Enlèvement des yeux chez les larves vivantes de poisson zèbre pour examiner la croissance et le développement du système visuel dépendants de l’innervation

Summary

L’article explique comment enlever chirurgicalement les yeux des larves vivantes de poisson zèbre comme première étape vers l’étude de la façon dont l’apport rétinien influence la croissance et le développement du tectum optique. En outre, l’article fournit des informations sur l’anesthésie larvaire, la fixation et la dissection cérébrale, suivies de l’immunohistochimie et de l’imagerie confocale.

Abstract

Les poissons-zèbres présentent une croissance et des capacités de régénération remarquables tout au long de la vie. Par exemple, les niches de cellules souches spécialisées établies au cours de l’embryogenèse favorisent la croissance continue de l’ensemble du système visuel, à la fois dans l’œil et le cerveau. La croissance coordonnée entre la rétine et le tectum optique assure une cartographie rétinotopique précise à mesure que de nouveaux neurones sont ajoutés dans les yeux et le cerveau. Pour déterminer si les axones rétiniens fournissent des informations cruciales pour réguler les comportements des cellules souches tectales et progénitrices tels que la survie, la prolifération et / ou la différenciation, il est nécessaire de pouvoir comparer les lobes tectaux innervés et dénervés chez le même animal et entre les animaux.

L’ablation chirurgicale d’un œil de poisson-zèbre larvaire vivant suivie de l’observation du tectum optique atteint cet objectif. La vidéo d’accompagnement montre comment anesthésier les larves, aiguiser électrolytiquement les aiguilles de tungstène et les utiliser pour enlever un œil. Il montre ensuite comment disséquer les cerveaux des larves de poisson zèbre fixes. Enfin, la vidéo donne un aperçu du protocole d’immunohistochimie et une démonstration de la façon de monter des embryons colorés dans l’agarose à faible point de fusion pour la microscopie.

Introduction

Le but de cette méthode est d’étudier comment l’entrée rétinienne influence la croissance et le développement du tectum optique, le centre de traitement visuel dans le cerveau du poisson-zèbre. En enlevant un œil, puis en comparant les deux côtés du tectum optique, les changements tectaux au sein du même spécimen peuvent être observés et normalisés, ce qui permet une comparaison entre plusieurs spécimens. Les approches moléculaires modernes combinées à cette technique permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la croissance et au développement du système visuel, ainsi qu’à la dégénérescence et à la régénération axonales.

Les systèmes sensoriels - visuels, auditifs et somatosensoriels - recueillent des informations à partir d’organes externes et transmettent ces informations au système nerveux central, générant des « cartes » du monde extérieur à travers le mésencéphale ^1,2. La vision est la modalité sensorielle dominante pour presque tous les vertébrés, y compris de nombreux poissons. La rétine, le tissu neural de l’œil, recueille des informations avec un circuit neuronal composé principalement de photorécepteurs, de cellules bipolaires et de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), les neurones de projection de la rétine. Les RGC ont de longs axones qui se frayent un chemin à travers la surface interne de la rétine jusqu’à la tête du nerf optique, où ils fasciculent et voyagent ensemble à travers le cerveau, se terminant finalement dans le centre de traitement visuel dans le mésencéphale dorsal. Cette structure est appelée tectum optique chez les poissons et autres vertébrés non mammifères et est homologue au colliculus supérieur chez les mammifères³.

Le tectum optique est une structure multicouche à symétrie bilatérale dans le mésencéphale dorsal. Chez le poisson-zèbre et la plupart des autres poissons, chaque lobe du tectum optique reçoit une entrée visuelle provenant uniquement de l’œil controlatéral, de sorte que le nerf optique gauche se termine dans le lobe tectal droit et le nerf optique droit se termine dans le lobe tectal gauche⁴ (Figure 1). Comme son homologue mammifère, le colliculus supérieur, le tectum optique intègre l’information visuelle à d’autres entrées sensorielles, y compris l’audition et la somatosensation, contrôlant les changements dans l’attention visuelle et les mouvements oculaires tels que les saccades ^1,5,6. Cependant, contrairement au colliculus supérieur des mammifères, le tectum optique génère continuellement de nouveaux neurones et glies à partir d’une niche de cellules souches spécialisée près des bords médial et caudal des lobes tectaux appelée zone de prolifération tectale⁷. Le maintien des progéniteurs prolifératifs dans le tectum optique et d’autres régions du système nerveux central contribue, en partie, à la remarquable capacité de régénération documentée chez le poisson-zèbre⁸.

Des travaux antérieurs examinant le cerveau de poissons aveugles ou borgnes ont révélé que la taille du tectum optique est directement proportionnelle à la quantité d’innervation rétinienne qu’il reçoit ^9,10,11. Chez les poissons des cavernes adultes, dont les yeux dégénèrent au début de l’embryogenèse, le tectum optique est sensiblement plus petit que celui des poissons de surface observés^étroitement apparentés 9. La dégénérescence de l’œil de poisson des cavernes peut être bloquée en remplaçant la lentille endogène par une lentille d’un poisson de surface pendant l’embryogenèse. Lorsque ces poissons des cavernes borgnes sont élevés à l’âge adulte, le lobe tectal innervé contient environ 10% plus de cellules que le lobe tectal non innervé⁹. De même, chez les larves de killifish qui ont été incubées avec des traitements chimiques pour générer des yeux de différentes tailles au sein d’un même individu, le côté du tectum avec plus d’innervation était plus grand et contenait plus de neurones¹⁰. Les preuves provenant d’expériences d’écrasement du nerf optique chez des poissons rouges adultes indiquent que l’innervation favorise la prolifération, la prolifération des cellules tectales diminuant lorsque l’innervation est perturbée¹¹.

Confirmant et étendant ces études classiques, plusieurs rapports récents fournissent des données suggérant que la prolifération en réponse à l’innervation est modulée, au moins en partie, par la voie BDNF-TrkB^12,13. De nombreuses questions ouvertes sur la croissance et le développement du tectum optique demeurent, notamment comment un système sensoriel en développement fait face aux blessures et à la dégénérescence axonale, quels signaux cellulaires et moléculaires permettent à l’entrée rétinienne de réguler la croissance du tectum optique, quand ces mécanismes deviennent actifs, et si la prolifération et la différenciation liées à l’innervation permettent à la rétine et à son tissu cible de coordonner les taux de croissance et d’assurer une cartographie rétinotopique précise. En outre, il existe des questions beaucoup plus vastes sur le développement dépendant de l’activité qui peuvent être abordées en interrogeant le système visuel du poisson-zèbre avec des approches chirurgicales telles que celle décrite ci-dessous.

Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’activité neuronale, en particulier à partir de l’entrée visuelle, modifie la survie et la prolifération cellulaires, l’approche décrite compare directement les lobes tectaux innervés et dénervés (Figure 1) chez les larves individuelles de poisson zèbre. Cette méthode permet de documenter la dégénérescence des axones RGC dans le tectum optique et de confirmer que le nombre de cellules mitotiques est en corrélation avec l’innervation.

Figure 1: Croquis de larves de poisson zèbre avant et après ablation unilatérale des yeux. (A) Dessin de 5 larves de dpf vues au microscope à dissection. Chaque larve est incrustée dans l’agarose à point de fusion bas et orientée latéralement avant qu’une aiguille en tungstène avec une pointe pointue et crochue ne soit utilisée pour arracher l’œil tourné vers le haut (œil gauche dans cet exemple). (B) Dessin de la vue dorsale d’une larve de 9 dpf résultant de la chirurgie décrite dans A. Seuls trois axones RGC hautement schématisés de l’œil droit sont montrés en train de défasciculer et de se connecter aux neurones du lobe tectal gauche. Abréviations : dpf = jours après la fécondation ; dps = jours après la chirurgie; RGC = cellules ganglionnaires rétiniennes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Les méthodes décrites dans le présent document ont été menées conformément aux lignes directrices et à l’approbation des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Reed College et de l’University College London. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les souches de poisson zèbre utilisées dans cette étude.

1. Préparer le matériel et les outils

1. Trouvez des solutions.
   1. Fabriquer un milieu embryonnaire (E3¹⁴) en diluant un bouillon de 60x (300 mM de NaCl, 10,2 mM de KCl, 20 mM de CaCl 2-dihydraté et 20 mM de MgCl_{2-hexahydraté} dans de l’eau désionisée, autoclavé et conservé à température ambiante). Ajouter 160 mL de 60x E3 à 10 L d’eau désionisée. Conserver à température ambiante.
   2. Faire 1% d’agarose à faible point de fusion (LMP) dans e3. Dissoudre 1 g d’agarose LMP dans 100 mL d’E3 en faisant bouillir au micro-ondes pendant 1-2 min à haute puissance. Aliquot agarose fondue dans des tubes de microfuge de 1,7 mL et conserver à 4 °C. Faire bouillir au bain-marie et maintenir dans un bloc chauffant à 40 °C lorsqu’il est prêt à être utilisé pour l’encastrement.
   3. Fabriquer la solution isotonique de Marc’s Modified Ringers (MMR¹⁵) en diluant un bouillon 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl 2-dihydraté, 50 mM HEPES, pH ajusté à 7,5 avec 10 M NaOH, puis autoclavé et conservé à température ambiante). Ajouter 10 mL de 10x MMR à 90 mL d’eau désionisée.
2. Versez les plaques Sylgard selon les instructions du fabricant, en leur permettant de durcir et de sécher pendant plusieurs jours¹⁶.
3. Aiguisez électrolytiquement les aiguilles en tungstène (protocole modifié à partir de ¹⁷).
   1. Tout d’abord, préparez une solution de KOH à 10% (p / v) en ajoutant 200 mL d’eau désionisée à un bocal en verre à large bouche avec un couvercle à vis. Incorporer lentement 20 g de granulés de KOH.
      REMARQUE: Cette solution caustique est hautement exothermique. Portez des gants et une protection oculaire et remuez la solution dans la hotte.
   2. Coupez un fil de tungstène de 2 à 3 cm de long et insérez-le dans le porte-aiguille.
   3. Connectez les fils de cathode et d’anode à l’alimentation. Fixez le clip en alligator à l’extrémité du fil cathodique à un trombone partiellement redressé et insérez le trombone dans la solution KOH, en le fixant sur le côté du pot.
   4. Ensuite, fixez le clip en alligator du fil d’anode au cou du porte-aiguille. Allumez l’alimentation (à ~20 V) et plongez le fil de tungstène dans la solution KOH, en tirant le fil hors de la solution à un angle pour aiguiser électrolytiquement le fil en une pointe fine.
      REMARQUE: Les bulles proviendront du trombone au fur et à mesure que la réaction se poursuit.
   5. Vérifiez la pointe de l’aiguille sous le microscope à dissection pour vous assurer qu’elle est suffisamment nette.
   6. Rincez l’aiguille à l’eau désionisée pour éliminer tous les résidus de KOH. Faites plusieurs aiguilles à l’avance et conservez-les jusqu’aux chirurgies et dissections larvaires.
4. Fabriquez des lames chambrées pour l’imagerie de spécimens de poissons-zèbres avec un microscope confocal vertical.
   1. Procurez-vous des lames de microscope en verre et de la résine époxy en deux parties (voir le tableau des matériaux). Mélangez l’époxy selon les instructions sur l’emballage et peignez des anneaux épais ou des rectangles sur les lames de verre. Laisser durcir et sécher les glissières dans la hotte pendant au moins 24 heures avant utilisation.

2. Collecte et élevage d’embryons

1. Couplez des poissons mâles et femelles adultes des génotypes souhaités dans des boîtes de reproduction en fin d’après-midi / début de soirée. Le lendemain matin, après qu’ils aient frayé, collectez les œufs nouvellement fécondés avec une passoire à mailles et transférez-les à l’E3 dans des boîtes de Pétri de 100 mm.
2. Incuber les embryons à ~27,5 °C avec un cycle de lumière de 14 h/10 h d’obscurité jusqu’au jour de la chirurgie. Changez e3 tous les jours ou si nécessaire.
3. Nourrissez les larves à l’aide d’un compte-gouttes rempli de rotifères récoltés une fois par jour, en commençant soit 5 jours après la fécondation (dpf), soit un jour après la chirurgie. Une fois que les larves ont plusieurs heures à manger, changez l’E3 pour éliminer les rotifères et les déchets restants.
   REMARQUE: Ne nourrissez pas les larves le jour de la chirurgie.

3. Préparer les larves pour la chirurgie

1. Le jour de la chirurgie, utilisez une pipette Pasteur en verre à large alésage pour transférer 10 à 15 larves dans une boîte de Petri de 35 mm remplie d’E3 frais.
2. Anesthésier les larves en ajoutant 3-5 gouttes de solution de tricaïne à 0,4% p/v (0,4 g de Tricaïne dissoute dans 210 mM de Tris, pH 9; solution finale ajustée à un pH de 7,4 si nécessaire¹⁸) à la boîte pour une concentration finale d’environ 0,0015% p/v de Tricaïne. Recherchez le manque de réponse au toucher pour déterminer si les larves sont correctement anesthésiées. S’ils sont toujours sensibles au toucher après environ 3 minutes, ajoutez 2-3 gouttes supplémentaires de solution de tricaïne à 0,4% p / v et réévaluez.
   REMARQUE: À ce stade de développement, il est possible de surveiller le flux sanguin et la fréquence cardiaque en plus de la motilité sous le microscope à disséquer.
3. Immobiliser les larves de poisson zèbre anesthésiées en les intégrant dans 1% d’agarose LMP dissoute dans e3.
   1. Tout d’abord, placez le couvercle d’une boîte de Petri de 35 mm face vers le haut sous le microscope à dissection. Ensuite, emmenez une larve dans une pipette Pasteur en verre à alésage étroit avec seulement une petite quantité d’E3.
   2. Ensuite, aspirer environ 200 μL d’agarose LMP fondue, chaude (~40 °C) 1% dans la pipette avec la larve. Enfin, versez la larve et l’agarose sur le couvercle de la boîte de Petri à l’envers.
   3. Utilisez une aiguille en tungstène terne pour manœuvrer rapidement mais doucement la larve afin qu’elle soit latérale, avec un œil tourné vers le haut. Attendez que l’agarose se fixe (~5 min).
      REMARQUE: Si l’agarose durcit alors que la larve n’est pas latérale, libérez-la de l’agarose (comme décrit à l’étape 5) et retournez-la dans le plat avec E3 et tricaïne.

4. Enlèvement des yeux

1. Une fois que l’agarose est réglée et que la larve est positionnée latéralement, utilisez la pointe d’une aiguille de tungstène très fine et aiguisée électrolytiquement pour percer la peau autour de l’œil, en suivant le bord de l’orbite oculaire.
2. Ensuite, faites glisser le bord de l’aiguille (pas la pointe) sous l’œil du côté temporal-ventral de l’œil. Utilisez une pression contrôlée pour libérer l’œil de l’orbite.
3. Utilisez des pinces chirurgicales très fines pour enlever l’œil en pinçant le nerf optique et en poussant l’œil de médial à latéral. Alternativement, continuez simplement à appuyer sur l’œil dorsalement et antérieurement avec le côté de l’aiguille, pour éventuellement trancher à travers le nerf optique et libérer l’œil.
   REMARQUE: Si des tissus autres que l’œil sont accidentellement poignardés pendant la chirurgie, tuez rapidement et humainement la larve par décapitation rapide.

5. Soins postopératoires jusqu’au critère d’évaluation expérimental

1. Après un retrait oculaire réussi, couvrez l’agarose avec une solution ROR.
2. Libérez chaque larve de l’agarose en brossant doucement une aiguille de tungstène autour de leur tête, puis autour de leur corps tout en stabilisant le couvercle de la boîte de Petri avec une pince.
3. Transférer les larves borgnes dans une boîte de Petri de 35 mm contenant du ROR complété par une dilution 1:100 d’un cocktail pénicilline/streptomycine. Incuber les embryons à ~27,5 °C avec un cycle de lumière de 14 h/10 h d’obscurité.
   REMARQUE: Cette solution isotonique de ROR complétée par des antibiotiques aide initialement à la guérison et à la survie des larves. Chaque plat peut contenir jusqu’à 15 larves en convalescence.
4. Le lendemain, retournez les larves à E3. À partir de l’après-midi suivant la chirurgie, nourrissez les larves (~ 6 dpf et plus) à l’aide d’un compte-gouttes rempli de rotifères récoltés une fois par jour. Après que les larves ont eu plusieurs heures à manger, changez l’E3 pour enlever les rotifères et les déchets restants.

6. Fixation des larves

1. Une fois que les larves ont atteint le stade de développement souhaité pour l’analyse, anesthésiez-les avec une dose létale de tricaïne (~ 0,4% de concentration finale) jusqu’à ce que leur cœur se soit arrêté.
2. Pipette jusqu’à 30 larves par tube de microfuge de 1,5 mL. Enlevez l’excès d’E3, puis ajoutez 0,5 à 1 mL de solution fixatrice (4 % de paraformaldéhyde (PFA) et 4 % de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) pour fixer le tissu. Incuber les larves pendant la nuit à 4 °C.
3. Lavez les larves avec du PBS le lendemain en enlevant le fixateur et en rinçant les larves 3 à 4 fois avec du PBS. Conserver les larves à 4 °C jusqu’à 7 jours avant la dissection.

7. Disséquer les larves pour révéler les cerveaux (adapté de ¹⁵)

1. Suspendre les larves fixes dans des gouttelettes de PBS sur une plaque de Sylgard sous un microscope à dissection. Fixez-les latéralement en plaçant deux broches en tungstène (généralement de vieilles aiguilles en tungstène de moins de 2 cm) à travers la notochorde, avec une broche juste postérieure à la zone pigmentée couvrant la région aorte-gonade-mésonéphros (AGM) et une autre alignée avec l’extrémité de l’extension du jaune.
   REMARQUE: Positionnez les broches en tungstène en aussi peu de tentatives que possible, car le tissu deviendra plus friable à chaque ponction.
2. Utilisez une aiguille en tungstène très pointue et une pince pointue pour exposer le cerveau en enlevant, dans cet ordre, le ou les yeux, l’oreille, la mâchoire, le tube digestif et la peau crânienne dorsale.
   1. Tout d’abord, retirez l’œil à l’aide d’une technique similaire à l’ablation chirurgicale des yeux à l’étape 4. Ensuite, détachez la larve et retournez-la du côté opposé, afin que l’autre œil soit accessible et répétez. Alternativement, enfoncez l’aiguille à travers la mâchoire de l’autre côté et retirez l’œil sans détacher.
      REMARQUE: Les yeux peuvent être prélevés à ce stade si l’analyse de ce tissu est souhaitée (similaire à ¹⁹).
   2. Ensuite, utilisez l’aiguille en tungstène pour gratter du côté temporal au côté ventral de l’oreille. Dans la même action / mouvement, amenez l’aiguille postérieure à la mâchoire et tirez doucement vers l’avant jusqu’à ce que l’oreille et la mâchoire soient enlevées.
   3. Utilisez des pinces pour retirer les organes ventraux et tout jaune restant.
   4. Enfin, faites une incision peu profonde dans la peau crânienne dorsale près de la jonction entre le cerveau postérieur et la moelle épinière. Soulevez la peau avec la pince et tirez-la vers l’avant et autour du télencéphale. Si cela s’avère trop difficile, commencez par l’incision initiale dans le cerveau postérieur et tirez la peau d’abord latéralement, puis ventralement et antérieurement, en prenant grand soin de ne pas rayer les bords latéraux du tectum.
      REMARQUE: Parce que le mésencéphale est l’objet de l’étude, le cerveau postérieur peut être coupé; cependant, une incision profonde peut entraîner une décapitation.
   5. Retirez tout tissu restant avec une pince. Détachez la larve et transférez-la au PBS dans un tube de microfuge de 1,5 mL.
      REMARQUE: Laissez la queue attachée au cerveau pour une meilleure visibilité lors de l’exécution de protocoles de montage complet.

8. Déshydratation et stockage du cerveau

1. Retirez le PBS du cerveau et ajoutez 1 mL de PBS contenant 0,1 % de TritonX-100 (PBST). Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
2. Retirez le PBST et remplacez-le par une solution 50:50 methanol:PBST. Incuber pendant 5-10 min à température ambiante.
3. Lavez le cerveau avec 100% de méthanol (MeOH) deux fois pendant 5 minutes chacun à température ambiante.
4. Stocker le cerveau dans du MeOH à 100% à -20 °C pendant au moins 16 h avant d’effectuer une immunohistochimie ou d’autres procédures complètes.
   REMARQUE: Les cerveaux peuvent être stockés dans MeOH jusqu’à 2 ans à -20 ° C.

9. Immunohistochimie

REMARQUE: Les protocoles établis pour de nombreuses techniques de montage complet utiles chez le poisson-zèbre peuvent être trouvés sur ZFIN²⁰. Ce manuscrit fournit des exemples comparant des larves borgnes et bi-oculaires qui ont été immunocolorées avec des anticorps qui reconnaissent soit la protéine fluorescente rouge (RFP), qui est exprimée dans les axones du nerf optique dans la lignée Tg[atoh7: RFP] (Figure 2), soit l’histone phosphorylée H3 (PH3), qui met en évidence les cellules mitotiques (Figure 3). Un protocole d’immunohistochimie standard pour les embryons et les larves en grains entiers est résumé ci-dessous.

1. Tout d’abord, réhydratez les cerveaux larvaires avec une série graduée de lavages MeOH:PBST à température ambiante en incubant les échantillons dans 50:50 MeOH:PBST pendant 5 min, puis dans 30:70 MeOH:PBST pendant 5 min, et en terminant par 3 lavages de PBST.
2. Pour perméabiliser les cerveaux, incubez-les dans du PBST supplémenté en protéinase K (PK) à une concentration finale de 20 μg/ml pk pendant 30 min à 37 °C. Conserver les aliquotes de 10 mg/mL pk à -20 °C et les décongeler avant utilisation.
3. Retirez la solution PK et lavez toute enzyme restante en rinçant le cerveau avec pbST 3 fois sur 15 min.
4. Refixez les cerveaux perméabilisés en les incubant dans 4% de PFA pendant 20 min à 25 °C (ou température ambiante). Ensuite, retirez le PFA et lavez tout fixateur restant en rinçant le cerveau 3 fois sur 15 min avec pbST.
5. Remplacer le rinçage PBST final par un tampon immunobloquant (IB) fraîchement préparé (10 % de sérum de chèvre normal et 1 % de DMSO dans le PBST) et incuber à température ambiante pendant au moins 1 h.
6. Diluer les anticorps primaires dans un tampon IB à la concentration appropriée (p. ex., 1:500 pour les anticorps RFP et 1:300 pour les anticorps PH3).
7. Retirez le tampon IB du cerveau et remplacez-le par la dilution de l’anticorps primaire. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital avec un léger balancement. Assurez-vous que les tubes reposent solidement sur les côtés.
8. Le lendemain matin, retirez la solution d’anticorps primaire avec une micropipette, rincez plusieurs fois dans du PBST, puis lavez le cerveau dans du PBST à température ambiante pendant 4 x 30 min.
   REMARQUE: Les dilutions d’anticorps primaires peuvent être réutilisées une fois dans les ~ 7 jours si elles sont stockées à 4 ° C.
9. Rincer le cerveau dans un tampon IB tout en diluant les anticorps secondaires dans un tampon IB à la concentration appropriée (par exemple, 1:500 pour Alexa-fluor 568 anti-lapin).
10. Retirez le tampon IB et remplacez-le par la dilution secondaire de l’anticorps. Incuber toute la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital avec un léger balancement des tubes reposant sur les côtés.
11. Le lendemain matin, retirez la solution d’anticorps secondaire, rincez avec du PBST, puis lavez le cerveau dans du PBST à température ambiante pendant 4 x 30 min.
12. Contre-tache avec 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou ToPro3 (1:5 000 dans PBST à 4 °C pendant la nuit).
13. Le lendemain matin, transférez les cerveaux larvaires dans PBS et passez aux étapes de montage et d’imagerie énumérées ci-dessous.

10. Montage et imagerie

1. Fixez une glissière chambrée dans le couvercle d’une boîte de Petri de 100 mm avec de la graisse sous vide.
2. Transférez les larves immunocolorées et traitées sur une plaque de puits ou une lame de dépression pour les voir avec un microscope à dissection.
3. Montez les larves sur la lame chambrée en colonnes d’agarose LMP à 1%.
   1. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, placez une larve sur la lame chambrée, en déposant le moins de PBS possible. Avec la même pipette, couvrez la larve avec de l’agarose LMP fondue à 1% (~40 °C).
   2. Avec une aiguille ou une pince en tungstène émoussée, tirez l’agarose dans une colonne, puis positionnez la larve aussi symétriquement que possible, avec la surface dorsale visible.
   3. Répétez cette procédure pour les larves restantes.
   4. Une fois que l’agarose a gelé, couvrez-la de quelques gouttes de PBS, puis placez-la sur la scène du microscope confocal.
4. Alignez la lentille de l’objectif avec l’échantillon, focalisez le microscope à l’aide de la lumière transmise et éclairez l’échantillon avec les lasers appropriés.
   REMARQUE: Dans cet exemple, des longueurs d’onde de 405 nm et 568 nm ont été utilisées pour exciter DAPI et RFP, respectivement.
5. Ajustez le gain, le décalage et la puissance du laser en déplaçant les barres de curseur à un niveau approprié par rapport au signal et au détecteur utilisé. Vérifiez les histogrammes de chaque couche et cliquez sur le bouton Indicateur d’état de saturation au-dessus de l’image pour évaluer le niveau d’exposition, en vous assurant qu’aucun des pixels n’est saturé et que le rapport signal/bruit est élevé. Pour un exemple de paramètres d’imagerie confocale optimaux pour la résolution cellulaire et subcellulaire chez le poisson-zèbre, voir ²¹.
6. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile de plans z à l’aide de la molette de défilement de la souris pour trouver le haut et le bas de l’échantillon. Cliquez sur les limites supérieure et inférieure pour l’acquisition d’images, puis déclenchez la capture z-stack en cliquant sur le bouton Exécuter maintenant .
   REMARQUE: Selon la symétrie du cerveau, la profondeur z totale pour un cerveau de poisson z larvaire de 9 dpf sera d’environ 150-200 μm.
7. Traitez et colorisez les images en tenant compte de l’accessibilité daltonienne (par exemple, utilisez le bleu et l’orange ou le magenta et le vert pour les images bicolores). Définissez des tables de choix dans le logiciel utilisé pour capturer les images ou dans un logiciel de traitement d’image tel que Photoshop d’Adobe.
8. Dans Photoshop, les photomicrographies brutes couleur enregistrées au format TIFF (Tagged Image File Format) 8 bits (i) convertissent le mode Image en RVB et (ii) accèdent à l’option Courbes sous le | Ajuste les menus, puis (iii) fait glisser les sorties de lumière colorée appropriées à 0 ou 255 niveaux pour obtenir la couleur souhaitée. Par exemple, pour obtenir un signal vert, sélectionnez le canal rouge et faites glisser sa sortie sur 0 ; Ensuite, sélectionnez le canal bleu et faites glisser sa sortie sur 0 aussi. De même, pour obtenir un signal magenta, sélectionnez le canal vert et faites glisser sa sortie sur 0; laissez les canaux rouges et bleus tels quels.
   REMARQUE: Des étapes similaires peuvent être effectuées dans le programme gratuit Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
9. Quantifiez manuellement le nombre de cellules affichant un marqueur spécifique à l’aide du plug-in de compteur de cellules dans ImageJ²², disponible sous Analyser dans le menu Plugins. Des exemples d’utilisation d’ImageJ pour le comptage de cellules peuvent être trouvés dans de nombreux tutoriels, y compris ²³.
10. Générez des représentations graphiques de données dans des logiciels statistiques tels que RStudio (voir les données supplémentaires pour . Rmd).

Representative Results

Pour confirmer si l’ablation des yeux était complète et évaluer comment le tectum optique change, des chirurgies ont été effectuées dans la souche Tg[atoh7:RFP], qui étiquette tous les RGC avec un APPEL d’offres ciblé sur la membrane et, par conséquent, tous les axones qui se projettent à partir de la rétine et forment le nerf optique²⁴. Bien que l’utilisation de cette souche ne soit pas absolument nécessaire, elle permet une observation et une visualisation simples des termini du nerf optique dans le neuropil du tectum optique. D’autres approches pour marquer le nerf optique, telles que le traçage axonal avec des colorants lipophiles DiI ou DiO^25,26 ou le marquage multispectral avec brainbow²⁷, seraient également possibles.

Comme le montre la figure 2, une dégénérescence progressive des axones rétiniens dans le neuropil du tectum optique a été observée après l’ablation des yeux. Deux jours après la chirurgie, les axones marqués par la DP présentaient des caractéristiques de dégénérescence wallérienne rapide²⁸, telles que le blebbing et la fragmentation (Figure 2A, B). Des travaux récents ont montré que les microglies engloutissent plus de myéline lorsque les neurones sont^{réduits au silence 29}. Conformément à la microglie engloutissant des morceaux des axones RGC en dégénérescence et migrant loin de la source de la dégénérescence, des ponctuations brillantes marquées rfP à l’intérieur et à l’extérieur du neuropil tectal ont été notées (Figure 1B, flèches). Quatre jours après la chirurgie, les axones fragmentés et les débris axonaux marqués par rfp sont considérablement réduits dans l’un ou l’autre lobe tectal, ce qui indique une clairance relativement rapide des axones mourants et dégénérés (Figure 2C,D).

Pour effectuer une immunohistochimie complète et visualiser le tectum optique des larves de poisson-zèbre, le cerveau a été exposé en disséquant les yeux, la mâchoire, les oreilles et la calotte crânienne de la peau et des tissus conjonctifs. Idéalement, le cerveau reste intact pendant cette procédure (p. ex., Figure 2C,D). Cependant, certaines parties du cerveau antérieur, en particulier le bulbe olfactif, sont susceptibles d’être endommagées ou complètement enlevées lorsque la calotte crânienne de la peau ou de la mâchoire est enlevée (Figure 2A, pointe de flèche). De plus, il arrive parfois que le bord latéral du tectum soit tranché lors du perçage ou du pincement de la peau pour l’arracher du cerveau (p. ex., figure 2A; déchirure sur le lobe tectal droit).

L’immunohistochimie a également été utilisée pour évaluer le nombre de cellules mitotiques dans les lobes innervés et non innervés du tectum optique en colorant des cerveaux entiers avec un anticorps PH3. Ces données montrent significativement moins de cellules mitotiques du côté dénervé des poissons larvaires borgnes (p = 0,00033, test t de Welch; Graphique 3).

Figure 2 : L’ablation des yeux à 5 dpf déclenche la dégénérescence des axones du nerf optique. (A-D) Projections représentatives d’intensité maximale montrant des vues dorsales de cerveaux de type sauvage provenant de larves intactes fixées à 7 dpf (A) ou 9 dpf (C), ou de larves borgnes provenant de chirurgies d’extirpation oculaire à 5 dpf, fixes à 2 dps (B) ou 4 dps (D). Tous les noyaux sont colorés avec DAPI (vert), et les axones du nerf optique se terminant dans le neuropil du tectum optique sont marqués par le transgène atoh7:RFP (magenta). L’astérisque indique un neuropil tectal innervé chez les larves dont seul l’œil droit est intact. Les flèches indiquent des exemples de fragments d’axones RGC dégénérés émanant du tectum optique dénervé. Arrowhead indique les parties manquantes du cerveau antérieur. Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : dpf = jours après la fécondation ; dps = jours après la chirurgie; RGC = cellules ganglionnaires de la rétine; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Le nombre de cellules mitotiques dans le tectum optique augmente avec l’innervation. (A-B) Projections représentatives d’intensité maximale montrant des vues dorsales de cerveaux de type sauvage à partir de larves intactes (A) ou borgnes (B) 9 dpf immunocolorées avec des anticorps pour le marqueur mitotique PH3 (magenta) et des noyaux contre-colorés avec DAPI (vert). L’astérisque indique un neuropil tectal innervé de l’œil droit intact. (C) Graphique en boîte avec tous les points de données individuels superposés montrant la quantification du rapport des cellules PH3⁺ dans le lobe tectal innervé (gauche) par rapport au lobe tectal dénervé (droit) en tant que rapport de différence (gauche-droite / total) pour les larves borgnes (n = 12) et bi-yeux (n = 8) 9 dpf. Moyennes des deux conditions par rapport au test t de Welch (***, p < 0,0005). Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : dpf = jours après la fécondation ; dps = jours après la chirurgie; PH3 = histone phosphorylée H3; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire : Plan et instructions pour le tracé illustré à la figure 3C. Ce fichier contient toutes les données et le code afin que n’importe qui puisse reproduire le diagramme de boîte avec tous les points de données superposés, comme illustré à la figure 3C. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les techniques décrites dans cet article illustrent l’une des nombreuses approches pour étudier le développement du système visuel des vertébrés chez le poisson-zèbre. D’autres chercheurs ont publié des méthodes pour disséquer la rétine embryonnaire et effectuer des analyses d’expression génique¹⁹ ou visualiser l’activité neuronale dans le tectum optique³⁰. Cet article fournit une approche pour explorer comment l’entrée rétinienne différentielle peut influencer les comportements cellulaires dans le tectum optique.

Pour assurer une disparition oculaire réussie et la survie des larves après la chirurgie, il est important que les larves soient en bonne santé, adéquatement anesthésiées et immobilisées dans 1% d’agarose. Il est également crucial que les pinces et les aiguilles en tungstène soient très pointues et propres. Les larves survivent mieux lorsqu’elles ne sont pas nourries 24 heures avant ou après la chirurgie, et l’élevage des larves en ROR complété par des antibiotiques accélère le processus de guérison. Il est important de noter que la force ionique plus élevée du ROR et surtout la concentration plus élevée de calcium favorisent la guérison¹⁴. Cependant, une exposition plus longue à la salinité plus élevée peut diminuer la survie, comme cela a été documenté chez le poisson-zèbre embryonnaire³¹. Une étape la plus critique est la fixation pour assurer la réussite des dissections cérébrales, qui sont essentielles pour l’analyse des données d’images d’échantillons immunocolorés. L’utilisation de PFA fraîchement préparé à 4% complété par 4% de saccharose (affectueusement appelé sweet fix) tend à augmenter la facilité d’élimination de la peau et la préservation des tissus cérébraux. Comme pour les chirurgies, des outils pointus et propres sont indispensables pour disséquer les cerveaux.

L’un des plus grands défis de ce protocole est l’intégration de larves pour les extirpations oculaires. Il est important que chaque personne trouve le moyen qui lui convient le mieux afin qu’elle puisse enlever rapidement et en toute confiance l’œil larvaire. Si la larve est poignardée accidentellement pendant la chirurgie, tuez-la sans cruauté par décapitation. Un autre défi consiste à déterminer les concentrations d’anticorps les plus efficaces pour l’immunocoloration en montage entier. Pour déterminer les concentrations d’anticorps appropriées, utilisez la littérature publiée comme point de départ et optimisez le protocole, car l’utilisation de réactifs publiés sur différents tissus (en particulier sur des tissus plus gros ou des animaux plus âgés) peut nécessiter des concentrations et / ou des temps d’incubation accrus.

La principale limite de cette méthode est le temps qu’une seule expérience prend du début à la fin et le nombre de poissons qui peuvent être étudiés à un moment donné. Par exemple, toutes les données présentées à la figure 3 ont pris environ un mois entre l’appariement initial des poissons et la collecte et l’analyse finales des données. Cette approche à débit relativement faible pourrait être complétée par des approches génétiques hétérologues qui font taire sélectivement l’activité neuronale dans le système visuel^32,33 ou par ^des mutants dépourvus d’axones RGC ou d’activité^34,35.

L’importance de cette méthode est qu’elle apporte une technique embryologique traditionnelle aux lignées de poissons transgéniques modernes, permettant une comparaison directe des mécanismes cellulaires et génétiques opérant dans chacun des lobes tectaux au sein d’un même individu. De plus, cette méthode est mûre pour une application à d’autres systèmes expérimentaux, y compris les poissons de surface Astyanax ³⁶ et / ou les larves transgéniques de poisson zèbre avec des microglies ^37,38,39 marquées par fluorescence et des astrocytes⁴⁰ pour étudier comment le système nerveux du poisson en développement réagit à une blessure aussi dramatique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation.
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae.
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions.
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (NIS-Elements by Nikon) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			Freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
RStudio			Freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains. This study used the AB, TU, Tg[atoh7:RFP] strains.			Available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.