Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод сбора крови из подключичной вены у крыс. Он обеспечивает быстрый, своевременный и легко идентифицируемый отбор проб без анестезии и получение высококачественной крови путем повторного отбора образцов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Повторяющийся забор крови из подключичной вены сознательной крысы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Крысы широко используются в фармакокинетических (ПК) и токсикокинетических (ТЗ) исследованиях, которые должны собирать определенное количество крови в определенные моменты времени для обнаружения воздействия лекарств. Метод забора крови крыс определяет качество плазмы и дополнительно влияет на точность результатов теста. Метод сбора крови в подключичных вен, описанный в этом протоколе, многократно собирает образцы крови в сознательном состоянии животных для удовлетворения потребностей тестов на ПК и ТЗ. Навыки удерживающего обращения и соответствующая процедура разреза иглы обеспечивают успешность забора крови. Он прост в эксплуатации, обеспечивая при этом качество плазмы и в то же время заботясь о благополучии животных. Однако этот метод требует квалифицированной операции, а неправильный может вызвать у животных слабость, боль, хромоту и даже смертность. Текущий метод был использован в испытательном центре для 4-недельного исследования пероральной токсичности на крысах Sprague Dawley (SD) с ТЗ. Максимальное количество крови, собранной в течение 24 ч, не превышало 20% от общей крови животного. Масса тела животных составляла более 200 г у самцов и самок. Данные показали, что масса тела животных неуклонно увеличивалась каждую неделю, и клиническое наблюдение было нормальным после повторяющегося сбора образцов.
Введение
В соответствии с руководящими принципами1 Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для использования человеком (ICH) и руководящимипринципами 2 Национального управления по медицинским изделиям (NMPA), количество временных точек сбора крови крыс в токсикокинетическом (TK) исследовании должно соответствовать требованиям динамической оценки воздействия лекарственных средств. Приблизительный общий объем крови крысы составляет 55-70 мл/кг массы тела3. Точки времени сбора, как правило, интенсивны в течение 30 минут после дозирования и уменьшаются после этого, и более десяти образцов крови должны быть собраны в течение 48 часов в обычном тестировании4. Например, образцы крови собирают в 12-ти временных точках (0 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 8 ч и 12 ч) при исследовании ТЗ перорально вводимых препаратов. Исследователи должны неоднократно собирать 200-250 мкл крови у крыс, чтобы получить высококачественную плазму для тестирования ТЗ5.
Участки сбора крови у крыс включают хвостовые кровеносные сосуды, ретроорбитальную сплетение, подчелюстную вену, сердце, брюшную аорту6 и так далее. Среди них сбор крови из каудальной вены крыс является часто используемым методом, который требует опытных и квалифицированных операторов 7,8. Собрать кровь из ретроорбитального сплетения вены менее сложно; однако этот метод не рекомендуется, так как он может повредить зрение крыс9, а кровь из сердца и брюшной аорты подходит только для окончательного забора крови10. Было показано, что другой метод сбора крови из подчелюстной вены у сознательной крысы приводит к большему количеству осложнений и выявил недостаточное качество образца крови11. Поэтому исследователи могут обезболить животное, чтобы уменьшить сложность отбора проб. Тем не менее, анестезия также увеличивает стоимость эксперимента, и что более серьезно, это повлияет на метаболическое состояние крыс12. Настоящий протокол использует быстрый и простой метод сбора крови в подключичных венах крыс без анестезии, что позволяет точно позиционировать и двусторонний переменный сбор крови для получения высококачественных образцов своевременным и повторным образом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Для экспериментов использовались самцы и самки крыс Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 недель. Крысы были выращены в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных13.
1. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Все крысы SD, используемые в этом исследовании, бодрствовали и не были обезболены / усыплены. Необходимо умение удерживать обращение, хватаясь за кожу на спине животного.
- Найдите самую нижнюю точку подключичной треугольной ямки между шеей и передней конечностью у крысы. Переместите ~2-3 мм в сторону головы и дойдите до точки иглы в месте сбора крови (рисунок 1). Удалите волосы с помощью электробритвы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных потребностей может потребоваться сыворотка или плазма. Плазма берется в качестве примера в этом протоколе, и это не повлияет на операцию забора крови. - Подготовьте ватные палочки, окрашенные 75% спиртом для протирания и дезинфекции и сухие ватные палочки для протирания.
2. Забор крови
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, 2 человека, оба из которых должны иметь опыт в сборе крови и методах сдерживания крыс, должны выполнить эти шаги.
- Захватите кожу на задней части шеи одной рукой, чтобы держать голову, шею и грудь крысы в вертикальном положении и обнажите место инъекции (видео 1). Выпрямите переднюю конечность со стороны места инъекции для поддержания ее уровня.
- Держите шприц параллельно голове крысы другой рукой и наклоните шприц наружу на 5°-10° так, чтобы кончик был наклонен в вентральное направление.
- Вставьте иглу полностью в переднюю полость. Оттяните шприц назад, чтобы поддерживать отрицательное давление внутри трубки.
- Медленно переместите иглу с глубины на мелководье и вернитесь вверх по тому же пути. Когда кровь попала в шприц-иглу, зафиксируйте положение иглы (Видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Затем кровь будет заполнена с постоянной скоростью в шприце, как показано на рисунке 2A (вид спереди) и рисунке 2B (вид сбоку). - Контролировать максимальное количество крови в соответствии со стандартами, установленными комитетом по уходу и использованию животных учреждения. Это зависит от веса и здоровья животного. При отсутствии других требований не удаляйте более 20% от общего объема крови животного в течение 24 ч, что требует ~3 недель восстановления14.
- Когда будет собран достаточный образец крови, немедленно извлеките шприц и подготовьтесь к лечению крови (шаг 3).
- Давление на место инъекции крысы в течение ~ 1-2 мин, чтобы остановить кровотечение. Поскольку место сбора находится в нижней части шеи, защемите кожу подключичной вены, чтобы остановить кровотечение, надавливая на нее (рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь может быть собрана поочередно из двусторонней подключичной вены, когда необходим повторный забор крови. - Верните крысу в клетку и понаблюдайте за ее состоянием.
3. Обработка образца крови
- Извлеките иглу из шприца и выбросьте ее в острый контейнер для инструмента. Медленно перенесите кровь из шприца в пробирку объемом 1,5 мл. Прижмите шприц к стенке, чтобы избежать образования пузырьков, если таковые имеются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку давление может привести к разрыву эритроцитов, удалите иглу, чтобы предотвратить гемолиз14. - Накройте трубку микроцентрифуги, осторожно проведите ею и переверните вверх дном не менее пяти раз, чтобы тщательно смешать кровь с антикоагулянтом.
- Центрифугируют образец цельной крови при 2000 х г в течение ~10-15 мин при комнатной температуре в течение 120 мин после сбора плазмы.
- Используйте пипетку (см. Таблицу материалов) для переноса верхней плазмы в пустую микроцентрифужную трубку. Не прикасайтесь к головке пипетки с нижней цельной кровью. Утилизируйте или повторно центрифугируйте плазму, загрязненную эритроцитами.
- Используйте образцы немедленно или храните их при -30 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики препарата определяют время хранения. Образцы плазмы, полученные из подключичной вены, полупрозрачные и светло-желтые. Гемолиз может превратить плазму в красный цвет.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Хорошие образцы плазмы из подключичной жилы были полупрозрачными бледно-желтыми (рисунок 4, левая трубка). Неправильный забор крови или манипуляции привели к гемолизу (рисунок 4, правая трубка).
Данные испытательного центра показали, что в 4-недельном исследовании пероральной токсичности глазной капли у крыс СД с ТЗ образцы крови были собраны дважды в 9-временных точках (0 ч, 0,167 ч, 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч и 24 ч) между перв...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существуют определенные преимущества сбора крови из подключичных вен. (1) Поскольку место сбора крови легко диссоциируется, а венозное сплетение не является регулярным из-за различных поз крыс, описанный метод может легко локализовать положение венозного сплетения при сохранении стабильных и удобных поз крыс. (2) Операция проста и благоприятна для быстрого развития навыков техников и меньшей боли для животных. (3) Режим работы, позволяющий животному чувствовать себя комфортно, значительно снижает беспокойное поведение и ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Лимей Ван, Цзяньминь Го, Сяомань Чжун, Яли Шэн, Цивэнь Лай, Хуэй Сун и Вэй Ян имеют финансовую долю в Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, которая, однако, не поддержала эту работу. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Это исследование финансировалось Ключевой лабораторией доклинической оценки и исследований лекарственных средств провинции Гуандун (No 2018B030323024) и Ключевой программой «Создание новых лекарств» Плана клинических исследований и разработок Гуандун (No 2019B020202001), Исследовательский проект Фонда фундаментальных и прикладных программ Гуанчжоу (No 202002030249 и No 202002030156).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шприц 1,0 мл (с иглой, 26 г, 0,45 мм x 15,5 мм) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD. (Наньчан, провинция Цзянси, Китай) | 20210629 | |
| 75% спирт | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Дэчжоу, провинция Шаньдун, Китай) | 210717 | |
| животного происхождения | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | класс: SPF | номер лицензии на производство лабораторных животных: SCXK (Хунань) 2019-0004, номер сертификата качества лабораторного животного: 4307272101972847 |
| Ватный тампон | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd. (Хэцзэ, провинция Шаньдун, Китай) | 20210301 | Необходимо стерилизовать. |
| Электробритва | Shenzhen Codos Electric Appliance Co., Ltd. (Шэньчжэнь, провинция Гуандун, Китай) | Трубка CP-6800 | |
| EP, 1,5 мл | Genetimes ExCell Technology, Inc. (Шанхай, Китай) | ||
| Гепарин натрия (2 мл: 12500 МЕ | Tianjin biochem pharmaceutical Co., Ltd (Тяньцзин, Китай) | 51200702 | Приготовьте 1250 МЕ/мл раствора гепарина натрия. Заранее добавьте раствор гепарина натрия в пробирку ВП и равномерно распределите его по стенке пробирки ВП, и высушите при температуре 60°С; C для использования. |
| Labtip (диапазон объема 5-200 мкм; L) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Низкоскоростная рефрижераторная центрифуга | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd. (Чанша, провинция Хунань, Китай) | L535R | |
| Пистолет-пипетка (20-200; L) | BRAND | 12N92305 | |
| Крысы (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Чанша, провинция Хунань, Китай) | ||
| Контейнер для острых инструментов | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Тайчжоу, провинция Чжэцзян, Китай) | ||
| Глазные капли | Этот реагент не является товаром и производитель требует его тестирования. В принципе конфиденциальности, производитель и модель не могут быть предоставлены. |
Ссылки
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499(2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766(2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767(2020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
