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Summary
双向有丝分裂激肽-5 Cin8积聚在运动过程中分裂和合并的簇中。团簇中的积累也会改变Cin8的速度和方向性。在这里，描述了使用纯化的Cin8-GFP进行运动性测定的方案以及Cin8的单分子和簇的运动特性分析。
Abstract
有丝分裂双极驱动蛋白-5电机在主轴动力学中执行基本功能。这些电机表现出同四聚体结构，具有两对催化运动域，位于活性复合物的两端。这种独特的架构使 kinesin-5 电机能够交联并滑动分离反平行主轴微管 （MT），从而提供将主轴极分开的向外力。以前，Kinesin-5电机被认为是完全正端定向的。然而，最近的研究表明，几种真菌运动蛋白-5电机在单分子水平上是负端的，并且可以在各种实验条件下切换方向性。酿酒 酵母驱动 蛋白-5 Cin8是这种双向运动蛋白的一个例子：在高离子强度条件下，Cin8的单分子在MT的负端方向上移动。还表明，Cin8形成运动团簇，主要在MT的负端，这种聚类允许Cin8切换方向性并经历缓慢的正端定向运动。本文提供了使用GFP标记的激动蛋白-5 Cin8的所有步骤的详细方案，从 酿酒酵母 细胞中的蛋白质过表达及其纯化到 体外 单分子运动性测定。这里描述的新开发的方法有助于根据其荧光强度区分Cin8的单分子和簇。该方法能够单独分析Cin8的单分子和簇的运动性，从而提供Cin8运动性对其簇大小的依赖性的表征。
Introduction
真核细胞内的大量运动事件是由分子运动蛋白的功能介导的。这些电机沿着细胞骨架丝，肌动蛋白丝和微管（MT）移动，并将ATP水解的化学能转化为驱动细胞内生物运动所需的动能和机械力。基于MT的 酿酒 酵母Cin8是一种双极性，同源异构体驱动蛋白-5运动蛋白，可交联并将纺锤体MT分开滑动1。Cin8在有丝分裂期间，在主轴组件2，3，4 和主轴伸长期间在分析期5，6，7中执行基本功能。此前已经证明Cin8是一种双向电机，它在不同的实验条件下切换方向性。例如，在高离子强度条件下，单个Cin8电机向MT的负端移动，而在集群中，在多电机MT滑动测定中，以及在反平行MT之间，Cin8电机主要向MT的正端移动8，9，10，11，12.由于几个原因，这些发现非常出乎意料。首先，Cin8在氨基末端携带其催化运动域，并且这种运动以前被认为是完全正端定向的，而Cin8被证明是单分子水平的负端定向。其次，运动蛋白电机被认为是单向的，要么是负端的，要么是正端定向的，而Cin8被证明是双向的，这取决于实验条件。最后，由于有丝分裂主轴处的MT方向，kinesin-5电机在主轴组装过程中主轴极分离中的经典作用以及相B只能通过其交联1，13的MT上的正端定向运动来解释。在关于Cin8双向性的第一次报告之后，其他一些运动蛋白电机被证明是双向的14，15，16，这表明运动蛋白电机的双向运动性可能比以前认为的更常见。
以前报道过，在细胞中，Cin8也以双向方式移动8，支持某些运动蛋白-5运动的双向运动对其细胞内功能很重要的观点。此外，由于据报道是双向的三个激肽-5电机来自真菌细胞，因此最近已经提出了激肽-5电机的双向性的可能作用在这样的细胞10中。根据该模型，在真菌细胞的闭合有丝分裂中，核包膜在有丝分裂期间不会分解，kinesin-5电机提供初始力，在主轴组装之前将纺锤体极分开。为了执行此任务，在主轴极分离之前，kinesin-5电机通过它们在单个核MT上的负端定向运动定位在主轴极附近。一旦到达此位置，kinesin-5电机就会从相邻的主轴极聚集，切换方向性，捕获和交联MT。随后，kinesin-5电机通过它们交联的MT上的正端定向运动来提供极的初始分离。通过该模型，真菌运动蛋白-5电机在主轴组件1，13中需要单个MT上的负端定向运动和交联MT上的正端定向运动。
所述方法的总体目标是获得高纯度真菌GFP标记的驱动蛋白-5 Cin8并进行单分子运动性测定（图1），同时分别分析Cin8的单分子和簇的运动性。单分子和团簇之间的分离很重要，因为已经证明影响Cin8方向性的因素之一是它在MTS10，12上簇的积累。替代运动性测定，例如MT表面滑动和MT滑动测定不提供有关单个运动蛋白活性的信息17，18。这里描述的稳健的单分子运动性测定和分析方法已成功应用于表征激酶-5马达，Cin8和Kip110，11，12，14，19，20的不同方面。
在这里，提出了Cin8过表达和纯化，MT聚合以及单分子运动性测定的详细方案。此外，还描述了区分Cin8的单分子和团簇的分析，以及通过平均位移（MD）和均方位移（MSD）分析确定单电机和团簇速度的分析。该协议旨在帮助研究人员可视化程序的所有步骤，并协助对此类测定进行故障排除。
图1：单分子运动性测定的示意图。 生物素化荧光MTs附着在玻璃表面，涂有与表面附着的生物素BSA相互作用的亲和素。绿色箭头表示单个Cin8分子在高离子强度条件下的运动方向。+/- 表示 MT 的极性 ，请单击此处查看此图的放大版本。
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Protocol
1. 缓冲液和试剂的制备
- 缓冲区
- -Leu aa 滴出混合物：混合 2 克腺嘌呤、尿嘧啶、色氨酸、组氨酸、赖氨酸和蛋氨酸，并在室温下储存。
- 酵母选择性培养基与棉子糖（1L）：通过搅拌（不加热）将6.7g酵母氮碱（与硫酸铵），2g-Leu aa滴出混合物和20g棉元糖在双蒸馏水中混合，直到完全溶解。使用0.22μm过滤器，将溶液过滤到无菌瓶中。
- 裂解缓冲液：在三重蒸馏水（TDW）中制备25 mL溶液，该蒸馏水由50 mM Tris，30 mM管，500 mM KCl，10%甘油，1.5mM β巯基乙醇，1 mM MgCl2，0.1 mM ATP和0.1%Triton X-100组成。使用6 M HCl将pH调节至8。
- 洗脱缓冲液：在TDW中制备10 mL溶液，包括50 mM Tris，30 mM管，500 mM KCl，350 mM咪唑，10%甘油，1.5mM β巯基乙醇，1 mM MgCl2，0.1 mM ATP和0.1%Triton X-100。使用6 M HCl将pH调节至7.2。
- P12缓冲液：在TDW中制备10 mL溶液，由12 mM管道，1 mM EGTA和2 mM MgCl2组成。使用10 M NaOH将pH调节至6.9。
- BRB80缓冲液：在超纯水中制备50 mL由80 mM管，1 mM EGTA和2 mM MgCl2 组成的溶液。使用10 M NaOH将pH调节至6.9。
- 普通微管蛋白缓冲液（GTB）：在超纯水中制备50 mL由80 mM管，0.5 mM EGTA和2 mM MgCl2 组成的溶液。使用10 M NaOH将pH调节至6.9。
- Tris-Pipes溶液：通过在TDW中混合6.055 g Tris和9.07 g Pipes来制备40 mL的1M Tris-0.6 M管道溶液，并使用6 M HCl将pH调节至7.2，用TDW将最终体积提高到50 mL。
注意：P12、BRB80 和 Tris-Pipes 缓冲液用于制备用于动力测定的储备溶液。这些缓冲液可以大量制备，在1.5mL管中等分，快速冷冻并储存在-20°C。
- 动力测定的储备溶液
- 微管蛋白（10mg mL-1）：将1mg冻干微管蛋白溶解在100μL冷（4°C）普通微管蛋白缓冲液（GTB）中。速冻1μL等分试样并将其储存在-80°C。
- 生物素化微管蛋白（1mg mL-1）：将20μg冻干微管蛋白溶解在20μL冷GTB中。速冻1μL等分试样并将其储存在-80°C。
- 罗丹明标记的微管蛋白（1mg mL-1）：将20μg冻干微管蛋白溶解在20μL冷GTB中。快速冷冻0.5μL等分试样并将其储存在-80°C。
- GMPCPP（10μM）：GMPCPP以100μL水溶液的形式从供应商处获得，并储存在-80°C。 在冰上用GMPCPP解冻小瓶。准备1μL等分试样，速冻并将其储存在-80°C。
- ATP：在0.5 M Tris缓冲液（pH 8）中制备500μL 100mM ATP溶液。快速冷冻2μL等分试样并将其储存在-20°C。
- MgCl2：在P12缓冲液中制备1 mL200 mM MgCl 2溶液。将5μL等分试样储存在-20°C。
- 酪蛋白：在BRB 80缓冲液中制备1mL溶液5mgmL-1酪蛋白。快速冷冻10μL等分试样并将其储存在-20°C。
- D-葡萄糖：在P12缓冲液中制备1mL 1M D-葡萄糖溶液。将10μL等分试样储存在-20°C。
- 葡萄糖氧化酶：在P12缓冲液中制备1 mL 10mg mL葡萄糖 氧化酶溶液。快速冷冻2μL等分试样并将其储存在-20°C。
- 过氧化氢酶：在P12缓冲液中制备1mL 0.8mg mL-1 过氧化氢酶溶液。速冻2μL等分试样并储存在-20°C。
- 二硫舒糖醇（DTT）：在通风橱中的P12缓冲液中制备1mL的1M DTT溶液。快速冷冻10μL等分试样并将其储存在-20°C。
- 磷酸肌酸：在P12缓冲液中制备1 mL磷酸肌酸溶液。快速冷冻2μL等分试样并将其储存在-20°C。
- 肌酸磷酸激酶：在0.25 M甘基甘氨酸中制备1mL溶液，5mg mL-1 肌酸磷酸激酶，pH 7.4。快速冷冻2μL等分试样并将其储存在-20°C。
- EGTA：在超纯水中制备100 mM EGTA溶液，并将其储存在室温下。
- KCl：在超纯水中制备1 M KCl溶液，并在室温下储存。
- 动力缓冲液和反应混合物
- 含有145 mM KCl的动力缓冲液（MB），2x储备液：通过混合100μL预制Tris-Pipes溶液，20μL 100mM EGTA，290μLKCl和590μLTDW，制备1mL的2x动力缓冲液储备。将缓冲液保持在冰上。
- 动力反应混合物：根据 表1 制备运动反应混合物并储存在冰上。
| 卷 | 股票 | 试剂名称 |
| 50 微升 | 2 倍 | MB（从步骤 1.3.1 开始） |
| 40 微升 | - | 断续器 |
| 1 μL | 100 毫米 | 断续器 |
| 1 μL | 200 毫米 | 氯化镁2 |
| 2 μL | 5毫克/毫升 | 酪蛋白 |
| 1 μL | 1 米 | 葡萄糖 |
| 1 μL | 1 米 | 断续器 |
| 1 μL | 10毫克/毫升 | 葡糖氧化酶 |
| 1 μL | 8毫克/毫升 | 过氧化氢酶 |
| 1 μL | 1 米 | 磷酸肌酸 |
| 1 μL | 5毫克/毫升 | 肌酸磷酸激酶 |
| 100 微升 | 总 |
表 1.
2. 酿酒酵母细胞中Cin8过表达和纯化
- 在1L酵母选择性培养基中生长用于过表达Cin8-GFP-6的质粒的酿酒酵母细胞在28°C下（参见步骤1.1.2）的1L酵母选择性培养基中达到指数生长期（OD 600 = 0.6-0.8）。
- 通过加入2%半乳糖诱导Cin8-GFP-6过表达。通过测量600nm处的吸光度来监测酵母培养物的生长。
- 半乳糖加入后5小时，通过在4°C下以4，000× g 离心15分钟收获细胞，将细胞悬浮在裂解缓冲液中并在液体N2中冷冻。
注意：冷冻细胞可以在-80°C下储存以备进一步使用或立即在液体N2中研磨。 - 使用冷却的研钵和研杵在液体N2 中研磨冷冻细胞。在研磨过程中加入液体N2 以保持提取物冻结。通常需要4-5倍的加入液体N2。
- 通过在相差或DIC显微镜下观察来监测细胞裂解。
- 解冻研磨细胞并在4°C下以21，000× g 离心30分钟。 将上清液加载到装有2 mL Ni-NTA的重力流柱上，并用裂解缓冲液预平衡。让上清液流出柱子。
- 用五列体积的裂解缓冲液洗涤色谱柱，然后用五柱体积的裂解缓冲液补充25mM咪唑。
- 用洗脱缓冲液洗脱Cin8-GFP-6（见步骤1.1.4）。
- 通过SDS-PAGE分馏分析洗脱的样品，然后用α-GFP抗体19探测考马斯蓝色染色和蛋白质印迹分析。
- 将含有Cin8-GFP-6His的馏分混合在一起（步骤2.8和2.9）。此外，通过尺寸排阻色谱（SEC）在0.5 mL min-1 的流速和1.5 MPa的柱压极限下纯化它们，同时监测280nm处的吸光度和GFP荧光发射，并在488nm处激发（图2A）。
- 收集与Cin8-GFP四聚体相对应的馏分，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析它们（见步骤2.9）（图2B）。
- 使用分光光度法或生化测定（如布拉德福德测定，BCA测定等）估计蛋白质浓度。
- 等分所选级分，在液体N 2中速冻， 并储存至在-80°C下使用。 这些纯化的蛋白质样品可以使用6个月。
注意：Cin8-GFP从蛋白酶缺乏的酿酒酵母菌株中过度表达和纯化，该菌株含有2μm质粒，用于Cin8-GFP-6他从半乳糖诱导启动子LGY 4093：MATα，Leu2-3，112，reg-1-501，ura3-52，pep4-3，prb1-1122，gal1，pOS7（2μ，LEU2，PGAL1-CIN8-GFP-6HIS）中过表达。酵母菌株和质粒可根据要求提供。
图2：Cin8-GFP的纯化。 （A）Ni-NTA纯化的Cin8-GFP的尺寸排阻色谱图，通过488 nm激发和在〜510 nm处发射连续GFP荧光检测。Cin8-GFP四聚体在~10 mL时从SEC色谱柱中洗脱出来（用箭头标记）。（B）从SEC洗脱的Cin8-GFP级分的考马斯染色SDS-PAGE凝胶（顶部）和α-GFP蛋白质印迹（底部），泳道中的样品如下：M - 分子量标记物，Ni2 + - Ni-NTA纯化的Cin8-GFP样品，将其加载到SEC柱中，GF级分：对应于图 A中标记的Cin8-GFP SEC洗脱的分数。右边的箭头标记了Cin8-GFP单体的大小（预计在SDS-PAGE上）。 请点击此处查看此图的大图。
3.使用纯化的Cin8进行单分子运动性测定
- 生物素和罗丹明标记的MT的聚合，用GMPCPP稳定。
- 通过在1.5 mL管中混合以下组分来开始MT聚合：1 μL 10 mg / mL微管蛋白，1 μL 1 mg / mL生物素化微管蛋白，0.5μL 1 mg / mL罗丹明标记微管蛋白，1μL 10 mM GMPCPP和6.5μL普通微管蛋白缓冲液（GTB）。将混合物在37°C下孵育1小时。
- MT聚合后，加入80μL温（37°C）GTB，小心混合并以16，500× g 离心20分钟。
- 弃去上清液，并通过用50μL温热的GTB上下移液来小心地重新悬浮沉淀。将悬浮液储存在28°C。
- 使用647nm罗丹明通道用荧光显微镜检查MT（图3A）。
注意：为了获得生物素化荧光标记的MT，聚合反应含有未标记的微管蛋白，以及生物素化和荧光标记的微管蛋白。在该方案中，使用罗丹明标记的微管蛋白，但也可使用其他荧光偶联物。
- 流动室组件
- 通过在先进的胶载玻片上放置四条双面胶带（~4 cm x ~3 mm）（平行于较长的边缘，相距约3-4 mm）来组装流动室，以在胶带条之间形成三个“通道”。从胶带条上取下保护纸，并在胶带条上放置硅烷化的盖玻片10 ，以形成三个体积约为10μL的流动室。
- MT固定到亲和素涂层表面（图1）
- 通过使用微量移液管将15μL1mg / mL生物素化牛血清白蛋白（b-BSA，溶解在GTB中）注入流动室来涂覆硅烷化的盖玻片。5分钟后，用80μL GTB洗涤腔室。
- 随后，如步骤3.3.1所示，将15μL的1mg / mL亲和素（溶解在GTB中）插入到与b-BSA结合的流动室中。5分钟后，用80μL GTB洗涤腔室。
- 使用20μL1%泊洛沙姆钝化盖玻片表面。3分钟后，用80μL GTB洗涤。
- 通过插入20μL在GTB中通常稀释至1：20的MT，将生物素化的MT（步骤3.1）附着到b-BSA-亲和素包被盖玻片上。将载玻片在倒置位置孵育，即盖玻片在黑暗湿度室（例如，含有湿纸巾的培养皿）中朝下5分钟。然后，用200μLGTB洗涤。
- 将30μL动力反应混合物（见步骤1.3.2）施加到流动室中。
- 将Cin8-GFP马达（步骤2.13）稀释在20μL动力反应混合物中（见 表1）（通常为终浓度为5-10μM）。将它们应用于流动室，并立即成像电机沿MT的运动。
- 运动运动成像
注：使用配备汞弧灯、100x/1.4数值孔径物镜和两个荧光带通滤光片组（一个波长为647 nm（罗丹明）和另一个波长为488 nm（GFP）的落射荧光倒置显微镜监测MT结合和电机的运动性。- 将一滴浸油放在显微镜物镜上。将流动室放在荧光显微镜载物台上，盖玻片朝下面向物镜。
- 打开罗丹明通道以聚焦附着在盖玻片表面的MT上，并使用Micro-Manager ImageJ-Fiji软件21以20毫秒的曝光获取图像。
- 打开GFP通道，以1秒的间隔和800毫秒的曝光获取90张延时图像，以分析Cin8-GFP运动性。
图3：MT和MT结合的Cin8-GFP.（A）来自两个场（左和右）的MT的图像按照步骤3.1中描述的方案聚合，并按照步骤3.4中所述用100x物镜成像。（B） 来自两个字段（左和右）的Cin8-GFP（下面板，用箭头标记）的图像，这些图像连接到上部面板中显示的MT。比例尺：4 μm。请点击此处查看此图的大图。
4. 运动性分析
注意：使用ImageJ-Fiji软件执行所有图像分析并生成kymographs。
- 一代诊断器
- 打开延时短片和相应的 MT 场图像。通过选择以下选项来同步这两个窗口： “分析>工具”>同步窗口”。
- 使用 分段线 选项突出显示一个 MT，并使用 “分析>多 Kymograph ”选项卡获取kymograph。
- Cin8-GFP簇大小的测定（即簇中Cin8分子的数量）
- 通过使用“处理>减去背景”选项执行 背景减 法和对不均匀照明的校正。将 滚动球半径 设置为 100 像素，然后选中 滑动抛物面 选项。
- 使用ImageJ-Fiji软件的TrackMate插件，通过选择以下选项，跟踪特定非运动Cin8-GFP电机（图3B）的平均荧光强度作为4像素半径圆内时间的函数： 插件>跟踪>TrackMate>LoG检测器>简单的圈速跟踪器。
- 对不同的Cin8-GFP电机重复步骤4.2.2。绘制不同Cin8-GFP电机的荧光强度作为时间的函数。
注意：测量簇大小的实验策略 - 即簇中Cin8分子的数量 - 为分析Cin8聚类相关运动性奠定了基础。附着在Cin8上的GFP的光漂白用于确定单个GFP分子对Cin8簇总强度的贡献。例如，荧光强度以约50个任意单位（a.u.）的步长降低，每个步骤可能代表一个GFP分子的光漂白（图4A）。由于Cin8是一种同聚体运动蛋白，因此它含有四个GFP分子。因此，所有强度≤200 a.u.的Cin8电机都可能是单个四聚体Cin8分子。按照该方法，将单个Cin8分子，Cin8分子对（Cin8四聚体的二聚体）和Cin8低聚物的Cin8运动荧光的强度范围分别分配为<200，200-400和>400。
- Cin8-GFP电机的强度分布分析
- 使用ImageJ-Fiji中的TrackMate插件测量延时序列第一帧中所有荧光Cin8-GFP电机的平均荧光强度，如步骤4.2.2中所述。
- 绘制Cin8-GFP平均强度的直方图，条柱大小为20 a.u.，并将直方图的主峰拟合到高斯曲线（图4B）。
注意：强度分布分析补充了光漂白实验中Cin8-GFP电机的簇尺寸测定。Cin8-GFP群体的强度分布直方图的高斯曲线在~125 a.u.处达到峰值，这与含有一个，两个，三个或四个荧光（非漂白）GFP分子的单个四聚体Cin8分子的平均强度一致，每个荧光GFP分子贡献约50 a.u。因此，使用这种强度分布方法，还可以计算一个GFP分子的贡献，这可以进一步用于分配Cin8-GFP分子的簇大小。
图4：Cin8-GFP漂白曲线和强度分布。 （A）GFP在四种不同的Cin8-GFP电机中的光漂白。单个光漂白步骤，每个步骤可能代表一个GFP的光漂白，导致荧光强度下降〜50 a.u.（B）Cin8-GFP电机在延时序列的第一帧中的强度分布（插图）。以~125 a.u为中心的高斯峰（蓝色）代表单个Cin8-GFP分子。该峰表现出具有一个，两个，三个或四个荧光GFP分子的单个Cin8四聚体的平均强度，每个GFP分子对总强度的贡献约为50 a.u.（即（50 + 100 + 150 + 200）/ 4 = 125）。 请点击此处查看此图的大图。
- 沿 MT 轨迹跟踪 Cin8-GFP 分子的运动性
- 裁剪要在录制帧的延时序列中分析的机器翻译，方法是使用 矩形 工具高亮显示该 机器翻译，然后选择“图像>裁剪”。
- 选择荧光Cin8-GFP颗粒进行分析。使用点工具和测量选项记录延时序列的每个帧（时间点）中的粒子坐标。对延时序列中其他荧光粒子的坐标进行类似的记录。
- 如步骤4.2中所述，在其外观的第一帧中为所有检查的Cin8-GFP颗粒分配簇大小。
- 平均位移 （MD） 和均方位移 （MSD） 分析
- 根据步骤4.4中确定的Cin8-GFP运动的坐标，计算每个时间点相对于初始坐标的Cin8-GFP位移，使用公式计算给定坐标下两点之间的距离：
其中，dt 是 Cin8-GFP 在时间 t 的位移，xt 和 yt 是时间 t 的相应坐标，x0 和 y0 是 Cin8-GFP 在 t = 0 时的相应坐标。 - 根据这些位移值计算特定Cin8-GFP颗粒的所有可能时间间隔的位移。对所有检查的Cin8-GFP颗粒重复该过程。
- 绘制所有检查的Cin8-GFP颗粒的平均位移（MD）与时间间隔的关系，并受线性拟合，MD = v x t + c。该拟合（v）的斜率表示运动Cin8-GFP粒子的平均速度。
注意：通过这种方式，可以单独计算属于每个簇大小的所有Cin8-GFP分子的平均速度，以表征不同簇大小的运动性。除了 MD 分析之外，还可以通过将步骤 4.5.1 和 4.5.2 中计算的位移值平方来执行均方位移 （MSD） 分析。绘制 MSD 值与时间间隔的关系，并拟合到多项式曲线 MSD = v2 x t2 + 2D x t + c，给出附加参数 D，即 Cin8-GFP 运动的扩散系数。MD分析应在极性标记为MTs 8，10上进行，而对于MSD分析，不需要MT极性知识。
- 根据步骤4.4中确定的Cin8-GFP运动的坐标，计算每个时间点相对于初始坐标的Cin8-GFP位移，使用公式计算给定坐标下两点之间的距离：
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Representative Results
该实验旨在研究不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单个MT上的运动特性.从 图5A中的Kymographs也可以看出Cin8-GFP的代表运动性，其中显示了运动随时间变化的空间位置。
为了分析Cin8-GFP的运动特性，首先，将簇大小（步骤4.3）分配给每个MT附着的运动Cin8-GFP颗粒，然后跟踪被检查的Cin8颗粒的位置作为时间的函数（步骤4.4）。对于每个聚类大小类别，从记录中提取单个Cin8-GFP的>40轨迹（图5B）。使用从跟踪分析获得的坐标，分别对每个聚类大小总体执行 MD 和 MSD 分析。速度是从线性拟合到MD获得的，如图 5C所示。发现单个Cin8-GFP分子以单向，负端定向方式以高速移动，而Cin8团簇表现出相当低的速度和较高的双向运动倾向（图5B，C）。
图 5：Cin8-GFP 运动性。 （A） Kymographs 表示 Cin8-GFP 电机在 MT 上的运动性，X 轴和 Y 轴分别表示 MT 晶格和时间。黄色箭头标记单个Cin8-GFP粒子向MT的负端方向的快速运动，而蓝色箭头标记Cin8簇在MT的正端方向上的缓慢运动。MT的极性在每个kymograph的底部（+/-）指示。单电机的位移迹线：4 μm，竖条：20秒（B）Cin8-GFP电机的单个电机的位移迹线（左）和簇（右）。使用跟踪单个Cin8-GFP电机后获得的坐标绘制位移迹线，如步骤4.4中所述。位移的负值和正值分别表示在 MT 的负端和正端方向上的移动。请注意，在同一测定下，与Cin8的单分子相比，Cin8簇的运动性较慢且双向。（C）Cin8电机的单分子（左）和簇（右）的平均位移（MD）±SEM的图作为时间间隔的函数。黑线表示图的线性拟合（MD = v xt + c，其中 v 是平均速度，t 是时间间隔，c 表示截距）。从拟合中可以明显看出，Cin8的单电机和簇的平均速度分别为-265±20 nm/s和-48±5 nm/s。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这项工作中，提出了使用双向驱动蛋白-5 Cin8进行单分子运动性测定的方案和运动性分析。包括C端的天然核定位信号（NLS）在内的全长Cin8 18 已经从本地宿主 酿酒酵母中纯化出来。由于Cin8是一种核运动蛋白，因此在液氮下研磨 酿酒酵母 细胞是最有效的细胞裂解方法。裂解后，通过结合金属亲和力和尺寸排阻色谱，得到高纯度的Cin8，这对于单分子运动性测定很重要。此前已有报道，Cin8在粗提取物和纯化样品8中的运动特性之间存在差异。此外，还有报道称，MT拥挤的运动和非运动蛋白会影响双向运动蛋白-5 Cut722的方向性。因此，需要高纯度的电机来进行可靠的运动性分析和关于野生型和突变运动行为的结论。这里描述的技术可以很容易地适应通过适当的缓冲液调整从酵母中纯化其他核蛋白。
这里描述的是一种高度稳健和灵敏的单分子运动性测定，具有GFP标记的Cin8。该测定的成功在很大程度上取决于适当的MT聚合和固定到表面。利用强烈的亲和素 - 生物素相互作用将MT固定到疏水玻璃表面上，从而不可逆地附着MT。在这些使用GFP标记Cin8的固定MT上，可以可靠地跟踪Cin8运动11，12，19。
据报道，Cin8形成含有一个以上四聚体马达10，12的簇，这些簇的运动性与单个Cin8分子的运动性不同。为了准确地表征Cin8运动性与其大小的函数，已经开发了一种基于荧光强度的方法来鉴定每个Cin8颗粒12的簇大小。基于此尺寸分类，在每个尺寸类别中分别分析运动性。在这种基于大小的分析之后，提供了有见地的细节，可用于了解同一分子11，12，19的低聚物的不同行为。这里描述的簇大小测定程序可以应用于确定各种荧光标记分子的大小。在执行基于荧光的尺寸测定时，应注意在外观的第一帧确定Cin8-GFP颗粒的簇大小，以避免漂白的影响，因为大簇在光漂白后可能显示为较小的簇。
动力表征由MD和/或MSD分析执行。如果只确定电机速度是有意义的，MD分析就足够了。但是，如果电机运动同时包含有源和无源成分，并且还需要测定扩散系数，则应进行MSD分析20，23，24，25。对于MD和MSD分析，需要确定每个时间点的电机坐标。为了进行有效的跟踪，保持最佳的电机浓度非常重要。MT不应该太拥挤的电机;理想情况下，在约10μm的MT上，一次应该有3-4个Cin8-GFP电机/颗粒。ImageJ-Fiji中的“KymoButler”或“TrackMate”插件等自动化工具也可用于跟踪运动电机26，27。这些自动化工具可以节省时间和工作，但它们有一些限制。例如，如果某些粒子的运动非常慢，这些工具可以将它们读作非运动粒子。此外，这些工具在识别低强度分子方面存在局限性。因此，它们可能表现出高强度偏倚。另一方面，手动跟踪（虽然耗时）对跟踪错误不太敏感。
综上所述，该方案从 酿酒酵母中过表达的Cin8的纯化开始，全面解释了单分子运动性测定以及随后对这种双向激动蛋白-5的运动性分析。可以很容易地遵循该协议来纯化和表征运动蛋白（如Cin8）的运动性。此外，方案的不同部分可以适应从酵母中纯化蛋白质或开发针对不同运动蛋白及其运动性表征的单分子运动性测定。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项研究部分得到了以色列科学基金会赠款（ISF-386/18）和以色列两国科学基金会赠款（BSF-2019008）的支持，该赠款授予L.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | FORMEDIUM | DOC0230 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | Sigma | A8549 | |
| Casein | Sigma | C7078 | |
| Catalase (C40) | Sigma | C40 | |
| Creatine-Kinase | Sigma | C3755 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fluorescence filter set for GFP | Chroma | 49002: ET-EGFP (FITC/Cy2) | |
| Fluorescence filter set for Rhodamine | Chroma | 49004: ET-CY3/TRITC | |
| Fluorescence inverted microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| Galactose | Tivan Biotech | GAL02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| Glucose Oxidase | Sigma | G7141 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| GlycylGlycine | Merck | G0674 | |
| GMPCPP | Jana Bioscience | Nu-405L | |
| GTB | Cytoskeleton | BST01-010 | |
| GTP | Sigma | G8877 | |
| Histidine | Duchefa Biochemie | H0710.0100 | |
| ImageJ-FIJI software | https://imagej.net/plugins/trackmate/ | version 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] for Windows 10 | |
| Imidazole | Sigma | I0125 | |
| InstantBlue Coomassie Protein Stain | Abcam | ab119211 | |
| Lens | Zeiss | 100x/1.4 oil DIC objective | |
| Lysine | FORMEDIUM | DOC0161 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| Methionine | Duchefa Biochemie | M0715.0100 | |
| Neo | Andor Technologies | sCMOS camera | |
| NeutraAvidin | Life | A2666 | |
| Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | |
| Phospho-Creatine | Sigma | P1937 | |
| Pipes | Sigma | P1851 | |
| Pluronic acid F-127 (poloxamer) | Sigma | P2443 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Raffinose | Tivan Biotech | RAF01 | |
| Size Exclusion chromatography instument | GE Healthcare | AKTA Pure | |
| Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | NanoDrop | |
| Superose-6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Tris | Roshe | 10708976001 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tryptophan | Duchefa Biochemie | T0720.0100 | |
| Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin, biotinylated | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin, TRITC Rhodamine | Cytoskeleton | TL530M | |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | |
| Yeast nitrogen base | FORMEDIUM | CYN0401S | |
| α-GFP antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC8036 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 |
References
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Tags
生物化学，第180期，驱动蛋白，Cin8，单分子运动，微管，双向运动Erratum
Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 06/09/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.
One of the author names was updated from:
Roy Abraham
to:
Roy Avraham
