Summary
Høyoppløselige kryo-EM-kart over makromolekyler kan også oppnås ved å bruke 200 kV TEM mikroskoper. Denne protokollen viser de beste fremgangsmåtene for å angi nøyaktige optikkjusteringer, datainnsamlingsordninger og valg av bildeområder som alle er avgjørende for vellykket innsamling av datasett med høy oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM.
Abstract
Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har blitt etablert som en rutinemessig metode for proteinstrukturbestemmelse det siste tiåret, og tar en stadig økende andel av publiserte strukturelle data. Nylige fremskritt innen TEM-teknologi og automatisering har økt både hastigheten på datainnsamling og kvalitet på innsamvede bilder, samtidig som det reduserer det nødvendige kompetansenivået for å skaffe kryo-EM-kart ved sub-3 Å-oppløsninger. Mens de fleste av slike høyoppløselige strukturer er oppnådd ved hjelp av toppmoderne 300 kV cryo-TEM-systemer, kan høyoppløselige strukturer også oppnås med 200 kV cryo-TEM-systemer, spesielt når de er utstyrt med et energifilter. I tillegg reduserer automatisering av mikroskopjusteringer og datainnsamling med bildekvalitetsvurdering i sanntid systemkompleksiteten og sikrer optimale mikroskopinnstillinger, noe som resulterer i økt utbytte av bilder av høy kvalitet og generell gjennomstrømning av datainnsamling. Denne protokollen demonstrerer implementeringen av nyere teknologiske fremskritt og automatiseringsfunksjoner på et 200 kV kryooverføringselektronmikroskop og viser hvordan man samler inn data for rekonstruksjon av 3D-kart som er tilstrekkelig for de novo atommodellbygging. Vi fokuserer på beste praksis, kritiske variabler og vanlige problemer som må vurderes for å muliggjøre rutinemessig innsamling av slike høyoppløselige cryo-EM-datasett. Spesielt følgende viktige emner gjennomgås i detalj: i) automatisering av mikroskopjusteringer, ii) valg av egnede områder for datainnsamling, iii) optimale optiske parametere for innsamling av data av høy kvalitet, iv) energifilterjustering for nulltapsavbildning og v) datahåndtering og kvalitetsvurdering. Anvendelse av beste praksis og forbedring av oppnåelig oppløsning ved hjelp av et energifilter vil bli demonstrert på eksempelet på apo-ferritin som ble rekonstruert til 1,6 Å, og Thermoplasma acidophilum 20S proteasome rekonstruert til 2,1-Å oppløsning ved hjelp av en 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor.
Introduction
Bestemmelse av proteinstruktur er avgjørende for å forstå molekylær arkitektur, funksjon og regulering av proteinkomplekser involvert i viktige cellulære prosesser, for eksempel cellemetabolisme, signaltransduksjon eller vertspatogeninteraksjoner. Kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) har dukket opp som en kraftig teknikk som er i stand til å løse 3D-strukturen til mange proteiner og deres komplekser som var for utfordrende for de tradisjonelle strukturelle teknikkene, for eksempel røntgendiffraksjon og NMR-spektroskopi. Spesielt har kryo-EM blitt bevist som den valgte metoden for membranproteiner, som ikke lett kan krystalliseres eller tilberedes i tilstrekkelige mengder for de tradisjonelle strukturelle teknikkene, og ga ny innsikt i strukturen og funksjonen til viktige cellulære reseptorer og ionkanaler 1,2,3,4,5 . Senest har cryo-EM spilt en viktig rolle i kampen mot Covid-19-pandemien ved å bestemme mekanismen for SARS-CoV-2-infeksjon på molekylært nivå, som belyste opprinnelsen til Covid-19 sykdom og ga grunnlag for rask utvikling av effektive vaksiner og terapeutiskestoffer 6,7,8,9,10.
Vanligvis brukes high-end 300-kV overføringselektronmikroskop (TEM) til høyoppløselig strukturbestemmelse av biomolekyler ved kryo-EM enpartikkelanalyse (SPA) for å avsløre deres konformasjon og interaksjoner. Nylig nådde SPA-teknikken en ny grense da den vanlige benchmark cryo-EM-prøven apo-ferritin ble rekonstruert ved atomoppløsning (1.2 Å)11,12 ved hjelp av en 300-kV TEM utstyrt med kaldt feltutslippspistol (E-CFEG), en direkte elektrondetektor og et energifilter. Ved denne resolusjonen var det mulig å entydig løse posisjoner av individuelle atomer i strukturen, konformasjon av individuelle aminosyresidekjeder samt hydrogenbinding og andre interaksjoner, som åpner nye muligheter for strukturbasert legemiddeloppdagelse av nye mål og optimalisering av eksisterende legemiddelkandidater.
Mellomtone 200 kV TEM mikroskoper brukes ofte til prøvescreening og prøveoptimalisering før endelig høyoppløselig datainnsamling ved hjelp av high-end TEM mikroskoper, spesielt på større cryo-EM-anlegg. Bildeprøver kan vanligvis løses i oppløsningsområdet 3-4 Å som er tilstrekkelig til å gå over til en avansert TEM på 300 kV for endelig datainnsamling. Derfor er datainnsamling ved hjelp av 200-kV TEM ofte ikke ytterligere optimalisert for høyest mulig oppløsningsresultater. Videre kan mange interessante biologiske spørsmål allerede besvares og publiseres ved disse resolusjonene, da alle aminosyre sidekjeder allerede er løst, og belegg av ligandbindingssteder kan også på en pålitelig måte bestemmes13. Det har allerede vist seg at 200 kV TEMs kan nå oppløsninger utover 3 Å for mange prøver 14,15,16,17,18. Bilder tatt ved 200 kV viser iboende høyere kontrast av avbildet partikler, noe som til og med kan lette mer nøyaktig innledende justering av partiklene til tross for mer svekket signal ved høy oppløsning sammenlignet med 300 kV TEM-bilder. Det er viktig å merke seg at den oppnådde oppløsningen av rekonstruerte kryo-EM-kart også er begrenset av strukturell fleksibilitet og konformasjons heterogenitet av avbildet prøver, som påvirker både 200-kV og 300-kV rekonstruksjoner. Faktisk ble mye mer kryo-EM-rekonstruksjoner oppnådd ved hjelp av 300 kV-systemene løst i 3-4 Å-oppløsningsområdet enn ved høyere oppløsninger19. Siden 200 kV TEM-mikroskoper er mindre komplekse og passer inn i mindre rom, representerer disse mikroskopene et godt, rimeligere alternativ for strukturbestemmelse av biologiske makromolekyler ved kryo-EM samtidig som automatisering av lange datainnsamlinger fra flere prøver som er lagret i mikroskopet Autoloader-systemet, bevares.
Innsamling av cryo-EM-datasett for høyoppløselig strukturbestemmelse krever nøyaktig justering av mikroskopoptikken. Kolonnejusteringer går systematisk fra elektronkilden ned til kondensatorlinsesystemet, objektivlinsen og energifilteret med en elektrondetektor. Den fullstendige sekvensen med justeringer er vanligvis ikke nødvendig. Ved behov styres brukeren via halvautomatiske prosedyrer med riktig beskrivelse av hvert trinn i et kontekstavhengig hjelpevindu gjennom justeringsprosedyren i mikroskopbrukergrensesnittet (Direct Alignments kontrollpanel). Når mikroskopet er fullstendig justert, forblir elektronoptikken stabil, og justeringene trenger ikke å endres i minst noen måneder. Bare de mest sensitive justeringene, for eksempel parallell belysning av prøveplanet, objektiv astigmatisme og komafri justering, må finjusteres like før innsamlingen av hvert datasett startes. Kvaliteten på innsamlede data kan deretter overvåkes under datainnsamling ved hjelp av forskjellige programvarepakker, for eksempel EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live20, Relion21, Scipion22, WARP23 eller Appion24.
I tillegg til nøyaktige justeringer av mikroskopet, er den høye kvaliteten på godt rensede prøver med minimal konformasjons- og komposisjonell heterogenitet også en forutsetning for innsamling av høyoppløselige datasett og løsning av høyoppløselige strukturer. Flere detaljer om typiske protokoller, hyppige utfordringer og mulige rettsmidler finner du i andre vurderinger dedikert til dette emnet 25,26,27. I hovedsak er det viktig å finne områder på et gitt kryo-EM-rutenett som har tilstrekkelig tynn is til å bevare høyoppløselig informasjon, og individuelle partikler er tett fordelt ved tilfeldige orienteringer uten overlappinger. Typiske kryo-EM-gitter har imidlertid ikke-ensartet istykkelse, og det er derfor viktig å finne og velge de optimale områdene for avbildning. Ulike måter for estimering av istykkelse på nettet er tilgjengelig i programvarepakker dedikert til automatisert innsamling av cryo-EM-datasett, for eksempel EPU 2, Leginon28 eller SerialEM29.
Fremveksten av raske og sensitive direkte elektrondetektorer gjorde det mulig å samle bilder i mange fraksjoner som filmer som muliggjorde kompensasjon av stråleinduserte bevegelser og resulterte i en betydelig økning i kvaliteten og mengden data som brukes i bildebehandling og endelig 3D-rekonstruksjon30. Samtidig gir automatisering og datainnsamling med høy gjennomstrømning enorme datasett med tusenvis av bilder/filmer som representerer utfordringer for datalagring og tilgang. Den vedtatte modellen med store cryo-EM-anlegg som betjener titalls til hundrevis av brukere, krever spesielt organisert datahåndtering med riktig sporing og datadeling i etablerte cryo-EM-rørledninger31,32.
Denne studien beskriver en protokoll for rutinemessig innsamling av høyoppløselige cryo-EM-datasett ved hjelp av 200 kV Glacios TEM mikroskop. Nødvendige justeringer av mikroskopoptikken er beskrevet sammen med prosedyrer for evaluering av kryo-EM-prøver og valg av egnede områder for datainnsamling med høy oppløsning. Organiseringen av innsamlede data og relaterte metadata med eksempelinformasjon er demonstrert i Athena - en datahåndteringsplattform som letter gjennomgangen av eksempelinformasjon og innsamlede data. Ved hjelp av musens apo-ferritinprøve var det mulig å oppnå en 3D-rekonstruksjon ved 1,6 Å resolusjon13. Ved hjelp av den beskrevne protokollen rekonstruerte vi også 3D-tetthetskartet over 20S-proteasomet fra Thermoplasma acidophilum ved 2,1 Å-oppløsning.
Protocol
Alle trinnene i protokollen er beskrevet for 200 kV Glacios TEM-systemet (referert heretter som 200 kV TEM) utstyrt med Selectris-X-energifilteret (referert heretter som energifilter) og Falcon 4-detektoren (referert heretter som direkte elektrondetektor). Protokolltrinnene er spesifikke for EPU-programmet, som er standard SPA-datainnsamlingsprogramvare forhåndsinstallert på hvert Glacios-system. Protokolltrinnene nedenfor tilsvarer EPU versjon 2.14, og små endringer forventes når du bruker en annen EPU-versjon. Forutsetninger for denne protokollen er: i) pistol- og kolonnejusteringene er godt justert, ii) EM-kalibreringene er riktige og iii) EPU-autofunksjonene er riktig kalibrert.
1. Laste gitter inn i mikroskopet
MERK: Den 200 kV TEM som brukes i dette eksperimentet kan holde opptil 12 autogrids (dvs. konvensjonelle TEM-rutenett klippet inn i en spesiell patron) i en kassett som er lastet inne i Autoloader av mikroskopet og stadig holdt ved temperaturer under -170 °C for å forhindre prøvedevitrifisering.
- Sett autogrider inn i Autoloader-kassetten under flytende nitrogenforhold.
- Sett kassetten med autogrider inn i en væske-nitrogenkjølt overføringskapsel.
- Sett kapselen inn i mikroskopet og klikk på Dock-knappen i mikroskopets brukergrensesnitt for å laste kassetten fra kapselen inn i autoloaderen til mikroskopet.
- Klikk på Inventar-knappen for å sjekke tilstedeværelsen av autogrider i den lastede kassetten.
- Klikk på Last inn og fjern-knappene for å sette inn autogrider i kolonnen for TEM-avbildning.
2. Sette et prosjekt i en datahåndteringsplattform (valgfritt)
MERK: Eksempelinformasjon og innsamlede data kan organiseres i den medfølgende databehandlingsplattformen som gjør det mulig å lagre strukturerte data for alle tilkoblede instrumenter. Et prosjekt kan opprettes som alle arbeidsflyttrinn kan defineres for å fange opp bilder og metadata på en organisert måte for gjennomgang og eksport.
- Start datahåndteringsportalprogrammet og logg inn med brukernavn og passord.
- I panelet til venstre i portalgrensesnittet klikker du på Legg til prosjekt-knappen for å opprette et nytt prosjekt eller klikker en knapp for et eksisterende prosjekt i listen nedenfor for å åpne et prosjekt.
- Klikk legg til eksperiment for å opprette et nytt eksperiment i det åpne prosjektet.
- Fyll ut beskrivelsen i Metadata-panelet for det nye eksperimentet, og klikk på Legg til arbeidsflyt-knappen for å opprette en ny arbeidsflyt i eksperimentet (f.eks. enkeltpartikkelanalyse).
- Du kan også klikke Legg til trinn-knappen i det midterste panelet for å opprette en skreddersydd arbeidsflyt eller legge til flere trinn i den forhåndsdefinerte SPA-arbeidsflyten (figur 1 og figur 2).
MERK: Trinnene kan representere prøvepreparering, prøvekarakterisering ved biokjemiteknikker, prøvevistrifisering, screening av kryo-EM-rutenett, datainnsamlingsøkter og dataanalyse. - Du kan eventuelt fylle ut beskrivelser i notatene for hvert trinn, som kan inneholde bilder og bilder.
- Opprett et datasetttrinn i arbeidsflyten, og velg datasetttypen som EPU.
MERK: Dette vil tillate analyseprogramvaren å plassere alle resultatdata / metadata på riktig sted i databehandlingsportalen automatisk under datainnsamling og eksportere dataene automatisk til det foretrukne målet, samtidig som du opprettholder en fullstendig oversikt over alle trinn og dataoverføring. - Fyll maler om eksempel- og EM-rutenettene i biokjemitrinnet , og knytt hvert rutenett til et eksempel (vær oppmerksom på at ett utvalg kan knyttes til flere rutenett).
- Tilknytt kombinasjoner av eksempelrutenett i metadatadelen i Datasett-trinnet .
3. Sett opp avbildningsforhåndsinnstillinger og bildeskiftkalibreringer i analyseprogramvaren
- Angi bildeparametere for individuelle bildemoduser, som vist i tabell 1. Hensynet til valg av bestemte innstillinger er beskrevet i detalj i diskusjonsdelen.
- Angi parallell belysning for den valgte forstørrelsen i forhåndsinnstillingen Datainnsamling for analyseprogramvaren
MERK: Det er bare én innstilling på C2-objektivet for parallell belysning av prøven ved den angitte SPOT-størrelsen (dvs. forhåndsinnstilte styrker til C1-objektivet) på TEM-systemer med 2 kondensator, for eksempel 200 kV TEM som brukes i denne studien. Elektrondosehastigheten per enhetsområde (e-/Å2/s) kan derfor bare justeres ved å endre spotstørrelsesinnstillingene og justere C2-styrken (stråleintensiteten) i henhold til trinnene nedenfor.- Flytt til et område med støtte karbonfolie og tynn eller ingen is.
- Velg objektivåpningen på 100 μm eller 70 μm i Blenderåpning-menyen i TEM-grensesnittet.
- Trykk på diffraksjonsknappen på kontrollpanelene for å bytte til diffraksjonsmodus.
- Sett inn lysstoffrørskjermen og endre FluCam-modusen til Høy oppløsning.
- Flytt det sentrale diffraksjonspunktet til en kant av blenderåpningen. Hvis blenderkanten ikke er synlig, øker du kameralengden (ved hjelp av forstørrelsesknappen).
- Drei fokusknappen forsiktig på kontrollpanelet for å sette ryggfokalplanet i fokus. Bakfokusplanet er fokusert når blenderkanten er synlig skarp.
- Reduser følsomheten til FluCam til laveste nivå og flytt det sentrale diffraksjonsstedet til midten av FluCam.
- Minimer størrelsen på det sentrale punktet ved hjelp av Intensitet-knappen på kontrollpanelet.
- Trekk tilbake objektiv blenderåpning i TEM UI og bytt tilbake til bildebehandlingsmodus.
- Klikk på Hent-knappen i analyseprogramvare for å lagre innstillingene i forhåndsinnstillingen Datainnsamling.
- Juster elektrondosehastigheten i forhåndsinnstillingen datainnsamling som er optimal for brukt detektor:
- Flytt til et tomt område på rutenettet (f.eks. en rutenett firkant med ødelagt karbonfolie)
- Klikk på Måledose-knappen i analyseprogramvare for å måle elektrondosehastigheten.
- Endre SPOT-størrelsen for å oppnå optimal doseringshastighet. Når det gjelder den direkte elektrondetektoren som brukes i denne protokollen, brukes vanligvis en doserate på 4-5 e-/pixel/s til datainnsamling med høy oppløsning. Dette tilsvarer vanligvis SPOT størrelse 4-6.
- Kontroller og juster parallell belysning ved den nye SPOT-størrelsesinnstillingen som beskrevet ovenfor.
- Velg EER-alternativet under Brøker for å bruke EER-modus på direkte elektrondetektor33.
- Klikk på Hent-knappen i analyseprogramvaren for å lagre innstillingene i forhåndsinnstillingen Datainnsamling.
- Bytt til autofokusforhåndsinnstillingen og trykk på Get-knappen for å lagre belysningsinnstillingene for fokusering. Endre eksponeringstiden manuelt til 1 s og binningsmodus 2.
- Bytt til forhåndsinnstillingen Thon Rings og trykk på Get-knappen for å lagre belysningsinnstillingene for denne forhåndsinnstillingen. Endre eksponeringstiden manuelt til 1-2 s og binningsmodus 2.
- Bytt til zero loss-forhåndsinnstillingen , og trykk på Get-knappen for å lagre belysningsinnstillingene for denne forhåndsinnstillingen. Endre eksponeringstiden manuelt til 0,5 s og binningsmodus 4.
- Kalibrer bildeskift mellom de angitte optiske innstillingene, som beskrevet i analyseprogramvarehåndboken ved hjelp av Image Shift Calibration-oppgaven i kategorien Forberedelse (tilleggsfigur 1).
Tabell 1: Typiske bildeinnstillinger for datainnsamling med høy oppløsning ved hjelp av en 200 kV cryo-TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Innstillingene vises for hver optiske forhåndsinnstilling som brukes til å sette opp automatisert datainnsamling (del 3 i protokollen). Disse innstillingene er spesifikke for 200 kV TEM mikroskop og direkte elektrondetektor som brukes i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
4. Rutenettkartlegging og valg av beste cryo-EM-rutenett for datainnsamling
- Velg Atlas-fanen og klikk på Ny økt-knappen for å åpne en ny økt.
- Fyll ut detaljer som øktnavn og datalagringssted, og klikk på Bruk-knappen for å åpne et nytt Screening-oppgavevindu , som viser en liste over alle rutenettene i Autoloader-beholdningen. Du kan også redigere navnene på rutenettene.
- Velg rutenettene av interesse ved å merke av i en avmerkingsboks ved siden av det tilsvarende rutenettnummeret.
- Klikk på Start-knappen for å starte en helautomatisk samling av atlas av alle valgte rutenett.
- Når samlingen er ferdig, klikker du på rutenettetiketter for å se gjennom de oppkjøpte atlasene.
MERK: Individuelle rutenettstorg klassifiseres i henhold til deres relative istykkelse, som er basert på relativ vurdering av gråtoneverdier i hvert atlas. De klassifiserte rutenettplassene er avbildet i forskjellige fargevalg som kan brukes til å styre valg av datainnsamlingsområder. Et rutenett produsert med en Vitrobot Mk IV vil vanligvis vise en istykkelsesgradient over hele rutenettet, noe som kan bidra til å identifisere den ideelle istykkelsen for datainnsamling. Et optimalt rutenett bør inneholde så lite overføring av isforurensning som mulig og vise nok ubrutte og sprekkfrie rutenettsnekker (figur 3). Gitter med egnet isfordeling kan undersøkes nærmere for å vurdere fordelingen av partikler i is ved høy forstørrelse (dvs. tetthet og orientering av individuelle partikler). - Klikk på Last inn prøve-knappen i toppmenyen for å sette inn et valgt rutenett med passende isfordeling i mikroskopkolonnen.
- Velg Atlas-fanen , høyreklikk på en passende rutenett firkant i atlasbildet og velg alternativet Flytt trinn her fra rullegardinmenyen for å flytte scenen til rutenettet.
- Velg kategorien Automatiske funksjoner for å sette rutenettplassen til eusentrisk høyde. Bytt til forhåndsinnstillingen Eucentric Height , klikk på auto-eusentrisk av Beam Tilt autofunksjon midt i den valgte rutenett firkanten og klikk på Start-knappen .
- Bytt til forhåndsinnstillingen Grid Square og skaff deg et bilde. Flytt scenen til et hull med is og ingen eller minimal forurensning med et høyreklikk og flytt trinn her alternativet.
- Bytt til forhåndsinnstillingen Hull/eusentrisk høyde og skaff deg et bilde. Flytt fasen til et karbonområde ved siden av hullet av interesse ved å høyreklikke og flytte trinn her alternativet.
- Klikk autofokusfunksjonen autofokus og angi verdier for ønsket defokus til 0 μm og iterat til -2 μm. Bytt til autofokusforhåndsinnstillingen og klikk på Start-knappen .
- Velg forberedelsesfanen på nytt, og bytt til forhåndsinnstillingen Hull/eusentrisk høyde . På det tidligere anskaffede hullbildet velger du et interesseområde i hullet og flytter fasen til denne posisjonen ved å høyreklikke og velge Flytt fase hit .
- Bytt til forhåndsinnstillingen datainnsamling og angi ventetiden etter stråleskiftet til 0,5 s og ventetiden etter trinn flyttes til 20 s. Skaff deg et bilde ved hjelp av defokus mellom -3 μm og -5 μm for å øke kontrasten med lav oppløsning for bedre visualisering av individuelle partikler.
- Du kan eventuelt gjenta trinn 4.7-4.13 til bildepartikler i forskjellige hull og forskjellige rutenett firkanter med forskjellige istykkelser etter behov.
- Når det mest passende rutenettet for datainnsamling med høy oppløsning er identifisert og valgt, klikker du last inn eksempel-knappen i den øverste menyen for å laste inn det valgte rutenettet i TEM.
MERK: Alternativt, hvis mer informasjon er nødvendig og / eller automatisering av denne screeningprosessen er ønsket, utfør avsnitt 5.
5. Sette opp en datainnsamlingsøkt i programvaren for enkeltpartikkelanalyse
MERK: Hvis du bruker gullfoliegitteret, kan det hende at presisering av objektiv astigmatisme og komajusteringer (avsnitt 6) ikke fungerer pålitelig. Det anbefales å laste inn et karbonfoliegitter eller kryssgitter EM-rutenett og utføre disse endelige justeringene før du setter opp datainnsamling.
- Velg EPU-fanen og klikk på Øktoppretting-knappen for å opprette en ny økt i venstre panel. Velg alternativet Ny økt for å bruke gjeldende optiske forhåndsinnstillinger eller alternativet Ny fra Innstillinger for å laste inn tidligere eksportert øktoppsett.
- Fyll ut øktnavn og datalagringssted.
MERK: Denne plasseringen brukes til å lagre integrerte bilder og metadata fra datainnsamlingsøkten i en undermappe med øktnavnet. Selv om disse dataene ikke vil ta opp en betydelig mengde lagringsplass, anbefales det å lagre disse dataene på Falcon-avlastingsdatalagringen på DMP-serveren, da EER-kamerarammene alltid lagres i rotkatalogen til denne datalagringen i en katalog med øktnavnet. - Velg Manuell type for økten hvis du vil ha kontroll over valg av enkelthull i rutenetts firkanter som er valgt for datainnsamling senere i protokollen.
- Velg raskere anskaffelsesmodus for å bruke AFIS (AFIS) (aberration-free image shifting) for datainnsamling for å redusere scenebevegelser mellom individuelle hull, redusere den generelle prøvedriften og øke gjennomstrømningen av datainnsamling uten forringelse av bildekvaliteten.
- Velg standard MRC-format for lagrede integrerte bilder.
- Angi det brukte rutenettet og typen. Denne protokollen brukte R-1.2/1.3 UltraAufoil for apo-ferritin og R-2/1 Quantifoil-rutenettet for 20S-proteasomet. Velg Quantifoil under Prøvebærer og R1.2/1.3 eller 2/1 under Quantifoil Type.
- VALGFRITT: Klikk på Athena Login-knappen nederst til høyre for å bruke EPU Quality Monitor (EQM).
- Angi påloggingsdetaljer i popup-vinduet i nettleseren for å aktivere innstillingsdelen i Oversikt over øktoppsett.
- Klikk på Velg-knappen i innstillingsdelen og bla gjennom etter det tidligere opprettede datasettet (Protokolldel 2) for å knytte det til den gjeldende datainnsamlingen. Aktiver Aktiver Kvalitetsmåler på .
- Klikk Bruk-knappen for å opprette en ny økt.
MERK: Denne handlingen åpner nye oppgaver i menyen i venstre kolonne. Hvis noen detaljer er feil i løpet av økten, er det mulig å gå tilbake til øktinstallasjonsoppgaven , endre/oppdatere detaljene og klikke Bruk på nytt for å oppdatere økten. - Velg Square Selection-oppgaven i panelet til venstre for å vise det innsamlede atlaset i rutenettet.
- Du kan eventuelt dobbeltklikke på en hvilken som helst flis av atlaset for å se et bilde av høyere kvalitet for bedre å bedømme iskvaliteten i rutenettplassene. Dobbeltklikk på bildet igjen for å gå tilbake til rutenettet.
- Identifiser rutenett firkanter med følgende egenskaper (Figur 4): (i) Støttefolien i rutenettet er intakt uten skade, (ii) Glasslegemet tynn is i foliehull (hullene ser lysere ut enn støttekarbonfolie), (iii) Så lite krystallinsk isforurensning (svarte flekker) i rutenettet firkant som mulig, (iv) Minimal lysstyrkegradient over rutenettet og innenfor individuelle foliehull.
MERK: Med forhåndsinnstillingene valgt og med et godt rutenett, kan 200 kV cryo TEM som brukes i denne studien, bilde med en hastighet på ~ 200-300 filmer / t. Med det i tankene, velg så mange firkanter som nødvendig, eller legg til mer senere ved å gå tilbake til den firkantede utvalgsoppgaven i henhold til mengden mikroskoptid som er tilgjengelig. For referanse ble det samlet inn 3000 filmer for å oppnå 1,6 Å-oppløsning av apo-ferritin. - Velg rutenettsnr firkanter for datainnsamling enten i hele atlaset eller flisbilder av høy kvalitet
- Høyreklikk på en rutenett firkant av interesse og velg Velg alternativet i hurtigmenyen
- Alternativt kan du holde nede Ctrl-tasten på tastaturet og venstreklikke på de ønskede rutenettsplassene
- Høyreklikk og opphev merking eller hold nede Skift-tasten , og venstreklikk for å fjerne firkanter
- Velg Hullmerking-oppgaven i panelet til venstre for å velge hull i de valgte rutenettplassene.
- Klikk på Auto-Eucentric-knappen for å automatisk flytte til den første valgte rutenettplassen, justere den eusentriske høyden og få et rutenett firkantet bilde for å finne foliehull.
- Klikk på Finn hull-knappen for å finne foliehull i bildet.
MERK: Hvis hullfinning ikke fungerte bra (dvs. det vil si at det enten er hull som er hoppet over eller hull med feil størrelse i bildet), må du kontrollere at riktige verdier ble lagt inn i Quantifoil Type-oppføringen i øktoppsettoppgaven og finne hull igjen. Hvis hullene fremdeles ikke blir funnet riktig, klikker du på Mål hullstørrelse-knappen for å stille inn hulldiameteren og avstanden manuelt og finne hull igjen. - Klikk fjern hull-knappen nær rutenettstangknappen for å fjerne merkingen av hull i nærheten av rutenettstenger.
- Juster grensene i lysstyrken til isfilteret (nederst til høyre i programvarevinduet) for å fjerne alle hull med for tykk is (ved hjelp av venstre grenselinje) samt alle tomme hull (ved hjelp av høyre grenselinje) som vist i figur 4.
MERK: For presisering kan spesifikke intensitetsverdier også skrives inn i de tilsvarende tekstboksene ved siden av Bruk-knappen . - Du kan også bruke markeringspenselen til å finjustere merkingen av hull manuelt: Venstreklikk og dra penselen for å oppheve merkingen av uønskede hull. Hold nede Ctrl-tasten og venstreklikk for å velge foliehull på nytt. Hold nede Skift-tasten , og rull med musehjulet for å justere penselstørrelsen.
- Velg et hull for å angi og teste en datainnsamlingsmal som skal brukes gjentatte ganger gjennom datainnsamlingen: Høyreklikk på et hull i rutenettets firkantede bilde, og velg alternativet Flytt fase til plassering.
- Velg Maldefinisjon - oppgaven i panelet til venstre.
- Velg forhåndsinnstillingen Hole/Eucentric og klikk på Hent-knappen for å skaffe et bilde.
- Klikk på Finn og midtstill hull-knappen for å midtstille et hull i bildet.
- Angi verdier for Forsinkelse etter bildeforskyvning til 0,5 s (standard) og Forsinkelse etter trinnforskyvning til 20 s.
MERK: Ettersom den parallelle strålediameteren er festet på 200 kV cryo-TEM-systemet som brukes i denne studien og vanligvis tilsvarer 1,6-1,7 μm med en 50-μm blenderåpning, Bare ett bilde kan hentes per hull ved hjelp av rutenettene R-1.2/1.3 og 2 bilder per hull (nær motsatte kanter) ved hjelp av rutenettene R-2/1 eller R-2/2. Vær oppmerksom på at størrelsen på de angitte oppkjøpsområdene på skjermen ikke samsvarer med den faktiske strålediameteren. Bildeskalalinjen kan brukes til å beregne en passende plasseringsavstand. - Velg Knappen Legg til anskaffelsesområde , og klikk på bildet for å velge stedet i det midtstilte hullet der høyforstørrelsesbildeanskaffelse skal hentes fra.
- Velg Knappen Legg til autofokusområde , og klikk på bildet for å velge plasseringen på støttefolien ved siden av det midtstilte hullet der autofokus for bilder skal utføres.
MERK: Bjelkestørrelsen for fokusering er 1,6-1,7 μm og bør plasseres like mye fra nærliggende hull på karbon. - Klikk på det grønne oppkjøpsområdet for å angi en sekvens av defokusverdier i Defocus List i den øverste delen av programvarevinduet. Angi den høyeste defokusen som først for å forbedre visualiseringen av partikler i en testkjøring av følgende malutførelsesoppgave .
- Klikk på det blå autofokusområdet for å angi autofokusspesifikke innstillinger i samme område:
- Velg alternativet Etter sentrering for å fokusere automatisk på starten av hver AFIS-klynge.
- Velg alternativet Objektivlinse for raskere autofokusering og redusert trinndrift.
- Velg oppgaven Malutførelse , og klikk Kjør.-knappen.
- Følg individuelle trinn i datainnsamlingsprosedyren (midtstill hullet, autofokusen i det valgte området og bildeinnhenting i de angitte områdene) og kontroller kvaliteten på avbildede partikler i det endelige bildet med høy forstørrelse.
- Klikk FFT-knappen nederst til høyre i bildevinduet med høy forstørrelse for å kontrollere FFT-bildet og visuelt vurdere om Thon-ringer viser flere svingninger og strekker seg til høy oppløsning i FFT-bildet.
- Hvis malutførelsen er fullført, klikker du på Forbered alle firkanter-knappen i Hole Selection-oppgaven for å få datainnsamlingen angitt automatisk i alle andre valgte rutenett firkanter i henhold til de brukte innstillingene i denne første rutenettplassen.
6. Endelige mikroskopjusteringer før du starter datainnsamling
MERK: For å oppnå de beste resultatene med høy oppløsning, bør de mest sensitive justeringene gjøres nøyaktig med de samme innstillingene som datainnsamlingsmodusen i datainnsamlingsprogramvaren og like før du starter den faktiske datainnsamlingen. Disse justeringene bør gjøres i en posisjon med tynt støttekarbon av rutenettet, tilstrekkelig fjernt fra noen rutenettstenger, og justert i eusentrisk høyde.
- Velg oppgaven Malutførelse , skaff deg et nytt bilde og flytt med scenen til et rent område på karbonfolie ved å høyreklikke og velge menyalternativet Flytt trinn her.
- Velg kategorien Automatiske funksjoner , og sett ønsket defokus til 0 μm og Iterate til -2 μm. Bytt til autofokusforhåndsinnstillingen og klikk på Start-knappen for å kjøre Autofokus-funksjonen.
- Legg den fluorescerende skjermen ned og åpne menyen med direkte justeringer i TEM-grensesnittet.
- For best resultat kan erfarne brukere bekrefte justeringer av dreiepunktet: Velg nP Beam Tilt pp X-oppgaven i Direkte justeringer-menyen og overlapp sprettstrålene maksimalt ved hjelp av multifunksjonsknappene på kontrollpanelene. Gjenta dette for aktiviteten Strålevinkel pp Y for np .
- Klikk på EF-knappen i den fluorescerende skjermkameramenyen for å vise en grønn sirkel som indikerer energifilterinngangsåpningen og sentrerer strålen over den grønne sirkelen.
MERK: Kontroller at Turbo-pumpen er stoppet før du fortsetter; vibrasjoner fra det reduserer antall synlige thon-ringer og fører ofte til at autofunksjonene mislykkes. - Gå tilbake til programvarevinduet, og velg kategorien Automatiske funksjoner på menylinjen.
- Velg Autostigmate-oppgaven , bytt til forhåndsinnstillingen Thon Ring og trykk på Start-knappen . Vær oppmerksom på prosessen for å sikre at (i) bildene som er tatt er på karbon, (ii) Thon-ringene er tydelig synlige, og (iii) den beregnede CTF-passformen (stiplede linjer) er godt plassert på Thon-ring minima (tilleggsfigur 2).
- Velg Autocoma-oppgaven , og trykk startknappen . Vær oppmerksom på prosessen for å sikre at bildene som er tatt er på karbon og at Thon-ringene er tydelig synlige og at de beregnede passformene (stiplede linjer) er godt plassert på Thon-ring minima. Zoom inn på hvert Thon-ringbilde ved hjelp av rullehjulet for musen (tilleggsfigur 3).
MERK: Hvis mikroskopet er utstyrt med et energifilter, bør energifilterjustering gjøres som en del av justeringssekvensen for å midtstille filterspalten til nulltapstoppen og korrigere eventuelle forvrengninger i prismet til energifilteret (trinn 6.9-6.14). Disse justeringene bør gjøres i et tomt område i rutenettet, for eksempel i en brutt rutenettstorg. - Åpne Sherpa UI og velg Energifilter-applikasjonen (tilleggsfigur 4).
- Sett kameraet til EF-Falcon, skuff 4x, eksponeringstid 0,2 s i Innstillinger-vinduet .
- Klikk på Senter-knappen i Null tap-alternativet for å midtstille null-tap energifilterspalten.
- Klikk på Tune-knappen i Isochromaticity-alternativet (Tilleggsfigur 4).
- Klikk på Tune Forstørrelse og Juster forvrengninger i alternativet Geometriske og kromatiske forvrengninger (Supplerende figur 5, Supplerende figur 6)
- Hvis resultatene ikke er innenfor angitte spesifikasjoner og vises i rød farge i utdatarapporten, gjentar du justeringene fra trinn 6.11 på nytt.
MERK: Selv om referansen til direkte elektrondetektorforsterkning kan være stabil over måneder, bør det tas en ny forsterkningsreferanse ved hjelp av Falcon 4 Reference Image Manager hvis bilder av tomme områder ikke viser jevn intensitet, men viser striper eller andre distinkte funksjoner. Alternativt kan du beregne en Fast Fourier Transform (FFT) av et slikt bilde og sikre at ingen linjer er synlige. - I programvarevinduet velger du kategorien Klargjøring og bytter til forhåndsinnstillingen Datainnsamling .
- Sett doseinnstillingen til 40 e-/Å2 og klikk på Mål doseringsfrekvens-knappen .
- Gå til EPU-fanen , velg automatisert anskaffelsesoppgave , og sjekk eventuelt funksjonen Automatisk nulltap . Klikk på Start run-knappen for å starte fullstendig automatisert datainnsamling.
7. Overvåking og optimalisering av datakvalitet under datainnsamling
MERK: Mens datainnsamling pågår, kan innsamlede data overvåkes ved hjelp av EQM gjennom datahåndteringsportalen. EQM utfører bevegelseskorrigering og CTF-bestemmelse direkte og viser resultatene i portalen. Brukeren er da i stand til å bedømme kvaliteten på individuelle oppkjøp, se grafer på ulike kvalitetsindikatorer, filtrere ut uønskede oppkjøp og eksportere dataene til deres endelige lagring enten på farten eller som en satsvis jobb.
- Naviger til datasettet som analyseprogramvaren plasserer dataene i ved hjelp av en nettleser.
- I datasettoversikten viser anskaffelseskort informasjonen om bevegelseskorrigering og CTF-bestemmelse i grafisk format. Klikk på individuelle kort for å få mer informasjon.
- Gjør det mulig for DataViz-panelet å vise aggregerte grafer fra hele datasettet som viser defokus, astigmatisme og CTF-konfidensområde per anskaffelse (tilleggs figur 7).
- Bruk filtrene på toppen av panelet til å velge bare dataene som er innenfor det forespurte defokusområdet, ha astigmatisme nær null, og CTF kan bestemmes opp til den angitte (mål) oppløsningen. Når filtrene er definert, trykker du på Bruk-knappen for å vise bare de valgte dataene i oversiktsvinduet for datasettet.
- Når de fleste bildene som er anskaffet, er innenfor de angitte kriteriene, lar du datainnsamlingsøkten fortsette å fullføres. Hvis bare en veldig liten brøkdel av de oppkjøpte bildene oppfyller de angitte kriteriene, kan du enten konfigurere innstillingene for analyseprogramvaren på nytt, flytte til et annet område i eksemplet (trykke på Neste grid square-knappen i analyseprogramvare), eller stoppe datainnsamlingen.
Representative Results
Databehandlingsportalen gir effektiv, strukturert lagring av innsamlede bilder, data og metadata fra flere eksperimentelle arbeidsflyter i én enkelt programvareplattform. Hvert definert eksperiment i et opprettet prosjekt består av en arbeidsflyt med kundedefinerte trinn for å fange opp eksempelinformasjon, innsamlede data og relaterte metadata uten begrensninger for å gi maksimal fleksibilitet og brukervennlighet for eventuelle eksperimenter og alle brukstilfeller (figur 1, figur 2). Databehandlingsportalen har også en labnotatfunksjonalitet som illustrerer arbeidsflyttrinn, inkludert bildebehandling med mellomliggende resultater, som alle kan knyttes til et prosjekt og gi så fullstendig en post som mulig for analyse og oppretting av rapporter og publikasjoner.
Figur 1: Eksempel på mulig organisering av data og metadata i databehandlingsplattformen. Hvert prosjekt kan bestå av flere eksperimenter, for eksempel kryo-EM eller massespektroskopi (viz. Protokoll trinn 2.3). Hvert eksperiment kan inneholde flere brukerdefinerte arbeidsflyter (viz. Protokoll trinn 2.5), som hver består av flere konfigurerbare trinn (viz. Protokoll trinn 2.7). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vis i en åpnet prosjektarbeidsflyt i databehandlingsplattformen. Figuren viser tilknyttede metadata og notater til det åpne trinnet i arbeidsflyten. Den venstre linjen med ikoner gir rask tilgang til forskjellige alternativer og menyer på databehandlingsplattformen. Panelet til venstre inneholder en liste over lagrede arbeidsflyter (vist bare én lagret arbeidsflyt "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7") og en blå knapp for å legge til en ny arbeidsflyt. Det sentrale panelet viser individuelle trinn i den åpne arbeidsflyten, som vist for SPA-arbeidsflyten her. Den blå knappen øverst til høyre kan legge til et ekstra trinn i den åpne arbeidsflyten. Panelet til høyre inneholder plass til enten innspilte metadata eller brukerinndata Notater for arbeidsflyten, som kan inneholde tekst, tabeller og bilder. Ulike formateringsalternativer for teksten er tilgjengelige. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Cryo-EM-gitter produsert med tradisjonelle dypfrysingsenheter, for eksempel Vitrobot, vil vanligvis vise en gradient av istykkelse over rutenettoverflaten. Noen gitter kan også bli skadet (bøyd) etter manuell håndtering og/eller klipping i en autogrid ringbærer. Figur 3 viser eksempler på ulike nett som vist i Atlas-oversikten. Gitteret med tykk is eller skade bør utelukkes fra videre undersøkelser.
Figur 3: Galleri av forskjellige gitter som vist i Atlas-oversikten. (A) Et dårlig rutenett med tykk is, (B) et bøyd rutenett med dårlig is- og isforurensning, (C) et akseptabelt rutenett med god isgradient, (D) et typisk rutenett med god tynn is og liten isgradient. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Valg av rutenett firkanter uten skade og optimal istykkelse er avgjørende for å samle datasett med høy oppløsning. Istykkelsen kan variere selv på nivået av individuelle rutenett firkanter, og det er derfor viktig å velge bare hull med optimal tynn is fra hver valgte rutenett firkant. Figur 4 viser et egnet rutenett med intakt folie og tynn is i midten. Den viste rutenettplassen er bra for å sette et filter for automatisert valg av hull med tynn is i alle valgte rutenett firkanter, da den inneholder en rekke forskjellige istykkelser samt tomme hull uten is, noe som er ekstremt nyttig for å sette et passende intensitetsområde i isfilteret i Hole Selection-oppgaven.
Figur 4: Et eksempel på et rutenett med en stigning av istykkelse, fra tomme rutenett firkanter i midten og tykk is nær rutenettet. Filteret for iskvalitet kan brukes til å velge rekkevidden av intensiteter inne i hull med den ideelle istykkelsen som er valgt i rutenetttorget (hullene med grønt overlegg). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Benchmark resultater ved hjelp av den beskrevne protokollen ble oppnådd ved hjelp av prøven av mus apo-ferritin (apoF) fra Kikkawa gruppe11. ApoF er et svært α helisk protein som danner et veldig stabilt oktaedralbur. Høy stabilitet og høy symmetri gjør apoF til en optimal prøve for høyoppløselig kryo-EM-bildebehandling og bildebehandling. ApoF har derfor blitt et standard utvalg for å vurdere ytelsen til kryo-EM-instrumenter 11,12,13. En frossen aliquot som inneholder 15 mg/ml renset apoF-prøve ble tint på is og avklart ved sentrifugering ved 10.000 x g i 10 min. Supernatanten ble fortynnet til 5 mg/ml med 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. 3 μL av den fortynnede prøven ble påført på en glød-utladet R-1.2/1.3, 300 mesh gullgitter i 30 s. Deretter ble gitteret blottet i 5 s før de stupte ned i flytende etan avkjølt av flytende nitrogen. Dypfrysing ble utført ved hjelp av et helautomatisk vitrifiseringssystem ved 100% fuktighet og 4 °C. Alle rutenett ble klippet i autogrider og lastet inn i en 200 kV Cryo-TEM. Omtrent 3000 filmer ble samlet inn med en gjennomstrømning på 300 filmer / t. Data ble behandlet ved hjelp av metodene som beskrevet11 med følgende modifikasjoner: i) Relion 4-beta versjon ble brukt i stedet for Relion 3.1, ii) automatisert partikkelplukking ble gjort ved hjelp av 2D-klasse gjennomsnitt av tidligere apoF rekonstruksjoner som referanser, og iii) den første 3D-modellen ble generert fra forrige apoF rekonstruksjon lav-bestått til 15--oppløsning Å oppløsning. Optikkgruppering ble ikke gjort for dette datasettet, da den brukte AFIS-prosedyren34 har vist seg å effektivt og pålitelig minimere strålevinkelinduserte faseskift som ikke begrenser datakvaliteten for å rekonstruere 3D-kart ved de rapporterte oppløsningene. 3D-raffinement etter bayesiansk polering og CTF-raffinement førte til 1,68 Å-oppløsningskart. Oppløsningen ble ytterligere forbedret med Ewald sfærekorreksjon, noe som resulterte i et 1,63 Å-oppløsningskart. Oversikten over datainnsamlings- og behandlingsparametere vises i tabell 2, og det endelige rekonstruerte tetthetskartet vises i figur 5, med Fourier Shell Correlation (FSC)-kurven vist i tilleggs figur 8.
Tabell 2: Datainnsamlings- og bildebehandlingsparametere som brukes til 3D-rekonstruksjon av apo-ferritin. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 5: Kryo-EM rekonstruksjon av apo-ferritin. (Venstre panel) 3D-gjengivelse av det rekonstruerte apoF cryo-EM-kartet ved 1,6 Å oppløsning. (Høyre panel) Detaljert visning av det rekonstruerte kartet på nivået av individuelle aminosyre sidekjeder. Tettheten av aminosyre sidechains er godt løst, og atommodellen kan entydig bygges innenfor dette kartet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Effekter og fordeler ved å bruke et energifilter i SPA-rekonstruksjonene ble evaluert ved hjelp av det prokaryote 20S-proteasomet isolert fra T. acidophilum. Det prokaryote 20S-proteasomet har også blitt brukt som en standard kryo-EM-prøve, da den representerer den stabile katalytiske kjernen i proteasomkomplekset med D7-symmetrien. Gitter ble utarbeidet ved å legge til 4,5 μL av det rensede T. acidophilum 20S proteasomprøven på et glødeladet 200-mesh R 2/1 kobbergitter. Prøver ble vitrifisert i en flytende etan/propanblanding ved hjelp av et helautomatisk vitrifiseringssystem satt til 4 °C og 100 % fuktighet med blolotkraft på 20 og flekktid på 4,5 s.
Tre forskjellige datasett ble samlet inn fra det samme kryo-EM-rutenettet med lignende rutenettstorg ved hjelp av en annen spaltebredde på energifilteret i rekkefølgen: i) spalte helt åpen (ingen spalte satt inn), ii) 20 eV-spalte og iii) 10 eV-spalte. Rutenettplassene ble valgt ved hjelp av et iskvalitetsfilter i analyseprogramvaren. Alle andre parametere for datainnsamling og databehandling ble beholdt på samme måte. Datasett ble samlet inn i 15 timer med totalt 4000 filmer og behandlet ved hjelp av metodene som beskrevet11 ved hjelp av Relion 3.1 med modifikasjonen at Laplacian-of-Gaussian partikkelplukkingsalgoritme ble brukt til å produsere innledende 2D-klassegjennomsnitt for referansebasert partikkelplukking fra de fulle datasettene. Det samme antallet (102 200) tilfeldig utvalgte partikler ble valgt og brukt til endelig gjentakelse og 3D-rekonstruksjon av hvert datasett. Databehandlingsvariabler er beskrevet i tabellen (tabell 3) nedenfor for å oppnå det endelige rekonstruerte EM-tetthetskartet vist i figur 6 med FSC-kurven vist i tilleggs figur 9. Optikkgruppering og Ewald-sfærekorrigering ble heller ikke gjort for disse datasettene.
Tabell 3: Datainnsamlings- og bildebehandlingsparametere som brukes til 3D-rekonstruksjon av T. acidophilum 20S-proteasomet. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Oppsummering av oppnådd oppløsning og B-faktor for kryo-EM-rekonstruksjoner av T. acidophilum 20S-proteasomet ved hjelp av datasett med forskjellig energispaltebredde. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 6: Effekt av energifiltrering på cryo-EM-bilder. (A) Cryo-EM-bilder ved forskjellige defokusverdier samlet inn med eller uten 10 eV-spalte. (B) Oversikt over 20S proteasome cryo-EM-kartet med segmenterte underenheter. (C) Zoomvisning på 20S-proteasomkartet med en montert atommodell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Kalibrering av bildeskiftoppgave (gul ellipse) for å justere bildeskift mellom ulike optiske forhåndsinnstillinger (røde ellipser) i analyseprogramvaren, ved hjelp av en krystall av sekskantet is som er synlig i hele forstørrelsesområdet mellom 100x og 165 000x. (Øverst) Kalibrering mellom forhåndsinnstillingene for datainnsamling og hull/eusentrisk høyde, (midtre) kalibrering mellom forhåndsinnstillingene Hole/Eucentric Height og Grid Square, (nederst) kalibrering mellom forhåndsinnstillingene Grid Square og Atlas. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Autostigmate-funksjon i analyseprogramvare (gul ellipse). (Venstre bilde) Hentet bilde. (Høyre bilde) Fourier overføring av det oppkjøpte bildet som viser konsentriske Thon-ringer og deres CTF-passform vist i radiale bjelker. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3: Brukergrensesnittet til Autocoma-funksjonen i analyseprogramvare (gul ellipse) for komajustering. Bildepanelet viser Fourier-overføringsbilder som er anskaffet ved forskjellige strålevinkeler, og DERES CTF-passform som brukes til beregning av koma. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 4: Brukergrensesnitt for energifilterjustering. Eksempel på en god tunning rapport av energifilteret erokromacity med alle parametere (vist i grønn tekst) innenfor spesifikasjoner. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 5: Brukergrensesnitt for energifilterjustering. Eksempel på god innstillingsrapport for forstørrelsesforvrengninger for energifilter med alle parametere (vist i grønn tekst) innenfor spesifikasjonene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 6: Brukergrensesnitt for energifilterjustering. Eksempel på god innstilling av energifilterkromatiske forvrengninger med alle parametere (vist i grønn tekst) innenfor spesifikasjonene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 7: DataViz-panelet på EPU Quality Monitor med en oversikt over datakvalitet i et samlet cryo-EM-datasett. Grafene med aggregerte data fra alle innsamlede bilder/filmer viser verdier (prikkplott) og distribusjon (stolpetegninger) av valgte kritiske kvalitetsindikatorer, for eksempel CTF-tilpasningssikkerhet (blå), defokus (oransje) og astigmatisme (grønn). Et delsett av de innsamlede bildene/filmene kan velges ved å angi parameterfiltre øverst i DataViz-panelet. Etter å ha brukt filtrene, kan utvalgte bilder / filmer eksporteres for videre behandling i en annen bildebehandlingspakke, for eksempel Relion eller CryoSpark. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 8: FSC-kurven for den endelige rekonstruksjonen av apoF til 1,6 Å-oppløsning, som rapportert av Relion 4-beta. Den blå kurven viser FSC for maskerte 3D-kart fra to uavhengig raffinerte 3D-rekonstruksjoner fra to gjensidig utelukkende halvdatasett. I henhold til gullstandarden FSC klokken 0.143 tilsvarer oppløsningen på det endelige 3D-kartet rekonstruert fra hele datasettet 1,6 Å. Den oransje kurven viser FSC for de maskerte 3D-rekonstruksjonene med randomiserte faser. FSC-kurvens raske fall indikerer at den brukte masken ikke bidro til den observerte FSC for de opprinnelige rekonstruerte kartene (blå kurve) utover ~2 Å-oppløsningen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 9: FSC-kurver for den endelige rekonstruksjonen av T. acidophilum 20S-proteasom ved hjelp av forskjellige spaltebredder på energifilteret, som rapportert av Relion 3.1. De blå kurvene viser FSC for maskerte 3D-kart fra to uavhengig raffinerte rekonstruksjoner fra henholdsvis to halvdatasett av hvert datasett. Gullstandarden FSC på 0,143 indikerer de oppnådde oppløsningene til de endelige 3D-kartene rekonstruert fra de respektive fullstendige datasettene (henholdsvis 2,3 Å, 2,2 Å og 2,1 Å-oppløsning). De røde kurvene viser FSC for maskerte kart med randomiserte faser. Det raske fallet i de røde FSC-kurvene indikerer at den brukte masken ikke bidro til FSC for de opprinnelige rekonstruerte kartene utover ~3 Å-oppløsningen. De grønne kurvene viser FSC for umaskerte 3D-kart, som påvirkes av støy i hele det rekonstruerte 3D-volumet og derfor faller raskere enn FSC for de maskerte 3D-kartene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Datatilgjengelighet: Kryo-EM tetthetskartene er deponert i EM Data Bank under tiltredelsestall: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteasome: EMD 14467, EMPIAR-10976.
Discussion
Den beskrevne protokollen forutsetter at optikken til det brukte TEM-mikroskopet er i en godt justert tilstand. For 200 kV TEM som brukes i denne protokollen, utføres, verifiseres og lagres slike kolonnejusteringer av en erfaren servicetekniker etter mikroskopinstallasjon eller betydelig tjenesteintervensjon. Disse justeringsinnstillingene kan tilbakekalles når som helst i mikroskopgrensesnittet. Brukere kan bruke direct alignment-prosedyrene i mikroskopgrensesnittet til å finjustere kritiske parametere på nytt. Noen justeringer, for eksempel pistolvinkel og pistolskift, er stabile og trenger ikke å justeres av brukere på daglig basis. Kontroller og om justeringer (om nødvendig) av pistolvinkel og skift av mikroskoplederen anbefales to ganger i året. På den annen side er noen justeringer kritiske og må justeres før hver datainnsamling som beskrevet i protokollen ovenfor (for eksempel objektiv astigmatisme og komafri justering). Hvis Autocoma-funksjonen i analyseprogramvaren ikke konvergerer, bør justering av strålevinkel dreiepunkter og / eller rotasjonssenter verifiseres og justeres, og riktig sentrering av C2-blenderåpningen bør bekreftes. Etterpå bør Autostigmate-funksjonen kjøres som objektive stigmatorer brukes også til komakorreksjon. Disse justeringene bør gjentakelsesreguleres til både Autostigmate- og Autocomafunctions lykkes med sin første gjentakelse. Om nødvendig kan et annet område velges (f.eks. støtte karbonfolie uten is), avbildedefokusjustert eller bildeanskaffelsestiden økt for å optimalisere signal-til-støy-forholdet i oppkjøpte bilder, og synligheten til flere Thon-ringer i Fourier-transformasjonen av de oppkjøpte bildene.
Moderne kryo-EM-mikroskoper genererer store mengder data som ofte overstiger 1 TB per datasett for å oppnå høyoppløselige 3D-rekonstruksjoner, spesielt for proteiner med lav symmetri. Cryo-EM-data og resultater kompletteres også vanligvis med data og resultater fra ortogonale metoder for å forstå strukturfunksjonsrelasjoner i hvert vitenskapelige prosjekt fullt ut. Organisering av innsamlede data, overføring til et datasamlebånd for bildebehandling og deling av en resulterende kryo-EM-rekonstruksjon blant samarbeidspartnere stiller ytterligere krav til nye brukere av cryo-EM-metodikk for å sette opp sin lokale IT-infrastruktur. Programvare for databehandling, for eksempel Athena, forenkler sentralisert lagring av data som er samlet inn av et tilkoblet instrument eller programvare som drives av en registrert bruker. Lagrede data og metadata er tilgjengelige ved hjelp av et enkelt nettlesergrensesnitt av flere brukere, som kan ha forskjellige roller i prosjektet med forskjellige tilgangsrettigheter (enten som eier, samarbeidspartner eller seer) basert på påloggingsinformasjon og datadelingsdefinisjon i eksperimentoppsettet. Denne digitaliseringen av eksperimentelle arbeidsflyter gir midler for deling av data og metadata mellom samarbeidspartnere uten unødvendig duplisering og øker produktiviteten og sporbarheten til brukte arbeidsflyter. Implementering av en generell og tilpassbar struktur av prosjekter, eksperimenter og arbeidsflyter i databehandlingsprogramvare er universell og muliggjør tilpasning og integrering av ortogonale eksperimenter ved hjelp av komplementære metoder i en enkelt prosjektdatabase.
Valg av områder for datainnsamlingen på et cryo-EM-rutenett er avgjørende for vellykket innsamling av datasett med høy oppløsning. Cryo-EM-gitter produsert med tradisjonelle dypfrysingsenheter, for eksempel Vitrobot (et helautomatisk vitrifiseringssystem), vil vanligvis vise en gradient av istykkelse over rutenettoverflaten (figur 4). Dette kan være gunstig ettersom rutenettet inneholder områder med forskjellige istykkelser; Områder med den ideelle istykkelsen for datainnsamling må imidlertid identifiseres som beskrevet i protokollen ovenfor. Et optimalt kryo-EM-rutenett bør inneholde så lite overføring isforurensning som mulig og inneholde nok rutenett firkanter med intakt hullete støttefolie. Innsamling av data på grid-firkanter som har sprekker eller ødelagte områder anbefales ikke, da innsamlede bilder vil bli påvirket av betydelig sterkere generell drift ved belysning av en elektronstråle i forhold til rutenettplassene med intakt støttefolie. Overskudd av krystallinsk is kan okkludere de fleste foliehull og/eller forstyrre autofokusering, og slike rutenettstorg bør også unngås. Rutenett firkanter med tynn is viser vanligvis store glassområder og mange lyse foliehull som er synlige i et bilde tatt ved hjelp av Atlas-forhåndsinnstillingen. Forekomsten av tykkere is nær rutenettstenger er å forvente og ukritisk ettersom foliehull i disse områdene av rutenettplassen er utelukket under Hullvalg-prosedyren. Tilstedeværelsen av flere tomme hull i en rutenett firkant kan bety at glassaktig is i de omkringliggende hullene er ekstremt tynn og kan inneholde skadede partikler eller ingen partikler i det hele tatt. Generelt er det lurt å velge rutenett firkanter med en rekke istykkelser på forskjellige regioner på rutenettet for innledende screening og vurdering for å forstå hvilke områder som har de beste forholdene for innsamling av data med høy oppløsning og viser den ideelle partikkeltettheten og orienteringsfordelingen. For apoF- og 20S-proteasomprøvene som brukes i denne studien, inneholder områder med den tynneste observerbare isen de beste forholdene for høyoppløselig avbildning av disse prøvene.
Når du velger hull automatisk i alle valgte rutenett firkanter ved hjelp av datainnsamlingsprogramvaren, anbefales det å utføre malutførelsesoppgave på et representativt hull i hver rutenett firkant for å sjekke og sikre at verken altfor tykke eller altfor tynne eller uventet ikke-glasslegeme firkanter ble valgt for datainnsamling. Under datainnsamlingen kan viktige kvalitetsindikatorer for innsamlede bilder, for eksempel bildedrift og CTF-tilpasning, overvåkes ved hjelp av EQM. Datainnsamling kan deretter optimaliseres ved å hoppe over områder som gir bilder av dårlig kvalitet. Bilder med høyoppløselig CTF-passform kan imidlertid fortsatt inneholde bilder med partikler i noen få foretrukne retninger eller partikler som er denaturert i et for tynt islag. Partikkelplukking i sanntid og 2D-klassifisering fra innsamlede bilder vil gi ytterligere informasjon om kvaliteten på strukturelle data i avbildede partikler og avsløre både foretrukne retninger av intakte partikler i is eller inkonsekvent struktur av (delvis) denaturerte partikler. Beregning av klassegjennomsnitt kan derfor bidra til å ytterligere avgrense passende regioner for datainnsamling, slik det allerede er implementert og vist i andre programvarepakker23,28.
Valg av bildeinnstillinger for datainnsamling, for eksempel forstørrelse, elektrondosehastighet og defokusområde, avhenger av flere kriterier, for eksempel måloppløsning, størrelse på proteinet, prøvekonsentrasjon, ønsket mikroskopgjennomstrømning, etc. For det direkte elektrondetektorkameraet som brukes i disse eksperimentene, ble elektrondosehastigheten valgt i området 4-5 e-/pix/s ved å velge en passende SPOT-størrelse og intensitet for å opprettholde parallell belysning. Som vist i tabell 1, kan en annen SPOT-størrelse brukes i forhåndsinnstillingen Hull/eusentrisk høyde for å sikre tilstrekkelig signal-til-støy-forhold i bildet for sentrering av hull under datainnsamling. Forstørrelsen bør velges slik at pikselstørrelsen er minst 2-3 ganger mindre enn måloppløsningen for cryo-EM-rekonstruksjonen. Imidlertid brukes den høyere forstørrelsen (dvs. mindre pikselstørrelse), det mindre synsfeltet er tatt i bilder, og det er mindre partikler per bilde, noe som til slutt fører til lengre datainnsamlingstid for å samle bilder med nok partikler til å rekonstruere 3D-kart til en høy oppløsning. For apoF-prøven brukte vi pikselstørrelsen på 0,43 Å da vi hadde tilstrekkelig prøvekonsentrasjon for høy tetthet av partikler i bilder og rettet under 2 Å-oppløsningen av rekonstruksjonen. For 20S-proteasomprøven brukte vi pikselstørrelsen på 0,68 Å til å dekke et større synsfelt i oppkjøpte bilder. Vanligvis for 200 kV TEM mikroskoper, er cryo-EM-bilder anskaffet i defokusområdet fra 0,8 til 2,0 μm. Men med det forbedrede kontrast- og signal-til-støy-forholdet ved hjelp av energifilteret, kan datainnsamlinger gjøres mye nærmere fokus for bedre å bevare høyoppløselig informasjon i oppkjøpte bilder på grunn av mindre avvik og tilsvarende redusert forfall av CTF-konvoluttfunksjonen. Vi bruker heller ikke en objektiv blenderåpning, da blenderåpningen kan introdusere flere bildeaberrasjoner, mens bildekontrasten allerede er tilstrekkelig forbedret ved hjelp av energifilteret. For apoF- og 20S-proteasomprøvene brukte vi defokusinnstillingene på 0,5 μm, 0,7μm og 0,9 μm. For mindre proteiner (<200 kDa) brukte vi defokusinnstillinger på -0,5 μm, -0,7 μm og -0,9 μm for å forbedre kontrasten til partikler og lette enklere partikkelplukking og innledende grov justering i 3D-raffineringstrinnet for 3D-rekonstruksjon, noe som førte til ~ 2,5 oppløsning Å 3D-kart (upubliserte resultater).
Vi har allerede vist at avbildning med et energifilter forbedrer signal-til-støy-forholdet (SNR) i cryo-EM-bilder samlet på high-end 300-kV TEM mikroskoper11. Faktisk, når elektroner passerer gjennom en prøve, oppstår to hovedtyper av interaksjoner: i) Elastisk spredte elektroner opprettholder sin energi og bidrar til bildedannelse ved forstyrrelser med den ikke-spredte hendelsesstrålen via fasekontrastmekanismen ii) uelastisk spredte elektroner mister litt energi i prøven og bidrar hovedsakelig til støy i bilder. Derfor kan SNR forbedres betydelig ved å filtrere de uelastisk spredte elektronene, som har lavere energi enn hendelsesstrålen og elastisk spredte elektroner, ved hjelp av en smal energispalte. Det er imidlertid viktig å bruke et tilstrekkelig stabilt energifilter, for eksempel Selectris eller Selectris-X, for å kunne bruke svært smale (10 eV eller mindre) spalter over lange (12+ timer) automatisert datainnsamling av høyoppløselige cryoEM-datasett.
Cryo-EM-bilder ervervet med 200 kV TEM-mikroskoper under samme forhold som med 300 kV TEM-mikroskoper viser mindre SNR ved høy oppløsning (spesielt <4 Å) på grunn av raskere forfall av CTF-konvoluttfunksjonene. Følgelig kreves et høyere antall partikler (og derfor et høyere antall innsamlede bilder) for å oppnå en viss oppløsning ved bruk av 200 kV TEMer. I tillegg er dybdeskarpheten (10-25 nm i oppløsningsområdet 2-3 Å) også omtrent 20% mindre i 200 kV-bilder35, noe som betyr at mindre partikler i islaget (vanligvis 20-50 nm tykk) vil være fullt i fokus og konstruktivt bidra til alle høyoppløselige funksjoner i en beregnet 3D-rekonstruksjon med mindre defokusverdier er raffinert for hver partikkel uavhengig i de senere stadiene av 3D-rekonstruksjonsprosedyren. For større partikler (som icosahedral virions eller andre makromolekylære forsamlinger), kan partikkelstørrelsen overstige dybdeskarpheten ved høye oppløsninger og introdusere fasefeil på grunn av planar-tilnærming av Ewald-sfæren i standard 3D-rekonstruksjonsalgoritmer36. Disse feilene kan forbedres av avanserte algoritmer som allerede er implementert i vanlige cryo-EM-bildebehandlingspakker 37,28,39. Siden Ewald-sfæren har større krumning i 200 kV-data enn 300 kV-data, er Ewald-sfærekorrigering nødvendig ved relativt lavere oppløsninger og/eller for relativt mindre makromolekylære samlinger ved bruk av 200 kV TEM-er. På den annen side viser 200 kV-bilder høyere kontrast av partikler i tynn is (20-50 nm) som er betydelig tynnere enn 200-300 keV-elektronen betyr fri bane (220-280 nm). Den høyere kontrasten bidrar til å forbedre riktig global justering av individuelle partikler, spesielt for svakt spredning av mindre proteiner hvis struktur ennå ikke er kjent, og 3D-referansemodellen er ennå ikke godt etablert.
Her demonstrerte vi på eksempelet på et 20S-proteasom at bildekontrast og kvalitet kunne forbedres på samme måte med et energifilter når du bruker et 200 kV TEM-mikroskop. Ved hjelp av samme antall partikler ble data samlet inn ved hjelp av 20 eV-spalten rekonstruert til 2,26 Å-oppløsning i forhold til data samlet inn med den fullt åpnede energispalten som bare ble rekonstruert til 2,34 Å-oppløsning. Den beste rekonstruksjonen ble oppnådd fra data samlet inn ved hjelp av 10 eV-spalten som ble rekonstruert til 2,14 Å-oppløsning. Disse resultatene er i samsvar med den teoretiske prediksjonen om at filtrering av de uelastisk spredte elektronene øker SNR i innsamlede bilder og letter høyere oppløsning i kryo-EM-rekonstruksjoner fra det gitte antall partikler, som oppsummert i tabell 4. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet av B-faktorene beregnet fra disse datasettene som indikerer høyere kvalitet på bilder i de energifiltrerede datasettene.
Vi kan derfor konkludere med at mens 300 kV TEM mikroskoper leverer den høyeste gjennomstrømningen og høyest mulig oppløsning i kryo-EM-rekonstruksjoner, gir 200 kV TEM-mikroskopene også datasett av høy kvalitet for høyoppløselige kryo-EM-rekonstruksjoner. Vi viste her at kvaliteten på oppkjøpte bilder, og derfor samlet tid til struktur, kan forbedres ytterligere ved å bruke 200 kV TEM utstyrt med et energifilter og en direkte elektrondetektor. Den presenterte protokollen beskriver alle nødvendige skritt for å rutinemessig skaffe høyoppløselige cryo-EM-data ved hjelp av dette oppsettet og avsløre fine strukturelle detaljer om makromolekylære 3D-strukturer, som er avgjørende for å forstå de viktigste strukturfunksjonsforholdene i strukturell biologi og strukturbasert legemiddeldesign.
Disclosures
Sagar Khavnekar melder om ingen interessekonflikter. De andre forfatterne er ansatte i Thermo Fisher Scientific, MSD-EM-divisjonen.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AutoGrid rings | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids. |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings. |
| Data Management Platform | Thermo Fisher Scientific | 1160939 | Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software |
| EPU Quality Monitor | Thermo Fisher Scientific | 1179770 | |
| EPU Software | Thermo Fisher Scientific | 1025080 | Part of the Glacios base configuration |
| Ethane 3.5 | Westfalen | A06010110 | Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol) |
| Falcon 4 200kV | Thermo Fisher Scientific | 1166936 | Direct electron detector |
| Glacios | Thermo Fisher Scientific | 1149551 | 200 kV TEM |
| GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification | Quorum | N/A | also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602) |
| QuantiFoil grids | Quantifoil | N/A | R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid |
| Relion | MRC Laboratory of Molecular Biology | N/A | open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/ |
| Selectris with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191753 | Energy filter |
| Selectris X with Falcon 4 for 200 kV |
Thermo Fisher Scientific | 1191755 | Energy filter |
| UltrAuFoil grids | Quantifoil | N/A | R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids |
| Vitrobot Mk. IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | Automated vitrification system |
| Whatman 595 filter paper | Thermo Fisher Scientific | AA00420S |
References
- Wang, J., Hua, T., Liu, Z. -J. Structural features of activated GPCR signaling complexes. Current Opinions in Structural Biology. 63, 82-89 (2020).
- Chen, S., Gouaux, E. Structure and mechanism of AMPA receptor - auxiliary protein complexes. Current Opinions in Structural Biology. 54, 104-111 (2019).
- Kühlbrandt, W. Structure and mechanisms of F-Type ATP synthases. Annual Review of Biochemistry. 88, 515-549 (2019).
- Laverty, D., et al. Cryo-EM structure of the human α1β3γ2 GABA A receptor in a lipid bilayer. Nature. 565 (7740), 516-520 (2019).
- Liu, F., Zhang, Z., Csanády, L., Gadsby, D. C., Chen, J. Molecular structure of the Human CFTR ion channel. Cell. 169 (1), 85-95 (2017).
- Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
- Ke, Z., et al. Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions. Nature. 588, 498-502 (2020).
- Yan, R., Zhang, Y., Li, Y., Xia, L., Guo, Y., Zhou, Q. Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2. Science. 367 (6485), 1444-1448 (2020).
- Walls, A. C., Park, Y. -J., Tortorici, M. A., Wall, A., McGuire, A. T., Veesler, D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell. 180, 281-292 (2020).
- Chiba, S., et al. Multivalent nanoparticle-based vaccines protect hamsters against SARS-CoV-2 after a single immunization. Communications Biology. 4 (1), 597 (2021).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Bai, X. C. Seeing atoms by single-particle Cryo-EM. Trends in Biochemical Sciences. 46 (4), 253-254 (2021).
- Koh, A., et al. High-resolution cryo-EM at 200kV enabled by Selectris-X and Falcon 4. Microscience Microscopy Congress 2021. , Abstract 212 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. Achieving better-than-3-Å resolution by single-particle cryo-EM at 200 keV. Nature Methods. 14 (11), 1075-1078 (2017).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C., Herzik, M. A. Sub-2 Angstrom resolution structure determination using single-particle cryo-EM at 200 keV. Journal of Structural Biology X. 4, 100020-100029 (2020).
- Mori, T., et al. C-Glycoside metabolism in the gut and in nature: Identification, characterization, structural analyses and distribution of C-C bond-cleaving enzymes. Nature Communications. 12 (1), 6294 (2021).
- Hamdi, F., et al. 2.7 Å cryo-EM structure of vitrified M. musculus H-chain apoferritin from a compact 200 keV cryo-microscope. PLoS One. 15 (5), 0232540 (2020).
- Abbott, S., et al.
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Gómez-Blanco, J., et al. Using Scipion for stream image processing at Cryo-EM facilities. Journal of Structural Biology. 204 (3), 457-463 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
- Bloch, M., Santiveri, M., Taylor, N. M. I. Membrane protein Cryo-EM: Cryo-grid optimization and data collection with protein in detergent. Methods in Molecular Biology. 2127, 227-244 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Schorb, M., et al. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Alewijnse, B., et al. Best practices for managing large CryoEM facilities. Journal of Structural Biology. 199, 225-236 (2017).
- Baldwin, P. R., et al. Big data in cryoEM: automated collection, processing and accessibility of EM data. Current Opinion in Microbiology. 43, 1-8 (2018).
- Guo, H., et al. Electron-event representation data enable efficient cryoEM file storage with full preservation of spatial and temporal resolution. International Union of Crystallography Journal. 7, 860-869 (2020).
- Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 76 (8), 724-728 (2020).
- Zhou, H., Chiu, W. Determination of icosahedral virus structures by electron cryomicroscopy at subnanometer resolution. Advances in Protein Chemistry. 64, 93-124 (2005).
- DeRosier, D. J. Correction of high-resolution data for curvature of the Ewald sphere. Ultramicroscopy. 81 (2), 83-98 (2000).
- Wolf, M., DeRosier, D. J., Grigorieff, N. Ewald sphere correction for single-particle electron microscopy. Ultramicroscopy. 106 (4-5), 376-382 (2006).
- Leong, P. A., Yu, X., Hong Zhou, Z., Jensen, G. J. Correcting for the ewald sphere in high-resolution single-particle reconstructions. Methods in Enzymology. 482, 369-380 (2010).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 42166 (2018).
