Summary
이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.
Abstract
오가노이드와 면역 세포의 복잡한 공동 배양은 점막 항상성의 섬세한 균형을 뒷받침하는 양방향 상호 작용을 조사하기위한 다목적 도구를 제공합니다. 이러한 3D 다세포 시스템은 다인자 질환을 해결하고 조직 상주 선천성 림프세포(ILC)와 같은 희귀 세포 유형을 연구할 때 발생하는 기술적 어려움을 해결하기 위한 환원주의 모델을 제공합니다. 이 글에서는 소장 오가노이드와 소장 라미나 프로프리아 유래 헬퍼-유사 타입 1 ILC(ILC1s)를 결합한 뮤린 시스템을 설명하며, 이는 다른 ILC 또는 면역 집단으로 쉽게 확장될 수 있다. ILCs는 점막에서 특히 풍부 한 조직 거주 개체군으로, 항상성을 촉진하고 손상이나 감염에 신속하게 반응합니다. ILCs와의 오가노이드 공동 배양은 이미 장의 새로운 상피 면역 신호 전달 모듈에 대한 빛을 비추기 시작했으며, 다른 ILC 서브 세트가 장 상피 장벽 무결성 및 재생에 어떻게 영향을 미치는지 밝혀 냈습니다. 이 프로토콜은 상피와 면역 세포 사이의 상호 작용에 대한 추가 조사를 가능하게하며, 점막 항상성과 염증의 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 보유하고 있습니다.
Introduction
장 상피와 장 상주 면역 체계 사이의 의사 소통은 장 항상성 1의 유지의핵심입니다. 이러한 상호 작용에 대한 중단은 염증성 장 질환 (IBD) 및 위장 암2를 포함한 국소 및 전신 질환 모두와 관련이 있습니다. 항상성의 한 가지 더 최근에 기술된 중요한 조절자의 주목할만한 예는 장 면역 환경에서 핵심 플레이어로 부상한 선천적 림프성 세포 (ILCs)의 연구에서 비롯됩니다3. ILCs는 장 항상성을 조절하고 사이토카인 매개 신호전달을 통해 염증을 크게 조율하는 이질적인 선천적 면역 세포의 그룹이다4.
뮤린 ILCs는 전사 인자, 수용체, 및 사이토카인 발현 프로필5에 기초한 아류형으로 광범위하게 분할된다. 세포독성 내추럴킬러(NK) 세포 및 헬퍼-유사 타입 1 ILCs(ILC1s)를 포함하는 제1형 ILCs는 T 세포(T-bet)6에서 발현되는 전사인자(eomesodermin) 에옴 및 T-박스 단백질의 발현에 의해 각각 정의되며, T 헬퍼 타입-1(TH1)면역과 관련된 사이토카인을 분비한다: 인터페론-γ(IFNγ) 및 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL)-12에 반응하여, IL-15 및 IL-187. 항상성 동안, 조직-상주 ILC1s는 상피 증식 및 매트릭스 리모델링을 유도하기 위해 변형 성장 인자 β(TGF-β)을 분비한다8. 제2형 ILCs(ILC2s)는 주로 T 헬퍼 타입-2(TH2) 관련 사이토카인의 분비를 통해 기생충 감염에 반응한다: IL-4, IL-5, 및 IL-13, 및 레티노산 관련 고아 수용체(ROR) α(ROR-α)9 및 GATA 결합 단백질 3(GATA-3)10,11,12의 발현을 특징으로 한다. . 마우스에서, 장내 "염증성" ILC2s는 킬러 세포 렉틴-유사 수용체 (서브패밀리 G 멤버 1, KLRG)13의 발현을 추가로 특징으로 하며, 여기서 이들은 상피 터프트-세포 유래 IL-2514,15에 반응한다. 마지막으로, 림프성 조직 유도제 세포 및 헬퍼-유사 타입-3 ILCs(ILC3s)를 포함하는 타입-3 ILCs는 전사 인자 ROR-γt 16에 의존하고, 국소 IL-1β 및 IL-23신호(17)에 반응하여 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF),IL-17, 또는 IL-22를 분비하는 그룹으로 군집된다. 림프성 조직 유도제 세포는 Peyer의 패치에 군집하고 발달18 동안 이러한 이차 림프성 기관의 발달에 결정적이며, ILC3s는 성인 뮤린 소장 라미나 프로프리아에서 가장 풍부한 ILC 아형이다. ILC3s를 갖는 최초의 뮤린 장내 오가노이드 공동배양 시스템 중 하나는 신호 트랜스듀서 및 전사 3의 활성화제에 대한 사이토카인 IL-22의 영향을 분리하기 위해 이용되었고, 전사 3(STAT-3) 매개된 류신-풍부 반복 G 단백질 결합 수용체 5(Lgr5)+ 장 줄기 세포 증식(19)을 포함하는, 재생 ILC-상피 상호작용의 강력한 예이다. ILCs는 기관(20,21) 사이에 각인-이질성을 나타내고, 편광 사이토카인(22)에 반응하여 서브세트 사이에 가소성을 나타낸다. 이러한 조직 특유의 각인과 가소성 차이를 일으키는 요인과 IBD23과 같은 만성 질환에서 그들이 어떤 역할을하는지는 오가노이드 공동 문화를 사용하여 해결할 수있는 흥미로운 주제로 남아 있습니다.
장 오가노이드는 장 상피24,25를 연구하는 성공적이고 신뢰할 수있는 모델로 부상했습니다. 이들은 Wnt 패밀리 멤버 3A (Wnt3a)의 내인성 공급원으로서 파네스 세포를 포함하는 장 상피 Lgr5+ 줄기 세포 또는 전체 단리된 크립트를 배양함으로써 생성된다. 이러한 3D 구조는 합성 하이드로젤(26) 또는 기저 라미나 프로프리아를 모방한 생체재료, 예를 들어 열-가교 기저 세포외 매트릭스(TBEM)에서 유지되며, 특히 상피 성장 인자(EGF), 골 형태유전 단백질(BMP)-억제제 노긴, Lgr5-리간드 및 Wnt-아고니스트 R-Spondin127을 모방하는 성장 인자로 추가로 보충된다. . 이러한 조건 하에서, 오가노이드는 상피 아피코-기저 극성을 유지하고, 오가노이드의 중심에서 흡수성 및 분비 세포로 말단으로 분화되는 신진 줄기 세포 크립트로 장 상피의 크립트-빌리 구조를 재편성하고, 그 후 anoikis28에 의해 내부 슈도루멘으로 흘려진다. 비록 장내 오가노이드 단독으로는 상피 발달과 역동성의 환원주의 모델로서 매우 유리했지만,29,30은 이러한 행동이 면역 구획에 의해 어떻게 조절, 영향 또는 심지어 파괴되는지를 이해하는 데 엄청난 미래의 잠재력을 가지고 있습니다.
다음의 프로토콜에서, 뮤린 소장 오가노이드와 라미나 프로프리아 유래 ILC1s 사이의 공동 배양 방법이 기술되어 있는데, 이는 최근에 이 집단이 어떻게 예기치 않게 염증의 장 시그니처를 감소시키고 대신이 시스템에서 TGF-β을 통한 상피 증식 증가에 기여하는지를 확인하기 위해 사용되었다8.
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Protocol
모든 실험은 동물 사용에 대한 모든 관련 규제 및 제도적 지침에 따라 완료되어야합니다. 다음 기사 및 비디오에 설명 된 연구에 대한 윤리적 승인은 동물 사용에 대한 모든 관련 규제 및 제도적 지침에 따라 획득되었습니다.
모든 마우스는 표준 윤리적 절차에 따라 자궁 경부 탈구에 의해 도태되었고, 훈련 된 개인에 의해 수행되었다. 장기 및 조직 수확 전에, 대퇴골 동맥의 슬라이스 또는 감금 (손에 프로토콜에 적절한대로)을 사망에 대한 확인 평가로 실시했습니다. 동물은 영국 동물 (과학 절차) 법 1986 (영국 홈 오피스 프로젝트 라이센스 (PPL : 70 / 7869 ~ 9 월 2018; P9720273E 2018년 9월부터).
1. 뮤린 소장 오가노이드 확립
참고 : 프로토콜의이 섹션은 뮤린 소장에서 장 오가노이드의 생성을 설명합니다. 크립트는 먼저 조직으로부터 분리되고, TBEM에 재현탁된 다음, EGF, 노긴, 및 R-스폰딘(ENR)을 함유하는 배지와 함께 인큐베이션된다. 뮤린 작은 장 오가노이드를 확립하는 것은 또한 다른 곳에서 잘 기술되어 있다24,25,27.
- TBEM을 얼음 위에 놓고 해동(40 μL/웰)하고, 24-웰 플레이트(친수성 및 음전하를 띤 표면을 갖는 플레이트를 나타냄)로 처리된 표준 조직 배양물을 37°C 인큐베이터에 넣어 예열한다.
참고: TBEM의 500 μL는 대략 2-4 h에서 해동할 것이다; 실온에서 방치하지 마십시오. - EGF, Noggin 및 R-Spondin을 기본 배지에 첨가하여 웰당 4 mL 또는 550 mL의 ENR 배지를 준비하고(표 1) 37°C 인큐베이터에 배치한다.
- 6-12 주 된 동물을 구부하고 포셉과 미세 해부 가위를 사용하여 소장을 해부하십시오. 얼음 위에 인산완충식염수(PBS) 15 mL에 넣는다.
- 위와 caecum을 배향 지점으로 사용하여 소장의 원하는 영역 (십이지장, 제주눔 또는 장폐색)을 분리하십시오. 이 프로토콜에서, 장폐색은 격리된다.
- PBS에 내장을 얼음 위에 10cm2 페트리 접시에 담그십시오. 포셉을 사용하여 지방을 부드럽게 제거하지만 장에서 완전히 제거하십시오.
- 미세 해부 가위를 사용하여 조직을 세로로 자르십시오 (천공을 피하기 위해 둥근 팁이있는 것이 바람직 함). 장을 PBS에 잠기게 하고, 흔들어 분변 물질을 제거하고, 점액면을 위로 유지하여 조직 배향을 추적한다.
- 얼음 위의 페트리 접시의 마른 뚜껑으로 조직을 옮기고 장 점액 / 융모 쪽을 위로 올려 놓습니다. 포셉으로 장의 한쪽 끝을 잡고 깨끗한 유리 슬라이드의 각진 가장자리를 사용하여 점액을 부드럽게 긁어 내십시오.
- 플레이트를 얼음처럼 차가운 PBS로 채우고 조직을 헹구십시오.
- 50 mL 튜브를 PBS2 (PBS + 2% FCS; 표 1 참조)로 미리 코팅하여 플라스틱에 대한 조직의 부착을 방지하고 이 튜브에 빙냉 PBS 10 mL를 첨가한다. 장을 작은 (~ 2mm) 세그먼트로 자르고 PBS2로 미리 코팅 된 50 mL 튜브로 옮깁니다.
- PBS2로 예비코팅된 25 mL 피펫을 사용하여, 세그먼트를 5-10회 상하로 피펫하여 조직 단편을 세척하였다.
- 세그먼트가 15-30 초 동안 정착되도록 허용하고, PBS 상청액을 제거 및 폐기하고, 용액이 맑을 때까지 (약 3-4 회) 1.10 및 1.11 단계를 반복하십시오.
- 세그먼트가 PBS 상청액을 침전시키고 버리도록 허용하십시오. 얼음처럼 차가운 암호 분리 버퍼 30mL를 추가합니다(표 1).
- 튜브를 수평 롤러 또는 로커 위에 놓고 4°C에서 30분 동안 30-60 rpm(또는 부드럽게)으로 두십시오. 지하실이 조기에 빠져 나와 생존력과 수율이 낮은 단일 세포가되기 때문에 더 빠른 속도, 더 높은 온도 또는 더 긴 지속 시간으로 배양하지 마십시오.
참고 :이 단계부터 모든 절차는 멸균 된 물질과 시약을 사용하여 무균 환경에서 수행되어야합니다. - 장 세그먼트가 50 mL 튜브의 바닥에 정착하도록 허용하십시오. 침전된 세그먼트를 방해하지 않고 크립트 분리 버퍼를 제거하고 얼음 위의 50mL 튜브로 옮깁니다.
참고: 크립트 격리 프로세스가 너무 엄격하면 이 부분에 크립트가 표시될 수 있습니다. 따라서 예비로 보관할 수 있지만 프로토콜이 끝날 때 최적으로 폐기됩니다. - 얼음처럼 차가운 PBS 20 mL를 장 세그먼트에 첨가하십시오. PBS2로 예비코팅된 25 mL 피펫을 사용하여, 피펫 장 세그먼트를 5-8회 상하로 한다.
- 세그먼트가 30 초 동안 정착하도록하십시오. 50 mL 튜브 및 25 mL 피펫을 PBS2로 프리코팅한다. 이 피펫을 사용하여, 상층액(분획 1)을 미리 코팅된 50 mL 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓는다.
참고: 이 분획은 나머지 크립트 격리 버퍼를 헹구는 역할을 합니다. 그러나, 이는 또한 추가적인 품질 관리 단계로서 기능한다; 피펫팅이 너무 활발하다면,이 헹굼 분수에 지하실이 풍부 할 것이고, 너무 온화하다면이 분수에 파편이 거의 없을 것입니다. 최적으로, 분획 1은 프로토콜의 끝에서 폐기되지만, 아래에서 얻은 분수 2-4로 문제가 발생하는 경우 오가노이드를 만드는 데 사용할 수 있습니다. - 단계 1.15 및 1.16을 반복하되 20 mL가 아닌 빙냉 PBS 10 mL를 첨가하고, 상층액을 PBS2로 미리 코팅된 신선한 50 mL 튜브에 넣는다(분획 2).
- 단계 1.17을 2회 더 반복하되 생성된 상등액을 분획 2로 풀링하고(단계 1.17로부터 동일한 50 mL 튜브 내로) 분획 2-4를 얻었다. 이 단일 50 mL 튜브는 30 mL의 빙냉 PBS에 박힌 지하실을 함유해야합니다.
- 풀링된 2-4 분획으로부터 50 μL 분취량을 제거하고 커버슬립 상에 놓는다. 거꾸로 된 광학 현미경을 사용하여 상피 토굴의 존재를 평가하십시오.
참고: 크립트가 없으면 크립트가 해제될 때까지 피펫팅 중에 더 많은 힘을 사용하여 1.17단계와 1.18단계를 반복합니다. 크립트가 1.14단계의 크립트 격리 버퍼 또는 1.16단계의 분획 1에서 조기에 제거되지 않았는지 확인하십시오. - 100 μm 스트레이너 및 50 mL 튜브를 PBS2로 프리코팅한다. 풀링된 크립트 분획을 이 스트레이너를 통해 사전 코팅된 50 mL 튜브에 통과시킵니다.
- 변형된 크립트 분획을 4°C에서 5분 동안 300 x g 으로 스핀다운한다.
- 상층액을 버리고 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F12 10mL에 토굴을 재현탁합니다. 지하실을 15 mL 튜브로 옮깁니다.
- 크립트를 4°C에서 5분 동안 210 x g 에서 스핀다운하여 단일 세포 및 림프구를 제거하였다.
- 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F12 1mL에 크립트를 재현탁합니다.
- 10μL 분취량을 꺼내 커버슬립 위에 놓습니다. 거꾸로 된 광학 현미경을 사용하여 크립트 수를 계산하여 크립트 농도를 결정하십시오.
- ~ 400 및 ~ 1,500 크립트에 필요한 볼륨을 계산하십시오. p1000 팁을 PBS2로 미리 코팅하고 이 팁을 사용하여 필요한 부피(~400개 및 ~1,500개의 크립트 포함)를 별도의 1.5mL 튜브에 피펫팅합니다.
- 크립트를 4°C에서 5분 동안 300 x g 로 스핀다운한다.
- 상청액을 가능한 한 많이 제거하고, 크립트를 80 μL의 TBEM에 재현탁시킨 후 얼음 위에 놓았다(12°C에서 발생하는 매트릭스 겔화를 방지하기 위해 4°C에서 미리 냉각된 피펫 팁).
- 단계 1.1에 놓인 24-웰 플레이트를 인큐베이터로부터 제거한다. 40 μL의 크립트를 천천히 원형 운동으로 우물 중앙으로 부드럽게 피펫하여 평평하지만 3D 돔 구조를 형성하거나 3 개의 분리 된 작은 돔으로 만듭니다.
참고 : 오가노이드의 생존력은 영양소와 가스가 덜 효과적으로 침투하는 돔의 중심에서 가장 낮습니다31; 따라서 투명한 3D 구조를 유지하면서 매체에 노출되는 표면적을 최대화하는 것이 중요합니다. - 1.29단계를 반복하여 웰당 ~200개의 크립트 밀도를 가진 총 두 개의 웰과 웰당 ~750개의 크립트 밀도를 가진 두 개의 웰을 더 만듭니다. 플레이트를 15-20분 동안 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에 직접 놓고, 점성이 있지만 여전히 액체 매트릭스 돔을 파괴하지 않도록 주의한다.
- 웰 당 550 μL의 예비-가온된 ENR 배지를 첨가하고(단계 1.2로부터) 37°C 및 5% CO2에서24 시간 동안 인큐베이션한다. 이 단계에서, 조직으로부터 갓 분리된 크립트의 오가노이드 생성의 수율 및 효율을 향상시키기 위해 분리 후 배양 후 처음 24시간 동안 5 μM의 Wnt 작용제 (CHIR 99021) 및 5 μM Rho 키나제 억제제 (Y-27632)로 ENR 배지를 보충하는 것이 제안된다.
참고: 크립트는 24시간 이내에 둥근 구조물을 형성하기 위해 가까이 있어야 하며, 크립트 새싹은 2-4일 이내에 나타나야 합니다(그림 1A). - 단계 1.31에서 배양이 끝날 때 신선한 ENR 배지로 교체한 다음, ~2일마다 또는 배지 내의 페놀 pH 지시약이 옅은 주황색으로 변하지만 노란색으로 변하기 전에 교체한다.
2. 뮤린 소장 오가노이드의 유지
참고 : 프로토콜의이 섹션은 뮤린 소장 오가노이드의 유지 및 통과에 대해 설명합니다. 오가노이드는 먼저 수확 된 다음 구부러진 p1000 팁을 사용하여 기계적으로 파괴됩니다. 이 과정은 수많은 지하실로 구성된 큰 오가노이드를 확장을 위해 여러 개의 작은 조각으로 분해하고 의사 루멘에 축적 된 죽은 세포를 방출합니다. 뮤린 소장 오가노이드 유지는 또한 다른 곳에서 잘 기술되어 있다24,25,27. 모든 절차는 멸균 물질과 시약을 사용하여 무균 환경에서 수행되어야합니다. 오가노이드의 파열이 발생하기 전에 4-5 일에 한 번씩 오가노이드를 통과하거나 확장하면 오가노이드 내강에 파편이 상당히 축적되어 발생합니다. 오가노이드는 오가노이드 밀도에 따라 1:2-1:3의 비율로 계대될 수 있으며, 이는 웰 당 100-200개의 오가노이드 사이가 최적으로 될 것이다.
- 단계 1.1 및 1.2에서와 같이, 얼음 (40 μL/웰) 상에서 TBEM을 해동하고 ENR 배지 (웰 당 550 μL)를 준비한다. 배지 및 표준 조직 배양 처리된 24-웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 놓는다.
- 오가노이드를 함유하는 플레이트를 인큐베이터에서 제거한다. 통과 할 우물에서 미디어를 버리십시오.
- 500μL의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F12를 웰에 넣습니다. p1000 팁(팁 내부에 오르가노이드가 달라붙지 않도록 매체로 사전 코팅됨)을 사용하여 오가노이드를 15mL 튜브에 삽입합니다.
- 250-300μL의 얼음처럼 차가운 Advanced DMEM/F12로 웰 바닥을 헹구어 오가노이드가 웰에 남아 있지 않도록 하고 2.3단계에서 수확한 오가노이드가 들어있는 15mL 튜브에 풀링합니다. 여러 웰을 통과시킬 때 2.3단계와 2.4단계를 반복하고 여러 웰의 오가노이드를 동일한 15mL 튜브에 풀링합니다.
- 오가노이드를 4°C에서 3분 동안 300 x g 로 스핀다운한다.
- 원심분리시, 네 개의 가시적인 분획이 있는지 확인하십시오: 건강한 오가노이드를 가진 염기 분획, 중심적이고 명확한 매트릭스 분획, 단일 및 죽은 세포를 포함하는 매트릭스 분획, 단일 및 죽은 세포를 포함하는 상부 상청액 층. 상청액, 파편 분획 및 오가노이드의 펠릿을 파괴하지 않고 가능한 한 많은 투명 매트릭스 단편을 제거하십시오.
- p1000 피펫 팁(약 2-5mm 벤드)의 팁을 부드럽게 구부립니다. 이 팁을 PBS2 또는 고급 DMEM/F12에 미리 코팅합니다. 이 팁을 사용하여 오가노이드를 10-20 번 위아래로 피펫하여 오가노이드와 나머지 매트릭스를 기계적으로 방해합니다.
- 4°C에서 3분 동안 210 x g에서 스핀다운한다.
- 단계 2.6에서와 같이, 해리된 크립트의 펠릿을 파괴하지 않으면서 상청액, 파편 분획 및 가능한 한 많은 투명 매트릭스 단편을 제거한다. 건강한 크립트 또는 작은 오가노이드가 투명한 펠렛을 형성하지 않은 경우, 4°C에서 3분 동안 300 x g 에서 다시 원심분리한다.
- TBEM의 필요한 부피를 계산하십시오 (1:2 또는 1:3 통과비가 사용되는지에 따라 수확된 오가노이드의 웰 당 80-120 μL).
- TBEM의 계산된 부피에서 펠렛을 재현탁시키고, 웰당 40 μL를 미리 가온된 24-웰 플레이트에 적용하여 돔을 형성하였다. 플레이트를 직접 인큐베이터(37°C; 5%CO2)에 15-20분 동안 배치한다.
- 웰 당 550 μL의 ENR 배지를 첨가하고, 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이션한다. 24 시간 후에 유기체 형성에 대한 배양물을 확인하십시오. 통과 후 2-3 일마다 신선한 ENR 배지로 교체하십시오.
3. 소장 라미나 프로프리아 선천성 림프 세포의 분리
참고: 프로토콜의 이 섹션은 RORγtGFP 리포터 마우스의 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터의 ILC1의 단리를 기술한다. 여기에는 상피 세포 제거, 조직 소화, 림프구의 밀도 구배 분리 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통한 ILC1 분리가 포함됩니다. 도 2의 게이팅 전략에 따른 FACS 분리는 세포외 염색 마스터믹스(표 4)를 필요로 하며, 기계(표 2) 및 게이팅(표 3)에 대해 표 2 및 표 3에 기재된 추가적인 염색 대조군이 설치된다. RORγt GFP 리포터 마우스는 살고, 순수한 ILC1 및 RORγtGFP+ ILC3을 게이트아웃하는데 사용된다. 라미나 프로프리아 림프구의 단리를 위한 조직 처리는 또한 다른 곳(32)에서 잘 기술되어 있다.
- 조직 처리
참고: 개별 생물학적 동물 복제물로부터의 조직은 이 프로토콜에서 분리되어 보관된다. 이 샘플은 적절하게 라벨을 붙이고 가능할 때마다 얼음 위에 보관해야합니다. 소화 효소를 제외한 모든 시약은 신속한 조직 소화를 보장하기 위해 실온에 도달하도록 허용되어야합니다.- TBEM을 얼음 위에 올려 놓고 해동시킵니다(40μL/웰). 표준 조직 배양 처리된 24-웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 보관하여 예비-가온한다.
- 신선한 상피 제거 완충액 및 소화 완충액을 준비한다( 표 1 참조). 중화 완충액에서 등장성 저점도 밀도 구배 배지 (LVDGM) (90% LVDGM 및 10% 10x PBS), 40% 등장성 LVDGM, 및 80% 등장성 LVDGM을 제조한다 (표 1).
- 6-12 주 된 동물을 구부하고, 포셉과 미세 해부 가위를 사용하여 소장을 해부하고, 얼음 위에 PBS 15 mL에 장을 놓습니다.
- 얼음 위에 10cm2 페트리 접시에 PBS에 내장을 담그고 포셉을 사용하여 지방을 부드럽게 그러나 완전히 장에서 제거하십시오.
- 림프 조직 유도제 세포와 B 세포를 고갈시키기 위해 미세 해부 가위를 사용하여 Peyer의 패치 (~ 5-10; 지방 조직 라인과 반대되는 라인에서 실행)를 제거하십시오.
참고 : Peyer의 패치는 Rag-/- 및 기타 혈통이 고갈 된 동물에는 없습니다. 기포와는 달리, Peyer의 패치는 찌르면 그대로 유지됩니다. - 미세 해부 가위를 사용하여 조직을 세로로 자르십시오 (천공을 피하기 위해 둥근 팁이있는 것이 바람직 함). 장을 PBS에 잠근 상태로 유지하고 흔들어 분변 물질을 제거하십시오.
- 조직을 2-4cm 길이의 조각으로 자르고 50 mL 튜브로 옮깁니다.
- 얼음처럼 차가운 PBS 약 20-40 mL를 넣고 5-15 초 동안 격렬하게 흔들어 점액과 이물질을 제거하십시오.
- 튜브의 내용물을 신선한 페트리 접시에 버리고 포셉을 사용하여 동일한 50mL 튜브에 장 조각을 교체하십시오.
- 단계 3.1.8 및 3.1.9를 3-4회 반복하거나 PBS가 지워질 때까지 반복하십시오.
- 상피 제거
- 장 조각을 얼음 위의 신선한 페트리 접시에 넣으십시오. 포셉을 사용하여 장 세그먼트를 집어 들고 건조한 표면을 두드려 과도한 액체를 제거하십시오.
- 조직을 ~ 0.75-1cm 조각으로 자르고 신선한 50 mL 튜브로 옮깁니다. 상피 제거 완충액 5-7 mL를 첨가한다(표 1). 튜브를 소용돌이 치며 모든 장 세그먼트가 버퍼에 잠겨 있는지 확인하십시오.
- 샘플을 12-15분 동안 락킹(100-150 rpm)하면서 37°C에서 인큐베이션한다. 튜브를 20-30 초 동안 소용돌이 치십시오.
- 3.2.1-3.2.3 단계를 한 번 더 반복하여 흐린 상층액 (분획은 상피 및 상피 세포 포함)을 버리고 신선한 상피 제거 버퍼로 대체하십시오.
- 조직의 소화
- 신선한 페트리 접시에 내용물을 팁. 포셉을 사용하여 장 세그먼트를 집어 들고 건조한 표면을 탭하여 과도한 액체를 버리십시오. 세그먼트를 얼음 위의 신선한 페트리 접시에 넣으십시오.
- 세그먼트를 페트리 접시의 중앙에 조밀 한 덩어리로 묶으십시오. 두 개의 메스 또는 날카로운 가위를 사용하여 p1000 피펫 팁을 통과 할 수있는 점성 일관성에 도달 할 때까지 조직을 잘게 파쇄했습니다.
- 핀셋을 사용하여 다진 조직을 깨끗한 50mL 튜브에 넣습니다. 페트리 접시를 1-2 mL의 소화 완충액 (표 1)으로 헹구어 남은 조직을 모으고 파쇄 된 조직이있는 50 mL 튜브에 풀링하십시오.
- 파쇄 된 조직에 소화 완충액 5-7 mL를 넣고 모든 조직이 튜브 바닥에 수집되도록하십시오.
- 샘플을 37°C에서, 배지 락킹(∼100-150 rpm)으로 15분 동안 인큐베이션한다. 소화를 돕기 위해 5 분마다 20-30 초 동안 튜브를 소용돌이 치십시오.
- 샘플이 인큐베이팅되는 동안, 각 샘플에 대해 신선한 50 mL 튜브 위에 40 μm 세포 스트레이너를 놓는다. 필터를 1-2 mL의 중화 완충액으로 코팅한다(표 1).
- 인큐베이션이 완료된 후 샘플을 20-30초 동안 볼텍스한다.
- 부분적으로 소화된 조직을 코팅된 40 μm 필터를 통해 중화 완충액을 함유하는 50 mL 튜브 내로 여과한다.
- 핀셋을 사용하여 40 μm 필터에서 소화되지 않은 조직을 수집하고 소화가 수행 된 50 mL 튜브에 다시 넣고 두 번째 소화 라운드를 수행하십시오. 필터를 제거하고 소화 완충액으로 헹구어 필터에 부착 된 소화되지 않은 조직을 제거하십시오.
- 일단 가능한 한 많은 소화되지 않은 조직이 필터로부터 제거되면, 소화가 수행된 50 mL 튜브에 다시 넣고, 여과된 상청액이 들어있는 50 mL 튜브 위에 1-2 mL 중화 완충액으로 필터를 헹구었다.
- 여과 된 상청액에 중화 완충액 20-25 mL를 넣고 얼음 위에 올려 놓고 조직 소화의 두 번째 라운드 동안 분리 된 세포의 생존력을 유지하십시오.
- 소화되지 않은 조직에 또 다른 5-10 mL의 소화 완충액을 첨가하고 3.3.5-3.3.10 단계를 반복하여 소화 된 조직을 3.3.8 단계에서 사용 된 것과 동일한 튜브로 필터링하도록합니다 (동일한 필터를 재사용할 수도 있음). 50mL 라인에 도달할 때까지 중화 완충액으로 필터를 헹구고 소화되지 않은 나머지 조직은 버립니다.
- 밀도 구배에 의한 림프구 분리
- 수집된 상청액을 각 생물학적 복제물에 대해 10분 동안 500 x g 에서 회전시킨다.
- 단계 3.4.1 동안, 5 mL의 80% 등장성 LVDGM을 각 생물학적 반복실험을 위한 15 mL 튜브에 첨가한다.
- 원심분리 후, 여과되고 소화된 조직으로부터 상층액을 버린다. 펠렛을 40% 등장성 LVDGM의 10 mL에 재현탁하여, 펠릿이 잘 균질화되고 큰 덩어리가 남지 않도록 한다.
- 피펫 보조제를 가장 느린 설정으로 설정하고, 80% 등장성 LVDGM을 함유하는 15 mL 튜브를 기울이고, 세포 현탁액이 80% 분획과 혼합되지 않도록 40% 등장성 LVDGM에 10 mL의 세포 현탁액을 매우 부드럽게 오버레이한다.
참고: 분획이 실수로 혼합되어야 하는 경우, PBS로 채워진 두 개의 50 mL 튜브 사이에 80% 분획에 도달한 림프구를 빠르게 분배하고, 500 x g에서 10분 동안 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 버리고 3.4.3-3.4.4 단계를 반복하십시오. - 튜브를 900 x g 및 20°C에서 회전시키고, 가속도 및 탈가속도를 최저 설정으로 설정하여 분수가 중단되지 않도록 합니다. 20 분 동안 원심 분리하십시오 (휴식 시간 제외).
참고: 이 단계 이후의 모든 절차는 멸균 물질과 시약을 사용하여 무균 조직 배양 후드에서 수행되어야 합니다. - 각 샘플에 대해 50 mL 튜브를 PBS2로 프리코팅하고 빙냉 PBS 45 mL를 첨가한다.
- 원심분리 후, 15 mL 튜브로부터 상부 파편층을 부드럽게 제거하였다. p1000 팁을 PBS2로 코팅하고, 이를 사용하여 40%-80% 구배 사이의 림프구 함유 간선을 45 mL의 빙냉 PBS를 함유하는 50 mL 튜브 내로 수집한다.
- 튜브를 4°C에서 5분 동안 300 x g 로 회전시킨다.
- 상청액을 버리고 펠렛을 500 μL의 FACS 완충액 (PBS, 2% FCS, 0.5 mM EDTA, 및 10 mM HEPES; 표 1 참조)에 재현탁시켰다. 40μm 필터를 FACS 버퍼로 사전 코팅하고 이를 사용하여 세포 현탁액을 유동 튜브로 여과합니다. 50 mL 튜브를 추가 500 μL의 FACS 버퍼로 헹구고 동일한 유동 튜브로 여과하십시오.
- 생성된 세포 현탁액 1 mL로부터 10 μL 분취량을 제거하였다. 세포 계수기 또는 혈구측정기를 사용하여 림프구 수율을 계수하고 각 샘플에 대한 세포 농도를 계산하십시오.
- 분류를 위한 샘플 준비 - 세포외 염색
참고: 세포외 염색 마스터믹스에 사용되는 항체와 고정성 생존력 염료 및 Fc 블록 용액을 제조하기 위한 시약은 최대 5 x 10에 충분한 농도로 사용됩니다.6 100 μL당 세포. 부피는 그에 따라 조정되어야 한다. ILC1을 분류하기 위한 FACS 기계 보상을 위해, 세포외 염색 마스터믹스 내의 각각의 형광단에 대한 단색 제어가 요구된다. 항체의 경우, 양성 항체 결합 비드 집단 및 음성 항체 비결합 비드 집단을 함유하는 보상 비드가 사용될 수 있다. 자외선 (UV) 고정 생존력 염료 단색 조절을 위해, 아민 반응성 (양성 신호의 경우) 및 비 반응성 (음성 신호의 경우) 집단을 포함하는 보상 비드가 사용될 수 있다. 에서 셀을 사용하는 것은 권장되지 않습니다. RORγtGFPUV 고정성 염료 단색 조절을 위한 리포터 마우스는, 이들 세포로서 GFP를 함유할 것이다.+ 신호.- 각 샘플에서 ∼10μL의 작은 분취량을 제거하고 250μL의 FACS 버퍼를 포함하는 별도의 유동 튜브에 풀링합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 이것은 염색되지 않은 대조군에 사용될 것이다.
- PBS 1 mL를 샘플 튜브 내의 나머지 부피에 첨가한다. 300-400 x g 에서 3-5분 동안 원심분리한다.
- 시료당 200 μL의 UV 고정성 생존력 염료 용액을 준비한다. UV 고정 가능한 생존력 염료 (제조업체의 지시에 따라 DMSO에 재현탁)를 PBS에 1:500 희석하십시오 (또는 제조업체의 지시에 따라).
- 상청액을 버리고 샘플을 200 μL의 UV 고정성 생존력 염료 용액에 재현탁시킨다. 튜브를 볼텍스하고, 4°C에서 10-15분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
- 2 mL의 FACS 완충액을 튜브에 첨가하여 UV 고정성 생존력 염료를 급냉시키고, 10초 동안 와류하고, 튜브를 4°C에서 3-5분 동안 300-400 x g 에서 원심분리한다. 원심분리된 튜브에서 상층액을 버린다.
- 시료당 200μL의 Fc 블록 용액(FACS 버퍼 중 0.25mg/mL의 Fc 블록)을 준비합니다.
- 단계 3.5.5로부터의 각각의 샘플에 200 μL의 Fc 블록 용액을 첨가하고, 10초 동안 와류하고, 4°C에서 10분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
- 500 μL의 FACS 버퍼를 신선한 유동 튜브에 첨가하십시오. 각 샘플로부터 2-5 μL 분취량을 제거하고 이를 형광 마이너스일 (FMO) 대조군을 위한 튜브 내로 풀링한다.
- FMO 튜브를 10초 동안 소용돌이치고, 각각의 FMO 대조군에 대해 표지된 신선한 유동 튜브 내로 고르게 분배한다(리니지 칵테일 FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO, 및 NK1.1 FMO; 표 3 참조). 관심있는 항체를 제외한 모든 항체를 각 튜브 ( 표 3에 기재된 바와 같이)에 첨가하고 10 초 동안 와류한다. FMO 컨트롤을 4°C의 어둠 속에 따로 두십시오.
- 샘플(FMO 대조군이 아님)을 4°C에서 3-5분 동안 300-400 x g 에서 원심분리한다.
- 표 4에 기재된 바와 같이 최종 항체 희석액으로 세포외 염색 마스터믹스 (샘플당 200 μL)를 준비한다. 단계 3.4.10으로부터의 세포 카운트에 따라 적절한 세포 농도 (100 μL 당 최대 5 x 106 세포)에 대한 염색 부피를 조정한다.
- 세포외 염색 마스터믹스를 샘플에 첨가하고, 10초 동안 와류하고, 이를 4°C의 어둠 속에 따로 놓는다.
- 게이팅 전략에 사용되도록 의도된 각 항체에 대해 신선한 단색 대조군을 준비한다(도 2). 소용돌이 항체 보상 비드를 20초 동안 와류하고, 유동 튜브에 비드 1방울을 추가하고, 0.5μL의 항체로 염색하고( 표 2에 나타낸 바와 같이, 또는 제조자의 지시에 따름), 10초 동안 와류시킨다.
- 아민 반응성 보상 비드 키트를 사용하여 UV 고정형 생존력 염료 단색 조절제를 제조하였다. 20초 동안 소용돌이 아민 반응성 보상 비드를 첨가하고, 1μL의 라이브/데드 UV 염료( 표 2에 표시되거나 제조업체의 지시에 따라)를 첨가하고, 10초 동안 와류한다.
- 샘플, FMO, 및 단색 대조군을 4°C에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
- 이 시간 동안 정렬 된 세포를 수집하기 위해 튜브를 준비하십시오. 고급 DMEM/F12에 있는 400-500μL의 10% FBS를 각 샘플의 1.5mL 튜브에 추가합니다.
- 인큐베이션 후, PBS2 2 mL를 각각의 샘플, FMO 대조군 및 단색 대조군에 첨가한다.
- 샘플을 원심분리하고, FMO 대조군, 및 단색 대조군을 4°C에서 3-5분 동안 300-400 x g 에서 조절한다.
- 모든 원심분리된 튜브에서 상층액을 버린다. 샘플 및 FMO 대조군을 250 μL의 FACS 버퍼에 재현탁시키고 10초 동안 와류시킨다.
- 단색 대조군을 250 μL의 PBS2에 재현탁시킨다. 아민 비반응성 비드 1방울을 UV 고정 생존 염료 단색 제어에만 첨가하십시오. 10 초 동안 모든 컨트롤을 소용돌이 치십시오.
- 이제 셀을 정렬할 준비가 되었습니다. 샘플, FMO 컨트롤 및 단색 컨트롤을 가능한 한 어둠 속의 얼음 위에 보관하여 세포 생존력을 향상시키고 광표백으로 인한 신호 손실을 방지하십시오.
4. 선천적 림프성 세포와 소장 오가노이드의 공동 배양
참고: 이 섹션에서는 분류된 뮤린 소장 ILC1(섹션 3의 프로토콜에 따라 분리됨)과 뮤린 소장 오가노이드(섹션 1 및 2에 설명되어 있음)의 공동 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드는 통과 후 1-2 일 후에 최적으로 사용해야합니다. 공동 배양은 오가노이드를 수확하고, 적절한 수의 ILC1을 첨가하고, 펠릿 오가노이드 및 ILC1을 함께 원심분리하고, TBEM에서 재현탁시키는 것을 포함한다. ILC1이 격리된 후 가능한 한 빨리 이 섹션을 완료하십시오. 모든 절차는 멸균 물질과 시약을 사용하여 무균 환경에서 수행되어야합니다.
- 3.1.1 단계의 TBEM이 해동되었는지 확인하십시오.
- 단계 2.3 및 2.4에 기재된 바와 같이 1-2-일령 오가노이드를 수확한다.
- 오가노이드 펠릿을 차가운 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F12 1mL에 재현탁합니다. 오가노이드를 통과시킬 때 행해진 것처럼 p1000 팁을 구부리지 마십시오, 여기서 의도는 공동 배양을 위한 오가노이드 구조를 유지하는 것이기 때문입니다. 필요한 경우, 오가노이드를 짧은 기간 동안 얼음 위에 코팅된 1.5 mL 튜브에 분리된 PBS2 튜브에 놓아 상이한 공동 배양 조건 사이에 분산시킨다.
참고: ILC 샘플이 공동 배양을 위해 준비되면 오가노이드의 준비를 시작하십시오. 얼음 위에서 작업하고 상피 세포 사멸을 최소화하기 위해 오가노이드가 수확되는 즉시 신속하게 작업하십시오. - 1.5 mL 튜브를 ILC 복제 샘플 당 PBS2로 예비코팅한다. ~ 100-200 개의 오가노이드 (24 웰 플레이트의 약 1 웰)를 각 튜브에 분배하십시오.
- p1000 팁을 PBS2에 프리코팅하고 이를 사용하여 FACS 정제 후 ILC1s의 부피를 평가하였다(250-300 μL+분류된 부피). 정렬로부터 기록된 세포의 수를 사용하여 mL당 ILC1의 농도를 결정하고 필요한 부피를 결정한다.
- 동일한 PBS2 코팅된 p1000 팁을 사용하여, 오가노이드를 함유하는 PBS2 코팅된 1.5 mL 튜브에 500개 이상의 ILC1s를 첨가한다. 정렬로부터 산출된 ILC1s의 수가 500개 미만이면, 원래 정렬을 포함하는 튜브에 직접 오가노이드를 첨가하여 전사로부터 세포의 손실을 최소화한다.
- ILC1 및 오가노이드를 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 스핀다운시킨다. 가능하다면 튜브 끝에 펠렛을 만드는 것과는 달리 튜브 내부의 가장자리를 따라 세포를 풀링하므로 작은 직경의 탁상 원심 분리기를 피하십시오. 세포 수는 매우 낮기 때문에 이러한 단계 동안 세포의 손실을 최소화하는 것이 필수적입니다.
- 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상청액을 천천히 그리고 부드럽게 제거한다 (이는 눈에 보이지 않을 수 있으며, 특히 오가노이드 ILC 전용 대조군에서는 보이지 않을 수 있다). 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
- 차가운 펠렛을 TBEM의 웰 당 30 μL에 재현탁시킨다. 튜브를 차가운 표면 (예를 들어, 조직 배양 후드에 놓인 작은 얼음 상자) 상에 유지하면서, 균일한 분포를 보장하기 위해 오가노이드 및 ILC를 적어도 10-15 번 혼합한다. 오가노이드의 손상과 거품의 형성을 피하기 위해 자주 그러나 부드럽게 삼중화하십시오.
- TBEM의 ILC-오가노이드를 웰당 30μL를 미리 가온된 24- 또는 48-웰 플레이트에 적용하여 단일 돔을 형성한다. 플레이트를 10-20분 동안 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에 직접 배치한다.
참고: ILC 전용 및 오가노이드 전용 컨트롤을 다운스트림 분석을 위해 설정하는 것이 좋습니다. ILC1은 드물지만 GFP-ILC2 는 과학적으로 적절한 경우 면역형광 또는 FSC/SSC 유세포 분석기 조절을 대체할 수 있습니다. - 임의의 원하는 실험 사이토카인 또는 차단 항체와 함께 완전한 ILC1 배지 (ENR + IL-2 + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-메르캅토에탄올; 표 1 참조)의 550 μL (웰 당)를 첨가하고, 24시간 동안 37°C 및 5%CO2 에서 인큐베이션한다.
- 24시간 후, 플레이트를 인큐베이터로부터 부드럽게 제거하고, 플레이트가 1분 동안 조직 배양 후드에 앉아 림프구가 침전되도록 한다.
- 200-250 μL의 배지를 제거하고 24-웰 플레이트의 빈 웰에 넣습니다. 이 상층액을 거꾸로 된 현미경으로 확인하여 림프구가 제거되지 않았는지 확인하십시오.
- 상청액이 맑으면 300 μL의 신선한 ILC1 배지를 원래의 웰에서 공동 배양하십시오. 림프구가 상청액에 존재하는 경우, 4°C에서 3-5분 동안 300-400 x g 에서 원심분리하고, 300 μL의 신선한 ILC1 배지에 재현탁시키고, 이것을 원래의 웰 내의 나머지 200-250 μL의 배지에 첨가한다. 1-2 일마다 또는 미디어가 옅은 주황색 / 노란색이 될 때 미디어를 보충하십시오.
참고: 매트릭스 돔의 팁이 매체의 표면을 깨뜨릴 정도로 매체가 충분히 증발하지 않도록 하십시오. 항상 행렬이 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 과도한 증발은 조직 배양 플레이트의 중앙 웰을 사용하고 주변 웰에 ∼600 μL의 PBS를 첨가함으로써 피할 수 있다. 성인 ILC와의 공동 배양은 1-4 일 동안 안정적이며, 그 후에 큰 혼란없이 파종되었던 오가노이드가 파열되어 새로운 지하실로 다시 종자됩니다. 상피를 분석하는 경우 공동 배양을 수립 한 후 1-4 일 이내에 배양물을 분석하는 것이 좋습니다. - 참조8에 기재된 바와 같이, 단일 세포 또는 벌크 RNA-seq 또는 RT-qPCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 용해 완충액으로 표적 집단의 면역형광, 유세포 분석 또는 FACS 정제를 사용하여 다운스트림 분석을 수행한다.
- 상청액이 맑으면 300 μL의 신선한 ILC1 배지를 원래의 웰에서 공동 배양하십시오. 림프구가 상청액에 존재하는 경우, 4°C에서 3-5분 동안 300-400 x g 에서 원심분리하고, 300 μL의 신선한 ILC1 배지에 재현탁시키고, 이것을 원래의 웰 내의 나머지 200-250 μL의 배지에 첨가한다. 1-2 일마다 또는 미디어가 옅은 주황색 / 노란색이 될 때 미디어를 보충하십시오.
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Representative Results
성공적으로 완료되면 새로 격리 된 지하실은 2-4 일 이내에 신진 토굴 구조를 형성해야합니다 (그림 1A). 건강하고 견고한 오가노이드 문화는 활발히 성장해야하며 프로토콜에 자세히 설명 된대로 계대 및 확장 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 FACS에 의한 살아있는 ILC1의 단리를 허용하는 RORγtGFP 뮤린 트랜스제닉 리포터 라인으로부터 소장 ILC1의 단리를 기술한다 (도 2). 여기에 요약된 프로토콜을 사용하여, 예상되는 ILC1 카운트 범위는 350-3,500개의 단리된 세포이다.
오가노이드로 시딩된 후, 공동-배양은 면역세포화학에 의해 가시화될 수 있다(도 3A-B). ILCs 및 상피 세포는 또한 도 3C에 입증된 바와 같이 유세포 분석기에 의해 분석될 수 있다. ILC1은 유세포 분석기 (도 4A-B) 및 면역 세포 화학 (도 4C)을 특징으로 하는 상피 CD44를 상향조절한다. 구체적으로, ILC1은 RT-qPCR에 의해 입증된 바와 같이 오가노이드에서 CD44 v6 스플라이스 변이체의 발현을 유도한다(도 4D).
표 1: 매질 및 완충제 조성물. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 단색 컨트롤. 단색 대조군의 조성은 도 2에 정의된 게이팅 전략을 사용하여 소장 라미나 프로프리아 ILC1을 분리한다. 사용된 항체의 세부사항은 물질의 표에서 찾을 수 있다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 형광 마이너스 하나(FMO) 마스터믹스. 리니지 칵테일 FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO 및 NK1.1 FMO용 FMO 마스터믹스의 구성. FMO 마스터믹스는 관심있는 항체를 제외하고 사용된 모든 항체를 함유하며, 샘플 분취량을 염색하는데 사용된다. 리니지 칵테일은 CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C로 정의됩니다. 사용된 항체의 세부사항은 물질의 표에서 찾을 수 있다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 세포외 염색 마스터믹스. 농도는 200 μL의 FACS 완충액에서 최대 5 x 106 세포까지 염색을 위해 조정된다. 사용된 항체의 세부사항은 물질의 표에서 찾을 수 있다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1 : 뮤린 소장 오가노이드. 대표적인 이미지는 (A) 통과 후 2-3일 후에 소장 오가노이드를 성공적으로 생성하고, (B) 실패한 배양물이다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 형질전환 RORγtGFP 리포터 마우스의 소장 라미나 프로프리아로부터 ILC1s를 분리하는 게이팅 전략. FACS에 의한 형질전환 RORγtGFP 리포터 마우스의 소장 라미나 프로프리아로부터의 ILC1 단리의 대표적인 유세포 측정 플롯. ILC1s는 라이브, CD45+, Lin-(CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+, 및 NK1.1+로 정의된다. N=>50 마우스로부터 대표적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 오가노이드 및 ILC1 공동배양물. 밝은 필드 이미지(A), 공초점 현미경 이미지(B), 및 단독으로 배양된 소장 오가노이드(SIO)의 FACS 플롯(C)(상단) 또는 ILC1s(하단)(N=3 마우스로부터의 ILC1s를 사용한 실험의 대표). (b) CD45로 염색하는 것은 ILC1s 및 Zonula 폐색 단백질 1 (ZO-1)이 오가노이드에서 상피 세포를 표시함을 예시한다. 스케일 바: 50 μm. (C) 이전에 단일 살아있는 세포에 게이팅됨. 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)는 오가노이드에서 장 상피 세포 (IEC)를 표시하고 CD45는 ILC1을 표시합니다. 도면은 참조8에서 적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 소장 오가노이드와 공동 배양한 ILC1s는 장 상피 세포에서 CD44의 상향조절을 유도한다. (A) 단독으로 배양된 소장 오가노이드(SIO)로부터의 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 양성 상피 세포(라이브, CD45-, EpCAM+)에서의 CD44 발현의 대표적인 세포측정 플롯(왼쪽) 또는 ILC1s와 함께 4일 동안 배양(오른쪽). (b) 장 상피 세포 (IEC)에서의 CD44 발현의 유동 정량화 (N=5 마우스로부터의 ILC1s). (c) d4 SIO 단독(왼쪽) 또는 ILC1s와 공동 배양한 CD44 국소화의 대표적인 공초점 현미경 이미지(오른쪽)(N=3 마우스를 대표함). 스케일 바: 50 μm. (D) CD44 스플라이스 변이체 v4 및 v6에 대한 엑손 특이적 프라이머를 사용한 RT-qPCR (N=3). 이 그림은 참조8에서 조정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 장 해리 프로토콜 동안 림프구의 손실을 최소화하여 희귀 한 ILC1을 분리하고,이 두 구획 사이에 공동 배양을 확립하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에는 많은 단계가 있으며, 일부는 ILC1에 특이적이지만,이 접근법은 다른 장 면역 세포 유형에 적용될 수 있으며 공동 배양 설정은 개별 연구 질문에 맞게 모듈식으로 조정할 수 있습니다. 몇 가지 중요한 단계(여기서 벗어나지 않는 것이 좋습니다)와 이 프로토콜의 기술적으로 까다로운 요소에 대한 문제 해결 지침이 여기에 강조 표시되어 있습니다.
단일 Lgr5+-eGFP 장 줄기 세포로부터의 뮤린 소장 오가노이드의 사용은 점점 더 잘 확립되고 있다33,34; 그러나이 프로토콜에서는 Lieberkuehn의 전체 지하실을 CD45.1 동물로부터 그대로 분리하는 것이 좋습니다. 무손상 크립트는 단일 Lgr5+ 세포보다 더 빠르게 회복될 뿐만 아니라, GFP 리포터가 없는 CD45.1 동물을 사용하면 오가노이드 공동 배양물에서 교차 오염된 CD45.2+ ILC가 분석되지 않으며 GFP 기반 리포터를 함유하는 면역 세포의 사용과 양립할 수 있습니다. 저자의 경험에 따르면, 중간엽 또는 면역 세포는 오가노이드의 1-3 구절 후에 이월되지 않습니다. 따라서 오가노이드를 확립하기 위한 CD45.2 또는 다른 동물의 사용은 전적으로 허용가능하다. 오가노이드 확립 중에 1.1.19 단계에서 크립트가 존재하지 않으면 손상되지 않은 크립트를 제거하기 위해보다 엄격한 수동 흔들림이 필요할 수 있습니다. 주변 실내 온도와 같은 환경적 요인(예를 들어, 절차가 여름 또는 겨울에 수행되는지 여부)은 해리 동안 인큐베이션 타이밍에 약간의 가변성을 추가할 수 있다. 토굴의 시딩 밀도는 초기 오가노이드 형성 수율에 영향을 미칩니다. 따라서 성공을 보장하기 위해 최소 두 개의 서로 다른 밀도를 시드하는 것이 좋습니다 (예 : 여기에 제안 된 200-750,이 범위는 개인의 필요에 따라 조정할 수 있음).
일단 확립되면, 장내 오가노이드 배양물은 동일한 마우스 균주로부터 확립된 라인들 사이에, 위장관(예를 들어, 십이지장 대 장폐색)을 따라, 그리고 심지어 오가노이드 배양물(35,36)의 동일한 웰 내에서도 이질적이다. 이 프로토콜은 많은 다른 오가노이드 배치에서 강력한 것으로 밝혀졌지만,이 이질성은 데이터 변동성에 기여할 수 있습니다. 표현형적으로 관련이 없는 데이터에서 발생하는 기술적 노이즈를 줄이기 위해 오가노이드 유지 관리(통과 및 미디어 변경)와 일관성을 유지하는 것이 좋습니다. 여기에는 사전 시드 통과 타임 라인 및 오가노이드를 해리하는 데 사용되는 힘과 일치하는 것이 포함됩니다. 또한 비교되는 실험에 동일한 기본 매트릭스를 사용하고 다른 동물에서 파생 된 오가노이드의 생물학적 복제물 (재정적으로나 기술적으로 실현 가능한 경우)을 사용하여 실험을 수행하여 결과가 견고하게 재현 될 수 있도록하는 것이 좋습니다.
공동 배양을 확립 할 때, 상피 세포에 대한 면역의 비율은 연구 질문에 기초한 최적화가 필요한 중요한 고려 사항입니다. ILC에 대한 상피 세포의 영향이 조사되는 경우, 시딩된 오가노이드의 수는 모든 ILC를 포화시키기에 충분할 필요가 있을 것이다. 반대로, 상피에 대한 ILC의 영향을 평가할 때, 상이한 ILC/상피 비율은 점막에서 ILC 서브세트 농축의 차등 상태를 반영하여 상이한 표현형 출력을 초래할 수 있다. ILC1 생존력은 배양물에서 잘 유지되며, 개체군은 평균 2-3배 확장을 겪는 ~500개의 ILC1 및 100개의 소장 오가노이드(SIO)와 함께 경미한 확장을 겪을 것이다. 그러나, 이러한 수율은 TGF-중화 개선 및 p38-억제와 함께 추가의 처리에 의해 영향을 받을 것이며, 공동배양 후 ILC1의 절대 수를감소시키며 8. 시딩된 ILC1 수의 50% 이상의 예상치 못한 손실은 ILC1과 SIO의 불균형한 비율(시드된 크립트 수 증가), SIO 오염(항생제 칵테일이 기능하고 마이코플라즈마에 대한 상청액을 시험하는 것), 또는 사이토카인 스톡의 품질 문제로 인해 발생할 수 있으며, ILC1은 IL-2 또는 IL-15의 부족에 특히 민감합니다. 농축된 96- 또는 48-웰 플레이트로부터의 공동-배양 상청액은 ELISAs에 성공적으로 사용되었다. 공동 배양을 해리시킬 때, 손상된 상피 세포로부터 세포 응집을 방지하기 위해 20분 동안 온화한 트립신 교체 후 DNase로 세포를 배양하거나 EDTA 기반 해리를 단일 세포로 수행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜의 강점은 환원주의 배양 조건과 복잡한 세포 유형의 균형을 유지한다는 것입니다. 그러나, 이들 배양물에서 다른 ILC 서브세트의 거동은 이러한 특정 프로토콜에 존재하지 않는 인자들에 의존할 수 있다. 예를 들어, ILC3 공동 배양에 사용되는 린데만스의 프로토콜에서, IL-23은 ILC3 유지 및 활성화8을 지원하기 위해 공동 배양 배지에 추가로 보충되었다. IL-15는 이 프로토콜에 기술된 공동 배양 시스템에서 ILC1의 유지에 특히 중요한 것으로 밝혀졌으며, 이는 항상성을 위해 이러한 사이토카인을 필요로 하는 ILC1의 이전 보고와 일치하였고, 이는 개발6은 아니었음에도 불구하고 항상성을 위해 이러한 사이토카인을 필요로 하였다. ILC를 활성화시키거나 ILC2s를 유지하기 위해, 성장 배지는 추가의 최적화를 필요로 할 수 있다. 또한, 상피를 제외하고 장의 다른 세포 구획은 ILC를 조절합니다. 예를 들어, 장 뉴런은 분비된 뉴로펩티드(37)의 활성을 통해 ILC2s를 부분적으로 조절하는 것으로 알려져 있다. 미생물 인자는 또한 ILC 표현형38에 영향을 미친다. 이러한 제한은 이들 요소, 예를 들어, 사이토카인, 펩티드, 또는 미생물 인자를 공동배양 시스템 내로 첨가함으로써 극복될 수 있었다. 이것은 심지어 환원주의 환경에서 ILC와 여러 세포 구획 사이의 상호 작용에 대한 심문을 허용 할 수 있습니다. 이 논리에 따라, 공동 배양을 확립하기 전에 항 생물 / 항 균 시약을 첨가하고 오가노이드 배지에 자주 보충하는 것이 중요합니다. 또한 모든 배양 오염 (예 : 곰팡이 성장 또는 마이코 플라즈마)이 항원 비특이적 ILC를 활성화시켜 오염되지 않은 배양물에 존재하지 않을 수있는 중요한 표현형을 생성하기 때문에 모든 배양이 무균 환경에서 수행되는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 항-바이오틱/-마이코틱 시약의 철회는 상피 또는 ILC에 악영향을 미치는 것으로 밝혀지지 않았기 때문에, 공동 배양물에서도 권장되지 않는다.
이 방법은 ILC와 장 상피 사이의 신호 전달 모듈을 특성화하는 독특한 방법을 제공하여 두 구획의 생물학을 조사 할 수 있습니다. 단일 세포 유형으로 구성된 다른 시험관 내 방법과 비교하여, 여기에 제시된 시스템은 생체내 생리학에 더 필적하며, 상피 세포와 ILC 사이의 다중 잠재적 신호전달 메카니즘이 심문될 수 있게 한다. 시험관내 ILC 배양의 다른 방법은 주로 기질 피더 세포주, 예컨대 OP9 또는 OP9-DL139에 의존한다. 이 라인은 장 환경을 대표하지 않는 신생아 마우스 calvaria에서 파생됩니다. 이들은 현재까지 시험관 내에서 ILC를 유지하기위한 황금 표준을 제공했지만, 상피에 대한 ILC의 영향을 이해하는 데있어 상당한 한계를 겪고 있습니다.
뮤린 소장 오가노이드와 라미나 프로프리아 유래 ILC 사이에 여기에 기술된 공동 배양 프로토콜은 상당한 연구 응용을 갖는다. 이러한 공동배양 시스템은 CD44+ 상피 크립트8의 확장에서 ILC1 유래 TGF-β의 역할을 결정하기 위해 이미 사용되어 왔으며, 이는 염증성 장 질환에서 상피 역학의 이해에 기여한다. 이 연구는 장 항상성 및 염증에서 상피 - ILC 신호 전달의 중요한 중요성을 뒷받침하는 문헌의 증가에 기여합니다3.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
E.R.은 Wellcome Trust (215027/Z/18/Z)의 박사 학위를 인정합니다. G.M.J.는 Wellcome Trust (203757/Z/16/A)의 박사 학위 펠로우십을 인정합니다. DC는 NIHR GSTT BRC 출신의 박사 과정 학생임을 인정합니다. J.F.N.은 Marie Skłodowska-Curie Fellowship, King 's Prize 펠로우십, RCUK / UKRI Rutherford Fund 펠로우십 (MR / R024812 / 1) 및 Wellcome Trust (204394 / Z / 16 / Z)의 과학 종자 상을 인정합니다. 우리는 또한 가이 병원에 본사를 둔 BRC 유세포 측정 핵심 팀에 감사드립니다. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 리포터 마우스는 G. Eberl(프랑스 파리의 파스퇴르 연구소)으로부터 관대 한 선물이었다. CD45.1 C57BL/6 마우스는 T. Lawrence (King 's College London, London)와 P. Barral (King 's College London, London)에 의해 친절하게 주어졌다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Anti-mouse CD45 (BV510) | BioLegend | 103137 | |
| Anti-mouse NK1.1 (PE) | Thermo Fisher Scientific | 12-5941-83 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| CD127 Monoclonal Antibody (APC) | Thermo Fisher Scientific | 17-1271-82 | |
| CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0193-82 | |
| CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0051-82 | |
| CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-0031-82 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423/10 | |
| COLLAGENASE D, 500MG | Merck | 11088866001 | |
| Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells | Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University) | ||
| DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) | Merck | 4942078001 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) | Gibco | 11320033 | |
| DNASE I, GRADE II | Merck | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) | Gibco | 21969-035 | |
| Ethilenediamine Tetraacetate Acid | Thermo Fisher Scientific | BP2482-100 | |
| FC block | 2B Scientific | BE0307 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated | Gibco | 10500064 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 3050-038 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14065056 | |
| HBSS (1X) | Gibco | 12549069 | |
| HEK-293T- mNoggin-Fc Cells | Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012). | ||
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) | Thermo Fisher Scientific | 46-5893-82 | |
| Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Thermo Fisher Scientific | L23105 | |
| Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) | Thermo Fisher Scientific | 48-5931-82 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetylcysteine (500mM) | Merck | A9165 | |
| NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) | Thermo Fisher | 25-3351-82 | |
| PBS (1 X) 7.2 pH | Thermo Fisher Scientific | 12549079 | |
| PBS (10X) | Gibco | 70013032 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | |
| Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein | R&D Systems | AFL236 | |
| Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF | R&D Systems | 247-GMP | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier free) | BioLegend | 589106 | |
| Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) | R&D Systems | 407-ML-005/CF | |
| UltraComp eBeads | Thermo Fisher Scientific | 01-2222-42 | |
| Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Bio-techne | 1254 | |
| Plastics | |||
| 50 mL tube | Falcon | 10788561 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 30121023 | |
| 10 mL pippette | StarLab | E4860-0010 | |
| 15 mL tube | Falcon | 11507411 | |
| 25 mL pippette | StarLab | E4860-0025 | |
| p10 pippette tips | StarLab | S1121-3810-C | |
| p1000 pippette tips | StarLab | I1026-7810 | |
| p200 pippette tips | StarLab | E1011-0921 | |
| Standard tissue culture treated 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| CO2 and temperature controled incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R/S | |
| Flow Assisted Cellular Sorter | BD equipment | FACS Aria II | |
| Heated shaker | Stuart Equipment | SI500 | |
| Ice box | - | - | |
| Inverted light microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000) | |
| p10 pippette | Eppendorf | 3124000016 | |
| p1000 pippette | Eppendorf | 3124000063 | |
| p200 pippette | Eppendorf | 3124000032 | |
| Pippette gun | Eppendorf | 4430000018 | |
| Wet ice | - | - |
References
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