플리콘17 을 시퀀싱하여 표적 재조합의 상태를 확인한다.
3. DNA 추출
참고: 출생 후 10일째에 마우스는 출생 후 2-4주 경에 GJA1-20k 녹아웃 마우스의 갑작스런 사망으로 인해 이 실험에 사용되었다4. 보다 일반적인 프로토콜은 또한 이전에 공개된 보고서(18)에 따라 적용될 수 있다.
- 깨끗한 가위로 발가락 또는 꼬리 끝 1-3mm를 자르고 0.2 mL 8-Strip PCR 튜브로 옮깁니다. 발가락 또는 꼬리 샘플 간의 오염을 방지하려면 미리 세척한 가위 또는 마우스당 하나의 블레이드를 사용하거나 70% 에탄올 또는 10% 표백제를 사용하여 각 샘플 전에 청소하십시오. 꼬리가 샘플링 후 피를 흘리면 거즈로 짧은 압력을 가하여 출혈을 막으십시오. 꼬리 샘플을 추출될 때까지 -20°C에서 약 일주일 동안 보관한다.
- 조직 용해 용액 ( 재료 표 참조)을 100 μL / 튜브에 넣고 잘 섞은 다음 탁상 미니 원심 분리기 (실온에서 10 초 동안 2,200 x g )로 스핀 다운하십시오. 꼬리 샘플이 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 튜브를 다음 프로그램에 의해 설정된 열 사이클러 위에 놓으십시오. 10분 동안 75°C(조직 용해), 5분 동안 95°C(불활성화), 및 4°C(유지). PCRs가 즉시 수행될 수 없는 경우에 조직 용해물을 최대 일주일 동안 4°C에서 저장한다.
4. PCR에 의한 DNA 증폭
- 시료당 5 μL의 뉴클레아제가 없는H2O, 0.75 μL의 10 μM 정방향 및 역방향 프라이머, 및 7.5 μL의 PCR 마스터 믹스( 물질표 참조)를 포함하는 PCR 용액을 새로운 PCR 튜브에 넣었다(프라이머 서열에 대해서는 표 1 참조). 샘플이 여러 개 있는 경우, 내용물을 튜브 당 분취량 14 μL로 스케일링한다.
- 조직 용해물 1 μL를 단계 3.1에서 제조된 PCR 용액에 첨가한다. 꼬리에 닿지 않도록주의하십시오.
- 잘 섞어서 탁상용 미니 원심 분리기 (실온에서 10 초 동안 2,200 x g )로 회전하십시오.
- 튜브를 아래 언급 된 프로그램에 의해 설정된 열 사이클러 위에 놓으십시오. PCR 산물을 4°C에서 1-2개월 동안 또는 -20°C에서 ∼1년 동안 보관한다.
참고: 3분 동안 95°C(단계 1, 초기 변성), 15초 동안 95°C(단계 2, 변성), 15초 동안 60°C(단계 2, 어닐링), 45초 동안 72°C(단계 2, 확장), 35 사이클 동안 2단계, 10분 동안 72°C(단계 3, 최종 확장) 및 4°C(단계 4, 유지)를 반복합니다.
5. 제한효소를 이용한 배양
- 7 μL의 뉴클레아제가 없는H2O, 2μL의 10x CutSmart 버퍼 및 1 μL의 NlaIII 제한 효소를 함유하는 효소 용액을 준비 한다(표 참조). 여러 샘플이있는 경우 각 함량을 곱하여 튜브 당 10 μL의 분취량을 혼합하십시오.
- 단계 3에서 수득한 PCR 산물 10 μL를 튜브당 효소 용액에 첨가한다.
- 잘 섞어서 탁상용 미니 원심 분리기 (실온에서 10 초 동안 2,200 x g )로 회전하십시오.
- 튜브를 아래 언급 된 프로그램에 의해 설정된 열 사이클러 또는 열 블록에 설정하십시오. -20°C에서 1-2개월 또는 ∼1년 동안 4°C에서 인큐베이션한 후 생성물을 보관한다.
참고: 16시간 동안 37°C(최소 2시간; 짧은 인큐베이션 시간으로 인해 불충분한 절단이 발생할 수 있음) 및 유지를 위한 4°C.
6. DNA 밴드 검출
- 전기영동을 위한 DNA 겔 염색을 함유하는 1.5% 아가로스 겔을 제조하였다.
- 0.75 g의 아가로스를 50 mL의 1x TAE 완충액에 넣은 다음, 아가로스가 완전히 용해될 때까지 마이크로파에서 혼합 및 가열하였다. 식힌 후 5 μL의 DNA 염색을 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
- 겔 몰드 (몰드 당 25 mL)에 붓고 겔이 응고되도록하십시오. 더 나은 분해능과 분리를 얻으려면 필요에 따라 아가로스 농도를 2.5 % -4 %로 늘리십시오.
- 소화된 PCR 산물 10 μL를 웰에 로딩한다. 필요한 경우 6x 로딩 버퍼를 혼합하십시오.
- 젤을 35 분 동안 100V로 실행하십시오.
참고: 이러한 매개 변수는 최적화가 필요할 수 있습니다. - UV 광 (302 nm 파장) 아래의 이미지.
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Representative Results
CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템은 마우스 염색체 10에서 각각 56,264,279 내지 56,264,281 및 56,264,291에서 56,264,293, 또는 Gja1 mRNA에서 869 내지 871 및 881 내지 883에서 ATG에서 TTA 돌연변이에 대한 ATG 돌연변이 및 침묵하는 TCC 돌연변이를 생성한다. 이러한 돌연변이는 GJA1 단백질에 대한 메티오닌 213 내지 류신 (M213L) 돌연변이를 초래하고, TTC에서 TTG 돌연변이는 바람직하지 않은 유전자 판을 피하기 위해 근처의 PAM 서열을 교란시킨다 (도 1). 돌연변이의 세부사항은 이전 보고서4에 기술되어 있다.
적절한 유전자형을 분석하기 위해, PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동 전에 제한 효소 "NlaIII"에 의해 소화될 필요가 있다(도 2, 단계 4). 도 2A에 나타낸 바와 같이, 야생형(WT) 대립유전자 PCR 산물은 2개의 상이한 염기쌍 생성물(227 bp 및 441 bp)로 절단될 것이다. 대조적으로, 돌연변이 대립유전자 PCR 산물은 돌연변이에 의한 NlaIII 인식 부위의 부족으로 인해 온전한(668 bp) 것이다(도 2B). 일반적인 아가로스 전기영동은 소화된 PCR 산물을 사용하여 수행될 수 있다(단계 5). 아가로스 겔에서 특정 밴드는 각 유전자형(WT, 야생형; Het, 이형접합체; 흠, 동형접합체). 위에서 언급한 제한으로 인해, 각 유전자형은 서로 다른 크기의 여러 밴드를 초래한다(그림 2C). 밴드는 WT (227 bp 및 441 bp)에서 두 개의 밴드, Het의 세 밴드 (227 bp, 441 bp 및 668 bp), 그리고 Hm (668 bp)에서 하나의 밴드가 될 것이다. 단일 제한 효소를 사용한 겔 이미징에 따르면, 마우스의 적절한 유전자형을 구별할 수 있다.
우리의 실험에서, 스물 한 명의 창립자가 처음에 생산되었으며, 그 중 아홉 마리는 이형접합체 또는 모자이크 동물이었다. 아홉 명의 설립자 중 두 명은 번식 연령까지 자라기 전에 사망했으며, 이중 대립 유전자 돌연변이 체세포의 함량이 높은 모자이크주의로 인해 사망했을 가능성이 큽니다. 이후 두 개의 독립적인 돌연변이 라인이 나머지 일곱 명의 설립자로부터 적어도 두 세대 동안 야생형 C57BL/6J 마우스로 역교차하여 확립되었다. 표적화된 돌연변이가 동형접합성일 때 치명적이기 때문에, 우리는 가능한 오프-타겟 돌연변이를 더 희석하기 위해 이형접합체로서 선을 유지해야만 했다. 동형접합성 실험 동물은 다음 세대를 교차시킴으로써 생산되었다.
50 ng / μL의 기증자 올리고를 가진 상대적으로 높은 배아 독성이 기증자 올리고를 배아에 주사하기 위해 경험되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 그러나 12.5 ng / μL의 공여체 농도는 결과 강아지에서 표적 재조합을 유도하지 못했습니다. 추가적으로, 올리고의 에탄올 침전이 오염 물질을 제거하는 데 도움이되고 효율적이고 표적화 된 게놈 편집의 유도를 허용한다는 것이 발견되었습니다. DNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하면 펠릿이 용액에 용해된다. 따라서, NaCl을 200 mM 최종 농도에서 사용하여 10 μg의 올리고를 침전시켜 전핵 미세주입 완충액으로 염의 운반을 최소화하였다. 배반포 분석을 통한 시험 주입은 에탄올 침전과 함께 공여체 올리고의 50 또는 25 ng/μL를 사용하여 시도되었다. 각 조건의 성공률은 76.9%(50ng/μL의 13개 샘플 중 10개) 및 25.0%(25ng/μL의 12개 샘플 중 3개)(그림 3A-C)였습니다. 에탄올 침전을 가진 50 ng / μL의 올리고는 여전히 다소 독성이 있었지만 많은 알을 주입해야했으며 재조합체는 높은 성공률로 생산되었습니다. 따라서 50 ng / μL의 공여체 올리고를 마침내 에탄올 침전으로 주사하고 50.0 %의 성공률을 가진 창시자 동물을 얻었습니다 (32 마리의 새끼 중 16 마리는 21 명의 생존자와 11 명의 출생 후 사망을 포함하여 재조합되었습니다). 균일한 돌연변이 또는 단대립유전자 또는 시퀀싱에 의해 확인된 안정한 전달을 갖는 동일한 돌연변이의 생식계열 전달을 갖는 창시자 동물 중 두 마리를 독립적인 라인을 확립하는데 사용하였다. 합의는 야생형 동물과 함께 두 세대를 역교차시키고 강화된 충실도 Cas9 단백질을 사용하면 주요 오프 타겟팅 이벤트를 제거한다는 것입니다. 이러한 사건의 수는 데노보 돌연변이19,20의 배경 비율과 통계적으로 구별될 수 없다.
실험에 사용된 바람직하지 않은 유전자형(야생형 또는 부적절한 재조합체)을 가진 동물을 실험에 사용하고 연구의 결론에 따라CO2 흡입에 의해 안락사시킨 다음, IACUC 프로토콜에 따라 자궁경부 탈구를 가하였다.
도 1: CRISPR/Cas9에 의한 유전자 표적화에 대한 개략적인 표현 . (A) 상동체 재조합을 위한 표적화된 서열. 단일 문자 아미노산은 서열 사이에 도시되어 있다. 컬러 하이라이트는 상동성 아암 (그레이), 돌연변이 코돈 (녹색), PAM 서열 (오렌지), 및 gRNA 표적 서열 (블루)을 나타낸다. 파란색 화살표는 gRNA를 나타냅니다. NlaIII 제한 부위는 점선으로 밑줄이 그어져 있습니다. (b) WT 및 돌연변이 대립유전자 및 공여체 올리고점 돌연변이에 대한 개략적인 서열은 M213L 돌연변이를 초래하였다. TCC에서 TCG에 대한 TCC는 원하지 않는 PAM의 중단에 대한 침묵하는 돌연변이 입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: WT 및 돌연변이 대립유전자의 개략적인 PCR 산물 및 제한 부위 . (A,B) NlaIII에 의한 PCR 및 소화의 반응식. 프라이머는 돌연변이 부위 주위의 Gja1 DNA의 668 bp를 증폭시킨다. WT 대립유전자 PCR 산물을 NlaIII에 의해 두 개의 상이한 크기로 소화시켰다. 대조적으로, 돌연변이 대립유전자는 소화되지 않고 온전한 PCR 산물을 유지한다. (c) 아가로스 겔의 대표적인 이미지는 WT 및 돌연변이 대립유전자를 나타낸다. 각각의 마우스 유전자형은 특정 밴드 크기를 가졌고; WT (레인 1, 3 및 5), Het (레인 2) 및 흠 (레인 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CRISPR 혼합물에서 공여체 올리고의 두 개의 상이한 용량에서의 재결합 효율. (A) 야생형(WT; 레인 #10, 12 및 14), 이형접합체/모자이크(het/mosaic; 레인 #1, 2, 3, 6, 8, 9, 2, 3, 6, 8, 9, 도 11 및 도 13), 동형접합성(hom; 레인 #4 및 5) 또는 증폭되지 않음(레인 #7). 야생형 양성 대조군 및 음성 대조군으로서H2O를 레인 #17과 #18 사이에 로딩하였다. (B-D) 원형 차트는 두 가지 다른 용량의 공여체 올리고 (B, C)와 50 ng / μL의 기증자 올리고 (D)를 주입 한 창시자 동물의 CRISPR 혼합물의 재조합 효율을 나타냅니다. 태어난 32 마리의 동물 중 11 마리가 어머니에 의해 살해되거나 이유식 전에 사망했습니다. PCR에서 증폭에 실패한 샘플은 재조합 효율의 계산에서 제외되었다. 모든 샘플로부터의 개별 유전자형 비율은 표 3 및 표 4에 나타내었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 시퀀스 | 코멘트 | |||
| crRNA | 5' AUUCAGAGCGAGAGACACCAGU UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' |
밑줄은 CRSPR 표적 서열을 나타냅니다. | |||
| 올리고 도나 DNA | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTTCT TACTGGTGTGTGTCGTTGGTGTCTCTCGCTCT GAATATCATTGAGCTCTTCTATGTCTTCTTC 3' |
밑줄은 돌연변이된 코돈을 나타냅니다. 주먹은 TTA 돌연변이 전 60 bp 및 TCG 돌연변이 후 48 bp 상동성 아암이다. | |||
| 유전자형 프라이머 포워드 | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| 유전자형 프라이머 역방향 | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
표 1: 시퀀스 정보.
| 구성 요소 | 재고 솔루션 | 분량 | 최종 집중 |
| 기증자 올리고 | 1μg/μL(Rnase-freeH2O) | 1.0 μL | 50 ng/μL |
| GJA1 crRNA | 1μg/μL(Rnase-freeH2O) | 0.4 μL | 20 ng/μL |
| tracrRNA | 1μg/μL(Rnase-freeH2O) | 0.8 μL | 40 ng/μL |
| eSpCas9 단백질 | 1μg/μL(Rnase-freeH2O) | 1.0 μL | 50 ng/μL |
| RNAse가 없는 주입 버퍼 | 0.1 mM EDTA pH 8.0 | 16.8 μL | |
| 10 mM 트리스-HCl pH 7.5 | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 총 볼륨 | 20.0 μL |
표 2: CRISPR 혼합물의 레시피.
| 차선 번호(그림 3) | 기증자 올리고 conc. | 상태 | 증폭되지 않음 | 야생형 | 헤트/모자이크 | 홈 | 메모 |
| 1 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | 삭제 | |||
| 2 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | ||||
| 3 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | ||||
| 4 | 50 ng/μl | 모룰라 | 홈 | ||||
| 5 | 50 ng/μl | 모룰라 | 홈 | ||||
| 6 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | 삭제 | |||
| 7 | 50 ng/μl | 모룰라 | 해당 없음 | ||||
| 8 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | ||||
| 9 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | ||||
| 10 | 50 ng/μl | 모룰라 | 야생형 | ||||
| 11 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | ||||
| 12 | 50 ng/μl | 모룰라 | 야생형 | ||||
| 13 | 50 ng/μl | 모룰라 | 헤트/모자이크 | 삽입 | |||
| 14 | 50 ng/μl | 모룰라 | 야생형 | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 ng/μl | 모룰라 | 해당 없음 | ||||
| 16 | 25 ng/μl | 모룰라 | 해당 없음 | ||||
| 17 | 25 ng/μl | 모룰라 | 해당 없음 | ||||
| 18 | 25 ng/μl | 모룰라 | 해당 없음 | ||||
| 19 | 25 ng/μl | 모룰라 | 야생형 | ||||
| 20 | 25 ng/μl | 모룰라 | 해당 없음 | ||||
| 21 | 25 ng/μl | 모룰라 | 야생형 | ||||
| 22 | 25 ng/μl | 모룰라 | 야생형 | ||||
| 23 | 25 ng/μl | 배반포 | 해당 없음 | ||||
| 24 | 25 ng/μl | 배반포 | 야생형 | ||||
| 25 | 25 ng/μl | 배반포 | 헤트/모자이크 | ||||
| 26 | 25 ng/μl | 배반포 | 야생형 | ||||
| 27 | 25 ng/μl | 배반포 | 해당 없음 | ||||
| 28 | 25 ng/μl | 배반포 | 야생형 | ||||
| 29 | 25 ng/μl | 배반포 | 야생형 | ||||
| 30 | 25 ng/μl | 배반포 | 헤트/모자이크 | 삽입/삭제 | |||
| 31 | 25 ng/μl | 배반포 | 야생형 | ||||
| 32 | 25 ng/μl | 배반포 | 헤트/모자이크 | 삽입 | |||
| 33 | 25 ng/μl | 배반포 | 야생형 | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
표 3: 모룰라와 배반포의 유전자형 분석 결과.
| 동물 # | 기증자 올리고 conc. | 상태 | 증폭되지 않음 | 야생형 | 헤트/모자이크 | 홈 | 메모 |
| d1 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 야생형 | ||||
| d2 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| d3 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 헤트/모자이크 | 삭제 | |||
| d4 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 야생형 | ||||
| d5 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| d6 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 야생형 | ||||
| d7 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| d8 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| 34 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| 35 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 36 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 37 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | 독립 라인으로 사용 | |||
| 38 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 39 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 40 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 41 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| 42 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 43 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 44 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 45 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| d1 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 홈 | ||||
| d2 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 야생형 | ||||
| d3 | 50 ng/μl | 죽은 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| 46 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| 47 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | 삽입 | |||
| 48 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | 삽입 | |||
| 49 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | ||||
| 50 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 51 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | 독립 라인으로 사용 | |||
| 52 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 53 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 헤트/모자이크 | 삽입/삭제 | |||
| 54 | 50 ng/μl | 라이브 강아지 | 야생형 | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
표 4: 창시자 동물의 유전자형 분석 결과.
비디오 1: 배아에 CRISPR 주사. CRISPR 혼합물을 단계 2.4에 기재된 1-세포 단계 배아 내로 주입한다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2 : 배반포가 픽업됩니다. 배반포가 2.6 단계에서 픽업되는 것을 보여주는 대표적인 비디오. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유전자 변형 마우스 모델은 유전자 기능을 이해하기위한 일반적인 접근법입니다. 그러나, GJA1-20k 내부적으로 번역된 이소형이 전장 Cx43과 동일한 Gja1 mRNA로부터 번역되기 때문에, GJA1-20k 발현을 억제하면서도 전장 Cx43 발현을 억제하기 위한 창의적인 전략이 고안되었다. 상기 접근법은 GJA1-20k의 내부 시작 코돈의 돌연변이에 기초한다. 단일 점 돌연변이로, M213은 Gja1 mRNA 상에서 L로 전환되었고, 이는 GJA1-20k 발현을 억제하는데 성공했지만 전장 Cx43 발현4를 유지하였다.
그러나, 단일 내부 번역 시작 부위의 점-돌연변이는 또 다른 어려움을 제시하였다: 마우스 유전자형을 결정한다. 단일 잔기 치환은 특정 프라이머를 만들기에는 너무 작다. 추가적으로, WT 및 돌연변이 대립유전자는 동일한 염기쌍을 갖는다. 이러한 문제를 해결하기 위해 지노타이핑 프로토콜에 한 단계가 더 추가되었습니다. GJA1-20k의 시작 코돈(표적화된 돌연변이 부위)이 제한 효소인 NlaIII에 의해 인식되기 때문에, NlaIII에 의해 인식되지 않는 부위는 돌연변이되었다(도 1; CATG에서 CTTA까지). 또한, PCR 산물을 생성하는 프라이머는 임의의 다른 NlaIII 적절한 부위를 갖지 않도록 설계되었다. 효소 소화 단계를 제한 효소와 함께 추가함으로써 점 돌연변이된 마우스 라인에 대해 적절한 지노타이핑 프로토콜이 확립되었다. 일반적으로, 효소 소화는 단시간 인큐베이션(37°C에서 0.5-2.0 h)에 의해 수행된다; 하룻밤 인큐베이션 (~ 16 h)은 전체 PCR 산물을 완전히 소화하는 것이 좋습니다. 표적 서열에 돌연변이의 도입은 WT와 돌연변이 대립유전자 사이의 잘못된 인식을 초래한다. 따라서, 이 프로토콜에서 충분한 소화를 위한 하룻밤 인큐베이션은 선택의 제한 효소가 스타 활성(21)을 갖지 않는 한 권장된다.
현재 프로젝트는 ATG (메티오닌)를 TTA (류신)로 변경하여 두 번째 번역 시작 사이트를 혼란에 빠뜨리는 것을 목표로했습니다. NlaIII는 표적 부위에서 CATG를 인식하기 때문에 신속한 스크리닝을 위한 편리한 제한 효소입니다. 시토신 (C)은 종종 번역 개시 부위 직전의 KOZAK 서열과 연관된다. NcoI (C/CATGG) 및 NdeI (CA/TATG)는 대체 코돈이 이러한 제한 부위의 생성/결실에 활용되어야 하는 경우 이 영역에서 스크리닝을 위한 다른 다목적 제한 효소입니다. 침묵 돌연변이의 도입이 제한 부위 기반 스크리닝을 위해 허용되지 않는 경우, 개별 샘플의 시퀀싱이 필요하다22,23. 이 프로젝트에서 표적 재조합은 매우 효율적이었습니다.
이 M213L 돌연변이 마우스 라인은 GJA1-20k의 기능을 분석 할 수있게합니다. 최근에, 이 마우스 라인을 사용하여, GJA1-20k가 심장4에서 전장 Cx43 갭 접합부의 밀매 및 형성에 필수적이라는 것이 확인되었다. 흥미롭게도, 동형접합성 M213L 돌연변이 (Gja1 M213L/M213L)는 GJA1-20k를 생성할 수 없기 때문에, 각각의 심장이 심장 삽입 디스크에서 갭 접합부를 형성하지 않기 때문에 출생 후 2-4주 후에 항상 갑작스런 사망을 초래한다. 대조적으로, 이형접합체 M213L 돌연변이는 정상 심장 기능에 근접함을 보여주며, 마우스는 WT 동물4의 것과 유사한 수명을 갖는다. 이전의 시험관내 연구는 또한 M213L 돌연변이가 적절한 갭 접합 형성1을 방해한다는 것을 보여주었다. 또한, 이러한 갭 접합 파괴는 외인성 GJA1-20k 트랜스펙션에 의해 구출된다. 기저 조건4 및 시험관내 연구 1 하에서의 이형접합성 M213L 돌연변이 마우스 심장에서의 정상적인 갭 접합 형성에 기초하여, M213L 돌연변이를 갖는 전장 Cx43이 갭 접합 단백질로서 적절한 기능을 유지한다는 결론을 내릴 수 있다.
Cx43 밀매에서 GJA1-20k의 필수적인 역할 외에도, GJA1-20k는 미토콘드리아 외막을 풍부하게하여 미토콘드리아 분열 및 생물 발생 3,24,25를 보호합니다. 미토콘드리아 기능 측면에서 GJA1-20k (Gja1M213L / WT)의 이형접합 돌연변이를 가진 마우스는 허혈 / 재관류 손상에 대해 극도의 민감성을 보입니다. 허혈 / 재관류에 노출 될 때, 성인 Gja1M213L / WT 마우스는 WT 대응 물25보다 훨씬 더 큰 경색 크기와 더 많은 파괴 된 미토콘드리아를 가지고 있습니다.
요약하면, M213L 돌연변이를 함유하는 새로운 마우스 라인은 내부적으로 번역된 GJA1-20k의 분석에 도움이 된다. 전장 Cx43 및 더 작은 GJA1-20k 둘 다 모든 포유동물 기관 시스템에서 발현된다는 점에 유의해야 한다. 미래의 연구는 심장 외 GJA1-20k의 역할도 탐구 할 것으로 예상됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 RMS에 국립 보건원 보조금 (R01HL152691, R01HL138577 및 R01HL159983)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine.
- Mayer, H.
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
