Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/63419
Automatic Translation
1,2, 2,3, 3, 4, 1,5,6, 1,2,5,6,7
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

Summary

يتم وصف بروتوكول المختبر الشامل وسير عمل التحليل لإجراء فحص سريع وفعال من حيث التكلفة ومباشر قائم على الخلايا اللونية للكشف عن العناصر المحايدة ضد AAV6.

Abstract

أثبتت الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة (rAAV) أنها ناقل آمن وناجح لنقل المواد الوراثية لعلاج مختلف الحالات الصحية في كل من المختبر والعيادة. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة المحايدة الموجودة مسبقا (NAbs) ضد قفيصات AAV تشكل تحديا مستمرا للإدارة الناجحة للعلاجات الجينية في كل من النماذج التجريبية الحيوانية الكبيرة والمجموعات البشرية. يعد الفحص الأولي لمناعة المضيف ضد AAV ضروريا لضمان فعالية العلاجات الجينية القائمة على AAV كأداة بحثية وكعامل علاجي قابل للتطبيق سريريا. يصف هذا البروتوكول مقايسة قياس الألوان في المختبر للكشف عن العوامل المحايدة ضد النمط المصلي AAV 6 (AAV6). يستخدم الفحص التفاعل بين AAV الذي يشفر جين مراسل الفوسفاتيز القلوي (AP) وركيزته NBT / BCIP ، والتي تولد وصمة أرجوانية غير قابلة للذوبان كميا عند الجمع.

في هذا البروتوكول ، يتم دمج عينات المصل مع AAV الذي يعبر عن AP ويتم احتضانه للسماح بحدوث نشاط تحييد محتمل. يضاف خليط مصل الفيروسات لاحقا إلى الخلايا للسماح بالنقل الفيروسي لأي AAVs لم يتم تحييدها. تتم إضافة الركيزة NBT / BCIP وتخضع لتفاعل كروموجيني ، يتوافق مع النقل الفيروسي ونشاط التحييد. يتم تحديد نسبة المساحة الملونة باستخدام أداة برمجية حرة لإنشاء عيارات محايدة. يظهر هذا الفحص علاقة إيجابية قوية بين التلوين والتركيز الفيروسي. أدى تقييم عينات المصل من الأغنام قبل وبعد إعطاء AAV6 المؤتلف إلى زيادة كبيرة في نشاط التحييد (125 إلى > زيادة قدرها 10000 ضعف). أظهر الفحص حساسية كافية للكشف عن النشاط المحايد في >1:32,000 تخفيف المصل. يوفر هذا الفحص طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن NAbs ضد AAVs.

Introduction

تستخدم الفيروسات المرتبطة بالأغينو (AAV) بشكل متزايد كناقلات لتوصيل العلاجات الجينية إلى العلاجات التجريبية لمختلف الحالات الصحية التي تؤثر على الجهاز القلبي الوعائي والرئوي والدورة الدموية والعينية والجهاز العصبي المركزي1،2،3،4،5. تنبع شعبية ناقلات AAV كمنصة رائدة للعلاج الجيني من ملف تعريف السلامة الإيجابي الخاص بها ، والتعبير الجيني المتحول على المدى الطويل ، والاستوائيات الخاصة بالأنسجة واسعة النطاق1,6. وقد مهدت النتائج الناجحة في الدراسات التي أجريت على الحيوانات الطريق لأكثر من خمسين تجربة سريرية للعلاج الجيني AAV وصلت بنجاح إلى نقاط نهاية فعاليتها7، فضلا عن إطلاق أول دواء متاح تجاريا للعلاج الجيني AAV معتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية8. بعد النجاحات الأولية ، واصلت AAV اكتساب قوة دفع في قطاعات البحوث الأساسية والسريرية كناقل مفضل وهي حاليا العلاج الجيني الوحيد في الجسم الحي المعتمد للاستخدام السريري في الولايات المتحدة وأوروبا9. ومع ذلك، فإن وجود أجسام مضادة محايدة موجودة مسبقا (NAbs) ضد قفيصات ناقلات AAV لا يزال يشكل عائقا أمام كل من البحوث قبل السريرية وفعالية التجارب السريرية. وتوجد NAbs في كل من المجموعات البشرية والحيوانية الساذجة وتمنع نقل الجينات بعد إعطاء ناقل AAV في الجسم الحي1. الإيجابية المصلية AAV هي معيار استبعاد لمعظم تجارب العلاج الجيني ، وبالتالي فإن الفحص الأولي لمناعة المضيف أمر بالغ الأهمية في كل من المختبر والعيادة. يعد إنشاء فحص يمكنه اكتشاف وجود NAbs ضد AAV خطوة أساسية في خط أنابيب أي مشروع بحثي قائم على العلاج الجيني AAV. يركز هذا التقرير على AAV6 الذي كان موضع اهتمام الباحثين بسبب نقله الفعال والانتقائي في العضلات المخططة (القلب والعضلات الهيكلية)1،10،11،12. يعتبر العلاج الجيني استراتيجية واعدة لاستهداف القلب لأنه من الصعب استهداف القلب على وجه التحديد دون إجراءات القلب المفتوح الغازية.

عادة ما يتم تحديد نشاط التحييد باستخدام إما اختبار تثبيط النقل القائم على الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي. في الجسم الحي عادة ما تتضمن اختبارات NAb إعطاء مصل من موضوع اختبار (على سبيل المثال ، إنسان أو كبير) إلى الفئران ، يليه AAV مع جين مراسل ، يليه اختبار للتعبير عن جين المراسل أو المستضد المقابل. تحدد الفحوص المخبرية عيارات NAb عن طريق احتضان المصل أو البلازما من إنسان أو كبير في تخفيفات تسلسلية باستخدام AAV المؤتلف (rAAV) الذي يعبر عن جين مراسل. الخلايا مصابة بخليط المصل / الفيروس ، ويتم تقييم مدى تثبيط التعبير الجيني للمراسل مقارنة بالضوابط. تستخدم الفحوصات في المختبر على نطاق واسع لفحص NAb بسبب تكلفتها المنخفضة نسبيا ، والسرعة في الاختبار ، والقدرة الأكبر على التوحيد القياسي والتحقق من الصحة 13,14 مقارنة بالفحوصات في الجسم الحي. غالبا ما يتم الإبلاغ عن أن الفحوصات في الجسم الحي لها حساسية أكبر15،16 ، ولكن تم تقديم نفس الادعاء فيما يتعلق بالمقايسات في المختبر14،17.

حتى الآن ، استخدمت اختبارات NAb في المختبر بشكل أساسي التلألؤ (luciferase) كجين مراسل للكشف عن التحييد. على الرغم من أن الطريقة القائمة على الضوء لها ميزة في العديد من السياقات ، إلا أن اختبار NAb اللوني / اللوني قد يكون مفيدا في بعض الظروف. تم استخدام المقايسات اللونية لتقييم التحييد بنجاح لفيروسات أخرى مثل الأنفلونزا والفيروسات الغدية18,19. وتنبع جاذبيتها من بساطتها وانخفاض تكلفتها والحاجة إلى أجهزة وأدوات مختبرية يومية فقط20. تتطلب مقايسات NAb التي تستخدم جين مراسل قائم على التلألؤ مجموعات ركيزة باهظة الثمن ومقياس لمعان وبرامج مقابلة للتحليل21. يتميز هذا الفحص اللوني بأنه يتطلب فقط مجهرا ضوئيا وركيزة رخيصة جدا. وقد أسفر الإبلاغ عن حساسية المقايسات اللونية مقابل المضيئة عن نتائج متضاربة. اقترحت إحدى الدراسات أن اختبارات ELISA القائمة على التلألؤ تعرض حساسية أكبر وقابلية تكرار مماثلة لمقايسات قياس الألوان22 ، في حين وجدت دراسة أخرى أن اختبارات ELISA القائمة على القياس اللوني تضفي حساسية أكبر23. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لفحص NAb في المختبر ضد AAV يستخدم التفاعل الكروموجيني بين AAV الذي يشفر جين مراسل الفوسفاتيز القلوي (AP) ورباعي التيتانوليوم الأزرق النيترو / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP). تم تطوير هذا البروتوكول خطوة بخطوة استنادا إلى تقرير سابق استخدم جين مراسل hPLAP (الفوسفاتيز القلوي للمشيمة البشرية) (AAV6-hPLAP) للكشف عن النشاط المحايد ضد AAV24. هذا الفحص فعال من حيث التكلفة ، وفعال من حيث الوقت ، وسهل الإعداد ، ويتطلب الحد الأدنى من المهارات التقنية والمعدات المختبرية والكواشف. علاوة على ذلك ، فإن بساطة هذا الفحص تمنحه إمكانية تحسينه للتطبيقات الواسعة عبر أنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة أو الأنماط المصلية الفيروسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع جوانب رعاية الحيوانات والتجارب وفقا لمعهد فلوري للعلوم العصبية والمبادئ التوجيهية للصحة العقلية والقانون الأسترالي لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية بعد المرجع 25. تم استخدام نعاج ميرينو البالغة من العمر 1.5-3 سنوات للدراسة. ويرد في الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول المقايسة.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول فحص NAb. (A) تمثيل مرئي لفحص NAb يوضح الخطوات الأساسية التي ينطوي عليها بروتوكول الأيام الثلاثة. لفترة وجيزة ، تزرع الخلايا وتطلى بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم إعداد التخفيفات التسلسلية للمصل ، واحتضانها باستخدام AAV ، ثم احتضانها مع الخلايا بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم إصلاح الخلايا وغسلها واحتضانها ودمجها مع الركيزة واحتضانها مرة أخرى ، تليها التصوير والكمية. (ب) صور تمثيلية للحد الأدنى من التحكم في الإشارة (تثبيط AAV الكامل) ، والحد الأقصى للتحكم في الإشارة (بدون تثبيط) ، وعينة مصل البويضة مع تثبيط إشارة ~ 50٪. شريط المقياس = 0.5 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. التحضير الأولي

  1. للتقييم في الأغنام: اجمع الدم في أنابيب منشط جلطة فاصل مصل 8 مل (انظر جدول المواد) ، واترك عينة الدم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20-30 دقيقة ، ثم قم بالدوران لأسفل عند 2100 × g لمدة 15 دقيقة. السوبرناتانت الواضح الذي يتشكل في الجزء العلوي من الأنابيب هو المصل. Aliquot المرحلة المائية واضحة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يبقى المصل عند -80 درجة مئوية مستقرا لمدة 5 سنوات تقريبا. تم جمع الدم من الوريد السباتي باستخدام إبرة 16 G (قطع الطرف) وحقنة من الحيوانات الواعية.
  2. قم بتسخين مصل البقر الجنيني المعطل (FBS) عن طريق وضعه في حمام مائي عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ويدور بشكل متقطع. للحصول على الدقة، ضع ميزان حرارة في زجاجة ثانية تحتوي على حجم مكافئ من الماء وأضفه إلى الحمام الحراري في نفس الوقت الذي تحتوي فيه زجاجة FBS. ابدأ التوقيت عندما يصل مقياس الحرارة إلى 56 درجة مئوية.
  3. استخدام تقنية التعقيم المناسبة وممارسة زراعة الخلايا لجميع الخطوات اللاحقة التي يتم تنفيذها في غطاء محرك السيارة لزراعة الخلايا26,27. رش 70٪ من الإيثانول على جميع الأشياء والغطاء قبل الاستخدام وتنظيفه بنسبة 1٪ هيبوكلوريت الصوديوم عند الانتهاء.
  4. اجعل متوسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو كاملا من خلال الجمع بين الجلوكوز العالي (4.5 جم / لتر) DMEM (89٪) مع FBS المعطل حراريا (10٪) والبنسلين Streptomycin (1٪). الجمع والتصفية باستخدام نظام ترشيح فراغي معقم (حجم المسام 0.22 ميكرومتر ، غشاء البولي إيثرسلفون) (انظر جدول المواد). تخزين DMEM كاملة ملفوفة في احباط في 4 درجة مئوية.
  5. إنشاء خلايا HT1080 (انظر جدول المواد) والمرور في قارورة مربعة 75 سم 2 كما هو موضح في المرجع 28. إنشاء مخزون مجمد متعدد من الخلايا. لا تستخدم الخلايا بعد 20 مقطعا لأن المزيد من المرور قد يؤثر على نتائج الفحص.

2. اليوم الأول - طلاء الخلايا

  1. مرور خلايا HT1080 عندما تصل إلى ~ 80٪ التقاء.
  2. قبل التسخين الكامل DMEM (أعدت في الخطوة 1.4) ، 0.05 ٪ التربسين-EDTA ، و 1x المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. قم بإزالة وسط النمو من الخلايا التي تم تمريرها باستخدام نظام الشفط.
    ملاحظة: يستخدم كل الطموح في هذا البروتوكول نظام فراغ مع أنبوب متصل بماصة مصلية معقمة سعة 5 مل.
  3. اغسل الخلايا في 10 مل من 1x PBS المسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) وخلايا التربسين لمدة 3-4 دقائق في 4 مل من التريبسين-EDTA المسخن مسبقا بنسبة 0.05٪ لفصل الخلايا عن القارورة.
  4. قم بتعطيل التربسين عن طريق إضافة 6 مل من DMEM الكامل الذي تم تسخينه مسبقا وماصة الخلايا في أنبوب 50 مل. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة وتركيزها باستخدام مقياس الدم وطريقة استبعاد التربان الأزرق29.
  5. قم بتخفيف الخلايا إلى تركيز 1 × 105 خلية / مل في DMEM كامل تم تسخينه مسبقا. زرع 100 ميكرولتر من الخلايا / البئر في لوحات واضحة ذات قاع مسطح 96 بئرا (1 × 104 خلية لكل بئر). احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2) بين عشية وضحاها لمدة 16-22 ساعة.

3. اليوم الثاني - إصابة الخلايا

  1. قم بإزالة الصفيحة / الألواح من الحاضنة واستخدم المجهر الضوئي للتأكد من أن الخلايا مشتتة بالتساوي داخل الآبار وأن الالتقاء هو ~ 50٪. إذا لم تكن الخلايا ضمن نطاق التقاء 45٪ -55٪ ، كرر بروتوكول "اليوم 1" واضبط تركيز الخلية الأولي وفقا لذلك.
  2. توليد تخفيفات تسلسلية لعينات المصل ذات الأهمية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل باستخدام DMEM الكامل الذي تم تسخينه مسبقا كمخفف. ويبين الجدول 1 توليد شلال التخفيف للعينات الثلاثية.
    1. لإجراء الفحص في ثلاثة أضعاف ، قم بإعداد جينوم ناقل 7.5 × 106 (vg) / μL من حل العمل من AAV6-hPLAP (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيف محلول مخزون الفيروسات في 1x PBS.
    2. أضف 66 ميكرولتر من محلول عمل الفيروسات 7.5 × 106 vg/μL إلى كل أنبوب يحتوي على 264 ميكرولتر من المصل/تخفيف الوسائط (330 ميكرولتر من الحجم الكلي/التخفيف، انظر الجدول 1).
      ملاحظة: هذا فحص قوي لا يتطلب ظروفا ثقافية مثالية. ومع ذلك ، لتحديد كمية دقيقة وضمان موثوقية كل عملية فحص ، من الضروري تضمين ما يلي: (1) التحكم في الفيروسات والوسائط فقط ، (2) التحكم في الوسائط فقط ، و (3) عينة تحكم إيجابية NAb على جميع اللوحات في ظل نفس الظروف التجريبية. الحجم الموصوف (330 ميكرولتر) يمثل عينات ثلاثية +10٪ من خليط المصل والفيروسات. يوصى بشدة بإجراء النسخ المتماثلة لتحديد نشاط التحييد بدقة.
  3. امزج تخفيفات الفيروس / المصل عن طريق السحب وضع الأنابيب التي تحتوي على مخاليط الفيروس / المصل في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة للسماح بحدوث تحييد محتمل.
  4. ماصة 100 ميكرولتر من خليط الفيروس / المصل إلى كل بئر على لوحة 96 بئر تحتوي على 1 × 104 خلية / بئر لكل تخفيف.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى توليد تركيز فيروسي نهائي من 15 ألف فيروس/تعدد خلايا العدوى (MOI) في كل بئر. ويقدم الجدول 2 مثالا على تخطيط لوحة العينة المكونة من 96 بئرا لتقييم العينات إلى تخفيف 1/512.
  5. لف الصفيحة المكونة من 96 بئرا والتي تحتوي على الخلايا والمصل و AAV-hPLAP في رقائق معدنية وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها لمدة 16-24 ساعة للسماح بدخول AAV إلى الخلايا.
تسمية سلسلة التخفيف التخفيف 3 × عينة (240 ميكرولتر) + 10٪ حجم المخزن المؤقت (24 ميكرولتر) نسبة المصل: الوسائط
التخفيف 1 (D1) 1/2 264 ميكرولتر مصل 264 ميكرولتر وسائط 50:50
التخفيف 2 (D2) 1/4 264 ميكرولتر D1 + 264 ميكرولتر الوسائط 25:75
التخفيف 3 (D3) 1/8 264 ميكرولتر D2 +264μL الوسائط 12.5:87.5
التخفيف 4 (D4) 1/16 264 ميكرولتر D3 +264 ميكرولتر الوسائط 6.25:93.75
التخفيف 5 (D5) 1/32 264 ميكرولتر D4 +264 ميكرولتر الوسائط 3.13:96.87
التخفيف 6 (D6) 1/64 264 ميكرولتر D5 +264 ميكرولتر الوسائط 1.56:98.44
التخفيف 7 (D7) 1/128 264 ميكرولتر D5 +264 ميكرولتر الوسائط 0.78:99.22
التخفيف 8 (D8) 1/256 264 ميكرولتر D5 +264 ميكرولتر الوسائط 0.39:99.61
التخفيف 9 (D9) 1/512 264 ميكرولتر D7 + 264 ميكرولتر الوسائط 0.2:99.8
التخفيف 10 (D10) 1/2048 132 ميكرولتر D8 + 396 ميكرولتر الوسائط 0.05:99.95
التخفيف 11 (D11) 1/8192 132 ميكرولتر D9 + 396 ميكرولتر الوسائط 0.01:99.99
التخفيف 12 (D12) 1/32768 132 ميكرولتر D10 + 396 ميكرولتر الوسائط 0.003:99.997

الجدول 1: كميات المصل والمخفف اللازمة لتوليد التخفيفات التسلسلية للمصل في ثلاثة أضعاف.

عينة المصل # 1 عينة المصل # 2 عينة المصل # 3 أحادي AB (mAB) ، عناصر تحكم وعينات إضافية
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 50 نانوغرام ماجستيريا 50 نانوغرام ماجستيريا 50 نانوغرام ماجستيريا
B 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 5 نانوغرام ماجستيريا 5 نانوغرام ماجستيريا 5 نانوغرام ماجستيريا
C 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 1/8 0.5 نانوغرام ميلي أمبير 0.5 نانوغرام ميلي أمبير 0.5 نانوغرام ميلي أمبير
D 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 1/16 MO (-C) MO (-C) MO (-C)
E 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 VO (+C) VO (+C) VO (+C)
F 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 1/64 نموذج #1 1/512 نموذج #1 1/512 نموذج #1 1/512
G 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 1/256 نموذج #2 1/512 نموذج #2 1/512 نموذج #2 1/512
H 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 1/512 نموذج #3 1/512 نموذج #3 1/512 نموذج #3 1/512

الجدول 2: مثال على تخطيط لوحة 96 بئرا لتقييم عينات المصل الساذجة في تخفيفات تتراوح من 1/2 إلى 1/512. يتم دمج تخفيفات أعلى في الفحص إذا تم تقييم عينة معروفة بأنها إيجابية ل AAV NAbs (عينات ما بعد الإدارة) أو إذا كانت هناك حاجة إلى عيار أعلى. MO (-C): التحكم في الوسائط فقط. VO (+C): التحكم في الفيروسات والوسائط فقط. mAb: جسم مضاد أحادي النسيلة ضد AAV (التحكم الإيجابي NAb).

4. اليوم 3 - تثبيت وإضافة الركيزة إلى الخلايا

  1. قم بتسخين أليكوت من 1x PBS إلى 37 درجة مئوية (~ 25 مل / 96 لوحة بئر). قم بتبريد الأليكوتات المنفصلة من PBS (~ 25 مل / 96 لوحة بئر) و H2O المقطر المزدوج (DDW ، ~ 25 مل / 96 لوحة بئر) إلى 4 درجات مئوية. قم بإذابة حبيبة من BCIP / NBT (انظر جدول المواد) في 10 مل من DDW في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل عن طريق الدوامة (10 مل يكفي ل 2 × 96 لوحة بئر).
  2. استنشاق الوسائط من آبار صفيحة البئر 96 باستخدام ماصة مصلية أو ما شابه ذلك متصلة بنظام الشفط القائم على الشفط أو فراغ غطاء الدخان. ضع طرف الماصة المصلية بلطف في البئر وأزل الوسائط مع توخي الحذر لعدم تعطيل الخلايا الملتصقة.
    1. أضف 50 ميكرولتر من RT 4٪ PFA إلى كل بئر باستخدام ماصة. لف اللوحة بورق القصدير واتركها في RT لمدة 10 دقائق لإصلاح الخلايا.
      تحذير: بارافورمالدهيد (PFA) هو مادة مسرطنة محتملة وسامة من الجلد أو ملامسة العين أو الاستنشاق. تعامل مع غطاء الدخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة وكذلك قناع الوجه. اصنع PFA طازجا بنسبة 4٪ مخففا في PBS (~ 7 مل مطلوب لكل لوحة 96 بئرا).
  3. غسل وشفط الخلايا مع 200 ميكرولتر من RT 1x PBS. كرر هذه الخطوة مرتين.
    ملاحظة: تعد الماصة متعددة القنوات خيارا فعالا لخطوات السحب.
  4. ماصة 200 ميكرولتر من PBS المسخنة مسبقا في كل بئر ، لف اللوحة في رقائق معدنية واحتضنها عند 65 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لإزالة طبيعة نشاط الفوسفاتيز القلوي الداخلي30.
  5. استنشاق الآبار وغسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من PBS الباردة (4 درجة مئوية). الشفط مرة أخرى ، وغسل في 200 ميكرولتر من DDW الباردة ، وشفط مرة أخرى.
  6. ماصة 50 ميكرولتر من BCIP / NBT المذاب (أعدت في الخطوة 4.1) في كل بئر.
  7. لف اللوحة في رقائق معدنية واحتضنها في RT لمدة 2-24 ساعة.
    ملاحظة: كن متسقا مع وقت الحضانة بين الأشواط. تسمح مرونة الوقت للمستخدمين بتصوير الآبار إما في اليوم 3 أو في اليوم التالي.
  8. باستخدام كاميرا المجهر الضوئي ، التقط صورا لكل بئر باستخدام عدسة موضوعية 4x ، مما يضمن استخدام نفس التعرض والتوازن الأبيض وإعدادات الضوء باستمرار لجميع الفحوصات التي يتم إجراؤها.
    1. ضع كل بئر بشكل متطابق وتأكد من أن حواف البئر غير مرئية في الصور. احفظ الصور بتنسيق TIF أو ما شابه ذلك.
      ملاحظة: تختلف الإعدادات المحددة بين المجاهر، ولكن القياس الكمي سيكون أكثر فعالية إذا كانت إضاءة الخلفية عالية ومتسقة في جميع أنحاء الآبار (الشكل 1B).

5. القياس الكمي لتحديد نشاط التحييد باستخدام ImageJ

  1. قم بتنزيل وتثبيت البرنامج المتاح مجانا "ImageJ" (انظر جدول المواد).
  2. افتح الصورة المراد تحليلها في ImageJ عن طريق تحديد ملف > فتح (الشكل 2).
  3. إذا كنت تستخدم صورا ملونة، فقم بالتحويل إلى تدرج رمادي عن طريق تحديد نوع الصورة > > 8 بت.
  4. انقر فوق الصورة > ضبط عتبة >. اضبط العتبة حتى يتم تلوين جميع المساحات الملونة باللون الأحمر، ولكن الخلفية ليست كذلك. عند إضافة NBT / BCIP ، سيترسب المنتج الملون في المنطقة المحيطة بالخلايا التي تعبر عن hPLAP.
    ملاحظة: يوصى باستخدام نفس إعداد العتبة لجميع الصور الملتقطة على نفس اللوحة.
  5. انقر فوق تحليل > تعيين القياسات ووضع علامة في مربعات الاختيار المنطقة والحد من العتبة وكسر المنطقة وعرض التسمية وانقر فوق موافق.
  6. لتحديد قراءة الإشارة (النسبة المئوية للتلوين) لبئر معين ، انقر فوق تحليل > قياس. يعرض عمود "النسبة المئوية للمساحة" في النافذة المنبثقة قراءة الإشارة.
  7. قم بإجراء قياس كمي لكافة نسخ العينات المتماثلة. استبعاد أي آبار ملوثة، أو آبار تظهر توزيعا غير متساو للخلايا، أو آبارا تختلف في كثافة الخلايا أو الإضاءة.
    ملاحظة: انظر الشكل التكميلي 1 للاطلاع على أمثلة للآبار التي ينبغي النظر في استبعادها. عادة ، قد تتطلب 3-4 آبار الاستبعاد من لوحة 96 بئرا. يوفر الشكل 2 تمثيلا مرئيا لعملية القياس الكمي باستخدام ImageJ.

Figure 2
الشكل 2: خطوات تحديد النسبة المئوية للتلوين باستخدام برنامج ImageJ. (أ) افتح الصورة المراد تحليلها باستخدام برنامج ImageJ. (ب) تحويل الصورة إلى تدرج رمادي 8 بت. (ج) افتح نافذة العتبة. (د) اضبط الحد الأقصى بحيث يتم تغطية جميع المناطق الملونة ، ولكن منطقة الخلفية ليست كذلك (يجب أن تكون هذه العتبة متسقة عبر لوحة بأكملها). (ه) حدد مربع الإسقاط "تحليل" ، وانقر فوق "تعيين القياسات" وحدد "المنطقة" و "جزء المساحة" و "عتبة الحد" و "ملصق العرض" ، وانقر فوق "موافق". (و) انقر فوق "قياس" لقياس المنطقة المغطاة. تشير المساحة ٪ إلى نسبة الصورة التي تم تلوينها. يمكن بعد ذلك استخدام هذا مع عينات التحكم لتحديد عيار TI50 . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. تحديد عيار تثبيط النقل (TI50)

  1. حدد متوسط القراءة من النسخ المتماثلة (باستخدام الخطوات الموضحة في الخطوة 5) لما يلي: (1) عنصر تحكم الوسائط فقط (قراءة إشارة الأساس). (2) التحكم في الفيروسات + الوسائط فقط (الحد الأقصى لقراءة الإشارة). (3) عينات الفيروسات + المصل ذات الاهتمام.
  2. احسب النسبة المئوية للتثبيط باستخدام الصيغة التالية:
    100 - [(اختبار قراءة إشارة العينة (الفيروس + عينة المصل محل الاهتمام) - قراءة إشارة خط الأساس (التحكم في الوسائط فقط)) / (الحد الأقصى لقراءة الإشارة (الوسائط والفيروسات فقط) - قراءة إشارة خط الأساس) × 100] = ٪ تثبيط النقل 13.
  3. احسب النسبة المئوية لتثبيط النقل من جميع النسخ المتماثلة لكل تخفيف لجميع العينات باستخدام الصيغة في 6.2. تحديد متوسط تثبيط النقل بين النسخ المتماثلة التقنية لكل تخفيف لجميع العينات والضوابط.
  4. احسب عيار تثبيط النقل بنسبة 50٪ (عيار TI50 ) لعينة ذات أهمية عن طريق تحديد أدنى تخفيف للعينة ينتج عنه تثبيط نقل بنسبة 50٪ أو أكبر لنشاط hPLAP. على سبيل المثال ، إذا كان التخفيف 1/8 للعينة يحتوي على تثبيط نقل أكبر من 50٪ بناء على الحساب الذي تم إجراؤه في 6.2 (ولا يؤدي التخفيف 1/4) ، فقم بالإبلاغ عن عيار TI50 على أنه 1/8.

7. تحديد جزيئات AAV المحايدة

  1. احسب عدد جسيمات AAV المحايدة لكل ميكرولتر من المصل لعينة معينة باستخدام الصيغة التالية:
    ((MOI x عدد الخلايا / بئر) / (حجم المصل / عامل تخفيف عيار TI50 )) / 2 = جزيئات AAV المحايدة / ميكرولتر من المصل 9.
    ملاحظة: القسمة على 2 تمثل TI50 التي تقيس 50٪ من الجسيمات المحايدة. بالنسبة للعينة التي تعطي عيار TI50 من 1/4 (مصل 25٪ ، مخفف بنسبة 75٪) حيث استخدم الفحص 80 ميكرولتر من المصل غير المخفف و MOI من 15k مطلي على خلية 1 × 104 ، سيتم استخدام الحساب التالي: ((15000 × 10000) / (80/4)) / 2 = 3.75x106 جسيمات محايدة / ميكرولتر من المصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فحص النقل لتحديد الجرعة الفيروسية المثلى لتغطية اللوحة
تم اختيار خلايا HT1080 ، وهي خط خلايا الساركوما الليفية الراسخ ، لهذا الفحص. تركيز 1 × 104 HT1080 خلية / بئر قدمت ~ 50٪ التقاء الخلايا في كل بئر من لوحة 96 بئر. لتحديد التركيز الفيروسي الأمثل للفحص، تمت إضافة rAAV ترميز جين مراسل hPLAP (الفوسفاتيز القلوي المشيمي البشري) (AAV6-hPLAP)31 في ثلاثة أضعاف في مجموعة من تركيزات vg تحتوي على جزيئات لكل خلية (MOI: 0 و 150 و 500 و 1500 و 5000 و 150000 و 50000 و 150000 (الشكل 3A)). منحت MOI من 15000 (1.5 × 108 vg / well) تلوين لوحة 36٪ وتم اختيارها كجرعة فيروسية مثالية. ولوحظت علاقة إيجابية بين التلوين والتركيزات الفيروسية لجميع MOI بين 0 و 15000 (n = 6 ، r = 0.995 ، P<0.001). عرض هذا التركيز بشكل كاف إشارة جين المراسل فوق الخلفية في وجود تركيزات عالية من NAbs (تلوين لوحة منخفضة) مع عدم فقدان الحساسية بسبب تشبع اللون في غياب NAbs (تلوين مرتفع ، الشكل 3B).

تمت تجربة فعالية الفحص ، عند تعرضها لعناصر محايدة ، باستخدام تخفيفات تسلسلية لجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر AAV6 (mAb) في ثلاثة أضعاف. تم تطبيق النهج القياسي لاستخدام التخفيف الأول لعرض 50٪ أو أكثر من تثبيط النقل (TI50) لتحديد عيار التحييد لعينة معينة (الخطوة 6). عند تقييم تخفيفات log10 ، عرض مضاد AAV6 mAb عيار TI50 من ~ 10 نانوغرام / مل (1 نانوغرام إجمالي مأب) ، في حين أن تركيز 500 نانوغرام / مل (50 نانوغرام إجمالي أب) وما فوق منع التعبير الجيني للمراسل تماما (الشكل 3C).

Figure 3
الشكل 3: تحسين الجرعة الفيروسية وتقييم فعالية المقايسة ضد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة ل AAV6 (mAB). (أ) نسبة التلوين (٪ من المساحة الكلية) للآبار الفردية في مضاعفات العدوى المختلفة (MOI) والصور التمثيلية (أدناه) التي تعرض التفاعل اللوني المقابل بين الفوسفاتيز القلوي (hPLAP) و NBT / BCIP لكل جرعة فيروسية (يسار). تظهر النسبة المئوية لتغطية اللوحة أيضا في شكل مجدول (يمين). تمثل كل نقطة بيانات نسخة طبق الأصل التقنية (n = 3 نسخ متماثلة لكل وزارة الداخلية). (ب) يظهر في الشكل 3 ألف تمثيل للعلاقة بين التلوين ووزارة الداخلية. يمثل الخط الأحمر المنقط أعلى تركيز تم اختباره ولم يؤثر على العلاقة الخطية بين التلوين والتركيز الفيروسي. (ج) تحييد النشاط ضد AAV6 من جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد ل AAV6 عند تخفيفات log10 . لوحظ تثبيط 50٪ من نقل AAV6 (TI50) عند تركيز ~ 10 نانوغرام / مل. n = 3 تكرارات لكل تخفيف. تمثل البيانات متوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقييم NAbs ضد AAV6 في عينات الأغنام
تم جمع المصل من الوريد السباتي باستخدام إبرة 16 G (قطع الطرف) وحقنة من الأغنام البالغة السليمة الساذجة الواعية (نعاج ميرينو البالغة من العمر 1.5-3 سنوات) (n = 11) وفحصها لتحديد عيار TI50 باستخدام فحص NAb الملون. تم تقييم التخفيفات التسلسلية المزدوجة التي تتراوح من 1/2 إلى 1/512 تخفيف لكل عينة مصل في نسختين أو ثلاث مرات. احتوى التخفيف 1/2 على ما مجموعه 40 ميكرولتر من المصل ، والذي يتوافق مع تركيز 1.88 × 106 جسيمات AAV لكل ميكرولتر من المصل. تفاوتت درجة تحييد AAV داخل مجموعة العينات الساذجة ، حيث تراوحت قيم عيار TI50 من 1/2 (الخط الأزرق) إلى 1/80 (الخط الأخضر ، 1.88 × 106 إلى 7.5 × 107 جزيئات AAV المحايدة / ميكرولتر من المصل) (الشكل 4A).

في وقت لاحق ، تم إجراء حقن القلب المباشر (n = 5) من AAV6 بجرعات تتراوح بين 5 × 1012 و 3 × 1013 vg للأغنام الساذجة. باختصار ، تم تخدير الأغنام كما هو موضح سابقا32. تم الكشف عن القلب من الوضع الجانبي الأيسر. تم فتح التامور ، وتم إعطاء AAV عن طريق حقن 10-40 ~ 20 ميكرولتر في عضلة القلب البطينية اليسرى (الأمامية) في المنطقة المحيطة بالفرع الثاني من الشريان التاجي الأمامي الأيسر (LAD). تم إغلاق التامور والعضلات الوربية والأنسجة تحت الجلد والجلد ، وتمت إزالة المخدر. تم جمع المصل من جميع الحيوانات قبل وبعد ستة إلى ثمانية أسابيع من إعطاء AAV من الوريد الوداجي الأيمن المعلب مسبقا باستخدام قطع إبرة 16 G ومحقنة (~ 5 مل مصل / حيوان). تم استخدام فحص NAb اللوني لتحديد التغيير في عيار NAb بعد إدارة AAV6. تم فحص عينات مصل ما بعد AAV في ثلاثة أضعاف كتخفيفات تسلسلية من 2 إلى 4 أضعاف تتراوح من 1/2 إلى 1/32768 تخفيف. وأشارت نتائج الفحص إلى أن قيم عيار TI50 المثبط ل AAV قبل إعطاء AAV تراوحت بين 1/4 و 1/80 (3.75 × 106 إلى 7.5 × 107 جسيمات AAV/ميكرولتر من المصل؛ و 3.75 × 106 إلى 7.5 × 107 جسيمات AAV/ميكرولتر من المصل؛ و 3.75 × 106 إلى 7.5 × 107 جسيمات AAV/ميكرولتر من المصل؛ و 3.75 × 106 إلى 7.5 × 107 جسيمات AAV/ميكرولتر من المصل؛ و 3.75 × 106 إلى 7.5 × 107 جسيمات الشكل 4 باء). بعد حقن القلب AAV ، لوحظ تباين واضح ومتسق في عيار NAb مقارنة بعيارات مصل ما قبل AAV (الشكل 4B ، الجدول 3). عرضت أدنى جرعة AAV (5 x1012 vg) عيار 1/2048 TI50 (خط أزرق متقطع ، 1.92 × 109 جسيمات AAV محايدة / مصل μL) وبقية الجرعات (1-3 × 1013 vg) عرضت عيارات TI50 تتراوح من 1/12000 إلى >1/32768 (1.13 x1010 إلى >3 × 1010 جسيمات AAV محايدة / ميكرولتر من المصل).

Figure 4
الشكل 4: مثال على تحييد نتائج فحص الأجسام المضادة (Nab) باستخدام عينات مصل البويض. (أ) تم جمع عينات مصل تحييد الفيروس المرتبط بالأدينو (AAV) من 11 خروفا ساذجا ، تم قياسها في تخفيفات تسلسلية مزدوجة تتراوح من 1/2 إلى 1/512. تمثل الخطوط الملونة عينات ذات نشاط تحييد منخفض ومرتفع ؛ تمثل الخطوط الرمادية العينات التسع الإضافية. يمثل الخط المنقط تثبيط نقل بنسبة 50٪ (TI50) وعيار TI50 المقابل للعينات التمثيلية المنخفضة (الزرقاء) والعالية (الخضراء). (ب) تحييد نشاط AAV لعينات المصل التي تم جمعها من خمسة أغنام قبل وبعد تلقي جرعة من AAV عن طريق الحقن القلبي المباشر. تم تقييم نشاط التحييد في تخفيفات تسلسلية مزدوجة تتراوح من 1/2 إلى 1/32768. يمثل كل لون المصل من مختلف ، وتمثل الخطوط المملوءة إدارة ما قبل AAV وتمثل الخطوط المنقطة إدارة ما بعد AAV. n = 2-3 تكرارات لكل تخفيف لكل عينة. تمثل البيانات متوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هوية الأغنام الحالة الإدارية الجرعة المستلمة (vg) عيار NAb (TI50) مصل AAV المحايد / ميكرولتر طي التغيير قبل مقابل آخر
الأغنام 1 ما قبل AAV 1x1013 1/5 5.6x106 6400
آخر –AAV 1/32000 3x1010
الأغنام 2 ما قبل AAV 1x1013 1/80 7.5x107 200
آخر –AAV 1/16000 1.5x1010
الأغنام 3 ما قبل AAV 5x1012 1/16 1.5x107 125
آخر –AAV 1/2000 1.9x109
الأغنام 4 ما قبل AAV 2x1013 1/4 3.8x106 >10000
آخر –AAV >/1/32000 > 3x1010
الأغنام 5 ما قبل AAV 3x1013 1/8 7.5x106 1700
آخر –AAV 1/12000 2.3x1010

الجدول 3: أثر التعرض لفيروس AAV على تحييد النشاط. تم تقييم نشاط تحييد الأغنام قبل وبعد تلقي حقن القلب المباشر من rAAV6 بجرعات مختلفة. يتم عرض الجرعة المستلمة قبل وبعد عيار TI50 وتغيير الطي بعد الإعطاء.

الشكل التكميلي 1: أمثلة مرئية لأسباب مختلفة لاستبعاد آبار العينة. (أ) يمكن رؤية وجود التلوث عن طريق كتل في المركز. (ب) ارتفاع كثافة الخلايا. (ج) الإضاءة غير المتساوية للبئر (الصورة اليسرى) ، والعتبة المقابلة لنفس البئر التي تعرض تغطية زائدة في الزاوية اليمنى السفلى (الصورة اليمنى). (د) الصور المتماثلة تقنيا، الصورة الموجودة على اليسار التي تمثل النتائج ذات كثافة الخلايا الطبيعية، الصورة الموجودة على اليمين تعكس النتائج ذات الكثافة الخلوية المنخفضة. (ه) يتم توزيع الخلايا بشكل غير متساو عبر البئر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: خريطة البلازميد المبسطة التي تعرض إدراج hPLAP. CMV: مروج الفيروس المضخم للخلايا. hPLAP: الفوسفاتيز القلوي المشيمي البشري. SV40: فيروس سيميان 40 إشارة polyadenylation. ITR: تسلسلات تكرار طرفية مقلوبة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يصف هذا التقرير مقايسة لونية تقيم مدى تحييد AAV في عينة مصل معينة من خلال تقييم تفاعل كروموجيني يتوافق مع درجة النقل الفيروسي في المختبر. استند تطوير البروتوكول إلى التفاعل اللوني المعروف بين إنزيم الفوسفاتيز القلوي و NBT / BCIP ، والذي تم استخدامه على نطاق واسع كأداة تلطيخ للكشف عن أهداف البروتين في تطبيقات مثل الكيمياء النسيجية المناعية وكأداة مراسلة لتقييم النقل الفيروسي24،33،34،35 . وتنبع مزاياها من وقتها وفعاليتها من حيث التكلفة، وإمكانية الوصول إليها، وسهولة إعدادها وأدائها مع إظهار درجة عالية من الفعالية. يحمل rAAV6 المستخدم في هذا الفحص (AAV-hPLAP) الجين المراسل الفوسفاتيز القلوي المشيمي البشري (hPLAP) ويقوده مروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV)34 (الشكل التكميلي 2). NBT / BCIP هي ركيزة hPLAP يتم نزع الفوسفوريل عنها في البداية بواسطة الفوسفاتيز القلوي وتخضع للأكسدة بالتتابع لتشكيل دايمر ، مما يؤدي إلى منتج غير قابل للذوبان بلون أرجواني نابض بالحياة 36.

عند اختيار MOI الأمثل لهذا الفحص ، كان الهدف هو إنشاء تركيز فيروسي من شأنه أن يعبر بشكل كاف عن جين مراسل AAV من خلال ربط خلايا الفيروس ، وبالاقتران مع الركيزة NBT / BCIP ، يوفر التلوين ضمن نطاق يمكن قياسه بدقة. تم اختيار MOI من 15000 ، لأنه كان أعلى تركيز تم اختباره ولم يؤثر على العلاقة الخطية بين التلوين والتركيز الفيروسي. تسببت التركيزات العالية (50,000 و 150,000 MOI) في هضبة منحنى استجابة لون التركيز ، مما يشير إلى تشبع اللون (الشكل 3B). أدى تقييم MOIs الفيروسية بين 0 و 15000 (n = 6) ومستوى التلوين المقابل لها إلى r = 0.995 (P < 0.001) ، مما يؤكد حساسية الفحص من خلال إنشاء علاقة إيجابية قوية جدا بين التركيز الفيروسي والتلوين المدفوع بجين المراسل. وبالنظر إلى التباين المحتمل في عوامل مثل ظروف زراعة الخلايا، وفنيي المختبرات، والتقنيات، والمعدات، فضلا عن الاختلافات في الدفعات الفيروسية، فمن المستحسن أن يقوم أي مستخدم جديد بإجراء تقييم تجريبي أولي لوزارة الداخلية المثلى عند إنشاء فحص NAb.

تعد وزارة الداخلية المختارة لفحص NAb معين عاملا مساهما رئيسيا في العيار الكلي الذي لوحظ لعينة مصل معينة. إذا تم اختيار وزارة الداخلية من 5000 بدلا من 15000 ، فمن المتوقع حدوث فرق 3 أضعاف في قيمة العيار. كان هذا تاريخيا إشكاليا في مجال العلاج الجيني AAV ، حيث نفذت تجارب ما قبل السريرية والسريرية المختلفة اختبارات AAV NAb بقيم MOI تتراوح من أقل من 1000 إلى 2500037 عالية ، مما يعني أن أي نوع من المقارنة بين الدراسات لعيارات NAb لنمط مصلي AAV معين له قيمة ضئيلة أو معدومة. وقد اقترح مؤخرا أن الإبلاغ عن عيارات كجزيئات AAV محايدة لكل ميكرولتر من المصل يمكن أن يوفر قيما أكثر قابلية للمقارنة عبر دراسات مختلفة9,38. قد تساهم العديد من العوامل الأخرى في التباين في العيار بين الدراسات ، مثل اختيار خط الخلية ، وجين المراسل ، وأوقات الحضانة ، وظروف الثقافة. لتسهيل توحيد اختبارات AAV NAb ، تم الإبلاغ عن كل من قيم العيار وجسيمات AAV المحايدة / ميكرولتر من المصل.

من الضروري تضمين تخفيف تسلسلي لعينة NAb معروفة على كل لوحة لتكون بمثابة تحكم إيجابي وعينة مشتركة بين اللوحات. هذا مهم لتحديد أي تباين محتمل بين عمليات التشغيل المنفصلة. يعد الجسم المضاد أحادي النسيلة المحايد ضد AAV موضع الاهتمام تحكما إيجابيا مثاليا ومعيارا ، ولكن عينة المصل الإيجابية ل NAbs مقبولة أيضا. تم التحقق من فعالية الفحص من خلال إثبات أن الجسم المضاد أحادي النسيلة الخاص بجسيمات AAV6 السليمة (ADK6) يمكن أن يمنع النقل كميا بطريقة تعتمد على التركيز.

استنادا إلى ورقة بيانات المواد الخاصة بالشركة المصنعة ، ينتج نظام الركيزة BSP / NBT المنتج الأزرق الأرجواني غير القابل للذوبان في غضون 10 دقائق تقريبا وهو مستقر للغاية. ومع ذلك ، يلاحظ أن الإجراءات قد تؤثر على طول وقت الحضانة. واستنادا إلى تقارير سابقة، استخدمت أطر زمنية تتراوح بين 1 و24 ساعة30,39. بالنسبة لهذا الفحص ، يجب أن تكون أوقات الحضانة متسقة بين الأشواط. تسمح مرونة الوقت للمستخدمين بتصوير الآبار إما في اليوم 3 من البروتوكول أو في اليوم التالي.

توفر التجارب قبل السريرية باستخدام نماذج حيوانية كبيرة نقطة انطلاق حاسمة بين المختبر والعيادة بسبب التشابه الفسيولوجي الذي تشترك فيه الحيوانات مثل الأغنام والخنازير مع البشر1,40,41. تاريخيا، خضعت معظم العلاجات الجينية المرشحة AAV التي وصلت إلى التجارب السريرية لتجارب أولية على الحيوانات الكبيرة1. أظهرت دراسات متعددة أن كلا من البشر ومجموعة من الحيوانات الكبيرة ، بما في ذلك الأغنام والخنازير والكلاب والأرانب والرئيسيات غير البشرية ، يمكن أن تؤوي أجساما مضادة محايدة ضد AAV6 بالإضافة إلى العديد من الأنماط المصلية AAV الأخرى42,43. وهذا يسلط الضوء على أهمية الفحص الأولي ل NAbs قبل التجارب في كل من النماذج الحيوانية الكبيرة والبشر. تم تقييم حالة عينات المصل من الأغنام التي لم يسبق لها التعرض المعروف ل AAV ، والتي عرض منها 10 من أصل 11 عيار TI50 <1/30 (<3 × 107 جسيمات AAV المحايدة / ميكرولتر من المصل). في المقابل ، عرض أحدهم عيار TI50 من 1/80 (7.5 × 107 جسيمات AAV محايدة / ميكرولتر من المصل). ذهب خمسة من الأغنام لتلقي حقن عضلة القلب المباشر من rAAV. من بين جميع العينات ، غيرت إدارة AAV بشكل كبير نشاط التحييد ، مع زيادات في تغيير الأضعاف تتراوح من 125 إلى > 10000 ضعف في قيم عيار TI50 بين التعرض قبل وبعد AAV (الجدول 3). وتجدر الإشارة إلى أن أدنى جرعة AAV6 التي تم إعطاؤها (5 × 1012 vg) تتوافق مع أدنى قيمة لعيار AAV TI50 (عيار TI50 1/2000) وزيادة تغيير الأضعاف (125 ضعفا). وبالمقارنة، لم يلاحظ أي دليل واضح على وجود NAbs مسبقا داخل الأغنام الساذجة ال 11 عند مستويات من شأنها أن تمنع نقل AAV (جميع قيم عيار TI50 <1/100). تشير البيانات من الأغنام ال 5 التي تلقت حقنة AAV مباشرة إلى أن الحد الأقصى لإيجابية NAb سيكون >1/1000 (استنادا إلى قيم ما قبل وبعد AAV). إن الفرق الصارخ بين عيار ما قبل NAb وبعده والقدرة على اكتشاف عيار >1/32000 يوفر مزيدا من التحقق من فعالية الفحص وحساسيته. يعد تحديد نقطة القطع التي تعتبر فيها العينة إيجابية لتحييد النشاط خطوة لاحقة أساسية عند تحديد عتبة للحيوانات الإيجابية NAb. يمكن تحديد ذلك من خلال تقييم التباين في مجموعة (~n ≥ 30) من العينات الساذجة من مجموعة محددة من الاهتمام. وهذا يسمح بوضع معايير لاختيار نقطة قطع مشتقة إحصائيا تعتبر فيها العينة إيجابية لتحييد النشاط. وبدلا من ذلك، يمكن أن تشير عينات المكافحة الإيجابية من الحيوانات قبل وبعد إعطاء AAV على حد سواء، كما هو موضح في الشكل 4B، إلى نطاق عيار إيجابي لتحييد النشاط. تم وصف التوصيات المتعلقة بوضع عتبات نقاط القطع والتحقق من صحة وتحسين مقايسات التحييد في المختبر على نطاق واسع في الأدبيات 44،45،46،47.

تتضمن هذه التقنية قيودا معينة. يعد استخدام كاميرا المجهر لتصوير الآبار مفيدا لأنه يوفر صورا عالية الجودة يمكنها التمييز بدقة بين درجة التحييد. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الفحص المجهري كثيف العمالة وقد لا يكون عمليا إذا تمت معالجة العديد من العينات (>100). قد يوفر الماسح الضوئي المسطح عالي الدقة أو الماسح الضوئي للألواح نهجا أسرع لتصوير الآبار إذا كان من الممكن الحفاظ على جودة الصور وإضاءتها. تم الإبلاغ عن ارتفاع MOI لتقليل حساسية الكشف عن المقايسة. وقد اقترح أن جرعات AAV العالية قد تتهرب من نشاط التحييد أو أن نقل AAV قد يحدث في وجود NAbs48,49,50. يستخدم هذا الفحص وزارة الداخلية عالية بشكل معتدل (15000) ؛ ومع ذلك ، لا يبدو أن الحساسية قد أعيقت لأنها يمكن أن تكتشف نشاط تحييد عند تخفيفات عالية جدا (>1: 32000) (الشكل 4B). وأخيرا، بما أن هذا الفحص يستخدم ناقلا فيروسيا، فإن الموافقة المناسبة من جانب هيئة الإدارة مطلوبة عموما لاستخدام AAV المؤتلف؛ هذا سوف يختلف من بلد إلى آخر.

باختصار ، يوفر هذا الفحص في المختبر طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة ويمكن الوصول إليها بسهولة وبسيطة للكشف عن وجود الأجسام المضادة المحايدة ضد rAAV6. يمكن تعديل هذا الفحص وتحسينه لأداء مع أنماط مصلية AAV مختلفة بسهولة نسبية. يمكن توفير متجه AAV6-hPLAP لهذا الفحص عند الطلب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة مشروع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية إلى JRM و CJT (ID 1163732) وجزئيا من قبل برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية التابع لحكومة فيكتوريا. يتم دعم SB من خلال منحة دكتوراه مشتركة بين معهد بيكر للقلب والسكري وجامعة لا تروب. يتم دعم KLW من قبل مؤسسة Shine On Foundation وزمالة قادة المستقبل من مؤسسة القلب الوطنية الأسترالية (ID 102539). يتم دعم JRM من قبل زمالة أبحاث عليا من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (ID 1078985).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Tags

علم الأحياء ، العدد 178 ،
طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bass-Stringer, S., Thomas, C. J.,… More

Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter