Summary
Een uitgebreid laboratoriumprotocol en analyseworkflow worden beschreven voor een snelle, kosteneffectieve en eenvoudige colorimetrische celgebaseerde test om neutraliserende elementen tegen AAV6 te detecteren.
Abstract
Recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) hebben bewezen een veilige en succesvolle vector te zijn voor het overbrengen van genetisch materiaal om verschillende gezondheidsproblemen in zowel het laboratorium als de kliniek te behandelen. Reeds bestaande neutraliserende antilichamen (NAbs) tegen AAV-capsiden vormen echter een voortdurende uitdaging voor de succesvolle toediening van gentherapieën in zowel grote dierexperimentele modellen als menselijke populaties. Voorlopige screening op gastheerimmuniteit tegen AAV is noodzakelijk om de werkzaamheid van op AAV gebaseerde gentherapieën te waarborgen als zowel een onderzoeksinstrument als een klinisch levensvatbaar therapeutisch middel. Dit protocol beschrijft een colorimetrische in vitro test om neutraliserende factoren tegen AAV serotype 6 (AAV6) te detecteren. De test maakt gebruik van de reactie tussen een AAV die codeert voor een alkalisch fosfatase (AP) reporter gen en het substraat NBT / BCIP, dat een onoplosbare kwantificeerbare paarse vlek genereert bij combinatie.
In dit protocol worden serummonsters gecombineerd met een AAV die AP tot expressie brengt en geïncubeerd om potentiële neutraliserende activiteit mogelijk te maken. Virusserummengsel wordt vervolgens toegevoegd aan cellen om virale transductie mogelijk te maken van eventuele AAV's die niet zijn geneutraliseerd. Het NBT/BCIP-substraat wordt toegevoegd en ondergaat een chromogene reactie, die overeenkomt met virale transductie en neutraliserende activiteit. Het aandeel van het gekleurde gebied wordt gekwantificeerd met behulp van een gratis softwaretool om neutraliserende titers te genereren. Deze test toont een sterke positieve correlatie tussen kleuring en virale concentratie. Beoordeling van serummonsters van schapen voor en na toediening van een recombinant AAV6 leidde tot een dramatische toename van de neutraliserende activiteit (125 tot >10.000-voudige toename). De test vertoonde voldoende gevoeligheid om neutraliserende activiteit te detecteren in >1:32.000 serumverdunningen. Deze test biedt een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode om NAbs tegen AAV's te detecteren.
Introduction
Adeno-geassocieerde virussen (AAV) worden steeds vaker gebruikt als vectoren voor de levering van gentherapieën aan proefbehandelingen voor verschillende gezondheidsproblemen die van invloed zijn op het cardiovasculaire, pulmonale, circulatoire, oculaire en centrale zenuwstelsel1,2,3,4,5. De populariteit van AAV-vectoren als toonaangevend gentherapieplatform komt voort uit hun positieve veiligheidsprofiel, transgenexpressie op lange termijn en brede weefselspecifieke tropismen1,6. Succesvolle resultaten in dierstudies hebben de weg vrijgemaakt voor meer dan vijftig klinische onderzoeken naar AAV-gentherapie die met succes hun werkzaamheidseindpunten hebben bereikt7, evenals de release van het eerste commercieel beschikbare AAV-gentherapiegeneesmiddel dat is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration8. Na de eerste successen is AAV blijven tractie krijgen in de basis- en klinische onderzoekssectoren als een vector bij uitstek en is het momenteel de enige in vivo gentherapie die is goedgekeurd voor klinisch gebruik in de VS en Europa9. Niettemin blijft de aanwezigheid van reeds bestaande neutraliserende antilichamen (NAbs) tegen AAV-vectorcapsiden een belemmering voor zowel preklinisch onderzoek als de werkzaamheid van klinische onderzoeken. NAbs zijn aanwezig in zowel naïeve menselijke als dierlijke populaties en remmen gentransductie na in vivo toediening van een AAV-vector1. AAV-seropositiviteit is een uitsluitingscriterium voor de meeste gentherapiestudies en daarom is voorlopige screening op gastheerimmuniteit cruciaal in zowel het laboratorium als de kliniek. Het opzetten van een test die de aanwezigheid van NAbs tegen AAV kan detecteren, is een essentiële stap in de pijplijn van elk op AAV-gentherapie gebaseerd onderzoeksproject. Dit rapport richt zich op AAV6 dat van belang is geweest voor onderzoekers vanwege de efficiënte en selectieve transductie in dwarsgestreepte spieren (hart- en skeletspieren)1,10,11,12. Gentherapie wordt beschouwd als een veelbelovende strategie voor het richten op het hart, omdat het moeilijk is om specifiek op het hart te richten zonder invasieve openhartprocedures.
Neutraliserende activiteit wordt meestal bepaald met behulp van een celgebaseerde in vitro of in vivo transductie remmingstest. In vivo NAb-assays omvatten meestal het toedienen van serum van een proefpersoon (bijv. Menselijk of groot dier) aan muizen, gevolgd door een AAV met een reporter-gen, gevolgd door testen op de expressie van het reporter-gen of het bijbehorende antigeen. In vitro assays bepalen NAb-titers door serum of plasma van een mens of groot dier in seriële verdunningen te incuberen met een recombinant AAV (rAAV) dat een reporter-gen tot expressie brengt. Cellen zijn geïnfecteerd met het serum/virusmengsel en de mate waarin de genexpressie van de reporter wordt geremd, wordt beoordeeld in vergelijking met controles. In vitro assays worden veel gebruikt voor NAb-screening vanwege hun relatief lagere kosten, snelheid bij het testen en grotere capaciteit voor standaardisatie en validatie13,14 in vergelijking met in vivo assays. Van in vivo assays wordt vaak gemeld dat ze een grotere gevoeligheid hebben15,16, maar dezelfde claim is gemaakt met betrekking tot in vitro assays14,17.
Tot op heden hebben in vitro NAb-assays voornamelijk luminescentie (luciferase) gebruikt als het reporter-gen om neutralisatie te detecteren. Hoewel een op licht gebaseerde methode in veel contexten verdienstelijk is, kan een colorimetrische / chromogene NAb-test in sommige omstandigheden voordelig zijn. Colorimetrische assays om neutralisatie te beoordelen zijn met succes gebruikt voor andere virussen zoals influenza en adenovirus18,19. Hun aantrekkelijkheid komt voort uit hun eenvoud, lagere kosten en de behoefte aan alleen alledaagse laboratoriumapparatuur en gereedschappen20. NAb-assays die een op luminescentie gebaseerd reporter-gen gebruiken, vereisen dure substraatkits, een luminometer en bijbehorende software voor analyse21. Deze colorimetrische test heeft het voordeel dat alleen een lichtmicroscoop en een zeer goedkoop substraat nodig zijn. Rapportage van de gevoeligheid van colorimetrische versus luminescente assays heeft tegenstrijdige resultaten opgeleverd. Eén studie suggereerde dat op luminescentie gebaseerde ELISA-assays een grotere gevoeligheid en vergelijkbare reproduceerbaarheid vertonen als colorimetrische assays22, terwijl een andere vond dat op colorimetrische gebaseerde ELISA-assays een grotere gevoeligheid verlenen23. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor een in vitro NAb-test tegen AAV die gebruik maakt van de chromogene reactie tussen een AAV-codering van een alkalisch fosfatase (AP) reportergen en een nitroblauw tetrazolium / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) substraat. Dit stapsgewijze protocol is ontwikkeld op basis van een eerder rapport dat een hPLAP (human placental alkaline phosphatase) reporter gen (AAV6-hPLAP) gebruikte om neutraliserende activiteit tegen AAV24 te detecteren. Deze test is kosteneffectief, tijdbesparend, eenvoudig in te stellen en vereist minimale technische vaardigheden, laboratoriumapparatuur en reagentia. Bovendien geeft de eenvoud van deze test het potentieel om te worden geoptimaliseerd voor brede toepassingen in verschillende soorten cellen, weefsels of virale serotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle aspecten van dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Florey Institute of Neuroscience and Mental Health en de Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes volgens Reference25. Voor het onderzoek werden 1,5-3-jarige Merino-ooien gebruikt. Een schematisch overzicht van het testprotocol is te vinden in figuur 1.
Figuur 1: Schematisch diagram van het NAb-assayprotocol. (A) Visuele weergave van de NAb-assay die de primaire stappen illustreert die betrokken zijn bij het driedaagse protocol. Kortom, cellen worden 's nachts gekweekt en verguld. De volgende dag worden seriële verdunningen van serum bereid, geïncubeerd met AAV en vervolgens 's nachts met de cellen geïncubeerd. De volgende dag worden cellen gefixeerd, gewassen, geïncubeerd, gecombineerd met het substraat en opnieuw geïncubeerd, gevolgd door beeldvorming en kwantificering. (B) Representatieve beelden van een minimale signaalcontrole (volledige AAV-remming), een maximale signaalcontrole (geen remming) en een ovineserummonster met ~50% signaalremming. Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Eerste voorbereiding
- Voor beoordeling bij schapen: bloed verzamelen in 8 ml serumscheider stolsel activatorbuizen (zie Materialen tabel), laat het bloedmonster 20-30 minuten bij kamertemperatuur (RT) staan en draai vervolgens gedurende 15 minuten af bij 2.100 x g . Het heldere supernatant dat zich aan de bovenkant van de buisjes vormt, is serum. Vul de heldere waterige fase in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: Het serum bij -80 °C blijft ~5 jaar stabiel. Bloed werd verzameld uit de halsslagader met behulp van een naald van 16 G (tip cut-off) en spuit van bewuste dieren. - Verwarm foetaal runderserum (FBS) door het gedurende 30 minuten in een waterbad bij 56 °C te plaatsen en met tussenpozen te wervelen. Plaats voor de precisie een thermometer in een tweede fles met een equivalent volume water en voeg deze tegelijkertijd met de FBS-fles toe aan het warmtebad. Begin met de timing wanneer de thermometer 56 °C bereikt.
- Gebruik de juiste aseptische techniek en celkweekpraktijk voor alle volgende stappen die worden uitgevoerd in de celkweek hood26,27. Spuit voor gebruik 70% ethanol op alle voorwerpen en de kap en reinig na voltooiing met 1% natriumhypochloriet.
- Maak Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) compleet door hoge glucose (4,5 g/L) DMEM (89%) te combineren met warmte-geïnactiveerde FBS (10%) en Penicilline Streptomycine (1%). Combineer en filter met behulp van een steriel vacuümfiltratiesysteem (poriegrootte van 0,22 μm, polyethersulfonmembraan) (zie Materiaaltabel). Bewaar complete DMEM gewikkeld in folie bij 4 °C.
- Stel HT1080-cellen op (zie Materiaaltabel) en doorgang in een vierkante kolf van 75 cm2 zoals beschreven in Referentie28. Maak meerdere bevroren voorraden cellen. Gebruik geen cellen na 20 passages, omdat verdere passageing de testresultaten kan beïnvloeden.
2. Dag 1 - Plating van cellen
- Passage HT1080-cellen wanneer ze ~ 80% confluentie bereiken.
- Verwarm volledige DMEM (bereid in stap 1.4), 0,05% trypsine-EDTA en 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 °C in een waterbad. Verwijder het groeimedium uit gepasseerde cellen met behulp van een aspiratiesysteem.
OPMERKING: Alle aspiraties in dit protocol maken gebruik van een vacuümsysteem met een buis bevestigd aan een steriele serologische pipet van 5 ml. - Was de cellen in 10 ml voorverwarmde (37 °C) 1x PBS en trypsinize cellen gedurende 3-4 minuten in 4 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA om de cellen los te maken van de kolf.
- Inactiveer de trypsine door 6 ml voorverwarmde complete DMEM toe te voegen en pipetteer de cellen in een buis van 50 ml. Bereken het aantal en de concentratie van levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en de trypan blue exclusion methode29.
- Verdun de cellen tot een concentratie van 1 x 105 cellen/ml in voorverwarmde complete DMEM. Zaai 100 μL cellen/goed in heldere 96-put platbodemplaten (1 x 104 cellen per put). Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% koolstofdioxide (CO2) gedurende 16-22 uur.
3. Dag 2 - Infecteren van de cellen
- Verwijder plaat (en) uit de incubator en gebruik een lichtmicroscoop om te bevestigen dat cellen gelijkmatig in de putten zijn verspreid en dat de samenvloeiing ~ 50% is. Als cellen zich niet binnen een bereik van 45% -55% confluentie bevinden, herhaal dan het 'Dag 1'-protocol en pas de initiële celconcentratie dienovereenkomstig aan.
- Genereer seriële verdunningen van de serummonsters van belang in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met behulp van voorverwarmde complete DMEM als verdunningsmiddel. Tabel 1 toont de generatie van een verdunningscascade voor drievoudige monsters.
- Om de test in drievoud uit te voeren, bereidt u een 7,5 x 106 vectorgenomen (vg)/μL werkoplossing van AAV6-hPLAP (zie Materiaaltabel) voor door een virusvoorraadoplossing in 1x PBS te verdunnen.
- Voeg 66 μL van de 7,5 x 106 vg/μL viruswerkoplossing toe aan elke buis met 264 μL serum/mediaverdunning (330 μL totaal volume/verdunning, zie tabel 1).
OPMERKING: Dit is een robuuste test die geen perfecte kweekomstandigheden vereist. Om echter nauwkeurig te kwantificeren en ervoor te zorgen dat elke testrun betrouwbaar is, is het noodzakelijk om het volgende op te nemen: (1) een virus- en mediacontrolecontrole, (2) een media-only controle en (3) een NAb-positief controlemonster op alle platen onder dezelfde experimentele omstandigheden. Het beschreven volume (330 μL) is goed voor drievoudige monsters +10% van het serum- en virusmengsel. Het uitvoeren van replicaties wordt ten zeerste aanbevolen voor de nauwkeurige bepaling van neutraliserende activiteit.
- Meng het virus/serum verdunningen door te pipetteren en plaats de buisjes met het virus/serummengsel in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten om mogelijke neutralisatie mogelijk te maken.
- Pipetteer 100 μL van het virus/serummengsel naar elke put op de 96-putplaat met 1 x 104 cellen/putje voor elke verdunning.
OPMERKING: Dit zal een uiteindelijke virale concentratie van 15k virussen / celmultipliciteit van infectie (MOI) in elke put genereren. Tabel 2 geeft een voorbeeld van een 96-put monsterplaatindeling voor het beoordelen van monsters tot een 1/512 verdunning. - Wikkel de 96-well plaat met cellen, serum en AAV-hPLAP in folie en plaats in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 16-24 uur om AAV toegang tot de cellen mogelijk te maken.
| Cascadelabel verdunning | Verdunning | 3 x monster (240 μL) + 10% buffervolume (24 μL) | Verhouding van serum:media |
| Verdunning 1 (D1) | 1/2 | 264 μL serum 264 μL media | 50:50 |
| Verdunning 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL media | 25:75 |
| Verdunning 3 (D3) | 1/8 | 264 μL D2 +264μL media | 12.5:87.5 |
| Verdunning 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL media | 6.25:93.75 |
| Verdunning 5 (D5) | 1/32 | 264 μL D4 +264 μL media | 3.13:96.87 |
| Verdunning 6 (D6) | 1/64 | 264 μL D5 +264 μL media | 1.56:98.44 |
| Verdunning 7 (D7) | 1/128 | 264 μL D5 +264 μL media | 0.78:99.22 |
| Verdunning 8 (D8) | 1/256 | 264 μL D5 +264 μL media | 0.39:99.61 |
| Verdunning 9 (D9) | 1/512 | 264 μL D7 + 264 μL media | 0.2:99.8 |
| Verdunning 10 (D10) | 1/2048 | 132 μL D8 + 396 μL media | 0.05:99.95 |
| Verdunning 11 (D11) | 1/8192 | 132 μL D9 + 396 μL media | 0.01:99.99 |
| Verdunning 12 (D12) | 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μL media | 0.003:99.997 |
Tabel 1: Volumes serum en verdunningsmiddel die nodig zijn om seriële verdunningen van serum in drievoud te genereren.
| Serummonster #1 | Serummonster #2 | Serummonster #3 | Mono AB (mAB), controles en extra monsters | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Een | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng MAb | 50 ng MAb | 50 ng MAb |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng MAb | 5 ng MAb | 5 ng MAb |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0,5 ng MAb | 0,5 ng MAb | 0,5 ng MAb |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MA (-C) | MA (-C) | MA (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Voorbeeld #1 1/512 | Voorbeeld #1 1/512 | Voorbeeld #1 1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Voorbeeld #2 1/512 | Voorbeeld #2 1/512 | Voorbeeld #2 1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Voorbeeld #3 1/512 | Voorbeeld #3 1/512 | Voorbeeld #3 1/512 |
Tabel 2: Voorbeeld 96-putplaatindeling voor het beoordelen van naïeve serummonsters in verdunningen variërend van 1/2 tot 1/512. Hogere verdunningen worden in de test opgenomen als een monster wordt beoordeeld waarvan bekend is dat het positief is voor AAV NAbs (monsters na toediening) of als een hogere titer vereist is. MO (-C): Controle alleen media. VO (+C): Virus en media controleren alleen. mAb: Monoklonaal antilichaam tegen AAV (NAb positieve controle).
4. Dag 3 - Fixeren en toevoegen van substraat aan de cellen
- Verwarm een aliquot van 1x PBS voor tot 37 °C (~25 ml/96-well plaat). Koel afzonderlijke aliquots van PBS (~ 25 ml / 96-well plaat) en dubbel gedestilleerde H2O (DDW, ~ 25 ml / 96-well plaat) tot 4 ° C. Los een pellet BCIP/NBT (zie Tabel met materialen) op in 10 ml DDW in een conische centrifugebuis van 50 ml door vortexing (10 ml is voldoende voor 2 x 96 putplaten).
- Zuig de media uit de putten van de 96-putplaat op met behulp van een serologische pipet of iets dergelijks dat is bevestigd aan een op zuiging gebaseerd aspiratiesysteem of zuurkastvacuüm. Plaats voorzichtig de punt van de serologische pipet in de put en verwijder de media en wees voorzichtig om de aangehechte cellen niet te verstoren.
- Voeg 50 μL RT 4% PFA toe aan elke put met behulp van een pipet. Wikkel de plaat in folie en laat het 10 minuten bij RT staan om de cellen te fixeren.
LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is waarschijnlijk carcinogeen en giftig door huid- of oogcontact of inademing. Handvat in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een mondkapje. Maak verse 4% PFA verdund in PBS (~ 7 ml vereist per 96-well plaat).
- Voeg 50 μL RT 4% PFA toe aan elke put met behulp van een pipet. Wikkel de plaat in folie en laat het 10 minuten bij RT staan om de cellen te fixeren.
- Was en aspirateer de cellen met 200 μL RT 1x PBS. Herhaal deze stap twee keer.
OPMERKING: Een meerkanaalspipet is een efficiënte optie voor de pipetteerstappen. - Pipetteer 200 μL voorverwarmd PBS in elke put, wikkel de plaat in folie en incubeer bij 65 °C gedurende 90 minuten om de endogene alkalische fosfatase-activiteit te denatureren30.
- Zuig putten en wascellen op met 200 μL koude (4 °C) PBS. Opnieuw aspirateren, 200 μl koude DDW inspoelen en opnieuw aspirateren.
- Pipetteer 50 μL van het opgeloste BCIP/NBT (bereid in stap 4.1) in elke put.
- Wikkel de plaat in folie en incubeer bij RT gedurende 2-24 uur.
OPMERKING: Wees consistent met de incubatietijd tussen runs; de tijdflexibiliteit stelt gebruikers in staat om putten te fotograferen op dag 3 of de volgende dag. - Maak met behulp van een lichtmicroscoopcamera foto's van elke put met behulp van een 4x objectieflens, zodat dezelfde belichting, witbalans en lichtinstellingen consistent worden gebruikt voor alle uitgevoerde tests.
- Plaats elke put identiek en zorg ervoor dat de randen van de put niet zichtbaar zijn op de foto's. Sla foto's op in TIF-indeling of iets dergelijks.
OPMERKING: Specifieke instellingen variëren tussen microscopen, maar kwantificering zal het meest effectief zijn als de achtergrondverlichting hoog en consistent is in de putten (figuur 1B).
- Plaats elke put identiek en zorg ervoor dat de randen van de put niet zichtbaar zijn op de foto's. Sla foto's op in TIF-indeling of iets dergelijks.
5. Kwantificering om de neutraliserende activiteit te bepalen met ImageJ
- Download en installeer de gratis beschikbare software "ImageJ" (zie Materiaaltabel).
- Open de te analyseren afbeelding in ImageJ door Bestand > Openen (Afbeelding 2) te selecteren.
- Als u gekleurde afbeeldingen gebruikt, converteert u deze naar grijswaarden door Afbeelding > Type > 8-bits te selecteren.
- Klik op Afbeelding > > drempel aanpassen. Pas de drempel aan totdat alle gekleurde gebieden rood zijn gekleurd, maar de achtergrond niet. Na toevoeging van NBT/BCIP zal het gekleurde product zich afzetten in het gebied rond de cellen dat hPLAP tot expressie brengt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om dezelfde drempelinstelling te gebruiken voor alle afbeeldingen die op dezelfde plaat zijn vastgelegd. - Klik op Analyseren > Metingen instellen en vink de selectievakjes Gebied, Beperken tot drempel, Gebiedsfractie en Label weergeven aan en klik op OK.
- Om de signaalaflezing (percentage van de kleuring) van een bepaalde put te bepalen, klikt u op Analyseren > meten. In de kolom '% Gebied' van het pop-upvenster wordt de signaallezing weergegeven.
- Voer kwantificering uit voor alle monsterreplicaties. Sluit verontreinigde putten, putten met een ongelijke celverdeling of putten die variëren in celdichtheid of verlichting uit.
OPMERKING: Zie aanvullende figuur 1 voor voorbeelden van putten die in aanmerking moeten worden genomen voor uitsluiting. Meestal kunnen 3-4 putten uitsluiting van een 96-putplaat vereisen. Figuur 2 geeft een visuele weergave van het kwantificeringsproces met behulp van ImageJ.
Figuur 2: Stappen voor het bepalen van de procentuele kleuring met behulp van ImageJ-software. (A) Open de afbeelding die moet worden geanalyseerd met ImageJ-software. (B) Converteer de afbeelding naar 8-bits grijswaarden. (C) Open het drempelvenster. (D) Pas de maximale drempel aan zodat alle gekleurde gebieden bedekt zijn, maar het achtergrondgebied niet (deze drempel moet consistent zijn over een hele plaat). (E) Selecteer de dropbox 'Analyseren', klik op 'Metingen instellen' en vink 'Gebied', 'Gebiedsfractie', 'Limietdrempel' en 'Weergavelabel' aan en klik op 'OK'. (F) Klik op "Maatregel" om het betrokken gebied te meten. Het gebied % geeft het deel van de afbeelding aan dat is gekleurd. Dit kan vervolgens worden gebruikt met de controlemonsters om de TI50-titer te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Bepaling van de titer transductieremming (TI50)
- Bepaal de gemiddelde uitlezing van replicaties (met behulp van de stappen die worden beschreven in stap 5) voor het volgende: (1) Alleen mediacontrole (basislijnsignaaluitlezing). (2) Virus + media alleen controle (maximale signaalaflezing). (3) Virus + serummonsters van belang.
- Bereken het remmingspercentage met behulp van de volgende formule:
100 - [(Signaaluitlezing van het testmonster (virus + interessant serummonster) - basislijnsignaaluitlezing (alleen mediacontrole)) / (maximale signaaluitlezing (alleen media en virus) - basislijnsignaaluitlezing) x 100] = % transductieremming13. - Bereken de % transductieremming van alle replicaties van elke verdunning voor alle monsters met behulp van de formule in punt 6.2. Bepaal de gemiddelde transductieremming tussen de technische replicaties voor elke verdunning voor alle monsters en controles.
- Bereken de 50% transductieremmingtiter (TI50-titer ) van een interessant monster door de laagste verdunning van het monster te bepalen die 50% of meer transductieremming van hPLAP-activiteit oplevert. Bijvoorbeeld, als een 1/8 verdunning van een monster meer dan 50% transductieremming heeft op basis van de berekening uitgevoerd in 6.2 (en een 1/4 verdunning niet), rapporteer de TI50-titer als 1/8.
7. Bepaling van geneutraliseerde AAV-deeltjes
- Bereken het aantal geneutraliseerde AAV-deeltjes per μL serum voor een bepaald monster met behulp van de volgende formule:
((MOI x celtelling/put) / (volume serum/verdunningsfactor van TI50 titer)) / 2 = geneutraliseerde AAV-deeltjes / μL serum9.
OPMERKING: Delen door 2 houdt rekening met de TI50 die 50% van de geneutraliseerde deeltjes meet. Voor een monster dat een TI50-titer van 1/4 (25% serum, 75% verdunningsmiddel) geeft waarin de test 80 μL onverdund serum en een MOI van 15k op 1 x 104 cellen gebruikte, zou de volgende berekening worden gebruikt: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3,75x106 geneutraliseerde deeltjes / μL serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transductietest om de optimale virale dosering voor plaatdekking vast te stellen
HT1080-cellen, een gevestigde fibrosarcoomcellijn, werden geselecteerd voor deze test. Een concentratie van 1 x 104 HT1080 cellen/put leverde ~50% celconfluentie in elke put van een 96-putplaat. Om de optimale virale concentratie voor de test te bepalen, werd een rAAV die codeert voor een hPLAP (human placental alkaline phosphatase) reporter gen (AAV6-hPLAP)31 toegevoegd in drievoud bij een reeks concentraties van vg bevattende deeltjes per cel (MOI: 0, 150, 500, 1500, 5000, 15000, 50000 & 150000 (Figuur 3A)). Een MOI van 15000 (1,5 x 108 vg/put) gaf 36% plaatkleuring en werd geselecteerd als de optimale virale dosering. Een positieve correlatie werd waargenomen tussen kleuring en virale concentraties voor alle MOI tussen 0 en 15000 (n = 6, r = 0,995, P<0,001). Deze concentratie gaf het reporter-gensignaal adequaat weer boven de achtergrond in aanwezigheid van hoge concentraties NAbs (lage plaatkleuring) zonder gevoeligheid te verliezen als gevolg van kleurverzadiging in afwezigheid van NAbs (hoge kleuring, figuur 3B).
De werkzaamheid van de test, bij blootstelling aan neutraliserende elementen, werd getest met behulp van seriële verdunningen van een anti-AAV6 muis monoklonaal antilichaam (mAb) in drievoud. De standaardbenadering van het gebruik van de eerste verdunning om 50% of meer transductieremming (TI50) weer te geven, werd toegepast om de neutraliserende titer van een bepaald monster te bepalen (stap 6). Bij beoordeling van log10-verdunningen vertoonde de anti-AAV6 mAb een TI50-titer van ~ 10 ng / ml (1 ng totaal mAb), terwijl een concentratie van 500 ng / ml (50 ng totaal Ab) en hoger volledig geremde reportergenexpressie (figuur 3C).
Figuur 3: Optimalisatie van de virale dosis en beoordeling van de werkzaamheid van de test tegen een anti-AAV6 monoklonaal antilichaam (mAB). (A) Het aandeel van de kleuring (% van het totale oppervlak) voor individuele putten bij verschillende multipliciteiten van infectie (MOI) en representatieve afbeeldingen (hieronder) die de overeenkomstige chromogene reactie weergeven tussen de alkalische fosfatase (hPLAP) en NBT/BCIP voor elke virale dosis (links). De procentuele plaatdekking wordt ook in tabelvorm weergegeven (rechts). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een technische replicatie (n = 3 replicaties per MOI). (B) Een weergave van de correlatie tussen kleuring en MOI is weergegeven in figuur 3A. De rode stippellijn vertegenwoordigt de hoogste geteste concentratie die de lineaire correlatie tussen kleuring en virale concentratie niet heeft beïnvloed. (C) Neutraliserende activiteit tegen AAV6 van een anti-AAV6 monoklonaal antilichaam bij log10 verdunningen. 50% remming van AAV6-transductie (TI50) wordt waargenomen bij een concentratie van ~ 10 ng / ml. n = 3 repliceren per verdunning. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Beoordeling van NAbs tegen AAV6 in schapenmonsters
Serum werd verzameld uit de halsslagader met behulp van een naald van 16 G (tip cut-off) en spuit van bewuste naïeve gezonde volwassen schapen (1,5-3-jarige Merino-ooien) (n = 11) en gescreend om de TI50-titer te bepalen met behulp van de colorimetrische NAb-test. Tweevoudige seriële verdunningen variërend van een 1/2 tot een 1/512 verdunning werden beoordeeld voor elk serummonster in tweevoud of drievoud. De 1/2 verdunning bevatte in totaal 40 μL serum, wat overeenkwam met een concentratie van 1,88 x 106 AAV-deeltjes per μL serum. De mate van AAV-neutralisatie varieerde binnen de naïeve steekproefpopulatie, met TI50-titerwaarden variërend van zo laag als 1/2 (blauwe lijn) tot zo hoog als 1/80 (groene lijn, 1,88 x 106 tot 7,5 x 107 geneutriseerde AAV-deeltjes / μL serum) (figuur 4A).
Vervolgens werd directe hartinjectie (n = 5) van AAV6 uitgevoerd in doses variërend tussen 5 x 1012 en 3 x 1013 vg bij naïeve schapen. Kortom, schapen werden verdoofd zoals eerder beschreven32. Het hart werd blootgesteld vanuit de linker zijwaartse positie. Het pericard werd geopend en AAV werd toegediend via 10-40 ~ 20 μL injecties in het linkerventrikel myocardium (anterieur) in het gebied rond de tweede tak van de linker voorste dalende kransslagader (LAD). Het hartzakje, de intercostale spier, het onderhuidse weefsel en de huid werden gesloten en het verdovingsmiddel werd verwijderd. Serum werd verzameld van alle dieren vóór en zes tot acht weken na toediening van AAV uit de voorgecannuleerde rechter halsader met behulp van een 16 G naaldafsnijding en spuit (~ 5 ml serum / dier). De colorimetrische NAb-test werd gebruikt om de verandering in NAb-titer na toediening van AAV6 te bepalen. Post-AAV serummonsters werden gescreend in drievoud als 2- tot 4-voudige seriële verdunningen variërend van een 1/2 tot een 1/32768 verdunning. Testresultaten gaven aan dat de AAV-remming TI50-titerwaarden vóór toediening van AAV varieerden van 1/4 tot 1/80 (3,75 x 106 tot 7,5 x 107 geneutraliseerde AAV-deeltjes / μL serum; Figuur 4B). Na AAV-hartinjectie werd een duidelijk en consistent contrast in de NAb-titer waargenomen in vergelijking met pre-AAV-serumtiters (figuur 4B, tabel 3). De laagste AAV-dosis (5 x1012 vg) vertoonde een TI50-titer van 1/2048 (blauwe stippellijn, 1,92 x 109 geneutraliseerde AAV-deeltjes/μL serum) en de rest van de doses (1-3 x 1013 vg) vertoonde TI50-titers variërend van 1/12000 tot >1/32768 (1,13 x1010 tot >3 x 1010 geneutriseerde AAV-deeltjes / μL serum).
Figuur 4: Voorbeeld van neutraliserende antilichaam (Nab) testresultaten met behulp van schapenserummonsters. (A) Adeno-Associated Virus (AAV) neutraliserende serummonsters werden verzameld van 11 naïeve schapen, gemeten in 2-voudige seriële verdunningen variërend van 1/2 tot 1/512. Gekleurde lijnen vertegenwoordigen monsters met een lage en hoge neutraliserende activiteit; grijze lijnen vertegenwoordigen de negen extra monsters. De stippellijn vertegenwoordigt 50% transductieremming (TI50) en de bijbehorende TI50-titers voor de lage (blauwe) en hoge (groene) representatieve monsters. (B) AAV-neutraliserende activiteit van serummonsters die bij vijf schapen zijn verzameld voor en na ontvangst van een dosis AAV via directe hartinjectie. Neutraliserende activiteit werd beoordeeld in 2-voudige seriële verdunningen variërend van 1/2 tot 1/32768. Elke kleur vertegenwoordigt serum van een ander dier, gevulde lijnen vertegenwoordigen pre-AAV-toediening en stippellijnen vertegenwoordigen post-AAV-toediening. n = 2-3 repliceren per verdunning voor elk monster. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Schapen ID | Beheerstatus | Ontvangen dosis (vg) | NAb Titer (TI50) | AAV geneutraliseerd / μL serum | Vouwwissel Pre vs. Post |
| Schapen 1 | Pre-AAV | 1x1013 | 1/5 | 5,6x106 | 6400 |
| Post -AAV | 1/32000 | 3x1010 | |||
| Schapen 2 | Pre-AAV | 1x1013 | 1/80 | 7,5x107 | 200 |
| Post -AAV | 1/16000 | 1,5x1010 | |||
| Schapen 3 | Pre-AAV | 5x1012 | 1/16 | 1,5x107 | 125 |
| Post -AAV | 1/2000 | 1,9x109 | |||
| Schapen 4 | Pre-AAV | 2x1013 | 1/4 | 3,8x106 | >10000 |
| Post -AAV | 1-> 32000 | >3x1010 | |||
| Schapen 5 | Pre-AAV | 3x1013 | 1/8 | 7,5x106 | 1700 |
| Post -AAV | 1/12000 | 2,3x1010 |
Tabel 3: Impact van AAV-blootstelling op neutraliserende activiteit. Neutraliserende activiteit voor schapen werd beoordeeld voor en na ontvangst van een directe hartinjectie van een rAAV6 in verschillende doses. De dosis vóór en na TI50-titers en de plooiverandering na toediening worden weergegeven.
Aanvullende figuur 1: Visuele voorbeelden van verschillende redenen om monsterputten uit te sluiten. (A) De aanwezigheid van besmetting kan worden gezien door klonten in het midden. (B) Hoge celdichtheid. (C) Ongelijke belichting van put (linker afbeelding), overeenkomstige drempeling van dezelfde put met overmatige dekking in de rechterbenedenhoek (rechter afbeelding). (D) Technische replicabeelden, waarbij de afbeelding aan de linkerkant resultaten met normale celdichtheid weergeeft, de afbeelding aan de rechterkant resultaten met een lage celdichtheid weergeeft. (E) Cellen zijn ongelijk verdeeld over een put. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Vereenvoudigde plasmidekaart met hPLAP-insert. CMV: Cytomegalovirus promotor. hPLAP: humane placenta alkalische fosfatase. SV40: Simian virus 40 polyadenylation signaal. ITR: Omgekeerde terminale herhalingssequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport beschrijft een colorimetrische test die de mate van AAV-neutralisatie in een bepaald serummonster beoordeelt door een chromogene reactie te evalueren die overeenkomt met de mate van in vitro virale transductie. De ontwikkeling van het protocol was gebaseerd op de bekende chromogene reactie tussen het enzym alkalische fosfatase en NBT/BCIP, die op grote schaal is gebruikt als kleuringsinstrument voor de detectie van eiwitdoelen in toepassingen zoals immunohistochemie en als een reportertool voor het evalueren van virale transductie24,33,34,35 . De verdienste komt voort uit de tijd en kosteneffectiviteit, toegankelijkheid, het gemak van opzetten en uitvoeren, terwijl het nog steeds een hoge mate van werkzaamheid aantoont. De rAAV6 die in deze test wordt gebruikt (AAV-hPLAP) draagt het reportergen human placentaal alkalische fosfatase (hPLAP) en wordt aangedreven door een cytomegalovirus (CMV) promotor34 (aanvullende figuur 2). NBT/BCIP is een hPLAP-substraat dat in eerste instantie wordt gedefosforyleerd door alkalische fosfatase en achtereenvolgens oxidatie ondergaat om een dimeer te vormen, wat resulteert in een onoplosbaar product dat een levendige paarse kleur heeft36.
Bij het selecteren van de optimale MOI voor deze test was het doel om een virale concentratie vast te stellen die het AAV reporter-gen voldoende tot expressie zou brengen door virus-celbinding, en in combinatie met het NBT / BCIP-substraat kleuring zou bieden binnen een bereik dat nauwkeurig kon worden gemeten. Een MOI van 15.000 werd geselecteerd, omdat het de hoogste geteste concentratie was die de lineaire correlatie tussen kleuring en virale concentratie niet beïnvloedde. Hogere concentraties (50.000 en 150.000 MOI) zorgden ervoor dat de concentratie-kleurresponscurve plateau werd, wat wijst op kleurverzadiging (figuur 3B). Beoordeling van virale MOI's tussen 0 en 15.000 (n = 6) en hun overeenkomstige kleuringsniveau resulteerde in r = 0,995 (P < 0,001), waarbij de gevoeligheid van de test werd gevalideerd door een zeer sterke positieve correlatie vast te stellen tussen virale concentratie en reporter-gengestuurde kleuring. Gezien de potentiële variabiliteit in factoren zoals celkweekomstandigheden, laboratoriumtechnici, technieken en apparatuur, evenals variaties in virale batches, wordt aanbevolen dat elke nieuwe gebruiker een voorlopige proefbeoordeling van de optimale MOI uitvoert bij het vaststellen van een NAb-test.
De MOI die voor een bepaalde NAb-test is gekozen, is een belangrijke bijdragende factor in de totale titer die wordt waargenomen voor een bepaald serummonster. Als een MOI van 5.000 in plaats van 15.000 was geselecteerd, zou een 3-voudig verschil in titerwaarde worden verwacht. Dit is historisch problematisch geweest op het gebied van AAV-gentherapie, omdat verschillende preklinische en klinische onderzoeken AAV NAb-assays hebben geïmplementeerd met MOI-waarden variërend van minder dan 1.000 tot zo hoog als 25.00037, wat betekent dat elke vorm van cross-study vergelijking van NAb-titers voor een bepaald AAV-serotype van weinig tot geen waarde is. Onlangs is gesuggereerd dat het rapporteren van titers als geneutraliseerde AAV-deeltjes per μL serum meer vergelijkbare waarden kan opleveren in verschillende onderzoeken9,38. Tal van andere factoren kunnen bijdragen aan variatie in titers tussen studies, zoals de keuze van de cellijn, reportergen, incubatietijden en kweekomstandigheden. Om de standaardisatie van AAV NAb-assays te vergemakkelijken, zijn zowel de titerwaarden als geneutraliseerde AAV-deeltjes / μL serum gerapporteerd.
Het is essentieel om op elke plaat een seriële verdunning van een bekend NAb-monster op te nemen om zowel als een positieve controle als een gemeenschappelijk monster tussen platen te fungeren. Dit is belangrijk om eventuele variabiliteit tussen afzonderlijke runs te identificeren. Een neutraliserend monoklonaal antilichaam tegen de AAV van belang is een ideale positieve controle en standaard, maar een serummonster dat positief is voor NAbs is ook acceptabel. De werkzaamheid van de test werd gevalideerd door aan te tonen dat een monoklonaal antilichaam specifiek voor intacte AAV6-deeltjes (ADK6) de transductie kwantitatief kan remmen op een concentratieafhankelijke manier.
Op basis van de materiaalfiche van de fabrikant produceert het BCIP/NBT-substraatsysteem het onoplosbare blauwpaarse product binnen ~ 10 minuten en is het zeer stabiel. Er wordt echter opgemerkt dat procedures de lengte van de incubatietijd kunnen beïnvloeden. Op basis van eerdere rapporten zijn tijdframes van 1-24 uur gebruikt30,39. Voor deze test moeten de incubatietijden consistent zijn tussen de runs. De tijdflexibiliteit stelt gebruikers in staat om putten te fotograferen op dag 3 van het protocol of de volgende dag.
Preklinische proeven met grote diermodellen vormen een cruciale opstap tussen het laboratorium en de kliniek vanwege de fysiologische gelijkenis die dieren zoals schapen en varkens delen met mensen1,40,41. Historisch gezien hebben de meeste kandidaat-AAV-gentherapieën die klinische proeven hebben gehaald, voorbereidende proeven ondergaan bij grote dieren1. Meerdere studies hebben aangetoond dat zowel mensen als een reeks grote dieren, waaronder schapen, varkens, honden, konijnen en niet-menselijke primaten, neutraliserende antilichamen tegen AAV6 en vele andere AAV-serotypen kunnen herbergen42,43. Dit benadrukt het belang van voorlopige screening voor NAbs vóór proeven in zowel grote diermodellen als mensen. De NAb-status van serummonsters van schapen waarvan niet eerder bekend was dat ze aan AAV waren blootgesteld, werd beoordeeld, waarvan 10 van de 11 TI50-titers vertoonden <1/30 (<3 x 107 geneutraliseerde AAV-deeltjes / μL serum). Daarentegen vertoonde men een TI50-titer van 1/80 (7,5 x 107 geneutraliseerde AAV-deeltjes / μL serum). Vijf van de schapen kregen een directe hartspierinjectie met rAAV. Van alle monsters veranderde toediening van AAV de neutraliserende activiteit drastisch, met een toename van de vouwverandering, variërend van 125 tot een > 10.000 keer in TI50-titerwaarden tussen pre- en post-AAV-blootstelling (tabel 3). Van belang is dat de laagste toegediende AAV6-dosis (5 x 1012 vg) overeenkwam met de laagste post-AAV TI50-titerwaarde (TI50-titer 1/2000) en de toename van de vouwverandering (125-voudige). Ter vergelijking: er werd geen duidelijk bewijs van reeds bestaande NAbs bij de 11 naïeve schapen waargenomen bij niveaus die AAV-transductie zouden voorkomen (alle TI50-titerwaarden <1/100). Gegevens van de 5 schapen die een directe AAV-injectie kregen, zouden suggereren dat een cut-off voor NAb-positiviteit >1/1000 zou zijn (gebaseerd op pre- en post-AAV-waarden). Het grote verschil tussen de pre- en post-NAb-titer en het vermogen om titers te detecteren >1/32.000 zorgt voor verdere validatie van de werkzaamheid en gevoeligheid van de test. Het vaststellen van een snijpunt waarop een monster als positief wordt beschouwd voor neutraliserende activiteit is een essentiële volgende stap bij het bepalen van een drempel voor NAb-positieve dieren. Dit kan worden bepaald door de variabiliteit in een groep (~n ≥ 30) van naïeve steekproeven uit een specifieke populatie van belang te beoordelen. Dit maakt het mogelijk om criteria vast te stellen om een statistisch afgeleid snijpunt te kiezen waarin een steekproef positief wordt geacht voor neutraliserende activiteit. Als alternatief kunnen positieve controlemonsters van dieren zowel vóór als na AAV-toediening, zoals weergegeven in figuur 4B, het positieve titerbereik voor neutraliserende activiteit aangeven. Aanbevelingen met betrekking tot het vaststellen van cut-point drempels en validatie en optimalisatie van in vitro neutraliserende assays zijn uitgebreid beschreven in de literatuur44,45,46,47.
De techniek brengt bepaalde beperkingen met zich mee. Het gebruik van de microscoopcamera om putten in beeld te brengen is nuttig omdat het beelden van zeer hoge kwaliteit biedt die de mate van neutralisatie nauwkeurig kunnen onderscheiden. Microscopie kan echter arbeidsintensief zijn en is mogelijk niet praktisch als er veel (>100) monsters worden verwerkt. Een flatbed- of plaatscanner met hoge resolutie kan een snellere benadering bieden voor het in beeld brengen van de putten als de kwaliteit en belichting van beelden kan worden gehandhaafd. Van hoge MOI's is gemeld dat ze de gevoeligheid voor assaydetectie verminderen. Er is gesuggereerd dat hoge AAV-doses neutraliserende activiteit kunnen ontwijken of dat AAV-transductie kan optreden in aanwezigheid van NAbs48,49,50. Deze test maakt gebruik van een matig hoge MOI (15.000); de gevoeligheid lijkt echter niet te worden belemmerd, omdat deze neutraliserende activiteit bij zeer hoge verdunningen (>1:32.000) kan detecteren (figuur 4B). Ten slotte, aangezien deze test een virale vector gebruikt, is over het algemeen de juiste goedkeuring door een bestuursorgaan vereist om recombinant AAV te gebruiken; dit zal van land tot land verschillen.
Samenvattend biedt deze in vitro test een snelle, kosteneffectieve, gemakkelijk toegankelijke en eenvoudige methode om de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen tegen rAAV6 te detecteren. Deze test kan worden aangepast en geoptimaliseerd om relatief gemakkelijk te presteren met verschillende AAV-serotypen. De AAV6-hPLAP-vector kan op verzoek voor deze test worden geleverd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door een National Health and Medical Research Council Project Grant aan JRM en CJT (ID 1163732) en gedeeltelijk door het Operational Infrastructure Support Program van de Victoriaanse overheid. SB wordt ondersteund door een gezamenlijke Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW wordt ondersteund door The Shine On Foundation en een Future Leader Fellowship van de National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM wordt ondersteund door een National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
| 75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
| 96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
| Aluminium foil | |||
| Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| Cell and tissue culture safety cabinet | |||
| Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Haemocytometer | |||
| High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 cells | ATCC | ||
| ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
| Oven | For a 65 °C incubation | ||
| Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | |||
| Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
| Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
| Water bath |
References
- Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
- Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
- Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
- Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
- Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
- Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
- Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
- Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
- Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
- Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
- Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
- Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
- Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
- Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
- Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
- Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
- Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
- Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
- Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
- Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
- National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
- Journal of Visualized Experiments.
- AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
- Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
- Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
- Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
- Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
- Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
- Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
- Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
- Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
- Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
- Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
- Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
- Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
- Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
- Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
- Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
- Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
- Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
- U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
- Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
- Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
- Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).
