Summary
Настоящий протокол описывает модель фасцио-кожного лоскута свиней и ее потенциальное использование в исследованиях васкуляризированных композитных тканей.
Abstract
Васкуляризованные композитные аллотрансплантаты (VCA), такие как трансплантация рук, лица или полового члена, представляют собой передовое лечение разрушительных дефектов кожи, которое потерпело неудачу на первых ступенях реконструктивной лестницы. Несмотря на многообещающие эстетические и функциональные результаты, основным ограничивающим фактором остается необходимость резко применяемой пожизненной иммуносупрессии и ее хорошо известные медицинские риски, препятствующие более широким показаниям. Поэтому снятие иммунного барьера при VCA имеет важное значение для того, чтобы склонить этическую шкалу и улучшить качество жизни пациентов с использованием самых передовых хирургических методов. De novo создание специфического для пациента трансплантата является предстоящим прорывом в реконструктивной трансплантации. Используя методы тканевой инженерии, VCA могут быть освобождены от донорских клеток и настроены для реципиента посредством перфузии-децеллюляризации-рецеллюляризации. Для разработки этих новых технологий необходима крупномасштабная модель VCA животных. Следовательно, фасцио-кожные лоскуты свиней, состоящие из кожи, жира, фасций и сосудов, представляют собой идеальную модель для предварительных исследований в VCA. Тем не менее, большинство моделей VCA, описанных в литературе, включают мышцы и кости. В этой работе сообщается о надежной и воспроизводимой технике сбора подкожно-кожного лоскута у свиней, практическом инструменте для различных областей исследований, особенно васкуляризированной композитной тканевой инженерии.
Introduction
Васкуляризованные композитные аллотрансплантаты (VCA) произвели революцию в лечении трудновосстанавливаемых потерь частей тела, таких как руки, лицо и пенис 1,2,3. К сожалению, первые долгосрочные исходы4 показали, что пожизненное введение высоких доз иммуносупрессантов может привести к тяжелым сопутствующим заболеваниям, включая диабет, инфекции, неоплазию и рено-сосудистую дисфункцию5. В последнее время экспертным командам VCA пришлось управлять риском хронического отторжения, приводящего к потере трансплантата, и выполнять первые случаи ретрансплантации лица 6,7. Были описаны различные стратегии для преодоления ограничений иммуносупрессии при VCA. Первый основан на установлении долгосрочной толерантности к трансплантату путем индуцирования состояния иммунного смешанного химеризма у реципиента аллотрансплантата 8,9. Второй включает в себя de novo создание специфического для пациента трансплантата с помощью тканевой инженерии.
В последнее время перфузионная децеллюляризация биологических тканей породила нативные каркасы внеклеточного матрикса (ECM), позволяющие сохранить сосудистую сеть и тканевую архитектуру целых органов10. Следовательно, рецеллюляризация этих ECM с реципиент-специфическими клетками создаст индивидуальный трансплантат, свободный от иммунных ограничений. В исследованиях по биоинженерии VCA несколько команд децеллюляризировали и получили такой ECM, сохранив всю архитектуру 11,12,13. Тем не менее, процесс рецеллюляризации остается сложным и не был успешным в моделях крупных животных14,15. Развитие этих прорывных технологий создает потребность в надежных и воспроизводимых моделях крупных композитных тканей животных. Модели свиней представляют собой наилучший выбор в биоинженерном процессе развития, поскольку свиная кожа представляет собой наиболее близкие анатомические и физиологические характеристики к коже человека16. Использование фасцио-кожных лоскутов (FCF) идеально подходит на первых шагах к созданию «индивидуальных» васкуляризированных композитных тканевых трансплантатов. Действительно, FCF является элементарной моделью VCA, содержащей кожу, жир, фасции и эндотелиальные клетки. Описание свиных миокожных лоскутов17 и остеомокожных лоскутов18 можно найти в литературе. Тем не менее, не уделяется внимания методам сбора фасцио-кожных клапанов.
Следовательно, это исследование направлено на то, чтобы предоставить исследователям подробное описание техники закупок FCF подкожной свиньи и изобразить все характеристики лоскута для его использования во многих областях исследований, особенно в васкуляризованной композитной тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные получали человеческую помощь в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию одобрил экспериментальный протокол (протокол IACUC #2020N000015). Для всех экспериментов использовались семь самок йоркширских свиней (20-25 кг).
1. Предоперационный уход
- Постигайте животное за твердую пищу за 12 ч до операции.
- Успокаивайте животное 4,4 мг/кг телазола, 2,2 мг/кг ксилазина и 0,04 мг/кг (в/м) атропина сульфата (см. Таблицу материалов).
- Поместите 18 г периферического внутривенного катетера в ушную вену.
- Интубировать свиней соответствующей эндотрахеальной трубкой (можно использовать 6-15 мм для свиней весом 10-200 кг) и подключить трубку к вентилятору. Вводят предоперационную анальгезию бупренорфином (0,05 мг/кг, в/м) (см. Таблицу материалов).
2. Интраоперационный мониторинг
- Поддерживайте анестезию ингаляционной смесью 1,5%-3% изофлурана с расходом кислорода 1,5 л/мин.
- Непрерывный мониторинг частоты сердечных сокращений, пульсоксиметрии и конечного прилива CO2. Оценивайте артериальное давление и температуру тела каждые 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой диапазон частоты сердечных сокращений составляет от 90 до 100 ударов в минуту, насыщение кислородом должно быть выше 93%, а конечный приливный диапазон CO2 составляет от 5% до 6% CO2. - Вводите 5-10 мл / кг в час 0,9% физиологического раствора на протяжении всей процедуры для регулирования среднего артериального давления между 60 мм рт.ст. и 90 мм рт.ст.
3. Двусторонние подкожные закупки FCF
- Поместите животное в лежачее положение. Брейте и скрабируйте как пах, так и задние конечности, включите все задние конечности в месте операции и задрапируйте стерильным способом.
- Пальпируйте пульс подкожной артерии ~3 пальца шириной медиаль от надколенника и пометьте его.
- Определите и нарисуйте пределы закрылка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний предел представляет собой ось, параллельную паховой складке на 3 см ниже нее. Латеральный предел представляет собой ось от переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника до медиальной части надколенника. - Нарисуйте овальную заслонку диаметром 10 см, центрированную на подкожной ножке и содержащуюся в ранее описанных пределах закрылков (этап 3.3).
- Сделайте разрез кожи размером 1,5 см относительно дистальной части ножки на лоскуте.
- Откройте фасцию и тупое рассечение, чтобы обнажить подкожную артерию и две ее вены комитанты. Выполняют двойную лигатуру и разделяют в один пучок.
- Разрезайте оставшуюся кожу лоскута лезвием.
- Используйте прижигание, чтобы открыть подкожную клетчатку и окружающие фасции. Выполняют тщательный гемостаз с помощью биполярных щипцов (см. Таблицу материалов).
- Прикрепите кожный компонент лоскута к подлежащей фасции с помощью 3-0 нерассасывающихся швов, чтобы избежать непреднамеренного вытяжения и нарушения перфорации сосудов.
- Освободите лоскут от грацилиса, рассекая фасцию от мышцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дистальная часть подкожной ножки проходит в плоскости между мышцей грацилиса и фасцией. Соответствующее напряжение и осторожный биполярный гемостаз боковых ветвей являются важнейшими элементами для облегчения рассечения ножки. - Используйте скальпель, чтобы сделать 12-сантиметровый разрез в паховой складке. Выполните перпендикулярный разрез, соединив паховую складку с проксимальной частью лоскута. Поднимите соединительную кожу и вскройте подкожный слой с помощью прижигания.
- Продолжайте рассечение ножки, следуя за подкожными сосудами вниз к бедренным сосудам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проксимальная часть подкожной ножки может либо проходить через межмышечную перегородку, либо погружаться в мышцу грацилиса. - Скелетонизируют бедренные сосуды и связывают их дистально к подкожной ветви двумя отдельными пучками. Продолжают рассечение бедренных сосудов от дистального до проксимального до достижения уровня паховой связки. Используйте биполярные щипцы для прижигания сосудистых зажимов и 2-0 шелковых завязок, чтобы перевязать глубокие бедренные сосуды, а затем разрезать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сосудистые клипсы также могут быть использованы перед разрезанием сосудов. - Повторите шаги 3.2-3.13 на контралатеральной задней конечности, чтобы собрать второй подкожный лоскут.
- Гепаринизировать животное внутривенной (IV) инъекцией гепарина (100 МЕ/кг) за 5 мин до шага 3.16.
- Разложить бедренную ножку (артерию и вену) как можно ближе к паховой связке и отделить лоскут от донорской свиньи.
- Расширьте концы бедренного сосуда и вставьте ангиокатетер 20 Г как в артерию, так и в вену. Используйте 3-0 шелковых завязок, чтобы закрепить катетер на сосудах.
- Медленно промывать фасцио-кожную лоскутную артерию 10 мл гепаринового физиологического раствора (100 МЕ/мл) до тех пор, пока не будет наблюдаться явный венозный отток (рисунок 1).
Рисунок 1: Нативный и децеллюляризованный подкожный фасцио-кожный лоскут. (А) Изолированный кожный лоскут с ангиокатетером 20 Г, вставленным в бедренную артерию, позволяющим промыть лоскут из крови и приступить к различным экспериментам (ангиография, перфузионная децеллюляризация). (B) Децеллюляризованный кожный лоскут. Перфузионная децеллюляризация, дающая белые, бесклеточные каркасы после 10 дней перфузии моющего средства. H&E-окрашенные полностью толщиной поперечные сечения (C) нативного кожного лоскута и (D) децеллюляризированного кожного лоскута. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Усыпить животное с помощью внутривенной инъекции фенобарбитала натрия (100 мг/кг). Подтверждают смерть отсутствием сердцебиения и дыхательных движений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этой работе на живых животных предшествовало определение подкожной перфорасомы на трех трупных экземплярах (рисунок 2). Цветной пломбировочный раствор вводили в подкожную артерию для помутнения специфической сосудистой сети, исходящей из артерии. Раствор состоит из 10 мл глицерина синего цвета, смешанного с 10 мл разбавителя (см. Таблицу материалов). Это позволило сгенерировать цветную карту кожи, васкуляризированной подкожной артерией, и позволило нарисовать границы подкожной FCF.
Рисунок 2: Определение перфорасом. Цветной раствор для подачи был введен в подкожную артерию трупных образцов, чтобы точно определить пределы кожи, перфузионной подкожной ножкой Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В этом исследовании было собрано в общей сложности 14 подкожных фасциокожных лоскутов (таблица 1). Среднее время закупки закрылков составило 47 (41; 62) мин. Средний диаметр артерии и вены составлял 2,25 мм (2; 2,5) и 3,56 мм (2,7; 3,9) соответственно. Наконец, средняя длина ножки составляла 10,8 см (10,4; 12,6).
| Масса животного (кг) | Продолжительность сбора FCF (мин) | Длина ножки (см) | Диаметр артерии (мм) | Венозный диаметр (мм) |
| Среднее (мин;макс. | Среднее (мин;макс. | Среднее (мин; макс.) | Среднее (мин; макс.) | Среднее (мин; макс.) |
| 23 (20; 25) | 47 (41; 62) | 10.8 (10.4; 12.6) | 2.25 (2; 2.5) | 3.56 (2.7; 3.9) |
Таблица 1: Характеристики подкожных закрылков основаны на 14 урожаях закрылков.
FCF-ангиографию (Рисунок 3) проводили после каждого сбора лоскута путем внутриартериальной инъекции контрастного продукта 10 мл сразу после промывки гепаринового физиологического раствора. Таким образом, этот этап позволил оценить васкуляризацию кожи веслом. Все ангиографические снимки показали плотную и хорошо распределенную сосудистую сеть на лоскуте.
Рисунок 3: Подкожная фасцио-кожная лоскутная ангиография. Контрастный продукт вводили через бедренную артерию, показывая плотную подкожную сосудистую сеть. Масштаб в сантиметрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Затем закрылки подвергали пользовательскому протоколу11 децеллюляризации. Закрылки были перфузированы с использованием машинной перфузии с контролируемым давлением, обеспечивая непрерывный поток с использованием этого протокола. При целевом давлении 80 мм рт.ст. поток PBS, SDS и Triton X был ограничен максимальной скоростью 3,1 мл/мин. Потребление кислорода не было отмечено, так как перфузионная система была предназначена для сдерживания клеток лоскута. Этот протокол привел к эффективной децеллюляризации всех тканей (рисунок 1), что подтверждается отсутствием ДНК во всех образцах тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной статье описывается надежный и воспроизводимый фасциокожный лоскут, заготовленный на задних конечностях свиней. Следование этому пошаговому хирургическому протоколу позволит приобрести два лоскута только на одном животном менее чем за 2 часа. Наиболее важным этапом операции является скелетонизация сосудистой ножки в пределах мышечных волокон грацилиса, что требует тщательного рассечения опытным хирургом. Закрепление кожи на фасции с помощью кожных швов является решающим советом, чтобы избежать эффекта сдвига, нарушающего сосуды перфоратора, и последующей деваскуляризации лоскута кожи. Характеристики подкожного FCF (длинная сосудистая ножка, приличные калибры сосудов) и его надежность делают его идеальной моделью для многих областей исследований.
Несколько команд продемонстрировали интерес к этой модели в протоколе биоинженерии кожи путем децеллюляризации и рецеллюляризации11. Отсутствие мышц было ключевым моментом в реализации протокола биоинженерии. Следовательно, мы искали фасциокожные лоскуты, расположенные либо на передней, средней части спины, бедре или паху, где panniculus carnosus (тонкий мышечный слой, разделяющий поверхностные и глубокие жировые слои у свиней) отсутствует19. В предварительных экспериментах брюшные кожные лоскуты на основе глубокой верхней эпигастральной артерии были собраны в соответствии с ранее опубликованными протоколами 20,21,22. Однако малый диаметр сосудов, более сложная техника сбора урожая и наличие panniculus carnosus представляли собой значительные недостатки. Экспериментальный протокол перфузионной децеллюляризации выявил несоответствия в перфузии кожи через перфораторы, которые казались слишком маленькими и / или поврежденными во время операции.
Этот лоскут также использовался для изучения механистических путей, участвующих в иммунном отторжении васкуляризированных кожных трансплантатов, причем кожа является наиболее иммуногенным компонентом в VCA 8,23. Используя эту модель, было точно оценено влияние компонента кожи на толерантность к трансплантации.
Кроме того, эта подробная процедура может также служить доклинической моделью в других областях исследований. Подкожный FCF может оценить травмы ишемии-реперфузии на модели кожи крупного животного ближе к человеку. Наконец, это также может быть полезно для сохранения перфузии аппарата ex-vivo VCA и помочь определить наилучшие параметры перфузии для поддержания жизнеспособности кожи до трансплантации24.
В заключение, это точное описание надежного и воспроизводимого метода закупки лоскутов предлагает ценный инструмент для биоинженерных исследований VCA у свиней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантами Shriners Hospitals for Children #85127 (BEU и CLC) и #84702 (AA). Авторы хотели бы поблагодарить фонд "Gueules Cassées" за поддержку заработной платы стипендиатов, участвующих в этом проекте.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| 20 G angiocatheter | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| Adson Tissue Forceps, 11 cm, 1 x 2 Teeth with Tying Platform | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| Atropine Sulfate | AdvaCare | 212-868 | |
| Bipolar cords | ASSI | 228000C | |
| Buprenorphine HCl | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| Dilating Forceps | Fine science tools (FST) | 18131-12 | |
| Endotrachel tube | Jorgensen Labs | JO615X | size from 6 to 15mm depending on the pig weight |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| Euthasol | Virbac AH | 200-071 | |
| Heparin Lock Flush Solution, USP, 100 units/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| Jewelers Bipolar Forceps Non Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| Metzenbaum scissors 180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil blue | Flow tech | LMV-120 | |
| Microfil dilution | Flow tech | LMV-112 | colored filing solution |
| Monopolar knife | ASSI | 221230C | |
| N°15 scalpel blade | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | General Electric | 4080358 | contrast product |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| Small Ligaclip | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens scissors 115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xylamed (xylazine) | Bimeda | 200-529 |
References
- Dubernard, J. M., et al. Human hand allograft: Report on first 6 months. The Lancet. 353 (9161), 1315-1320 (1999).
- Meningaud, J. P., et al. Procurement of total human face graft for allotransplantation: A preclinical study and the first clinical case. Plastic and Reconstructive Surgery. 126 (4), 1181-1190 (2010).
- Cetrulo, C. L., et al. Penis transplantation: First US experience. Annals of Surgery. 267 (5), 983-988 (2018).
- Lantieri, L., et al. Face transplant: Long-term follow-up and results of a prospective open study. Lancet. 388 (10052), London, England. 1398-1407 (2016).
- Derek, E., Dhanireddy, K.
- Lantieri, L., et al. First human facial retransplantation: 30-month follow-up. Lancet. 396 (10264), London, England. 1758-1765 (2020).
- Kauke, M., et al. Full facial retransplantation in a female patient-Technical, immunologic, and clinical considerations. American Journal of Transplantation. 21 (10), 3472-3480 (2021).
- Leonard, D. A., et al. Vascularized composite allograft tolerance across MHC barriers in a large animal model. American Journal of Transplantation. 14 (2), 343-355 (2014).
- Kawai, T., et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. The New England Journal of Medicine. 368 (19), 1850-1852 (2013).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Lupon, E., et al. Engineering Vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 9 (2), 66-76 (2001).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. Journal of Visualized Experiments. (80), e50475 (2013).
- Rosh, E. H., Vistnes, L. M., Ksander, G. A. The panniculus carnosus in the domestic pic. Plastic and Reconstructive Surgery. 59 (1), 94-97 (1977).
- Alessa, M. A., et al. Porcine as a training module for head and neck microvascular reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (139), e58104 (2018).
- Minqiang, X., Jie, L., Dali, M., Lanhua, M. Transmidline abdominal skin flap model in pig: Refinements and advancements. Journal of Reconstructive Microsurgery. 28 (02), 111-118 (2012).
- Bodin, F., et al. Porcine model for free-flap breast reconstruction training. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 68 (10), 1402-1409 (2015).
- Kadono, K., Gruszynski, M., Azari, K., Kupiec-Weglinski, J. W. Vascularized composite allotransplantation versus solid organ transplantation: Innate-adaptive immune interphase. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (6), 714-720 (2019).
- Kruit, A. S., et al. Rectus Abdominis flap replantation after 18 h hypothermic extracorporeal perfusion-A Porcine Model. Journal of Clinical Medicine. 10 (17), 3858 (2021).
