Summary
I denne protokol anvendes en musehjertetransplantationsmodel til undersøgelse af mekanismen for hjerteallotransplantatafstødning. I denne heterotopiske hjertetransplantationsmodel forbedres driftseffektiviteten, og overlevelsen af hjertetransplantater sikres ved en cervikal ende-til-ende anastomose af hjerteimplantation ved hjælp af en modificeret manchetteknik.
Abstract
Afstødning af hjerteallotransplantat begrænser patienternes langsigtede overlevelse efter hjertetransplantation. En musehjertetransplantationsmodel er ideel til at undersøge mekanismen for afstødning af hjerteallotransplantat i prækliniske studier på grund af deres høje homologi med humane gener. Denne forståelse vil hjælpe med at udvikle unikke tilgange til forbedring af patienters langsigtede overlevelse behandlet med hjertetransplantater. I en musemodel udføres abdominal donorhjerteimplantation almindeligvis med en ende-til-ende anastomose til modtagerens aorta og ringere vena cava ved hjælp af sting. I denne model implanteres donorens hjerte ved ende-til-ende anastomose til modtagerens halspulsåre og jugularvene ved hjælp af den modificerede manchetteknik. Transplantationsoperationen udføres uden syning og kan således øge modtagerens overlevelse, da der ikke er nogen interferens med blodforsyningen og venøs refluks i underkroppen. Denne musemodel ville hjælpe med at undersøge mekanismerne bag den immunologiske og patologiske (akutte / kroniske) afvisning af hjertetransplantater.
Introduction
Hjertetransplantation er blevet standardbehandlingen for terminal hjertesvigt. Mere end 5.500 hjertetransplantationer om året udføres i de organisationer, der er registreret under International Society for Heart and Lung Transplantation. Blandt de allogene hjertetransplantationsmodtagere er den 1-årige afstødningsrate stadig >10%, mens den 3-årige afstødningsrate steg til 36%1,2. Imidlertid mangler effektive profylaktiske behandlinger til patienter med hjerteallograft afstødning. Derfor er dyremodelstudier berettigede, der belyser de fysiologiske mekanismer, der ligger til grund for immunologisk og patologisk afvisning af hjertetransplantater. Sådanne undersøgelser vil bidrage til undersøgelsen af nye mål, der er nødvendige for at udvikle effektive lægemidler, hvilket vil bidrage til at forhindre afstødning af hjertetransplantater og forbedre overlevelsesraten hos disse patientpopulationer.
Nogle potentielle immunologiske og patofysiologiske mekanismer for hjerteallograft afvisning er blevet foreslået for nylig i musemodelstudier af heterotopisk hjertetransplantation 3,4,5. Derfor blev musens heterotopiske hjertetransplantation en ideel præklinisk model til at undersøge mekanismerne for immunafstødning og patologisk skade, der forekommer i hjertetransplantater efter hjertetransplantation på grund af deres høje homologi med humane gener. Det fremherskende koncept er at udføre heterotopisk transplantation i en musemodel ved hjælp af en abdominal ende-til-ende anastomose i modtageren aorta og ringere vena cava ved hjælp af sting, svarende til den normale menneskelige anatomi. Denne procedure kan dog forstyrre modtagerens blodforsyning og venøs refluks i underkroppen6. Derfor foreslås en modificeret heterotopisk hjertetransplantationsprocedure i en musemodel her.
Donorens hjerte implanteres med modtagerens halspulsåre og halsvene ved en ende-til-ende cervikal anastomose ved hjælp af en modificeret manchetteknik. Denne modificerede procedure lettede den operative gennemførlighed og sikrede overlevelsen af hjertetransplantatet uden at forstyrre blodforsyningen og venøs tilbagesvaling af underkroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Eight Edition, National Research Council (US) 2011. Procedurer, der involverer dyreforsøgspersoner, er blevet godkendt af Animal Care and Use Committee på Chongqing University Cancer Hospital, Chongqing, Kina. Hanmus med BALB/c og C57BL/6, der vejer 20-30 g, opnået fra kommercielle kilder (se materialetabel), blev anvendt til allogen hjertetransplantationsundersøgelse. C57BL/6-musene blev brugt som donorer og syngeneiske modtagere, mens BALB/c-musene fungerede som allogene modtagere. Et skema over protokollen er vist i figur 1.
BEMÆRK: Alle forsyninger, der anvendes under operationen, herunder kirurgiske instrumenter og opløsninger, er sterile. Den kirurgiske procedure overholder princippet om aseptisk driftsteknik.
1. Procedure for modtagere
- Inducer generel anæstesi via inhalation af 5% isofluran gennem et 15 x 10 x 10 cm induktionskammer forbundet med en hætte (se materialetabel).
- Fastgør modtagermusen på operationsbordet med en varmepude. Bevar bedøvelsen med kontinuerlig inhalation af 2% isofluran gennem en ansigtsmaske over næse og mund.
BEMÆRK: Langsom respirationsfrekvens og rytme, hornhinderefleksens forsvinden og fraværet af pedalrefleks i tæerne indikerer effektiviteten af anæstesi. - Efter barbering af håret desinficeres det kirurgiske område med tre skiftevis runder povidon-jodskrubbe efterfulgt af alkohol. Skær derefter huden 1,5-2 cm parallelt med den cervikale midterlinje fra højre mandibulære vinkel til haleenden.
- Disseker ~ 1 cm af den højre ydre jugularvene ved hjælp af en elektrokoagulator og mikrotang. Klip venen i den proksimale ende med en atraumatisk mikrovaskulær klemme og liger den i den distale ende.
- Før den distale ende af venen gennem en 22 G polyurethan pigget manchet (se tabel over materialer) med en skrå ende og overfladiske riller. Fastgør venen med manchettens håndtag ved hjælp af en mikrovaskulær klemme.
- Fjern 8-0 ligationssutur i den distale ende, drej lumen over manchetten fastgjort af den overfladiske modhager indefra og ud og fastgør med en 10-0 kirurgisk sutur i overfladens riller.
- Resekter den højre sublinguale kirtel for at danne en fossa til implantering af hjertetransplantatet, og reserver højre lap af den submaxillære kirtel og den rigtige sternocleidomastoid.
- Disseker den højre fælles halspulsåre i ~ 1 cm ved hjælp af mikropincet, og klip arterien med en atraumatisk mikrovaskulær klemme i den proksimale ende. I den distale ende ligeres og afskæres arterien.
- Før den distale ende af arterien gennem en 26 G polyurethan piggemanchet (se materialetabel) med en skrå ende og riller på overfladen. Fastgør arterien med manchettens håndtag ved hjælp af en mikrovaskulær klemme.
- Fjern ligationssuturen i den distale ende, vend lumen indvendigt ud over manchetten, og fastgør med en overfladisk modhager og riller med en 10-0 kirurgisk sutur.
- Efter klargøring af modtagerens kar skal du droppe 100 IE / ml heparinsaltvand på beholderne for at forhindre trombose. Dæk livmoderhalssnittet med sterilt vådt saltvandsgaze til efterfølgende implantation.
2. Donorprocedure
- Anvend samme bedøvelsesprocedure (trin 1.1) til donormusen.
- Barber mavehåret ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, og desinficer det kirurgiske område med tre skiftende runder povidon-jodskrubbe efterfulgt af alkohol.
- Skær maven (2-3 cm) med en saks langs midterlinjen fra symphysis pubis til subxiphoid, og udvid det indskårne område med en tilbagetrækning.
- Disseker 1 cm af abdominal aorta og ringere vena cava ved hjælp af en elektrokoagulator og en mikrotang, og udfør heparinisering ved at injicere 1 ml fysiologisk saltvand suppleret med 250 IE / ml heparin gennem den ringere vena cava. Herefter punktafgifter abdominal aorta og ringere vena cava.
- Punktafgifter thoraxen langs den forreste aksillære linje på begge sider ved hjælp af en kirurgisk saks for at adskille brystvæggen. Ligate den overlegne vena cava med en 8-0 kirurgisk sutur.
- Indsæt en hovedbundsnål ved den suprahepatiske ringere vena cava. Derefter injiceres iskold fysiologisk saltvand suppleret med 100 IE / ml heparin gennem hovedbundens nål fra suprahepatisk ringere vena cava for at perfusere donorhjertet, indtil blodfarven falmer.
- Re-perfuse donorhjertet med 2-3 ml iskold histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) opløsning (se tabel over materialer) ved hjælp af en hovedbund nål fra aortabuen for at beskytte donor myokardiet. Den gennemsnitlige varme iskæmitid er 5 min.
- Ligate den overlegne og ringere vena cava og lungevenen med en 5-0 kirurgisk sutur. Disseker og afskær donor aorta og lungearterie før deres forgrening. Derefter opdeles den overlegne og ringere vena cava og lungevenen for at fjerne donorens hjerte.
3. Implantation
- Implanter donorhjertet i livmoderhalslommen på modtagermusen i omvendt position.
- Træk manchetten med en everted modtager jugular vene ind i lumen i donor lungearterien for at udføre ende-til-ende anastomose af donor lungearterien til modtageren ekstern jugular vene. Ligate manchetten ved hjælp af rillerne på overfladen gennem en 10-0 kirurgisk sutur for at fastgøre anastomose.
- Anvend en lignende procedure for ende-til-ende anastomose af donor aorta til modtageren carotisarterien.
- Slip den atraumatiske mikrovaskulære klemme i jugularvenen efterfulgt af halspulsåren for at perfusere donorens hjerte igen. Den gennemsnitlige kolde iskæmitid er 15 min.
- Fastgør hjertetransplantatet og sutur det ordentligt for at forhindre vridning af transplantatet.
- Luk det cervikale snit med kontinuerlige suturer ved hjælp af en 5-0 polyamid monofilamentsutur (se materialetabel).
BEMÆRK: Fjern suturen, når såret er helt helet. - Hold modtagermusen inde i et varmt, tørt og rent bur, indtil den kommer sig efter bedøvelse.
BEMÆRK: Det tager 5-10 minutter at komme sig. - Buprenorphin (0,05 mg/kg) injiceres subkutant i modtagermusen hver 6. time i 48 timer ved postoperativ analgesi.
BEMÆRK: Analgesidoseringen blev optimeret til denne undersøgelse. Analgesiregimet kan dog forlænges / ændres, hvis der er tegn på smerte i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for brug af dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne cervikale heterotopiske hjertetransplantationsmodel med mus var overlevelsesraten for modtagermus ca. 95,2 % (20 ud af 21 mus overlevede). Den primære dødsårsag var postoperativ blødning. Det hurtige hjerteslag med en regelmæssig rytme tjener som en indikator for overlevelsen af det implanterede donorhjerte.
C57BL/6 og BALB/c mus var henholdsvis 7,8 MHC (H-2b) og MHC (H-2d) typerne i denne model. Disse to stammer adskiller sig fra H-2, hvilket forårsager akut T-cellemedieret afvisning9. Af alle hjertetransplantater gik 62,5% tabt inden for 7 dage efter transplantationen, vurderet ved palpering af hjerteslaget. Alle hjertetransplantater gik tabt inden for 8 dage efter transplantationen. I modsætning hertil overlevede alle de isogene hjertetransplantationer ud over 4 uger (figur 2). Mus, der overlevede ud over 4 uger, blev aflivet ved CO2 -indånding.
Figur 1: Skematisk oversigt over musens cervikale heterotopiske hjertetransplantationsmodel. (A) Protokol til forberedelse af modtageren: Efter klipning af den fælles halspulsåre og ydre jugularvene i den proksimale ende er karrets vaskulære lumen everted og fastgjort efter at have passeret gennem piggemanchetten med en skrå ende og riller på overfladen. Den stiplede firkant viser manchettens struktur og brug. (B) Donorhjerteresektion: Efter donorhjertets perfusion med heparin og HTK-opløsning fra den ringere vena cava og aorta ligeres den overlegne og ringere vena cava og lungevene med suturer. Donorens hjerte resekteres derefter ved at skære karkarrene. C) implantation af donorens hjerte. Donorens lungearterie og aorta anastomoseres til modtagerens ydre halsvene og halspulsåren via manchetten med modtagerens vaskulatur vendt indvendigt ud i et ende-til-ende-mønster. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Overlevelseskurve for hjertetransplantater. Overlevelseskurven for hjertetransplantater viser, at allogene hjertetransplantationer går tabt inden for 8 dage efter transplantationen, hvilket blev vurderet ved palpering af hjerteslaget. I alt 10 recipientmus gennemgik den modificerede cervikale heterotopiske hjertetransplantation i hver gruppe. Alle de isogene hjertetransplantationer overlevede mere end 4 uger. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Rupert Oberhuber et al.10 | Xin Mao et al (nuværende arbejde) | |||
| Anæstesi | xylazin og ketamin | isofluran (sikker, kontinuerlig og stabil) | ||
| Højre lap af den submandibulære kirtel | fjernelse | konservering (Reducer snurren af transplantater) | ||
| Højre sternocleidomastoid | fjernelse | konservering (Reducer snurren af transplantater) | ||
| Hjerte perfusion | Retrograd perfusion med 4 °C HTK-opløsning fra aortabuen | 1. Anterograd perfusion med iskold fysiologisk saltvand suppleret med 100 IE/ml heparinopløsning fra den suprahepatiske vena cava. 2. Retrograd reperfusion med iskold HTK-opløsning fra aortabuen. (Reducer koagulation og øg myokardiebeskyttelsen) | ||
| Manchet | stump ende, med håndtag | skrå ende, med håndtag, modhager og riller på overfladen (Letter eversion og fiksering) | ||
Tabel 1: Sammenligning af hjertetransplantationsteknikker. Den nuværende mus cervikal heterotopisk hjertetransplantationsteknik er modificeret fra Oberhuber, R. et al.10 og har yderligere fordele for hjertetransplantatoverlevelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musehjertetransplantationsmodellen bidrager til undersøgelsen af afstødningsmekanismer efter hjertetransplantation og bidrager til udviklingen af unikke tilgange til forbedring af hjerteallograftmodtagernes langsigtede overlevelse. Hjertetransplantation hos mus er imidlertid en kompleks og udfordrende opgave, der kræver et højt niveau af mikrokirurgiske teknikker, især i vaskulær anastomose11,12,13. Musens abdominale heterotopiske hjertetransplantationsmodel udføres ved hjælp af sting ved anastomose af donor aorta og lungearterie til modtageren aorta og ringere vena cava. Modtagerens aorta og ringere vena cava skal blokeres i denne operation. Derfor kan iskæmi i underkroppen og trombose i den ringere vena cava øge invaliditet og død hos modtagermus. For at reducere vanskelighederne ved vaskulær anastomose under transplantation introducerede Matsuura et al. først en cervikal hjertetransplantationsmodel hos mus ved hjælp af manchetteknikken i 199114. I denne model øgede den overærmelignende everted anastomose af skibe ved ligering med manchet anastomoseeffektiviteten. I modsætning til anastomose af skibe med suturer i en abdominal hjertetransplantation musemodel reducerede det blødningssandsynligheden efter proceduren. Derfor reducerede forbedringen af anastomoseeffektiviteten iskæmitiden for hjertemusklen og øgede overlevelsesraten for hjertetransplantater. Derudover afbryder cervikal implantation af donorens hjerte ikke cirkulationen af modtagerens aorta og ringere vena cava sammenlignet med abdominal implantation15; Derfor øges overlevelsen af modtagermus.
En unik eksperimentel mus heterotopisk hjertetransplantationsmodel er beskrevet her, etableret af Rupert Oberhuber et al.10. Proceduren involverer en ende-til-ende cervikal anastomose af donor aorta og lungearterien til modtagerens halspulsåre og jugularvene efter en modificeret manchetteknik. I denne model forstyrrer den systemiske cirkulation af modtagermusene ikke10, og donorens hjerte blev perfuseret fra de ringere vena cava og aorta med heparin- og HTK-opløsninger for bedre myokardiebeskyttelse. Den kritiske komponent i denne model adskilte sig imidlertid fra Oberhuber et al.10, som anvendte den modificerede piggemanchet med en skrå ende og riller svarende til Finsterer et al.16. Den skrå ende letter en overærmelignende evert af det vaskulære lumen. Rillerne på overfladen letter fastgørelsen af everted karvægge med en manchet ved hjælp af suturer, og modhagen uden for manchetten reducerer glidningen af anastomoserede karvægge fra manchetten (figur 1). Disse ændringer forkorter operationstiden med 20% og forbedrer hjertetransplantaternes implantationseffektivitet og overlevelse. Desuden er den modificerede piggemanchet fremstillet af det mest almindelige polyurethankateter, der anvendes til hovedbundsakupunktur, hvilket reducerer omkostningerne ved proceduren betydeligt. En sammenligning af den nuværende teknik med Oberhuber et al.10 er vist i tabel 1.
De unikke træk ved denne model skal bemærkes. For det første er manchettens længde og kaliber afgørende for vellykket anastomose. Manchettens passende længde var ~3 mm med et håndtag (1 mm) (figur 1). Manchettens passende kaliber er henholdsvis 26 G og 22 G for arterie og vener. Manchettens uegnede længde og kaliber ville resultere i vridning eller overdreven spænding af de anastomoserede kar. For det andet er de passende længder af modtagerens kar 1,5 til 2 gange manchetten. For det tredje er donorens hjerte ikke perfuseret med for stort tryk, hvilket potentielt kan beskadige transplantatet. For det fjerde fastgøres hjertetransplantatet, og manchetten anastomoseres i en passende position ved suturering efter implantation for at undgå bevægelse eller vridning af anastomoserede kar eller transplantater. For det femte bidrager bevarelse af den submaxillære kirtel og sternocleidomastoid til at reducere snurring eller vridning af de anastomoserede kar eller transplantat, når man resekterer den rigtige sublinguale kirtel for at producere en fossa til hjertetransplantat. For det sjette, for at lette den oversleeve-lignende evert af det vaskulære lumenog reducere trombose efter operationen, kan heparinopløsning (100 IE / ml) tilføres de anastomoserede kar, mens anastomose udføres.
Denne manchetteknik letter anastomose af donor- og modtagerkar under implantation; Manchettens hårdhed kan dog igen øge risikoen for at vride de anastomoserede kar, hvilket resulterer i en stigning i trombose efter transplantation. Optimering af manchetmaterialet er berettiget til at reducere komplikationer, øge transplantatoverlevelsen og øge udnyttelsesgraden af modellerne i efterfølgende eksperimenter. Desuden kan det fibrøse ar i snittet begrænse pladsen til hjertetransplantatet og påvirke dets langsigtede overlevelse. Desuden kan udstødning af hjertetransplantatet forstyrre modtagermusenes normale hæmodynamiske blodgennemstrømning. Endelig er denne model ikke-funktionel og kan ikke bruges til at evaluere transplantaternes hjertefunktion. Ikke desto mindre giver denne undersøgelse viden om hjertetransplantationens immunologiske og patologiske funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81870304) til Jun Li.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C3090954 | |
| 8-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | C2090880 | |
| 10-0 Polyamide Monofilament suture | B.Braun Medical Inc. | G0090781 | |
| 22 G polyurethane cuff | B.Braun Medical Inc. | 4251628-02 | |
| 26 G polyurethane cuff | Suzhou Linhua Medical Instrument Co., LTD | REF383713 | |
| Anesthesia induction chamber | RWD Life Science Co., LTD | V100 | |
| Atraumatic microvascular clamp | Beyotime | FS500 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (20–30 g) | Centre of Experimental Animals (Army Medical University, Chongqing, China) | ||
| Buprenorphine | US Biological life Sciences | 352004 | |
| Electrocoagulator | Guangzhou Runman Medical Instrument Co., LTD | ZJ1099 | |
| Gauze | Henan piaoan group Co., LTD | 10210402 | |
| Heating pad | Guangzhou Dewei Biological Technology Co., LTD | DK0032 | |
| Heparin | North China Pharmaceutical Co., LTD | 2101131-2 | |
| HTK solution | Shenzhen Changyi Pharmaceutical Co., LTD | YZB/Min8263-2013 | |
| Injection syringe (10 mL) | Shandong weigao group medical polymer Co., LTD | 20211001 | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co., LTD | 21070201 | |
| Physiological saline | Southwest pharmaceutical Co., LTD | H50021610 | |
| Scalp needle | Hongyu Medical Group | 20183150210 | |
| Shaver | Beyotime | FS600 | |
| Small animal anesthesia machine | RWD Life Science Co., LTD | R500 | |
| Surgical operation microscope | Tiannuoxiang Scientific Instrument Co. , Ltd, Beijing, China | SZX-6745 | |
| Swab | Yubei Medical Materials Co., LTD | 21080274 |
References
- Khush, K. K., et al. The International thoracic organ transplant registry of the international society for heart and lung transplantation: Thirty-sixth adult heart transplantation report - 2019; focus theme: Donor and recipient size match. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 38 (10), 1056-1066 (2019).
- Stehlik, J., et al. The registry of the international society for heart and lung transplantation: 29th official adult heart transplant report--2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 31 (10), 1052-1064 (2012).
- Huang, H., et al. Combined intrathymic and intravenous injection of mesenchymal stem cells can prolong the survival of rat cardiac allograft associated with decrease in miR-155 expression. Journal of Surgical Research. 185 (2), 896-903 (2013).
- Eggenhofer, E., et al. Features of synergism between mesenchymal stem cells and immunosuppressive drugs in a murine heart transplantation model. Transplant Immunology. 25 (2-3), 141-147 (2011).
- Sula Karreci, E., et al. Brief treatment with a highly selective immunoproteasome inhibitor promotes long-term cardiac allograft acceptance in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (52), 8425-8432 (2016).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Lin, C. M., Gill, R. G., Mehrad, B. The natural killer cell activating receptor, NKG2D, is critical to antibody-dependent chronic rejection in heart transplantation. American Journal of Transplantation. 21 (11), 3550-3560 (2021).
- Ito, H., Hamano, K., Fukumoto, T., Wood, K. J., Esato, K. Bidirectional blockade of CD4 and major histocompatibility complex class II molecules: An effective immunosuppressive treatment in the mouse heart transplantation model. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 17 (5), 460-469 (1998).
- Zhou, Y. X., et al. Acute rejection correlates with expression of major histocompatibility complex class I antigens on peripheral blood CD3(+)CD8(+) T-lymphocytes following skin transplantation in mice. Journal of International Medical Research. 39 (2), 480-487 (2011).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Cui, D., Tan, C., Liu, Z. An alternative technique of arterial anastomosis in mouse heart transplantation. Clinical Transplantation. 32 (6), 13264 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26 (4), 223-228 (2013).
- Fang, J., et al. A simplified two-stitch sleeve technique for arterial anastomosis of cervical heterotopic cardiac transplantation in mice. American Journal of Translational Research. 5 (5), 521-529 (2013).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), 293-299 (2014).
