직렬 섹션 전자 현미경을 사용하여 간세포에서 소기관 간 접촉 부위의 입체 특성화

요약

간세포의 소기관 또는 다른 조직의 세포 사이의 막 접촉 부위의 입체 세부 사항을 획득하는 간단하고 포괄적 인 프로토콜.

초록

투과 전자 현미경 검사는 오랫동안 세포 초 구조의 시각화를위한 황금 표준으로 간주되어 왔습니다. 그러나 분석은 종종 두 차원으로 제한되어 3차원(3D) 초구조와 소기관 간의 기능적 관계를 완전히 설명하는 능력을 방해합니다. 부피 전자 현미경 (vEM)은 메조 스케일, 마이크로 스케일 및 나노 스케일 해상도에서 3D로 세포 초 구조의 심문을 가능하게하는 기술 모음을 설명합니다.

이 프로토콜은 TEM(직렬 섹션 전송 EM)을 사용하여 vEM 데이터를 획득할 수 있는 액세스 가능하고 강력한 방법을 제공하며 샘플 처리부터 디지털 3D 재구성에 이르는 기술적 측면을 하나의 간단한 워크플로우에서 다룹니다. 이 기술의 유용성을 입증하기 위해, 소포체와 미토콘드리아와 간 간세포에서의 접촉 부위 사이의 3D 초구조적 관계가 제시된다. 소기관 간 접촉은 소기관 사이의 이온, 지질, 영양소 및 기타 소분자의 전달에 중요한 역할을합니다. 그러나 간세포에서의 초기 발견에도 불구하고 물리적 특징, 역학 및 기능에 대해 배울 것이 여전히 많습니다.

소기관 간 접촉은 두 소기관의 서로 근접성 (일반적으로 ~ 10-30nm)과 접촉 부위의 범위 (펑크 접촉에서 더 큰 3D cisternal-like 접촉에 이르기까지)에 따라 다양한 형태를 표시 할 수 있습니다. 밀접한 접촉을 검사하려면 고해상도 이미징이 필요하며 직렬 섹션 TEM은 간세포 분화 중 소기관 간 접촉의 3D 초구조뿐만 아니라 대사성 질환과 관련된 간세포 구조의 변화를 시각화하는 데 매우 적합합니다.

서론

1930 년대에 발명 된 이래로 전자 현미경을 통해 연구자들은 세포와 조직의 구조적 구성 요소 ^1,2를 시각화 할 수있었습니다. 대부분의 조사는 3D 모델을 구축하기 위해 힘든 직렬 섹션 수집, 수동 사진, 네거티브 처리, 수동 추적 및 유리, 플라스틱 또는 스티로폼 ^3,4 시트에서 3D 모델의 생성 및 조립이 필요하기 때문에 2D 정보를 제공했습니다. 거의 70년이 지난 지금, 현미경 성능, 직렬 섹션 수집, 자동화된 디지털 이미징, 3D 재구성, 시각화 및 분석을 위한 정교한 소프트웨어 및 하드웨어에서부터 현재 총칭되는 볼륨 EM(vEM)에 대한 대안적인 접근법에 이르기까지 프로세스의 다양한 측면에서 상당한 발전이 있었습니다. 이러한 vEM 기술은 일반적으로 미크론 스케일에 걸쳐 나노미터 해상도에서 3D 초구조 정보를 제공하는 것으로 간주되며 투과 전자 현미경 (TEM) 및 새로운 주사 전자 현미경 (SEM) 기술을 포함합니다. 리뷰 5,6,7,8 참조.

프로토콜

모든 동물은 영국 내무부 지침에 따라 수용되었으며, 조직 수확은 영국 동물 (과학 절차) 법 1986에 따라 수행되었습니다.

1. 시편 고정 및 준비

1. 간 조직을 적절한 크기의 조각, 대략 8 mm x 8 mm x 3 mm로 해부하고, 그 조각을 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS, 37°C)에 넣는다.
2. 실온 (20-25 °C) 고정제 (1 % 수크로오스 중 1.5 % 글루타르 알데히드, 0.1 M 카코 딜 레이트 나트륨)를 간 조각에 주입하고 PBS에서 실온에서 최대 20 분 동안 고정제로 옮깁니다. 건조를 피하기 위해 항상 조직을 용액에 담그십시오.
   참고: 알데히드는 부식성이 있고 발암성 가능성이 있는 자극제입니다. 카코딜레이트 나트륨은 삼키거나 흡입하면 독성이 있습니다. 모든 고정 장치는 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 동안 처리되어야하며 실험은 흄 후드에서 수행되어야합니다. 좋은 고정은 더 단단한 조직을 초래할 것입니다.
3. 진동하는 마이크로톰을 블레이드, 얼음 욕조 및 차가운 PBS로 채워진 버퍼 트레이로 설정합니다. 고정 된 간 조직의 첫 번째 조각을 시아 노 아크릴레이트 접착제로 표본 홀더에 장착하고 블록을 진동하는 마이크로 톰으로 옮깁니다.

결과

이 기술의 경우, 관심 영역은 생물학적 연구 목표에 따라 선택되고 포매된 조직의 트리밍 및 절편화 전에 확인된다. 유사하게, 블록 얼굴의 크기는 연구 질문에 의해 결정될 수 있다; 이 경우, 샘플은 대략 0.3 mm x 0.15 mm의 블록 면을 남기도록 트리밍되었다(도 4A). 이를 통해 그리드 당 9 개의 직렬 섹션으로 구성된 두 개의 그리드를 허용하여 18 개의 직렬 섹션을 제공하고 약 62 μm^{3 (316} μm x 150 μm x 1.3 μm)의 부피의 간 조직 부피를 통합했습니다. 이 부피는 간 조직에서 개별 미토콘드리아의 완전한 3D 재구성을 허용하기에 충분했다.

토론

소기관 구조 및 상호작용을 3D로 시각화하기 위한 접근 가능한 vEM 기술이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. 간세포에서 소기관 간 접촉의 형태학은 여기에서 사례 연구로 제시됩니다. 그러나, 이러한 접근법은 또한 말초 신경에서의 슈완 세포-내피 상호작용(⁴⁵), 내피 세포에서의 바이벨 팔레이드 바디 생물발생(⁴⁶), 신장 세포에서의 화물 분비(47), 및 해마 뉴런⁽⁴⁸)에서의 시냅스 형태학을 포함하는 다양한 다른 샘플 및 연구 영역을 조사하기 위해 적용되었다. . 간 생물학을 더 잘 이해하기 위해, 이 접근법은 2D 세포 배양물, 3D 간 오가노이드 모델 시스템(⁴⁹) 및 간 조직에서 간세포 형태학을 조사하는데 사용될 수 있다. 이 견고하고 유연한 접근 방식은 기존의 120kV 투과 전자 현미경 및 초미세 경합금에 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & 마이크로; m 주사기 필터	Sarstedt	83.1826.001
알루미늄 트레이	Agar Scientific	AGG3912
Amira v6	ThermoFisher		https://www.thermofisher.com
클로로포름	피셔	C/4960/PB08
DDSA/Dodecenyl 숙신산 무수물	TAAB	T027	Epon 성분
다이아몬드 나이프	DiaTOME	울트라 45도;
DMP-30 / 2,4,6- 트라이 (디메틸 아미노 메틸) 페놀	TAAB	D032	Epon 성분
Dumont 핀셋 N5	Agar Scientific	AGT5293
피지			https://imagej.net/
Fiji TrakEM2 플러그인			https://imagej.net/
포름 알데히드 36 % 용액	TAAB	F003
Formvar 코팅된 슬롯 그리드	수제		대체품: EMS 디아섬(FF2010-Cu)
어플리케이터 로드가 있는 유리병	Medisca	6258
유리 바이알	Fisher Scientific	15364769
글루테알데히드 25% 용액	TAAB	G011
MNA/메틸 나딕 무수물	TAAB	M011	Epon 성분
오스뮴 테트록사이드 2% 용액	: TAAB	O005
페리시안화 칼	시그마 - 알드리치	P-8131
프로필렌 옥사이드	피셔 사이언티픽	: E / 0050 / PB08
재사용 가능한 접착제	블루 택
레이놀즈 리드 시트레이트	TAAB	L037	단면 염색
: 카코딜 산 나트륨	시그마 - 알드리치	C-0250	0.1 M Caco 완충기
최고 접착제	RS 분대	918-6872	Cyanoacrylate 접착제, 단계 1.3
TAAB 812 수지	TAAB	T023	Epon 성분
Tannic 산	TAAB	T046
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
2액형 에폭시 수지	RS 분대	132-605	대안 : Step 2.13
초박절편기	Leica	UC7
진동 초소형 절편기	Leica		100 µ m 두께의 슬라이스, 1mm 진폭에서 0.16mm/s 절단.
Weldwood 원래 접촉 시멘트	DAP	107	접촉 접착제 : 단계 3.1.4

: 륨,