Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

Nadezhda Podoplelova; Polina Soloveva; Andrei Garzon Dasgupta; Aleksandra Filkova; Mikhail Panteleev

doi:10.3791/63459

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa

2.1K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/63459

⸱

6 de abril de 2022

Nadezhda Podoplelova¹^,² , Polina Soloveva¹^,⁴ , Andrei Garzon Dasgupta¹^,²^,³ , Aleksandra Filkova¹^,² , Mikhail Panteleev¹^,²^,³^,⁴

¹Center for Theoretical Problems of Physicochemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, ²National Medical Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitry Rogachev, ³Faculty of Physics, Lomonosov Moscow State University, ⁴Faculty of Biological and Medical Physics, Moscow Institute of Physics and Technology

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.

Resumen

En el cuerpo humano, la mayoría de las principales reacciones fisiológicas involucradas en la respuesta inmune y la coagulación de la sangre proceden en las membranas de las células. Un primer paso importante en cualquier reacción dependiente de la membrana es la unión de la proteína en la membrana de fosfolípidos. Se ha desarrollado un enfoque para estudiar la interacción de las proteínas con las membranas lipídicas utilizando proteínas marcadas fluorescentemente y citometría de flujo. Este método permite el estudio de las interacciones proteína-membrana utilizando células vivas y vesículas de fosfolípidos naturales o artificiales. La ventaja de este método es la simplicidad y disponibilidad de reactivos y equipos. En este método, las proteínas se etiquetan utilizando colorantes fluorescentes. Sin embargo, se pueden utilizar proteínas autofabricadas y disponibles comercialmente, marcadas fluorescentemente. Después de la conjugación con un colorante fluorescente, las proteínas se incuban con una fuente de la membrana de fosfolípidos (microvesículas o células), y las muestras se analizan por citometría de flujo. Los datos obtenidos se pueden utilizar para calcular las constantes cinéticas y el equilibrio K_d. Además, es posible estimar el número aproximado de sitios de unión a proteínas en la membrana de fosfolípidos utilizando perlas de calibración especiales.

Introducción

Las biomembranas separan el contenido interno de las células animales y el espacio extracelular. Tenga en cuenta que las membranas también rodean las microvesículas formadas durante el ciclo de vida de la célula y los orgánulos. La membrana celular está compuesta predominantemente de lípidos y proteínas. Las proteínas de membrana realizan funciones de señalización, estructurales, de transporte y adhesivas. Sin embargo, la bicapa lipídica también es esencial para la interrelación de la célula animal con el espacio extracelular. Este artículo propone un método para estudiar la interacción periférica de las proteínas externas con la membrana lipídica.