Langsigtet kontinuerlig måling af nyreblodgennemstrømning hos bevidste rotter

Summary

Denne protokol beskriver en langsigtet kontinuerlig måling af renal blodgennemstrømning hos bevidste rotter og samtidig registrering af blodtryk med implanterede katetre (væskefyldt eller ved telemetri).

Abstract

Nyrerne spiller en afgørende rolle i at opretholde homeostase af kropsvæsker. Reguleringen af renal blodgennemstrømning (RBF) er afgørende for de vitale funktioner af filtrering og metabolisme i nyrefunktionen. Mange akutte undersøgelser er blevet udført i bedøvede dyr for at måle RBF under forskellige betingelser for at bestemme mekanismer, der er ansvarlige for reguleringen af nyreperfusion. Af tekniske årsager har det imidlertid ikke været muligt at måle RBF kontinuerligt (24 timer/dag) hos uhæmmede ubedøvede rotter over længere perioder. Disse metoder tillader kontinuerlig bestemmelse af RBF over mange uger, samtidig med at blodtryk (BP) registreres med implanterede katetre (væskefyldt eller ved telemetri). RBF-overvågning udføres med rotter placeret i et cirkulært servostyret rottebur, der muliggør rottens uhæmmede bevægelse gennem hele undersøgelsen. Samtidig forhindres sammenfiltring af kabler fra strømningssonden og arteriellekatetre. Rotter instrumenteres først med en ultralydsstrømssondeplacering på venstre nyrearterie og et arterieltateter implanteret i højre lårarterie. Disse føres subkutant til nakken og forbindes til flowmåleren og tryktransduceren for at måle RBF og BP. Efter kirurgisk implantation placeres rotter straks i buret for at komme sig i mindst en uge og stabilisere ultralydssondeoptagelserne. Urinopsamling er også mulig i dette system. De kirurgiske og postkirurgiske procedurer til kontinuerlig overvågning er demonstreret i denne protokol.

Introduction

Nyrerne er kun 0,5% af kropsvægten, men rige på blodgennemstrømning og modtager 20% -25% af den samlede hjerteudgang¹. Reguleringen af renal blodgennemstrømning (RBF) er central for nyrefunktion, kropsvæske og elektrolythomeostase. Betydningen af blodgennemstrømningsregulering for nyrerne illustreres pænt af den betydelige stigning i RBF i den resterende nyre efter ensidig nefrektomi ^2,3,4 og af reduktionerne af RBF, der forekommer ved nyresvigt ^5,6,7. Hvorvidt sådanne ændringer i RBF forekommer som reaktion på ændringer i nyrefunktionen eller et fald i funktion på grund af reduktion af RBF har været udfordrende at fastslå hos bedøvede kirurgisk fremstillede dyr eller mennesker. Der kræves tidsmæssige undersøgelser, hvor hændelserne kan bestemmes før og efter en defineret ændring og observeres hos det samme dyr under begivenhedernes udvikling. I dyre- og humanstudierne er RBF blevet estimeret indirekte ved clearance af para-amino hippurinsyre (PAH)8,9,10 og i nyere tid ved billeddannelsesteknikker såsom ultralyd^9,11,12, MR^4,13 og PET-CT ^14,15 som giver nyttige snapshotbilleder af hver nyre, og som kan følge sygdommens progression. Det er udfordrende at evaluere RBF hos små dyr ved ultralyd eller MR-scanninger uden anæstesi. Det har været umuligt løbende at måle RBF under bevidste forhold på den samme rotte over længere perioder.

Den nuværende protokol udviklede derfor teknikker, der muliggør samtidige kontinuerlige 24 timers / dag målinger af RBF, som er blevet kombineret med kontinuerlige blodtryksmålingsmetoder til frit bevægelige rotter som beskrevet tidligere 16,17,18,19,20,21 . Denne teknologi giver mulighed for tidsmæssig evaluering af RBF i forskellige modeller af rotter for at studere årsagssammenhænge i forskellige nyresygdomme i fremtiden.

Protocol

Protokollen er godkendt af Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Dahl saltfølsomme rotter (hanner og hunner), ~8 uger gamle, 200-350 g, blev brugt til forsøgene.

1. Tilberedning af dyr

1. Installer et bevægelsesresponsbursystem til rotten, et perivaskulært flowmodul, sprøjtepumpe, optageenhed og software (se Materialetabel) i dyrerummet.
2. Placer rotterne i buret for at blive fortrolige med miljø, mad og vandsystem mindst ugen før operationen. Hurtigt rotterne fra dagen før operationen, fordi et højt maveindhold kan forstyrre placeringen af strømningssonden i venstre nyrearterie og kan forårsage trakeal aspiration.
3. Tilslut en 5 cm polyurethanrør (indvendig diameter 0,30 mm og ydre diameter 0,64 mm) til enden af 90 cm polyurethanrør (indvendig diameter 0,64 mm og ydre diameter 1,02 mm) med PVC-cement for at fremstille et lårbensarterieltateter (se Materialetabel).
   1. Steriliser katetrene med en ethylenoxidsterilisator, strømningssonden med 2,5% glutaraldehyd og de kirurgiske instrumenter i en dampautoklave. Tør kirurgiske tabeller, mikroskopi og lys med 1% natriumhypochlorit.

2. Kirurgi

1. Placer RBF-sonden ved at følge nedenstående trin.
   1. Anæstetiser rotterne med 2,0%-2,5% Isofluran i den grad, at rotterne ikke reagerer på smertestimuleringen. Placer det på operationsbordet, der er indstillet til 37 °C, og injicer 0,09 mg/kg buprenorphin SR og 15 mg/kg cefazolin (se Materialetabel) før operationen.
   2. Barber hele maven med en elektrisk klipper og et område på nakken omkring den 7. livmoderhvirvel, hvor kateteret og flowet beviser, at ledningerne vil komme ud^.
   3. Efter barbering skal du tørre området med 70% ethanol, 10% povidon-jod og igen med 70% ethanol.
   4. Placer rotten i den udsatte position. Lav et snit på 1 cm ved hjælp af en skalpel på nakken og venstre flanke. Udfør derefter en stump dissektion med hæmostatiske tang og ryd et subkutant rum fra flankesnittet til nakken.
   5. Før strømningssonden gennem denne subkutane tunnel fra halsen til flankesnittet med hæmostatiske tang.
   6. Placer rotten i liggende stilling. Lav et 4-5 cm midterlinje abdominal snit.
   7. Disseker området omkring nyrearterien med buet pincet for at udsætte et rum, der er tilstrækkeligt til at placere strømningssonden (se Materialetabel). Derefter direkte gennembore venstre quadratus lumborum muskel med de hæmostatiske tang og træk hovedet af strømningssonden ind i bukhulen.
   8. Krog spidsen af strømningssonden til venstre nyrearterie, og tilslut den til flowmåleren (se Materialetabel). Tilsæt lidt gel omkring sondespidsen, og værdien af strømningshastigheden vises på flowmåleren.
      BEMÆRK: Selvom det afhænger af rottens størrelse, vil der blive observeret en strøm på ca. 3-5 ml / min i en 230 g rotte.
   9. Lim polyesterfibernettet, der er fastgjort til sonden, med vævslim til mavevæggen og hold det, indtil det er tørt og bundet (~ 1-2 min). Når strømmen er på plads, skal du afbryde strømningssonden fra flowmåleren og dække maven med saltvandsvædet gasbind og gå videre til trinnet med at indsætte kateteret.
2. Indsæt lårkateteret ved at følge nedenstående trin.
   BEMÆRK: Metoden til indsættelse af et væskefyldt kateter er den samme som almindelige telemetriinstallationer. Selvom telemetri foretrækkes, muliggør arteriekateteret trykovervågning og periodeblodprøvetagning fra den bevidste rotte.
   1. Fyld først kateteret med saltvand og klem det med vaskulær tang, inden du laver et 1 cm hudsnit ved hjælp af en skalpel på venstre lår for at dissekere og udsætte lårarterien. Mens du blokerer strømmen ved den proksimale side af lårbenet arterien med en tråd, indsættes kateteret.
   2. Skyl med en lille mængde saltvand, tilslut med rustfri ledning i passende størrelse, og bind kateteret med en tråd for at fastgøre det.
   3. Når ligaturen er bundet rundt om kateteret, skal du oprette en subkutan tunnel ved at bruge en trocar i rustfrit stål fra låret til bagsiden af nakken for at bringe kateteret til nakkeområdet. Fastgør det med 3-0 silkesuturer placeret i trapeziusmusklen.
3. Sutur sonden.
   1. Drej rotten til den udsatte position og sy den cirkulære sløjfe af strømningssonden subkutant ved flanken. Sutur snittet ved flanken og nakken med 4-0 kirurgisk sutur (se Materialetabel).
   2. Fastgør en hudknap til strømningssonden og sutur den med 3-0 silke i nakken.
   3. Tilslut strømssonden til flowmåleren igen, drej rotten tilbage til rygpositionen for at kontrollere RBF, og foretag de endelige justeringer af strømningssonden for at optimere dens position på nyrearterien.
   4. Endelig sutureres musklen med 3-0 silke og huden med 4-0 kirurgisk sutur.

3. Bjærgning af dyret

1. Efter omhyggelig observation, indtil rotterne er helt genoprettet fra anæstesien, skal du returnere rotterne til et bevægelsesresponsbursystem, forbinde strømningssonden til blodgennemstrømningsmåleren og tillade en genopretningsperiode på ca. en uge for at stabilisere sonden og strømningsmålingen.
   BEMÆRK: Optagelse behøver ikke at ske i denne periode.
2. Tilsæt 3% hepariniseret saltvand kontinuerligt gennem hele undersøgelsen fra arteriekateteret med en hastighed på 100 μL / h for at forhindre koagulering.
3. Når flowet stabiliseres efter 5-6 dage, indstilles flowmålerkalibreringen til at måle blodgennemstrømningen til 0-20 ml / min og begynde den kontinuerlige registrering af RBF.

Representative Results

De gennemsnitlige arterielle trykdata (figur 1A) og blodgennemstrømningsdata (figur 1B) fra en repræsentativ mandlig Dahl-saltfølsom rotte er vist. Dahl saltfølsomme rotter opretholdes i en koloni og opdrættes på Medical College of Wisconsin. Operationen blev udført i en alder af 8 uger, og kropsvægten var 249 g på tidspunktet for operationen. Rotter blev fodret med en 0,4% NaCl diæt, og kosten blev ændret til en 4% NaCl diæt i en alder af 10 uger. Målingerne blev fortsat i 3 uger på en 4% NaCl-diæt, og eksperimentet blev afsluttet ved 13 ugers alderen. Dataene vises med et minutgennemsnit. En klar daglig forskel blev observeret i gennemsnitligt arterielt tryk og blodgennemstrømning. Mens blodtrykket stiger med en høj salt kost, blodgennemstrømningen tendens til at falde snarere end at stige, tyder på øget renal vaskulær resistens.

Figur 1: Repræsentative data om arterielt tryk og blodgennemstrømning. Gennemsnitligt arterielt tryk (mm Hg) (A) og renal blodgennemstrømning (ml / min) (B) vises med et minutgennemsnit. LS: lavt salt (0,4% NaCl) diæt, HS: Højt salt (4% NaCl) diæt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Den nuværende protokol beskriver en teknik, der bruger kommercielt tilgængelig instrumentering til at registrere RBF og arterielt tryk kontinuerligt over mange uger. Derudover kan urin opsamles ved hjælp af enheden beskrevet i trin 1.1. Det kan også bruges til at evaluere metabolitter i urinen og, når et arterieltateter implanteres, blodprøvetagning til analyse.

Traditionelt er RBF-målinger opnået akut i kirurgisk fremstillede bedøvede dyr eller estimeret ved PAH-clearance. Det har imidlertid vist sig, at forskellige anæstetika og kirurgi^22,23 ændrer renal blodgennemstrømning og arterielt tryk. Undersøgelser på mennesker har rapporteret, at isofluran reducerede PAH-clearance fra henholdsvis 476,8-243,3 ml / min og inulinclearance fra 88,0 til 55,7 ml / min.⁸. Thiobarbital er et bedøvelsesmiddel, der er meget udbredt til kritiske undersøgelser af rotter. Alligevel rapporteres det, at H_{2O2-produktionen} i mitokondrierne i nyrebarken stiger 90 minutter efter anæstesi med thiobarbital²⁴, hvilket kan påvirke blodgennemstrømningen. Målinger i ubedøvede og ubelastede dyr ville være langt at foretrække for mange eksperimentelle undersøgelser. Metoden til måling af RBF ved implantering af en flowsonde er blevet demonstreret hos hunde²⁵ og rotter²⁶. Dette arbejde har også etableret en måde at måle RBF i rotter i laboratoriet.

Anvendelse af de teknikker, der er beskrevet i denne præsentation, kan løse mange spørgsmål relateret til de sekventielle begivenheder efter en given stimulus. Den ubedøvede instrumenterede rottemodel muliggør bestemmelse af både øjeblikkelige og kroniske reaktioner på lægemiddel og langsigtede konsekvenser af forskellige stimuli, der kan forekomme under udviklingen af hypertension.

Operationen indebærer minimalt blodtab med næsten 100% overlevelsesrate med en vis træning. Flowproberne kan genbruges efter vask med protease indeholdt anionisk vaskemiddel og sterilisering efter et 4-ugers forsøg. Imidlertid vil plastbelægningen gradvist forringes og vil efter flere anvendelser kræve reparation. Hudknappen i den næste, hvor katetrene forlader, repræsenterer det mest betydningsfulde potentielle problem, da det er sårbart over for infektion, irritation og ridser, hvis det ikke rengøres og desinficeres omhyggeligt. Men hvis dette bliver løs, kan det hurtigt repareres under anæstesi.

Det kritiske trin i proceduren er operationen, og det kan tage et stykke tid at mestre teknikken. Men når de er opnået, kan ubedøvede kroniske undersøgelser udføres produktivt med minimale problemer. Det er muligt at operere på rotter på 200-350 g uanset stamme eller køn. Forsøg på rotter af forskellig størrelse og dyr er også mulige ved hjælp af flowprober af forskellig størrelse, der allerede er udarbejdet af producenterne.

Der er dog begrænsninger og specifikke problemer, som man skal være opmærksom på. For det første skal kirurgi udføres ved hjælp af steriliserede instrumenter, katetre og flowprober i det omfang det er muligt for at minimere postkirurgiske infektioner. For det andet, da operationen er omfattende og kræver over en time, skal der gives en tilstrækkelig lang restitutionsperiode, før der opnås "kontrol" -målinger til undersøgelsen. Denne periode i vores laboratorium strækker sig generelt fra 7-10 dage. For det tredje har ileus (en okklusion eller lammelse af tarmen) været et problem i nogle tilfælde, der repræsenterer en postoperativ komplikation. Dette kan forhindres ved at undgå eksponering af tarmen (f.eks. Holde sig indpakket i fugtigt gaze) under proceduren og undgå at lukke abdominalsnittet, indtil bindingen var godt tørret. Det er vigtigt at undgå at udsætte tarmen for nyrearterien under operationen og sikre, at tarmen ikke er snoet, når den sutureres. For det fjerde skal det erkendes, at RBF vil stige proportionalt med stigende nyrevægt. Dette skal overvejes i undersøgelser, hvor renal hypertrofi forekommer efter fjernelse af den kontralaterale nyre. For det femte har vi kun erfaring med at måle RBF i op til en måned og har ikke forsøgt at forlænge målingerne ud over denne periode. Da tingene fungerede godt i hele denne periode i næsten alle tilfælde, kunne undersøgelser sandsynligvis forlænges mange uger ud over. Endelig et kort ord om parallelle arterielle trykmålinger: de implanterede væskefyldte katetre med fortyndet heparin for at opretholde 24 timers / dag patency og implanterede telemetrianordninger anvendes. Hver har fordele og ulemper afhængigt af det eksperimentelle design og behov. For eksempel er blodprøvetagning mulig fra arteriekateteret, hvis katetermetoden vælges, og heparinisering er ikke nødvendig for telemetrimetoden. Begge har dog tjent os godt under langsigtede målinger af RBF og BP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1RB probe	Transonic	1RB	ultrasonic flow probe
Betadine	Avrio Health		povidone-iodine
Buprenorphine SR-LAB	ZooPharm		Buprenorphine
Cefazolin	APOTEX	NDC 60505	Cefazolin
Crile Hemostats	Fine Surgical Instruments	13004-14	Hemostats for blunt dissection
Isoflurane	Piramal	NDC 66794	Isoflurane
Medium Clear PVC cement	Oatey		PVC cement
Mersilene polyester fiber mesh	Ethicon		polyester fiber mesh
MetriCide28	Metrex	SKU 10-2805	2.5% glutaraldehyde
Micro-Renathane 0.025 x 0.012	Braintree Scientific	MRE 025	use for catheter
MINI HYPE-WIPE	Current Technologies	#9803	1% sodium hypochlorite
Oatey Medium Clear PVC Cement	Oatey	#31018	PVC cement
PHD2000 syringe pump	Harvard apparatus	71-2000	syringe pump
Ponemah software	DSI		recording software
Precision 3630 Tower	Dell		Computer for recording
Raturn Stand-Alone System	BASi	MD-1407	a movement response caging system
RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025	Braintree Scientific	RPT 040	use for catheter
Silicone cuff	Transonic	AAPC102	skin button
Surgical lubricant sterile bacteriostatic	Fougera	0168-0205-36	gell for flow probe
Tergazyme	Alconox		protease contained anionic detergent
TS420 Perivascular Flow Module	Transonic	TS420	perivascular flow module
Vetbond	3M	1469SB	tissue adhesive
WinDaq software	DATAQ		recording software