Summary
Il presente protocollo descrive una misurazione continua a lungo termine del flusso sanguigno renale in ratti coscienti e contemporaneamente la registrazione della pressione sanguigna con cateteri impiantati (riempiti di liquido o per telemetria).
Abstract
I reni svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi dei fluidi corporei. La regolazione del flusso sanguigno renale (RBF) è essenziale per le funzioni vitali di filtrazione e metabolismo nella funzione renale. Molti studi acuti sono stati condotti su animali anestetizzati per misurare la RBF in varie condizioni per determinare i meccanismi responsabili della regolazione della perfusione renale. Tuttavia, per ragioni tecniche, non è stato possibile misurare i RBF in modo continuo (24 ore al giorno) in ratti non anestetizzati non trattenuti per periodi prolungati. Questi metodi consentono la determinazione continua dei globuli rossi per molte settimane, registrando contemporaneamente la pressione sanguigna (BP) con cateteri impiantati (riempiti di liquido o mediante telemetria). Il monitoraggio RBF viene effettuato con ratti collocati in una gabbia circolare servocomandata che consente il movimento sfrenato del ratto durante lo studio. Allo stesso tempo, viene impedito l'aggrovigliamento dei cavi dalla sonda di flusso e dai cateteri arteriosi. I ratti vengono prima strumentati con un posizionamento di una sonda a flusso ultrasonico sull'arteria renale sinistra e un catetere arterioso impiantato nell'arteria femorale destra. Questi sono instradati per via sottocutanea alla nuca e collegati rispettivamente al flussometro e al trasduttore di pressione per misurare RBF e BP. Dopo l'impianto chirurgico, i ratti vengono immediatamente messi nella gabbia per recuperare per almeno una settimana e stabilizzare le registrazioni della sonda ad ultrasuoni. Anche la raccolta delle urine è fattibile in questo sistema. Le procedure chirurgiche e post-chirurgiche per il monitoraggio continuo sono dimostrate in questo protocollo.
Introduction
I reni sono solo lo 0,5% del peso corporeo ma ricchi di flusso sanguigno, ricevendo il 20% -25% della gittata cardiaca totale1. La regolazione del flusso sanguigno renale (RBF) è fondamentale per la funzione renale, il fluido corporeo e l'omeostasi elettrolitica. L'importanza della regolazione del flusso sanguigno per il rene è ben illustrata dal sostanziale aumento di RBF nel rene rimanente dopo nefrectomia unilaterale 2,3,4 e dalle riduzioni di RBF che si verificano nell'insufficienza renale 5,6,7. Se tali cambiamenti in RBF si verificano in risposta ad alterazioni della funzione renale o una diminuzione della funzione dovuta alla riduzione di RBF è stato difficile da accertare in animali anestetizzati preparati chirurgicamente o soggetti umani. Sono necessari studi temporali in cui gli eventi possono essere determinati prima e dopo un cambiamento definito e osservati nello stesso animale durante la progressione degli eventi. Negli studi sugli animali e sull'uomo, la RBF è stata stimata indirettamente dalla clearance dell'acido ippurico para-amminico (IPA)8,9,10 e in tempi più recenti da tecniche di imaging come ultrasuoni9,11,12, MRI4,13 e PET-CT 14,15 che forniscono utili immagini istantanee di ciascun rene e che possono seguire la progressione della malattia. È difficile valutare RBF in piccoli animali mediante ecografia o risonanza magnetica senza anestesia. È stato impossibile misurare continuamente RBF in condizioni coscienti nello stesso ratto per periodi prolungati.
Il presente protocollo, quindi, ha sviluppato tecniche che consentono misurazioni simultanee continue 24 ore al giorno di RBF, che è stato combinato con metodi di misurazione continua della pressione sanguigna per ratti che si muovono liberamente come descritto in precedenza 16,17,18,19,20,21 . Questa tecnologia consente la valutazione temporale di RBF in vari modelli di ratti per studiare le relazioni causa-effetto in vari disturbi renali in futuro.
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Protocol
Il protocollo è approvato dal Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Per gli esperimenti sono stati utilizzati ratti sensibili al sale di Dahl (maschi e femmine), ~ 8 settimane di età, 200-350 g.
1. Preparazione degli animali
- Installare un sistema di ingabbiamento della risposta al movimento per il ratto, un modulo di flusso perivascolare, una pompa a siringa, un dispositivo di registrazione e un software (vedi Tabella dei materiali) nella stanza degli animali.
- Metti i ratti nella gabbia per familiarizzare con l'ambiente, il cibo e il sistema idrico almeno la settimana prima dell'intervento. Digiunare i ratti dal giorno prima dell'intervento chirurgico perché un alto contenuto di stomaco può interferire con il posizionamento della sonda di flusso nell'arteria renale sinistra e può causare aspirazione tracheale.
- Collegare un tubo di poliuretano di 5 cm (diametro interno 0,30 mm e diametro esterno 0,64 mm) all'estremità dei 90 cm di tubo in poliuretano (diametro interno 0,64 mm e diametro esterno 1,02 mm) con cemento PVC per realizzare un catetere arterioso femorale (vedi tabella dei materiali).
- Sterilizzare i cateteri con uno sterilizzatore all'ossido di etilene, la sonda di flusso con glutaraldeide al 2,5% e gli strumenti chirurgici in autoclave a vapore. Pulire i tavoli chirurgici, la microscopia e le luci con ipoclorito di sodio all'1%.
2. Chirurgia
- Posizionare la sonda RBF seguendo i passaggi seguenti.
- Anestetizzare i ratti con isoflurano al 2,0%-2,5% nella misura in cui i ratti non rispondono allo stimolo del dolore. Posizionarlo sul lettino chirurgico fissato a 37 °C e iniettare 0,09 mg/kg di buprenorfina SR e 15 mg/kg di cefazolina (vedere Tabella dei materiali) prima dell'intervento.
- Rasare l'intero addome con un tagliacapelli elettrico e una regione sulla nuca intorno alle 7° vertebre cervicali dove il catetere e il flusso provano che i fili usciranno.
- Dopo la rasatura, pulire l'area con etanolo al 70%, al 10% di iodio povidone e di nuovo con etanolo al 70%.
- Metti il topo in posizione prona. Fai un taglio di 1 cm usando un bisturi sulla nuca e sul fianco sinistro. Quindi, eseguire una dissezione smussata con una pinza emostatica e liberare uno spazio sottocutaneo dall'incisione del fianco alla parte posteriore del collo.
- Passare la sonda di flusso attraverso questo tunnel sottocutaneo dal collo all'incisione del fianco con pinza emostatica.
- Metti il topo in posizione supina. Fare un'incisione addominale della linea mediana di 4-5 cm.
- Sezionare l'area intorno all'arteria renale con una pinzetta curva per esporre uno spazio sufficiente per posizionare la sonda di flusso (vedere Tabella dei materiali). Quindi perforare senza mezzi termini il muscolo lombare quadrato sinistro con la pinza emostatica e tirare la testa della sonda di flusso nella cavità addominale.
- Agganciare la punta della sonda di flusso all'arteria renale sinistra e collegarla al flussometro (vedere Tabella dei materiali). Aggiungi un po 'di gel intorno alla punta della sonda e il valore della portata apparirà sul flussometro.
NOTA: Anche se dipende dalle dimensioni del ratto, si osserverà un flusso di circa 3-5 ml/min in un ratto da 230 g. - Incollare la rete in fibra di poliestere attaccata alla sonda con adesivo tissutale alla parete addominale e tenere asciutta e incollata (~1-2 min). Una volta che il flusso è in posizione, scollegare la sonda di flusso dal flussometro e coprire l'addome con una garza imbevuta di soluzione salina e passare alla fase di inserimento del catetere.
- Inserire il catetere femorale seguendo i passaggi seguenti.
NOTA: il metodo per l'inserimento di un catetere riempito di liquido è lo stesso delle normali installazioni di telemetria. Sebbene sia preferibile la telemetria, il catetere arterioso consente il monitoraggio della pressione e il prelievo di sangue dal ratto cosciente.- In primo luogo, riempire il catetere con soluzione salina e bloccarlo con una pinza vascolare prima di eseguire un'incisione cutanea di 1 cm usando un bisturi sulla coscia sinistra per sezionare ed esporre l'arteria femorale. Mentre si blocca il flusso sul lato prossimale dell'arteria femorale con un filo, inserire il catetere.
- Sciacquare con una piccola quantità di soluzione salina, collegare con filo inossidabile di dimensioni appropriate e legare il catetere con un filo per fissarlo.
- Una volta che la legatura è legata attorno al catetere, creare un tunnel sottocutaneo utilizzando un trocar in acciaio inossidabile dalla coscia alla parte posteriore del collo per portare il catetere alla regione del collo. Fissalo con suture di seta 3-0 posizionate nel muscolo trapezio.
- Suturare la sonda.
- Ruotare il ratto in posizione prona e cucire l'anello circolare della sonda di flusso per via sottocutanea sul fianco. Suturare l'incisione sul fianco e sul collo con sutura chirurgica 4-0 (vedi Tabella dei materiali).
- Attaccare un pulsante di pelle alla sonda di flusso e suturarlo con seta 3-0 nella parte posteriore del collo.
- Collegare nuovamente la sonda di flusso al flussometro, riportare il ratto in posizione dorsale per controllare RBF e apportare le regolazioni finali della sonda di flusso per ottimizzare la sua posizione sull'arteria renale.
- Infine, suturare il muscolo con seta 3-0 e la pelle con sutura chirurgica 4-0.
3. Recupero dell'animale
- Dopo un'attenta osservazione, fino a quando i ratti non sono completamente recuperati dall'anestesia, riportare i ratti a un sistema di gabbia di risposta al movimento, collegare la sonda di flusso al misuratore di flusso sanguigno e consentire un periodo di recupero di circa una settimana per stabilizzare la sonda e la misurazione del flusso.
NOTA: la registrazione non deve essere eseguita durante questo periodo. - Infondere soluzione salina eparinizzata al 3% in modo continuo durante lo studio dal catetere arterioso alla velocità di 100 μL/h per prevenire la coagulazione.
- Quando il flusso si stabilizza dopo 5-6 giorni, impostare la calibrazione del flussometro per misurare il flusso sanguigno a 0-20 ml / min e iniziare la registrazione continua di RBF.
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Representative Results
Sono mostrati i dati sulla pressione arteriosa media (Figura 1A) e i dati sul flusso sanguigno (Figura 1B) di un ratto rappresentativo maschio di Dahl sensibile al sale. I ratti sensibili al sale di Dahl sono mantenuti in una colonia e allevati presso il Medical College of Wisconsin. L'intervento è stato eseguito all'età di 8 settimane e il peso corporeo era di 249 g al momento dell'intervento. I ratti sono stati nutriti con una dieta NaCl allo 0,4% e la dieta è stata cambiata in una dieta NaCl al 4% all'età di 10 settimane. Le misurazioni sono state continuate per 3 settimane con una dieta al 4% di NaCl e l'esperimento è stato interrotto a 13 settimane di età. I dati sono mostrati con una media al minuto. Una chiara differenza diurna è stata osservata nella pressione arteriosa media e nel flusso sanguigno. Mentre la pressione sanguigna aumenta con una dieta ricca di sale, il flusso sanguigno tende a diminuire piuttosto che aumentare, suggerendo una maggiore resistenza vascolare renale.
Figura 1: Dati rappresentativi della pressione arteriosa e del flusso sanguigno. La pressione arteriosa media (mm Hg) (A) e il flusso sanguigno renale (ml/min) (B) sono mostrati con una media minima. LS: dieta a basso contenuto di sale (0,4% NaCl), HS: dieta ad alto contenuto di sale (4% NaCl). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il presente protocollo descrive una tecnica che utilizza strumentazione disponibile in commercio per registrare RBF e pressione arteriosa in modo continuo per molte settimane. Inoltre, l'urina può essere raccolta utilizzando il dispositivo descritto al punto 1.1. Può anche essere utilizzato per valutare i metaboliti nelle urine e, quando viene impiantato un catetere arterioso, il prelievo di sangue per l'analisi.
Tradizionalmente, le misurazioni dei globuli rossi sono state ottenute in modo acuto in animali anestetizzati preparati chirurgicamente o stimate mediante clearance degli IPA. Tuttavia, è stato dimostrato che vari anestetici e chirurgia22,23 alterano il flusso sanguigno renale e la pressione arteriosa. Studi sull'uomo hanno riportato che l'isoflurano ha ridotto la clearance degli IPA da 476,8-243,3 ml/min e la clearance dell'inulina da 88,0 a 55,7 ml/min, rispettivamente8. Il tiobarbital è un anestetico ampiamente utilizzato per studi critici sui ratti. Tuttavia, è stato riferito che la produzionedi H 2 O2 nei mitocondri della corteccia renale aumenta di 90 minuti dopo l'anestesia con tiobarbital24, che potrebbe influenzare il flusso sanguigno. Le misurazioni in animali non anestetizzati e non stressati sarebbero di gran lunga preferibili per molti studi sperimentali. Il metodo di misurazione dei globuli rossi mediante l'impianto di una sonda di flusso è stato dimostrato nei cani25 e nei ratti26. Questo lavoro ha anche stabilito un modo per misurare RBF nei ratti in laboratorio.
L'applicazione delle tecniche descritte in questa presentazione può affrontare molte domande relative agli eventi sequenziali a seguito di un determinato stimolo. Il modello di ratto strumentato non anestetizzato consente la determinazione delle risposte immediate e croniche al farmaco e delle conseguenze a lungo termine di vari stimoli che possono verificarsi durante lo sviluppo dell'ipertensione.
L'intervento chirurgico comporta una perdita di sangue minima con tassi di sopravvivenza quasi del 100% con un po 'di allenamento. Le sonde di flusso possono essere riutilizzate dopo il lavaggio con detergente anionico contenuto in proteasi e la sterilizzazione dopo un esperimento di 4 settimane. Tuttavia, il rivestimento in plastica si deteriorerà gradualmente e, dopo diversi usi, richiederà una riparazione. Il pulsante della pelle nel prossimo in cui i cateteri escono rappresenta il problema potenziale più significativo in quanto è vulnerabile a infezioni, irritazioni e graffi se non accuratamente pulito e disinfettato. Tuttavia, se questo si allenta, può essere rapidamente riparato in anestesia.
Il passo critico della procedura è la chirurgia, e potrebbe richiedere un po 'di tempo per padroneggiare la tecnica. Tuttavia, una volta raggiunti, gli studi cronici non anestetizzati possono essere condotti in modo produttivo con problemi minimi. È possibile operare su ratti di 200-350 g indipendentemente dal ceppo o dal sesso. Sono possibili anche esperimenti su ratti di diverse dimensioni e animali utilizzando sonde di flusso di diverse dimensioni già preparate dai produttori.
Tuttavia, ci sono limitazioni e questioni specifiche a cui bisogna prestare attenzione. In primo luogo, la chirurgia deve essere condotta utilizzando strumenti sterilizzati, cateteri e sonde di flusso nella misura del possibile per ridurre al minimo le infezioni post-chirurgiche. In secondo luogo, poiché l'intervento chirurgico è esteso e richiede più di un'ora, è necessario fornire un periodo di recupero sufficientemente lungo prima di ottenere misurazioni di "controllo" per lo studio. Questo periodo nel nostro laboratorio si estende generalmente da 7-10 giorni. In terzo luogo, l'ileo (un'occlusione o paralisi dell'intestino) è stato un problema in alcuni casi che rappresenta una complicanza postoperatoria. Ciò può essere evitato evitando l'esposizione dell'intestino (ad esempio, tenere avvolto in una garza umida) durante la procedura ed evitando di chiudere l'incisione addominale fino a quando il legame non è stato ben asciugato. È essenziale evitare di esporre l'intestino all'arteria renale durante l'intervento chirurgico e assicurarsi che l'intestino non sia attorcigliato durante la sutura. In quarto luogo, si dovrebbe riconoscere che RBF aumenterà proporzionalmente con l'aumento del peso renale. Questo deve essere considerato negli studi in cui l'ipertrofia renale si verifica dopo la rimozione del rene controlaterale. In quinto luogo, abbiamo esperienza nella misurazione dei RBF solo per un mese e non abbiamo cercato di estendere le misurazioni oltre questo periodo. Dal momento che le cose hanno funzionato bene durante questo periodo in quasi tutti i casi, gli studi potrebbero probabilmente essere estesi molte settimane oltre. Infine, una breve parola sulle misurazioni parallele della pressione arteriosa: vengono utilizzati i cateteri impiantati riempiti di liquido con eparina diluita per mantenere la pervietà 24 ore al giorno e dispositivi di telemetria impiantati. Ognuno ha vantaggi e svantaggi a seconda del disegno sperimentale e delle esigenze. Ad esempio, il prelievo di sangue è possibile dal catetere arterioso se viene scelto il metodo del catetere e l'eparinizzazione non è richiesta per il metodo di telemetria. Tuttavia, entrambi ci sono serviti bene durante le misurazioni a lungo termine di RBF e BP.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni per la ricerca scientifica (P01 HL116264, RO1 HL137748). Gli autori desiderano ringraziare Theresa Kurth per i suoi consigli e l'aiuto nel mantenere l'ambiente sperimentale come responsabile del laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
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