Summary
Het huidige protocol beschrijft een langdurige continue meting van de renale bloedstroom bij bewuste ratten en tegelijkertijd het registreren van de bloeddruk met geïmplanteerde katheters (met vloeistof gevuld of door telemetrie).
Abstract
De nieren spelen een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van lichaamsvloeistoffen. De regulatie van de renale bloedstroom (RBF) is essentieel voor de vitale functies van filtratie en metabolisme in de nierfunctie. Veel acute studies zijn uitgevoerd bij verdoofde dieren om RBF onder verschillende omstandigheden te meten om mechanismen te bepalen die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van nierperfusie. Om technische redenen was het echter niet mogelijk om RBF continu (24 uur per dag) te meten bij ongeremde ongedoofde ratten gedurende langere perioden. Deze methoden maken de continue bepaling van RBF gedurende vele weken mogelijk, terwijl tegelijkertijd de bloeddruk (BP) wordt geregistreerd met geïmplanteerde katheters (vloeistof gevuld of door telemetrie). RBF-monitoring wordt uitgevoerd met ratten die in een cirkelvormige servogestuurde rattenkooi worden geplaatst die de ongeremde beweging van de rat gedurende het hele onderzoek mogelijk maakt. Tegelijkertijd wordt het in de knoop raken van kabels van de stroomsonde en arteriële katheters voorkomen. Ratten worden eerst geïnstrumenteerd met een ultrasone flow probe plaatsing op de linker nierslagader en een arteriële katheter geïmplanteerd in de rechter femorale slagader. Deze worden subcutaan naar de nekgeleid en verbonden met respectievelijk de flowmeter en de druktransducer om RBF en BP te meten. Na chirurgische implantatie worden ratten onmiddellijk in de kooi geplaatst om minstens een week te herstellen en de ultrasone sonde-opnames te stabiliseren. Urine opvang is ook haalbaar in dit systeem. De chirurgische en postoperatieve procedures voor continue monitoring worden in dit protocol gedemonstreerd.
Introduction
De nieren zijn slechts 0,5% van het lichaamsgewicht, maar rijk aan bloedstroom, het ontvangen van 20% -25% van de totale cardiale output1. De regulatie van de renale bloedstroom (RBF) staat centraal in de nierfunctie, lichaamsvloeistof en elektrolytenhomeostase. Het belang van de regulatie van de bloedstroom naar de nier wordt mooi geïllustreerd door de aanzienlijke toename van RBF in de resterende nier na unilaterale nefrectomie 2,3,4 en door de reducties van RBF die optreden bij nierfalen 5,6,7. Of dergelijke veranderingen in RBF optreden als reactie op veranderingen in de nierfunctie of een afname van de functie als gevolg van vermindering van RBF is een uitdaging om vast te stellen bij verdoofde chirurgisch bereide dieren of menselijke proefpersonen. Er zijn temporele studies nodig waarin de gebeurtenissen vóór en na een gedefinieerde verandering kunnen worden bepaald en bij hetzelfde dier kunnen worden waargenomen tijdens de progressie van gebeurtenissen. In de dier- en mensstudies is RBF indirect geschat door de klaring van para-amino hippuurzuur (PAK)8,9,10 en in recentere tijd door beeldvormingstechnieken zoals echografie 9,11,12, MRI 4,13 en PET-CT14,15 die nuttige momentopnamen van elke nier geven en die de progressie van de ziekte kunnen volgen. Het is een uitdaging om RBF bij kleine dieren te evalueren door middel van echografie of MRI-scans zonder anesthesie. Het was onmogelijk om RBF onder bewuste omstandigheden continu te meten bij dezelfde rat gedurende langere perioden.
Het huidige protocol heeft daarom technieken ontwikkeld die gelijktijdige continue 24 uur/dag metingen van RBF mogelijk maken, die is gecombineerd met continue bloeddrukmeetmethoden voor vrij bewegende ratten zoals eerder beschreven 16,17,18,19,20,21 . Deze technologie maakt de temporele evaluatie van RBF in verschillende modellen van ratten mogelijk om oorzaak-gevolgrelaties in verschillende nieraandoeningen in de toekomst te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is goedgekeurd door het Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Dahl zoutgevoelige ratten (mannetjes en vrouwtjes), ~ 8 weken oud, 200-350 g, werden gebruikt voor de experimenten.
1. Voorbereiding van dieren
- Installeer een bewegingsresponssysteem voor de rat, een perivasculaire flowmodule, spuitpomp, opnameapparaat en software (zie materiaaltabel) in de dierenkamer.
- Plaats de ratten in de kooi om vertrouwd te raken met de omgeving, het voedsel en het watersysteem ten minste de week voorafgaand aan de operatie. Vast de ratten vanaf de dag voor de operatie omdat een hoog maaggehalte de plaatsing van de stroomsonde in de linker nierslagader kan verstoren en tracheale aspiratie kan veroorzaken.
- Sluit een polyurethaanbuis van 5 cm (binnendiameter 0,30 mm en buitendiameter 0,64 mm) aan op het einde van de 90 cm polyurethaanbuis (binnendiameter 0,64 mm en buitendiameter 1,02 mm) met PVC-cement om een femorale arteriële katheter te maken (zie Materiaaltabel).
- Steriliseer de katheters met een ethyleenoxidesterilisator, de stroomsonde met 2,5% glutaaraldehyde en de chirurgische instrumenten in een stoomautoclaaf. Veeg chirurgische tafels, microscopie en lichten af met 1% natriumhypochloriet.
2. Operatie
- Plaats de RBF-sonde volgens de onderstaande stappen.
- Verdoof de ratten met 2,0% -2,5% isofluraan in die mate dat de ratten niet reageren op de pijnprikkel. Plaats het op de operatietafel bij 37 °C en injecteer vóór de operatie 0,09 mg/kg buprenorfine SR en 15 mg/kg cefazoline (zie materiaaltabel).
- Scheer de hele buik met een elektrische tondeuse en een gebied op de nek rondde 7e halswervels waar de katheter en de stroom bewijzen draden zullen vertrekken.
- Veeg na het scheren het gebied af met 70% ethanol, 10% povidon-jodium en opnieuw met 70% ethanol.
- Plaats de rat in buikligging. Maak een snede van 1 cm met behulp van een scalpel op de nek en de linkerflank. Voer vervolgens een stompe dissectie uit met een hemostatische tang en maak een onderhuidse ruimte vrij van de flankincisie naar de achterkant van de nek.
- Passeer de stroomsonde door deze onderhuidse tunnel van de nek naar de flankincisie met hemostatische tang.
- Plaats de rat in rugligging. Maak een buikincisie van 4-5 cm in de middellijn.
- Ontleed het gebied rond de nierslagader met een gebogen pincet om een ruimte bloot te leggen die voldoende is om de stroomsonde te plaatsen (zie Materiaaltabel). Doorprik vervolgens botweg de linker quadratus lumborumspier met de hemostatische tang en trek de kop van de stroomsonde in de buikholte.
- Haak de punt van de stroomsonde aan de linker nierslagader en sluit deze aan op de flowmeter (zie Materiaaltabel). Voeg wat gel toe rond de punt van de sonde en de waarde van het debiet verschijnt op de stroommeter.
OPMERKING: Hoewel het afhangt van de grootte van de rat, zal een stroom van ongeveer 3-5 ml / min worden waargenomen bij een rat van 230 g. - Lijm het polyestervezelgaas dat aan de sonde is bevestigd met weefsellijm aan de buikwand en houd vast tot het droog en gebonden is (~ 1-2 min). Zodra de stroom op zijn plaats is, koppelt u de stroomsonde los van de stroommeter en bedekt u de buik met zout ingesmoord gaas en gaat u verder met de stap van het inbrengen van de katheter.
- Breng de femorale katheter in volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: De methode voor het inbrengen van een met vloeistof gevulde katheter is dezelfde als bij reguliere telemetrie-installaties. Hoewel telemetrie de voorkeur heeft, maakt de arteriële katheter drukmonitoring en periodebloedafname van de bewuste rat mogelijk.- Vul eerst de katheter met zoutoplossing en klem deze vast met een vasculaire tang voordat u een huidincisie van 1 cm maakt met behulp van een scalpel op de linkerdij om de dijslagader te ontleden en bloot te leggen. Terwijl u de stroom aan de proximale kant van de dijbeenslagader met een draad blokkeert, brengt u de katheter in.
- Spoel met een kleine hoeveelheid zoutoplossing, sluit deze aan met de juiste grootte roestvrije draad en bind de katheter vast met een draad om deze te bevestigen.
- Zodra de ligatuur rond de katheter is gebonden, maakt u een onderhuidse tunnel door een roestvrijstalen trocar van de dij naar de achterkant van de nek te gebruiken om de katheter naar het nekgebied te brengen. Zet het vast met 3-0 zijden hechtingen die in de trapeziusspier worden geplaatst.
- Hecht de sonde.
- Draai de rat naar de buikligging en steek de cirkelvormige lus van de stroomsonde subcutaan op de flank. Hecht de incisie aan de flank en de nek met 4-0 chirurgische hechting (zie Materiaaltabel).
- Bevestig een huidknop aan de flowsonde en hecht deze met 3-0 zijde aan de achterkant van de nek.
- Sluit de stroomsonde opnieuw aan op de stroommeter, draai de rat terug naar de dorsale positie om RBF te controleren en maak de laatste aanpassingen van de stroomsonde om zijn positie op de nierslagader te optimaliseren.
- Hecht ten slotte de spier met 3-0 zijde en de huid met 4-0 chirurgische hechting.
3. Herstel van het dier
- Na zorgvuldige observatie, totdat de ratten volledig hersteld zijn van de anesthesie, brengen de ratten terug naar een bewegingsrespons-cagingsysteem, sluit de stroomsonde aan op de bloedstroommeter en laat een herstelperiode van ongeveer een week toe om de sonde en stroommeting te stabiliseren.
OPMERKING: Opnemen hoeft in deze periode niet te gebeuren. - Injecteer 3% gehepariniseerde zoutoplossing continu gedurende het onderzoek vanuit de arteriële katheter met een snelheid van 100 μL / h om de stolling te voorkomen.
- Wanneer de stroom na 5-6 dagen stabiliseert, stelt u de kalibratie van de flowmeter in om de bloedstroom te meten op 0-20 ml / min en begint u met de continue registratie van RBF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gemiddelde arteriële drukgegevens (figuur 1A) en bloedstroomgegevens (figuur 1B) van een representatieve mannelijke Dahl-zoutgevoelige rat worden weergegeven. De zoutgevoelige ratten van Dahl worden in een kolonie gehouden en gefokt aan het Medical College of Wisconsin. De operatie werd uitgevoerd op de leeftijd van 8 weken en het lichaamsgewicht was 249 g op het moment van de operatie. Ratten kregen een 0,4% NaCl-dieet en het dieet werd op de leeftijd van 10 weken gewijzigd in een 4% NaCl-dieet. De metingen werden gedurende 3 weken voortgezet op een 4% NaCl-dieet en het experiment werd beëindigd op de leeftijd van 13 weken. De gegevens worden weergegeven met een miniemgemiddelde. Een duidelijk dagverschil werd waargenomen in de gemiddelde arteriële druk en bloedstroom. Terwijl de bloeddruk stijgt met een zoutrijk dieet, heeft de bloedstroom de neiging om te dalen in plaats van toe te nemen, wat wijst op een verhoogde renale vasculaire weerstand.
Figuur 1: Representatieve arteriële druk en bloedstroomgegevens. De gemiddelde arteriële druk (mm Hg) (A) en de renale bloedstroom (ml/min) (B) worden weergegeven met een minuutgemiddelde. LS: zoutarm (0,4% NaCl) dieet, HS: Zoutrijk (4% NaCl) dieet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een techniek die gebruik maakt van commercieel beschikbare instrumentatie om RBF en arteriële druk continu gedurende vele weken te registreren. Bovendien kan urine worden verzameld met behulp van het apparaat dat wordt beschreven in stap 1.1. Het kan ook worden gebruikt om metabolieten in de urine te evalueren en, wanneer een arteriële katheter wordt geïmplanteerd, bloedafname voor analyse.
Traditioneel worden RBF-metingen acuut verkregen bij chirurgisch bereide verdoofde dieren of geschat door PAH-klaring. Het is echter aangetoond dat verschillende anesthetica en chirurgie22,23 de renale bloedstroom en arteriële druk veranderen. Studies bij mensen hebben gemeld dat isofluraan de PAK-klaring verminderde van 476,8-243,3 ml / min en inulineklaring van 88,0 tot 55,7 ml / min, respectievelijk8. Thiobarbital is een verdovingsmiddel dat veel wordt gebruikt voor kritische studies van ratten. Toch wordt gemeld dat de H 2 O2-productie in de mitochondriën van de nierschors 90 minuten na anesthesie met thiobarbital24 toeneemt, wat de bloedstroom kan beïnvloeden. Metingen bij niet-verdoofde en niet-gestresste dieren zouden verre de voorkeur hebben voor veel experimentele studies. De methode om RBF te meten door een stroomsonde te implanteren is gedemonstreerd bij honden25 en ratten26. Dit werk heeft ook een manier gevonden om RBF bij ratten in het laboratorium te meten.
Het toepassen van de technieken die in deze presentatie worden beschreven, kan veel vragen beantwoorden met betrekking tot de opeenvolgende gebeurtenissen na een bepaalde stimulus. Het ongedoofde geïnstrumenteerde rattenmodel maakt het mogelijk om zowel onmiddellijke als chronische reacties op geneesmiddelen en langetermijngevolgen van verschillende stimuli die kunnen optreden tijdens de ontwikkeling van hypertensie te bepalen.
De operatie omvat minimaal bloedverlies met bijna 100% overlevingskansen met enige training. De stroomsondes kunnen worden hergebruikt na het wassen met protease-bevattend anionisch reinigingsmiddel en sterilisatie na een experiment van 4 weken. De plastic coating zal echter geleidelijk verslechteren en zal na verschillende toepassingen moeten worden gerepareerd. De huidknop in de volgende waar de katheters uitkomen, vertegenwoordigt het belangrijkste potentiële probleem, omdat het kwetsbaar is voor infectie, irritatie en krassen als het niet zorgvuldig wordt gereinigd en gedesinfecteerd. Als dit echter losraakt, kan het snel worden gerepareerd onder anesthesie.
De kritieke stap van de procedure is de operatie en het kan een tijdje duren om de techniek onder de knie te krijgen. Eenmaal bereikt, kunnen niet-verdoofde chronische studies echter productief worden uitgevoerd met minimale problemen. Het is mogelijk om ratten van 200-350 g te opereren, ongeacht stam of geslacht. Experimenten op ratten van verschillende grootte en dieren zijn ook mogelijk met behulp van stroomsondes van verschillende groottes die al door fabrikanten zijn voorbereid.
Er zijn echter beperkingen en specifieke problemen waar men aandacht aan moet besteden. Ten eerste moet de operatie worden uitgevoerd met behulp van gesteriliseerde instrumenten, katheters en stroomsondes voor zover mogelijk om postoperatieve infecties te minimaliseren. Ten tweede, omdat de operatie uitgebreid is en meer dan een uur vereist, moet een voldoende lange herstelperiode worden geboden voordat "controle" -metingen voor het onderzoek worden verkregen. Deze periode in ons laboratorium strekt zich over het algemeen uit van 7-10 dagen. Ten derde is ileus (een occlusie of verlamming van de darm) in sommige gevallen een probleem geweest dat een postoperatieve complicatie vertegenwoordigt. Dit kan worden voorkomen door blootstelling van de darm te vermijden (bijv. Gewikkeld in vochtig gaas) tijdens de procedure en te voorkomen dat de buikincisie wordt gesloten totdat de binding goed is gedroogd. Het is essentieel om te voorkomen dat de darm tijdens de operatie wordt blootgesteld aan de nierslagader en ervoor te zorgen dat de darm niet wordt gedraaid tijdens het hechten. Ten vierde moet worden erkend dat RBF proportioneel zal toenemen met toenemend niergewicht. Hiermee moet rekening worden gehouden in onderzoeken waarin renale hypertrofie optreedt na verwijdering van de contralaterale nier. Ten vijfde hebben we slechts tot een maand ervaring met het meten van RBF en hebben we niet geprobeerd om metingen na deze periode uit te breiden. Omdat het in bijna alle gevallen goed ging in deze periode, konden studies waarschijnlijk vele weken later worden verlengd. Tot slot een kort woord over parallelle arteriële drukmetingen: de geïmplanteerde met vloeistof gevulde katheters met verdunde heparine om 24 uur / dag doorgankelijkheid te behouden en geïmplanteerde telemetrie-apparaten worden gebruikt. Elk heeft voor- en nadelen, afhankelijk van het experimentele ontwerp en de behoeften. Bloedafname is bijvoorbeeld mogelijk vanuit de arteriële katheter als de kathetermethode wordt gekozen en heparinisatie is niet vereist voor de telemetriemethode. Beide hebben ons echter goed gediend tijdens langetermijnmetingen van RBF en BP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies voor wetenschappelijk onderzoek (P01 HL116264, RO1 HL137748). De auteurs willen Theresa Kurth bedanken voor haar advies en hulp bij het onderhouden van de experimentele omgeving als laboratoriummanager.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
- Chonchol, M., Smogorzewski, M., Stubbs, J., Yu, A. Brenner & Rector's The Kidney. 11, Elsevier Inc. Philadelphia, PA. (2019).
- Chen, J. -K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase signaling determines kidney size. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2429-2444 (2015).
- Sigmon, D. H., Gonzalez-Feldman, E., Cavasin, M. A., Potter, D. L., Beierwaltes, W. H. Role of nitric oxide in the renal hemodynamic response to unilateral nephrectomy. Journal of the American Society of Nephrology. 15 (6), 1413-1420 (2004).
- Romero, C. A., et al. Noninvasive measurement of renal blood flow by magnetic resonance imaging in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 314 (1), 99-106 (2018).
- Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A.
- Regan, M. C., Young, L. S., Geraghty, J., Fitzpatrick, J. M. Regional renal blood flow in normal and disease states. Urological Research. 23 (1), 1-10 (1995).
- Ter Wee, P. M. Effects of calcium antagonists on renal hemodynamics and progression of nondiabetic chronic renal disease. Archives of Internal Medicine. 154 (11), 1185 (1994).
- Mazze, R. I., Cousins, M. J., Barr, G. A. Renal effects and metabolism of isoflurane in man. Anesthesiology. 40 (6), 536-542 (1974).
- Corrigan, G., et al. PAH extraction and estimation of plasma flow in human postischemic acute renal failure. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 277 (2), 312-318 (1999).
- Laroute, V., Lefebvre, H. P., Costes, G., Toutain, P. -L. Measurement of glomerular filtration rate and effective renal plasma flow in the conscious beagle dog by single intravenous bolus of iohexol and p-aminohippuric acid. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 17-25 (1999).
- Wei, K., et al. Quantification of renal blood flow with contrast-enhanced ultrasound. Journal of the American College of Cardiology. 37 (4), 1135-1140 (2001).
- Cao, W., et al. Contrast-enhanced ultrasound for assessing renal perfusion impairment and predicting acute kidney injury to chronic kidney disease progression. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (17), 1397-1411 (2017).
- Markl, M., Frydrychowicz, A., Kozerke, S., Hope, M., Wieben, O.
- Juillard, L., et al. Dynamic renal blood flow measurement by positron emission tomography in patients with CRF. American Journal of Kidney Diseases. 40 (5), 947-954 (2002).
- Juárez-Orozco, L. E., et al. Imaging of cardiac and renal perfusion in a rat model with 13N-NH3 micro-PET. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 31 (1), 213-219 (2015).
- Mori, T., Cowley, A. W. Role of pressure in angiotensin II-induced renal injury. Hypertension. 43 (4), 752-759 (2004).
- Mori, T., et al. High perfusion pressure accelerates renal injury in salt-sensitive hypertension. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (8), 1472-1482 (2008).
- Polichnowski, A. J., Cowley, A. W. Pressure-induced renal injury in angiotensin II versus norepinephrine-induced hypertensive rats. Hypertension. 54 (6), 1269-1277 (2009).
- Polichnowski, A. J., Jin, C., Yang, C., Cowley, A. W. Role of renal perfusion pressure versus angiotensin II renal oxidative stress in angiotensin II-induced hypertensive rats. Hypertension. 55 (6), 1425-1430 (2010).
- Evans, L. C., et al. Increased perfusion pressure drives renal T-cell infiltration in the dahl salt-sensitive rat. Hypertension. 70 (3), 543-551 (2017).
- Shimada, S., et al. Renal perfusion pressure determines infiltration of leukocytes in the kidney of rats with angiotensin II-induced hypertension. Hypertension. 76 (3), 849-858 (2020).
- Cousins, M. J., Mazze, R. I. Anaesthesia, surgery and renal function: Immediate and delayed effects. Anaesthesia and Intensive Care. 1 (5), 355-373 (1973).
- Cousins, M. J., Skowronski, G., Plummer, J. L.
- Schiffer, T. A., Christensen, M., Gustafsson, H., Palm, F. The effect of inactin on kidney mitochondrial function and production of reactive oxygen species. PLOS ONE. 13 (11), 0207728 (2018).
- Evans, R. G., et al. Chronic renal blood flow measurement in dogs by transit-time ultrasound flowmetry. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 38 (1), 33-39 (1997).
- Bell, T. D., DiBona, G. F., Biemiller, R., Brands, M. W. Continuously measured renal blood flow does not increase in diabetes if nitric oxide synthesis is blocked. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (5), 1449-1456 (2008).
