Summary
본 프로토콜은 의식이있는 쥐에서 신장 혈류의 장기간 연속 측정과 동시에 이식 된 카테터 (유체 충전 또는 원격 측정)로 혈압을 기록하는 것을 설명합니다.
Abstract
신장은 체액의 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 신장 혈류 (RBF)의 조절은 신장 기능에서 여과 및 신진 대사의 중요한 기능에 필수적입니다. 신장 관류의 조절을 담당하는 메커니즘을 결정하기 위해 다양한 조건에서 RBF를 측정하기 위해 마취 된 동물에서 많은 급성 연구가 수행되었습니다. 그러나 기술적인 이유로 장기간 동안 억제되지 않은 마취되지 않은 쥐에서 RBF를 지속적으로(24시간/일) 측정하는 것은 불가능했습니다. 이러한 방법을 사용하면 몇 주에 걸쳐 RBF를 지속적으로 측정할 수 있으며 동시에 이식된 카테터(유체 충전 또는 원격 측정)로 혈압(BP)을 기록할 수 있습니다. RBF 모니터링은 연구 전반에 걸쳐 쥐의 억제되지 않은 움직임을 가능하게 하는 원형 서보 제어 쥐 케이지에 배치된 쥐와 함께 수행됩니다. 동시에 유동 프로브와 동맥 카테터의 케이블이 엉키는 것을 방지합니다. 쥐는 먼저 왼쪽 신장 동맥에 초음파 흐름 프로브를 배치하고 오른쪽 대퇴 동맥에 이식 된 동맥 카테터를 계측합니다. 이들은 목덜미에 피하로 라우팅되고 각각 유량계와 압력 변환기에 연결되어 RBF와 BP를 측정합니다. 외과 적 이식 후, 쥐는 즉시 케이지에 배치되어 적어도 1 주일 동안 회복하고 초음파 프로브 기록을 안정화시킵니다. 소변 수집도이 시스템에서 가능합니다. 지속적인 모니터링을 위한 수술 및 수술 후 절차가 이 프로토콜에서 입증됩니다.
Introduction
신장은 체중의 0.5 %에 불과하지만 혈류가 풍부하여 총 심 박출량의 20 % -25 %를받습니다1. 신장 혈류 (RBF)의 조절은 신장 기능, 체액 및 전해질 항상성의 핵심입니다. 신장에 대한 혈류 조절의 중요성은 일측 신장 절제술 2,3,4 후 나머지 신장에서 RBF의 실질적인 증가와 신부전 5,6,7에서 발생하는 RBF의 감소에 의해 잘 설명됩니다. RBF의 이러한 변화가 신장 기능의 변화에 반응하여 발생하는지 또는 RBF의 감소로 인한 기능의 감소가 마취된 외과적으로 준비된 동물 또는 인간 대상체에서 확인하기가 어려웠습니다. 사건이 정의 된 변화 전후에 결정되고 사건이 진행되는 동안 동일한 동물에서 관찰 될 수있는 시간적 연구가 필요합니다. 동물 및 인간 연구에서 RBF는 파라 아미노 히푸르산 (PAH)8,9,10의 제거에 의해 간접적으로 추정되었으며, 최근에는 초음파9,11,12, MRI4,13 및 PET-CT 14,15와 같은 이미징 기술에 의해 추정되었습니다. 각 신장의 유용한 스냅 샷 이미지를 제공하고 질병의 진행을 추적 할 수 있습니다. 마취없이 초음파 또는 MRI 스캔으로 작은 동물에서 RBF를 평가하는 것은 어렵습니다. 장기간에 걸쳐 동일한 쥐의 의식 조건에서 RBF를 지속적으로 측정하는 것은 불가능했습니다.
따라서, 본 프로토콜은 RBF의 동시 연속 24시간/일 측정을 가능하게 하는 기술을 개발했으며, 이는 이전에 기술된 바와 같이 자유롭게 움직이는 쥐를 위한 연속 혈압 측정 방법과 결합되었다 16,17,18,19,20,21 . 이 기술은 미래의 다양한 신장 질환에서 인과 관계를 연구하기 위해 쥐의 다양한 모델에서 RBF의 시간적 평가를 허용합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 위스콘신 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용의 승인을 받았습니다. 달염에 민감한 래트(수컷 및 암컷), ~8주령, 200-350g을 실험에 사용하였다.
1. 동물 준비
- 동물실에 쥐를 위한 움직임 반응 케이지 시스템, 혈관주위 흐름 모듈, 주사기 펌프, 기록 장치 및 소프트웨어( 재료 표 참조)를 설치합니다.
- 적어도 수술 일주일 전에 환경, 음식 및 수계에 익숙해 지도록 쥐를 새장에 넣으십시오. 높은 위 함량은 왼쪽 신장 동맥으로의 유동 프로브의 배치를 방해하고 기관 흡인을 유발할 수 있기 때문에 수술 전날부터 쥐를 빨리 먹습니다.
- 5cm의 폴리우레탄 튜빙(내경 0.30mm, 외경 0.64mm)을 90cm의 폴리우레탄 튜빙(내경 0.64mm, 외경 1.02mm)의 끝에 PVC 시멘트로 연결하여 대퇴 동맥 카테터를 만듭니다( 재료 표 참조).
- 에틸렌 옥사이드 멸균기로 카테터를, 2.5% 글루타르알데히드가 포함된 플로우 프로브를, 증기 오토클레이브에서 수술 기구를 멸균합니다. 수술대, 현미경 검사 및 조명을 1% 차아염소산나트륨으로 닦습니다.
2. 수술
- 아래 단계에 따라 RBF 프로브를 놓습니다.
- 쥐가 통증 자극에 반응하지 않는 정도까지 2.0%-2.5% 이소플루란으로 쥐를 마취합니다. 37°C로 설정된 수술대에 놓고 수술 전에 부프레노르핀 SR 0.09mg/kg과 세파졸린 15mg/kg( 재료 표 참조)을 주사합니다.
- 전기 클리퍼로 복부 전체를 면도하고 카테터와 흐름이 와이어가 빠져 나가는 7번째 자궁 경부 척추 주변의 목덜미 부위를 면도합니다.
- 면도 후 70 % 에탄올, 10 % 포비돈 요오드 및 70 % 에탄올로 해당 부위를 닦으십시오.
- 쥐를 경향이있는 위치에 놓습니다. 목덜미와 왼쪽 옆구리에 메스를 사용하여 1cm 자릅니다. 그런 다음 지혈 겸자로 둔기 해부를 수행하고 옆구리 절개에서 목 뒤쪽까지 피하 공간을 청소하십시오.
- 지혈 겸자로 목에서 옆구리 절개로이 피하 터널을 통해 흐름 프로브를 통과시킵니다.
- 쥐를 앙와위 자세에 놓습니다. 4-5cm 정중선 복부 절개를하십시오.
- 곡선 핀셋으로 신장 동맥 주변 영역을 해부하여 유동 프로브를 배치하기에 충분한 공간을 노출시킵니다( 재료 표 참조). 그런 다음 지혈 겸자로 왼쪽 사각 요추 근육을 뚫고 흐름 프로브의 머리를 복강 내로 당깁니다.
- 유량 프로브의 끝을 왼쪽 신장 동맥에 걸고 유량계에 연결합니다( 재료 표 참조). 프로브 팁 주위에 젤을 추가하면 유량 값이 유량계에 나타납니다.
알림: 쥐의 크기에 따라 다르지만 3g 쥐에서 약 5-230mL/분의 흐름이 관찰됩니다. - 복벽에 조직 접착제로 프로브에 부착 된 폴리 에스테르 섬유 메쉬를 붙이고 건조하고 접착 될 때까지 유지합니다 (~ 1-2 분). 흐름이 제자리에 있으면 유량계에서 유량 프로브를 분리하고 식염수에 적신 거즈로 복부를 덮고 카테터를 삽입하는 단계로 넘어갑니다.
- 아래 단계에 따라 대퇴 카테터를 삽입합니다.
참고: 유체로 채워진 카테터를 삽입하는 방법은 일반 원격 분석 설치와 동일합니다. 원격 측정이 선호되지만 동맥 카테터는 의식이 있는 쥐의 압력 모니터링 및 기간 혈액 샘플링을 가능하게 합니다.- 먼저 카테터를 식염수로 채우고 혈관 집게로 고정한 후 왼쪽 허벅지에 메스를 사용하여 1cm 피부 절개를하여 대퇴 동맥을 해부하고 노출시킵니다. 실로 대퇴 동맥의 근위부의 흐름을 차단하면서 카테터를 삽입하십시오.
- 소량의 식염수로 플러시하고 적절한 크기의 스테인리스 와이어로 꽂고 카테터를 실로 묶어 고정합니다.
- 합자가 카테터 주위에 묶이면 허벅지에서 목 뒤쪽까지 스테인리스 스틸 투관침을 사용하여 카테터를 목 부위로 가져와 피하 터널을 만듭니다. 승모근에 3-0 실크 봉합사로 고정하십시오.
- 프로브를 봉합하십시오.
- 쥐를 엎드린 위치로 돌리고 흐름 프로브의 원형 루프를 측면에서 피하로 꿰매십시오. 옆구리와 목의 절개 부위를 4-0 수술 봉합사로 봉합합니다 ( 재료 표 참조).
- 플로우 프로브에 스킨 버튼을 부착하고 목 뒤쪽에 3-0 실크로 봉합하십시오.
- 유량 프로브를 유량계에 다시 연결하고 쥐를 등쪽 위치로 되돌려 RBF를 확인하고 유량 프로브를 최종 조정하여 신장 동맥에서의 위치를 최적화합니다.
- 마지막으로 3-0 실크로 근육을 봉합하고 4-0 수술 봉합사로 피부를 봉합합니다.
3. 동물의 회복
- 주의 깊게 관찰 한 후, 쥐가 마취에서 완전히 회복 될 때까지, 쥐를 운동 반응 케이지 시스템으로 되돌리고, 유량 프로브를 혈류 측정기에 연결하고, 프로브 및 유량 측정을 안정화시키기 위해 약 일주일의 회복 기간을 허용한다.
참고: 이 기간 동안 녹음을 수행할 필요는 없습니다. - 응고를 방지하기 위해 동맥 카테터에서 연구 전반에 걸쳐 3% 헤파린화 식염수를 100μL/h의 속도로 지속적으로 주입합니다.
- 5-6일 후에 흐름이 안정되면 유량계 보정을 설정하여 0-20mL/min에서 혈류를 측정하고 RBF의 연속 기록을 시작합니다.
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Representative Results
대표적인 수컷 달 염에 민감한 쥐로부터의 평균 동맥압 데이터(도 1A) 및 혈류 데이터(도 1B)가 도시되어 있다. Dahl 소금에 민감한 쥐는 식민지에서 유지되며 위스콘신 의과 대학에서 사육됩니다. 수술은 8 주령에 이루어졌으며 수술 당시 체중은 249g이었습니다. 쥐에게 0.4% NaCl 식단을 공급하고 10주령에 4% NaCl 식단으로 식단을 변경했습니다. 측정은 4% NaCl 식이에서 3주 동안 계속되었고, 실험은 13주령에 종료되었다. 데이터는 분 평균으로 표시됩니다. 평균 동맥압과 혈류에서 명확한 일주 차이가 관찰되었습니다. 고염분 식단으로 혈압이 상승하는 반면, 혈류는 증가하기보다는 감소하는 경향이 있어 신장 혈관 저항이 증가함을 시사합니다.
그림 1: 대표적인 동맥압 및 혈류 데이터. 평균 동맥압 (mmHg) (A) 및 신장 혈류 (mL / min) (B)는 분 평균으로 표시됩니다. LS : 저염 (0.4 % NaCl) 다이어트, HS : 고 염 (4 % NaCl) 다이어트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 프로토콜은 RBF 및 동맥압을 수주에 걸쳐 연속적으로 기록하기 위해 상업적으로 이용가능한 계측기를 이용하는 기술을 기술한다. 또한 단계 1.1에 설명 된 장치를 사용하여 소변을 수집 할 수 있습니다. 또한 소변의 대사 산물을 평가하고 동맥 카테터를 이식 할 때 분석을 위해 혈액 샘플링을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
전통적으로, RBF 측정은 외과적으로 준비된 마취된 동물에서 급성으로 얻어지거나 PAH 클리어런스에 의해 추정되었다. 그러나 다양한 마취제와 수술22,23이 신장 혈류와 동맥압을 변화시키는 것으로 나타났습니다. 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 이소플루란은 PAH 청소율을 각각 476.8-243.3mL/분으로, 이눌린 청소율을 88.0-55.7mL/분으로 감소시켰습니다8. 티오바르비탈은 쥐에 대한 비판적 연구에 널리 사용되는 마취제입니다. 그럼에도 불구하고 신장 피질의 미토콘드리아에서 H 2 O2생성은 혈류에 영향을 줄 수있는 티오바르비탈24로 마취 후 90 분 후에 증가한다고보고되었습니다. 마취되지 않고 스트레스를받지 않은 동물에서의 측정은 많은 실험 연구에서 훨씬 바람직 할 것입니다. 유동 프로브를 이식하여 RBF를 측정하는 방법은 개25 및 래트26에서 입증되었습니다. 이 연구는 또한 실험실에서 쥐의 RBF를 측정하는 방법을 확립했습니다.
이 프레젠테이션에 설명된 기술을 적용하면 주어진 자극에 따른 순차적 이벤트와 관련된 많은 질문을 해결할 수 있습니다. 마취되지 않은 계측 쥐 모델은 약물에 대한 즉각적이고 만성적 인 반응과 고혈압 발병 중에 발생할 수있는 다양한 자극의 장기적인 결과를 결정할 수있게합니다.
수술은 약간의 훈련을 통해 거의 100 %의 생존율로 최소한의 혈액 손실을 포함합니다. 플로우 프로브는 프로테아제가 함유된 음이온성 세제로 세척하고 4주간의 실험 후 살균한 후 재사용할 수 있습니다. 그러나 플라스틱 코팅은 점차 열화되고 여러 번 사용한 후에는 수리가 필요합니다. 카테터가 나오는 다음 피부 버튼은 조심스럽게 세척하고 소독하지 않으면 감염, 자극 및 긁힘에 취약하기 때문에 가장 심각한 잠재적 문제를 나타냅니다. 그러나 이것이 느슨해지면 마취하에 신속하게 수리 할 수 있습니다.
절차의 중요한 단계는 수술이며 기술을 습득하는 데 시간이 걸릴 수 있습니다. 그러나 일단 달성되면 마취되지 않은 만성 연구를 최소한의 문제로 생산적으로 수행 할 수 있습니다. 균주 또는 성별에 관계없이 200-350g의 쥐를 수술하는 것이 가능합니다. 다양한 크기와 동물의 쥐에 대한 실험은 제조업체가 이미 준비한 다양한 크기의 흐름 프로브를 사용하여 가능합니다.
그러나 주의해야 할 한계와 특정 문제가 있습니다. 첫째, 수술 후 감염을 최소화하기 위해 가능한 한 멸균 된 도구, 카테터 및 흐름 프로브를 사용하여 수술을 수행해야합니다. 둘째, 수술이 광범위하고 한 시간 이상이 필요하기 때문에 연구를 위한 "대조" 측정을 얻기 전에 충분히 긴 회복 기간을 제공해야 합니다. 우리 실험실의이 기간은 일반적으로 7-10 일입니다. 셋째, 장폐색 (장의 폐색 또는 마비)은 수술 후 합병증을 나타내는 경우에 따라 문제가되었습니다. 이것은 시술 중 장의 노출을 피하고 (예 : 축축한 거즈로 싸서 유지) 결합이 잘 건조 될 때까지 복부 절개를 닫지 않음으로써 예방할 수 있습니다. 수술 중 장이 신장 동맥에 노출되는 것을 피하고 봉합 시 장이 뒤틀리지 않도록 하는 것이 중요합니다. 넷째, RBF는 신장 체중 증가에 비례하여 증가 할 것임을 인식해야합니다. 이것은 반대쪽 신장 제거 후 신장 비대가 발생하는 연구에서 고려되어야합니다. 다섯째, 우리는 최대 한 달 동안 RBF를 측정 한 경험이 있으며이 기간 이상으로 측정을 연장하려고 시도하지 않았습니다. 거의 모든 경우에 이 기간 동안 일이 잘 작동했기 때문에 연구는 몇 주 이상 연장될 수 있었습니다. 마지막으로, 평행 동맥압 측정에 대한 간략한 설명: 24시간/일 개통성을 유지하기 위해 희석된 헤파린이 주입된 유체 충전 카테터와 이식된 원격 측정 장치가 사용됩니다. 각각은 실험 설계 및 필요에 따라 장단점이 있습니다. 예를 들어, 카테터 방법을 선택하면 동맥 카테터에서 혈액 샘플링이 가능하며 원격 측정 방법에는 헤파린 화가 필요하지 않습니다. 그러나 둘 다 RBF와 BP의 장기 측정 중에 우리에게 도움이 되었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 과학 연구 보조금(P01 HL116264, RO1 HL137748)의 지원을 받았습니다. 저자는 실험실 관리자로서 실험 환경을 유지하는 데 도움이 된 Theresa Kurth의 조언과 도움에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
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