Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לשימוש לבחינת חמצון מצע על ידי מעקב אחר ייצור 14CO2 במבחנה.
Abstract
המיטוכונדריה מארחת את המכונות למחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) ולשרשרת הובלת האלקטרונים (ETC), המייצרות אדנוזין טריפוספט (ATP) כדי לשמור על הומאוסטזיס של אנרגיה. גלוקוז, חומצות שומן וחומצות אמינו הם מצעי האנרגיה העיקריים המניעים את הנשימה המיטוכונדרית ברוב התאים הסומאטיים. עדויות מראות שלסוגי תאים שונים עשויה להיות העדפה מובהקת למצעים מסוימים. עם זאת, ניצול המצע על ידי תאים שונים בשלד לא נחקר בפירוט. יתר על כן, מכיוון שמטבוליזם תאי מכוון לשינויים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים, הערכות ישירות של תלות במצע בתאי השלד עשויות לספק תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות עצם.
הפרוטוקול הבא מבוסס על העיקרון של שחרור פחמן דו חמצני ממולקולות מצע לאחר זרחון חמצוני. על ידי שימוש במצעים המכילים אטומי פחמן המסומנים באופן רדיואקטיבי (14C), השיטה מספקת בדיקה רגישה וקלה לשימוש לקצב חמצון המצע בתרבית תאים. מקרה בוחן עם פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMMs) מדגים ניצול שונה של המצעים העיקריים בין שני סוגי התאים.
Introduction
זרחון חמצוני (OXPHOS) באאוקריוטים הוא התהליך שבו חומרי מזון מתפרקים בתוך המיטוכונדריה כדי לשחרר אנרגיה כימית בצורה של ATP באמצעות צריכת חמצן. קטבוליזם של מצעים שונים בתוך המיטוכונדריה באמצעות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA) מייצר מעט מולקולות ATP ישירות, אלא מאחסן אנרגיה באמצעות הפחתה של נושאי האלקטרונים ניקוטיןמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD+) ופלווין אדנין דינוקלאוטיד (FAD+). לאחר מכן הנשאים המופחתים מתחמצנים על ידי ETC הממוקם על הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה כדי ליצור שיפוע ריכוז פרוטונים על פני הממברנה. הפרוטונים זורמים בסופו של דבר במורד השיפוע שלהם בחזרה לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית דרך ATP synthase כדי לייצר ATP. OXPHOS הוא האמצעי היעיל ביותר לייצור ATP מצעי אנרגיה ומועדף בדרך כלל בסביבות אירוביות. בעבר, גליקוליזה אירובית - ייצור של לקטט מגלוקוז בזמן שיש חמצן - נחשבה לפתופיזיולוגית, לעתים קרובות סימן היכר של תאים סרטניים. יותר ויותר, מתגלה כי כמה סוגי תאים נורמליים משתמשים בגליקוליזה אירובית מסיבות שעדיין לא פוענחו במלואן.
גמישות מטבולית היא היכולת של תאים או אורגניזמים להסתגל לדרישות האנרגיה המשתנות ולמקורות הדלק הזמינים. לדוגמה, הביקוש האנרגטי של שרירי השלד נענה בעיקר על ידי OXPHOS במצב יציב אך על ידי גליקוליזה אנאירובית במהלך תרגיל בעצימות גבוהה1. ככל שמשך הפעילות הגופנית גדל, חמצון הגלוקוז וחומצות השומן תורמים יותר לייצור האנרגיה הכולל2. עם זאת, השימוש במצע אינו תלוי רק בזמינות, שכן מצעים מתחרים באופן אנטגוניסטי במהלך חמצון. בעיקר, חמצון חומצות שומן הוכח כמעכב את ניצול הגלוקוז על ידי שרירי השלד בתופעה הידועה בשם אפקט רנדל3. השפעה הדדית הודגמה על ידי מחקרים מאוחרים יותר 4,5. בנוסף, מחלות רבות קשורות לשינוי בהעדפת המצע ולהתפתחות של חוסר גמישות מטבולית בתאים. לדוגמה, חמצון חומצות שומן מופחת בשריר השלד של חולי סוכרת מסוג II בהשוואה לנבדקי ביקורת רגילים6. השינויים המטבוליים בהגדרות המחלה הם נושא לחקירה אינטנסיבית מכיוון שהם עשויים לתרום לפתוגנזה.
חילוף החומרים האנרגטי בסוגי תאי השלד הוא יחסית לא מובן מאליו, אך זכה לתשומת לב בשנים האחרונות7. עבודות קודמות הראו כי גליקוליזה אירובית היא מסלול האנרגיה הדומיננטי באוסטאובלסטים קלבריאליים, בעוד שחמצון גלוקוז באמצעות מחזור TCA ממלא תפקיד בהיווצרות אוסטאוקלסט 8,9. אחרים סיפקו ראיות לחומצות שומן כמקור אנרגיה לאוסטאובלסטים10. כמו כן, הוכח כי קטבוליזם של גלוטמין תומך בהתמיינות אוסטאובלסט מאבותאבותיהם 11,12. עם זאת, עדיין חסרה הבנה מקיפה של שימוש במצע על ידי סוגי תאי שלד שונים. בנוסף, שינויים בחילוף החומרים התאי במהלך התמיינות תאים או בתגובה לאותות פתולוגיים צפויים לשנות את ניצול מצע הדלק. להלן פרוטוקול קל לשימוש לבדיקת חמצון מצע במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש בחומרים רדיואקטיביים (RAM) דורש אישור מראש של ועדת בטיחות ייעודית בכל מוסד. RAMs המשמשים בפרוטוקול זה אושרו על ידי בריאות ובטיחות קרינה סביבתית (EHRS) באוניברסיטת פנסילבניה. השימוש בבעלי חיים דורש אישור מראש של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במוסד הביתי. המחקר הבא אושר על ידי IACUC בבית החולים לילדים בפילדלפיה.
1. הכנת פתרונות מלאי ל-14מצעים עם תווית C
- הכינו תמיסת מלאי אלבומין בסרום בקר (BSA) של 4 מ"מ על ידי ערבוב של 11 גרם BSA ו-33.1 מ"ל של מי מלח עם מאגר פוספט (DPBS) של Dulbecco וניעורו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך כ-3 שעות עד להמסת BSA במלואה. מחממים את תמיסת המלאי של BSA באמבט מים בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- 50 μCi יבש באוויר 14C-oleate (50 μCi/μmol באתנול) בבקבוקון עם המכסה כבוי במשך 8 שעות במכסה מנוע עבודה ייעודי של זיכרון RAM. מוסיפים 312.5 μL של H2O ולאחר מכן 3.5 מ"ג (11.5 מיקרומול) של נתרן oleate. מערבבים היטב.
- מחממים את התמיסה המתקבלת ל-70 מעלות צלזיוס באמבטיית מים. הוסף 0.9375 מ"ל של תמיסת המניות BSA שתוכננה מראש כדי להניב תמיסת מלאי אולט חם של 10 mM (המכילה יחס של 1:11.5 של 14C-oleate לאולט ללא תווית). Aliquot את פתרון המלאי ולאחסן אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
- יש להשתמש ב-14C-גלוקוז וב-14C-גלוטמין מיד לאחר ההפשרה.
2. הכנת תווך המכיל 14מצעים המסומנים ב-C
הערה: כדי להבטיח ריכוזים אמינים של מצעי אנרגיה במדיה, יש להשתמש במדיה מותאמת אישית עם מצעים טריים שנוספו זמן קצר לפני השימוש. כאן נעשה שימוש במדיום חיוני מינימלי מותאם אישית (MEMα) ללא גלוקוז, פירובט, גלוטמין, פנול אדום או נתרן ביקרבונט. עם זאת, יש לקבוע תווך אופטימלי עבור כל סוג תא.
- שחזרו 8.67 גרם של האבקה הבינונית ב-1 ליטר של מים מטוהרים. הוסף 2.2 גרם של נתרן ביקרבונט כדי להשיג pH של 7.4 ולסנן את התמיסה באמצעות סינון ואקום 0.22 מיקרומטר.
- הוסיפו מרכיבים טריים כדי להשיג את המדיום השלם (cMEMα) עם ריכוזים סופיים של 5.5 mM גלוקוז, 2 mM גלוטמין, 1 mM פירובט ו-10% סרום בקר עוברי (FBS). תוספים נוספים ל-cMEMα עם 100 mM L-קרניטין ו-10 מיקרומטר HEPES כדי להקל על חמצון חומצות השומן.
- מיד לפני השימוש, הוסיפו 14מצעים עם תווית C ל-cMEMα שהוכן לאחרונה כדי ליצור מדיה חמה. כדי להפוך את המדיום החם של האולאט, הוסף את תמיסת האולאט החם של 10 מ"מ ל-cMEMα לריכוז סופי של 100 μM oleate (דילול 1:100, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).
הערה: מלאי האולאט החם של 10 mM המכיל יחס של 1:11.5 של אולט חם:קר (ראה שלב 1.3) משמש להשגת רמה פיזיולוגית של 100 μM סה"כ אולאט במדיה תוך מזעור כמות החומר הרדיואקטיבי. - הפוך 10 mM מלאי oleate ללא תווית על ידי הוספת 24.36 מ"ג של נתרן oleate ל 2 מ"ל של H2O באמבט מים ב 70 °C ב 70 ° C במשך ~ 20 דקות עד מומס לחלוטין לפני ערבוב במהירות עם 6 מ"ל של 4 mM BSA תמיסת מלאי מתוכנן מראש ל 70 ° C. מעבירים לאמבטיית מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ומסננים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח.
- כדי להפוך את הגלוקוז לבינוני חם, הוסיפו 14C-גלוקוז לריכוז סופי של 1.333 μM (1:4,125 דילול, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL). כדי להפוך את הגלוטמין לבינוני חם, הוסיפו 14C-גלוטמין לריכוז הסופי של 2 מיקרומטר (1:1,000 דילול, רדיואקטיביות סופית 0.4 μCi/mL).
- השלימו את מדיום הגלוקוז והגלוטמין החם בתמיסת מלאי של 10 מ"מ של אולאט ללא תווית משלב 2.4 כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 μM oleate, זהה לזה שבמדיום החם של האולאט.
3. הכנת תאים
הערה: פראוסטאובלסטים קלבריים ומקרופאגים של מח עצם משמשים כדוגמאות כאן. המשתמשים צריכים להכין את סוג התא שלהם לפי הפרוטוקולים המתאימים. מטב את הריכוז של קולגן II שישמש לעיכול בניסויי פיילוט מכיוון שהפעילות האנזימטית עשויה להשתנות בין הרבה דברים שונים.
- בידוד ותרבות של פראוסטאובלסטים קלבריאליים
- הקרב את הגורים לאחר הלידה 3-5 (P3-5) על ידי עריפת ראשים והעבר אותם ל-DPBS קר כקרח המכיל פניצילין-סטרפטומיצין (P/S).
- חשוף את הקלבריה על ידי הסרת העור והרקמות הרכות. אסוף את האזור האמצעי על-ידי חיתוך הרקמות הסובבות מאחורה לחזית ב-DPBS (איור 1A). מגרדים את המשטחים הפנימיים והחיצוניים של הקלבריה בעדינות באמצעות פינצטה כדי לסייע בשחרור התאים בעת העיכול הבא.
- מכינים תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-4 מ"ג/מ"ל של קולגן מסוג II ב-DPBS ומסננים כל תמיסה עם מסנן טרי של 0.22 מיקרומטר. מעכלים תחילה את הקלבריה המנוקה עם תמיסת הקולגן של 2 מ"ג/מ"ל למשך 15 דקות ומשליכים את תמיסת העיכול. לעכל את הדגימות המנוקות בתמיסת קולגן 4 מ"ג/מ"ל 3 פעמים במשך 15 דקות בכל פעם, תוך איגום וחיסכון בתמיסת העיכול.
- סנן את תמיסת העיכול דרך מסנני תאים של 70 מיקרומטר וצנטריפוגה של הסכל ב-300 × גרם למשך 5 דקות. החייאת גלולת התא ב-cMEMα (ראה שלב 2.2) המכילה 10% FBS ו-P/S.
- לספור ולזרוע את התאים ב 4 × 104 תאים / ס"מ2 ב 10 ס"מ צלחות. תרבית את התאים באינקובטור 37 °C עם 5% CO2 במשך 3 ימים.
- נתקו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין-EDTA. ספרו וזרעו את התאים בצלחות תרבית תאים של 24 בארות עם cMEMα המכילות 10% FBS ו-P/S ב-7.5 × 105/ס"מ2. זרעו לפחות 4 בארות לכל סוג תא לכל מצע ולפחות שלוש בארות נוספות עבור כל סוג תא לספירת תאים לפני הבדיקה.
- תרברו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה לפני בדיקות חמצון המצע.
- בידוד ותרבות של BMMs
הערה: תרבית של BMMs דורשת גורם מגרה מושבה מקרופאגים (M-CSF), אשר ניתן לרכוש באופן מסחרי כחלבון רקומביננטי. מדיום מותנה מקו התא CMG14-12 שהונדס כדי לבטא M-CSF הוא חלופה חסכונית המשמשת כאן13.- אספו עצם הירך והטיביות מעכברים בני 8 שבועות לאחר הסרת השרירים ורקמות החיבור. חותכים ומשליכים את שני קצות העצמות במספריים חדים.
- שטפו את מח העצם מעצם הירך אחת וטיביה אחת לתוך צלחת פטרי בגודל 10 ס"מ עם מזרק המצויד במחט 23 גרם המכילה 15 מ"ל של cMEMα עם 10% FBS, P/S, ו-10% CMG14-12 בינוני מותנה (BMM בינוני). תרבית את התאים בצלחת פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- לאחר 3 ימים, יש להשליך את מדיית התרבות ולשטוף עם DPBS. נתקו את התאים המחוברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 0.25% טריפסין-EDTA למשך 5 דקות. צנטריפוגה והחזרת גלולת התא בתווך BMM.
- לספור ולזרוע את התאים בלוחות תרבית תאים של 24 בארות ב-7.5 × 105/ס"מ2 באותו אופן שתואר ב-3.1.6. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס לילה במדיום BMM לפני תחילת הבדיקות.
4. בדיקת חמצון מצע עם מלכודת CO2
הערה: יש לקבוע צפיפות זריעה מתאימה עבור כל סוג תא כדי להשיג מפגש של 80-90% לפני תחילת הבדיקה. שים לב שצפיפות התאים יכולה להשפיע על המצב המטבולי של התאים.
- שטפו את התאים בבארות הנוספות פעמיים באמצעות DPBS. נתקו את התאים עם 0.25% טריפסין-EDTA ותאי תערובת של 20 μL שעברו החייאה ב-DPBS עם 20 μL של תמיסת צבע מסחרית מוכנה לשימוש של 20 מיקרול'ידין כתום/פרופידיום יודיד (AO/PI). קבע את מספר התאים החיים באמצעות מונה תאים אוטומטי ורשום את המספר לחישובים סופיים.
- לשטוף את התאים בבארות הבדיקה פעמיים עם DPBS. הוסיפו 500 μL של מדיום חם לכל בדיקה היטב במכסה התרביות המיועד ל-RAM. אטמו את הצלחות בפרפילם ודגרו את התאים באינקובטור המיועד ל-RAM ב-37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
- במהלך הדגירה, חותכים את נייר הסינון לחתיכות עגולות מעט גדולות יותר מהשטח שבתוך המכסה של צינורות מיקרו-צנטריפוג' של 1.5 מ"ל ומכניסים את הנייר בנוחות לתוך המכסה (איור 1B). הוסיפו 200 μL של 1 M חומצה פרכלורית לכל צינור ו-20 μL של נתרן הידרוקסיד לנייר הסינון המותקן בתוך המכסה.
- לאחר הדגירה של התאים, מעבירים 400 μL של מדיום תרבית מכל באר לצינורות המוכנים וסוגרים את הכובעים מיד. השאירו את הצינורות במדף צינורות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- במהלך הדגירה, קבעו בקבוקון סקינטילציה לכל צינור ומלאו אותו ב-4 מ"ל של נוזל ציצית. מעבירים כל פיסת נייר סינון לבקבוקון חרטום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- בצע בדיקות מגבונים על מכסה המנוע של תרבית הרקמה, אמבט המים (המשמש להכנת 14C-oleate), מקרר, אינקובטור, כיור, קרקע וכל אזור עבודה אחר לזיהום זיכרון RAM פוטנציאלי. מכניסים את מגבוני הנייר לבקבוקוני סקינטילציה המכילים נוזל סקינטילציה.
- מדוד רדיואקטיביות של 14C בבקבוקוני ה-scintillation באמצעות מונה נצנוץ. הקלט את תוצאות הקריאה. נטרל את סביבת העבודה בהתאם להנחיות בטיחות הקרינה במידת הצורך.
5. ניתוח נתונים
הערה: בהנחה שכל מצע מחומצן באופן מלא כדי לשחרר CO2, ניתן לחשב את קצב חמצון המצע מהרדיואקטיביות CO2 הלכודה.
- חישוב קצב חמצון המצע באמצעות Eq (1) וערכי X, Y ו-Z המופיעים בטבלה 1 עבור מצעים שונים.
קצב חמצון המצע (μmol/cell/h) =
(1)- חשב היטב את סך ההתפוררות לדקה (DPM) עבור כל תגובה. עבור X, השתמש בערך DPM (קריאת מונה נצנוץ) מ-0.4 מ"ל של מדיום התגובה המשמש ללכידת CO2 מתוך 0.5 מ"ל של מדיום התגובה הכולל. לכן, ה-DPM הכולל מכל תגובה היטב הוא X × 1.25.
- חלקו את ה-DPM הכולל בפקטור של 2,220,000 כדי להמיר ל-μCi.
- המרת הרדיואקטיביות ב-μCi למספר של 14מולקולות המסומנות ב-C. חלק את ערך μCi בפעילות הספציפית (Y) של כל מצע מסומן. השתמש בערכי Y הבאים (טבלה 1): 14C-גלוקוז: 300 mCi/mmol; 14 C-גלוטמין: 200 mCi/mmol; 14 C-oleate: 50 mCi/mmol.
- חשב את המספר הכולל של מולקולות מחומצנות מ-14המולקולות המחומצונות המסומנות כ-C על-ידי הכפלת האחרונה בגורם הדילול החם לסך הכל (Z). השתמש בערכי Z הבאים (טבלה 1): גלוקוז: 4,125; גלוטמין: 1,000; oleate: 12.5.
- חלקו את המכפלה המתקבלת במספר תא (cell#) וב-4 (עבור זמן התגובה של 4 שעות) כדי לקבוע את קצב חמצון המצע לכל תא. השתמש בתא# שנקבע בבארות המקבילות בתחילת הבדיקה.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדוגמה זו, שיטת לכידת CO2 משמשת להשוואת חמצון המצע על ידי פראוסטאובלסטים ראשוניים לעומת BMMs, המשמשים לעתים קרובות עבור אוסטאובלסט במבחנה או התמיינות אוסטאוקלסט או אוסטאוקלסט, בהתאמה. לאחר שהתאים הראשוניים מועברים ומתרבית ב-cMEMα במהלך הלילה, הם בדרך כלל מגיעים ל-80-90% מהמפגש ומציגים את המורפולוגיה האופיינית להם. הקדם-אובלסטים הקלבריים גדולים משמעותית מ-BMMs (איור 2). כל סוג של תא נתון לבדיקות חמצון עבור גלוקוז, גלוטמין ואולאט על ידי ביצוע שלבים 4.1 עד 4.7. התוצאות מנותחות באמצעות Eq (1).
התוצאות מראות שקצב החמצון של כל מצע גבוה משמעותית בפרה-אוסטאובלסטים קלבריים מאשר ב-BMMs, מה שככל הנראה מצביע על ייצור אנרגיה גדול יותר על-ידי OXPHOS בפרה-אוסטאובלסטים (איור 3). מחקרים קודמים עם טכנולוגיית סוסון ים הראו כי OXPHOS אחראי לכ-60% מייצור ה-ATP בפרה-אוסטאובלסטים, אך יורד באופן משמעותי באוסטאובלסטים בוגרים, שבהם הגליקוליזה האירובית אחראית לכ-80% מהאנרגיה9. התוצאות הנוכחיות מראות כי כל שלושת המצעים העיקריים תורמים ל-OXPHOS בפראוסטאובלסטים. עם זאת, יש צורך בחקירה נוספת כדי לקבוע אם ניצול של אחד או כל המצעים מצטמצם באוסטאובלסטים הבוגרים.
איור 1: דיאגרמות עבור בדיקת לכידת CO2 וכריתת קלבריה. (A) האזור האמצעי של הקלבריה, המסומן על ידי המשולש המקווקו הכתום, נקטף עבור איזולטון תאים. (B) צינורות מיקרו-סנטריפוג' של 1.5 מ"ל משמשים ללכידת CO2 (שלב 1). ניירות סינון (נייר כחול להמחשה) נחתכים כך שיתאימו למכסי צינורות (שלב 2). הוסיפו 200 μL של 1 M חומצה פרכלורית ל-400 μL של מדיה חמה מתרבית התאים בכל צינור ו-20 μL של NaOH לנייר הסינון (שלב 3) לפני סגירת המכסה (שלב 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: מורפולוגיה אופיינית של BMMs ושל פראוסטובלסטים מעגליים. (A, B) תמונות מייצגות בהגדלה נמוכה יותר. (ג, ד) תמונות מייצגות בהגדלה גבוהה יותר. סרגלי קנה מידה = 400 מיקרומטר (A, B), 100 מיקרומטר (C, D). קיצורים: BMMs = מקרופאגים שמקורם במח עצם; preOBs = preosteoblasts. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: קצבי חמצון המצע בפראוסטאובלסטים של העגל וב-BMMs. (A) גלוקוז. (B) גלוטמין. (ג) אולט. החישובים מניחים שכל מולקולת מצע מחומצנת לחלוטין. קיצורים: BMM = מקרופאג' שמקורו במח עצם; preOB = preosteoblast. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| המצע | רדיואקטיביות (X) | פעילות ספציפית (Y), mCi/mmol | גורם דילול (Z) |
| גלוקוז | DPM1 | 300 | 4,125 |
| גלוטמין | DPM2 | 200 | 1,000 |
| Oleate | DPM3 | 50 | 12.5 |
טבלה 1: פרמטרים המשמשים בניתוח נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול מספק שיטה קלה לשימוש לקביעת קצב החמצון של מצעי אנרגיה עיקריים. זוהי חלופה פשוטה יותר לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בצלוחיות המכילות באר מרכזית ומכוסות בפקקי גומי 14,15,16. למרות שהמחקר לדוגמה כאן מבוצע עם תרבית תאים, ניתן להתאים את השיטה בקלות לגולשי רקמות או להומוגנטים של רקמות המכילים מיטוכונדריה שלמה, כפי שתואר קודם לכן17.
כמה צעדים מרכזיים שיש לקחת בחשבון בפרוטוקול זה כוללים את הכנת הריאגנטים ואת ההגדרה של הצינורות עבור 14 CO2 השמנה. הבטחת הצמדה מתאימה של אולאט ל-BSA היא חיונית כדי למנוע מחומצות שומן חופשיות (FFAs) לפגוע בקרום התא ולאפשר ספיגה יעילה של התא לצורך חילוף החומרים. דגירה של תמיסת BSA מספיק זמן לפירוק מלא, שכן דגירות ארוכות עם BSA ב-70 מעלות צלזיוס מובילות להתמצקות בלתי הפיכה.
cMEMα טרי חייב להיעשות עבור כל מערך ניסוי בשל זמן מחצית החיים הקצר של מצעים כגון L-גלוטמין. לבסוף, נייר הסינון צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים היטב לכובע כדי למנוע קריאות שגויות. נפילה מקרית של נייר המסנן לתוך נוזל התגובה תוביל לערכי DPM גבוהים באופן חריג, אותם יש להשמיט מניתוח נוסף. ניתן להגדיר ארבע עד חמש בארות משוכפלות במקרה של זיהום פוטנציאלי. אם ערכי ה- DPM הסופיים נמוכים מדי, לדוגמה, פחות מ- 100, הגדלת כמות המצע הרדיואקטיבי או זמן הדגירה יכולה להיות מועילה.
ישנן אזהרות לשימוש באולאט כמצע הפונדקאי לחמצון חומצות שומן. Oleate היא חומצת השומן החד-בלתי רוויה וארוכת השרשרת הנפוצה ביותר המהווה 32% מכלל חומצות השומן במחזור הדם וברקמות. עם זאת, חומצות שומן ארוכות שרשרת אחרות, כגון פלמיטט (28%) ולינולאט (14%), הן גם מצעים עיקריים ב-vivo 18,19. לכן, תוספת של תרביות התאים עם oleate לבדה עשויה שלא לשקף במדויק את קצב החמצון של חומצות שומן כאשר גם מינים אחרים נמצאים. בעת ביצוע הבדיקה, ניתן להפיג חשש זה על ידי הכללת אותן חומצות שומן אחרות בתקשורת התרבות.
יש לציין כי חילוף החומרים בתאים תלוי הקשר מאוד ויכול להפגין פלסטיות רבה בהתאם לזמינות המצע ולמתח החמצן, בין היתר. לכן חשוב להעריך תוצאות במבחנה בהקשר של מצבים פיזיולוגיים. עם זאת, ברור יותר ויותר כי תאים נוטים לשמור לפחות על היבטים מסוימים של המאפיינים המטבוליים שלהם במבחנה, ככל הנראה בשל התכנות המטבולי והזיכרון הספציפיים לתא. לפיכך, שיטות פשוטות במבחנה , כמו זו, מציעות כלי חשוב להשגת תובנות לא רק על המגוון המטבולי בין סוגי התאים, אלא גם על חוסר ויסות פוטנציאלי בתנאי המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.
Acknowledgments
העבודה נתמכה בחלקה על ידי מענק NIH R01 AR060456 (FL). אנו מודים לד"ר מייקל רובינסון ואליזבת קריזמן (בית החולים לילדים של פילדלפיה) על עזרתם הנדיבה במונה ההברקה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
References
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
