Summary
Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere le fasi microchirurgiche necessarie per eseguire un trapianto laringeo eterotopico nei topi. I vantaggi di questo modello murino rispetto ad altri modelli animali di trapianto laringeo sono il suo rapporto costo-efficacia e la disponibilità di saggi e dati immunologici.
Abstract
Il trapianto eterotopico laringeo, sebbene sia una procedura tecnicamente impegnativa, offre maggiori analisi scientifiche e benefici in termini di costi rispetto ad altri modelli animali. Sebbene descritta per la prima volta da Shipchandler et al. nel 2009, questa tecnica non è ampiamente utilizzata, probabilmente a causa delle difficoltà nell'apprendimento della tecnica microchirurgica e del tempo necessario per padroneggiarla. Questo documento descrive in dettaglio i passaggi chirurgici, nonché le potenziali insidie da evitare, al fine di incoraggiare un uso efficace di questa tecnica.
In questo modello, le arterie carotidi bilaterali della laringe donatrice sono anastomizzate, all'arteria carotide ricevente e alla vena giugulare esterna, consentendo il flusso sanguigno attraverso l'innesto. Il flusso sanguigno può essere confermato intraoperatoriamente dalla visualizzazione del riempimento del sangue nelle arterie carotidi bilaterali dell'innesto, dall'arrossamento delle ghiandole tiroidee dell'innesto e dal sanguinamento dai micro vasi nell'innesto. Gli elementi cruciali per il successo includono la delicata conservazione dei vasi dell'innesto, l'arteriotomia e la venotomia delle dimensioni corrette e l'utilizzo del numero appropriato di punti di sutura sulle anastomosi arterioso-arteriose e arterioso-venose per fissare i vasi senza perdite e prevenire l'occlusione.
Chiunque può diventare esperto in questo modello con una formazione sufficiente ed eseguire la procedura in circa 3 ore. Se eseguito con successo, questo modello consente di eseguire studi immunologici con facilità e a basso costo.
Introduction
Per i pazienti affetti da danni irreparabili alla laringe o cancro della laringe, una laringectomia totale è spesso l'unica opzione1. La laringectomia totale lascia i pazienti senza la capacità di respirare e parlare da soli, oltre a sperimentare disagio sociale e psicologico2. I pazienti con cancro della laringe che necessitano di una laringectomia totale sono eccellenti potenziali candidati per il trapianto laringeo. Mentre è stato eseguito il trapianto laringeo umano nel contesto di danni laringei irreparabili, l'allotrapianto della laringe è attualmente evitato in questi pazienti a causa del timore di recidiva del tumore, della possibilità di rigetto cronico e delle infezioni derivate dal donatore3. L'immunosoppressione è la causa principale di queste preoccupazioni. La drammatica perdita del primo paziente con trapianto parziale di laringe a causa della recidiva del tumore dopo trattamento immunosoppressivo convenzionale è la prova che un regime immunosoppressivo appropriato dovrebbe essere messo a punto prima di ulteriori tentativi di trapianto nei pazienti con cancro della laringe 4,5.
Per comprendere meglio la risposta immunitaria dell'ospite a una laringe trapiantata, il primo modello di trapianto laringeo nei ratti è stato sviluppato nel 1992 da Strome, e miglioramenti alla tecnica chirurgica sono stati apportati nel 2002 6,7. Sebbene questo modello sia efficace per lo studio del trapianto laringeo, la mancanza di agenti immunologici specifici per il ratto e il costo più elevato associato ai modelli di ratto hanno portato allo sviluppo di un nuovo modello murino per lo studio del trapianto laringeo nel 20098.
L'applicazione principale della tecnica descritta è studiare diversi regimi farmacologici immunosoppressori nel trapianto laringeo. Il miglioramento delle attuali terapie immunosoppressive può ampliare il pool di candidati e portare a un trapianto sicuro nei pazienti oncologici. I vantaggi di questo modello murino sono il suo rapporto costo-efficacia e l'ampia disponibilità di dati immunologici e reagenti.
I team che lavorano su regimi di trattamento immunosoppressivo per il trapianto laringeo possono utilizzare questo metodo per raccogliere un grande volume di dati immunologici e diversi regimi farmacologici possono essere rapidamente testati e confrontati. Altre potenziali modalità di trattamento che possono modulare la risposta immunitaria al trapianto, come le iniezioni di cellule staminali, possono anche essere testate utilizzando questo modello. Infine, possono essere ideati esperimenti per osservare gli effetti sistemici a lungo termine del trapianto laringeo estendendo il periodo di follow-up.
La tecnica qui descritta utilizza anastomosi end-to-side per fornire flusso arterioso e venoso a un innesto eterotopico di laringe. L'innesto è un complesso laringotracheoesofageo (LTE) che comprende la laringe, le ghiandole tiroidee, le ghiandole paratiroidi, la trachea e l'esofago del donatore, con arterie carotidi bilaterali e peduncoli intatti. Un'arteria carotide donatrice è anastomizzata all'arteria carotide ricevente e fornisce il flusso sanguigno arterioso, mentre l'altra arteria carotide donatrice è anastomizzata alla vena giugulare esterna ricevente e fornisce il flusso sanguigno venoso (Figura 1).
Sono state apportate diverse modifiche alla tecnica chirurgica del modello di ratto per garantire il successo nel modello murino. Ad esempio, è stato utilizzato un agente anestetico inalato al posto di un agente iniettabile per aumentare il controllo sulla profondità dell'anestesia e ridurre le complicanze. La sutura continua viene utilizzata nell'anastomosi arterioso-arteriosa nei ratti; Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte dei vasi del topo, questo è tecnicamente difficile e può causare il restringimento del lume 7 del vaso. Di conseguenza, le suture interrotte vengono utilizzate nel modello murino e migliorano la pervietà del vaso. Inoltre, nel modello di ratto, il peduncolo dell'arteria tiroidea superiore (STA) viene sezionato e visualizzato. Date le dimensioni più piccole della STA nei topi, questa dissezione potrebbe causare danni e persino la transezione dello STA. Di conseguenza, non viene sezionato nel modello murino. Invece, la fascia vicina viene preservata per garantire che la STA sia mantenuta intatta.
Le principali potenziali insidie di questa tecnica includono il danneggiamento dei peduncoli complessi LTE del donatore, l'arteriotomia o la venotomia di dimensioni errate, l'occlusione dei vasi nei siti di anastomosi o il lasciare spazi vuoti nei siti di anastomosi che possono causare sanguinamento. Per evitare questi passi falsi, è necessario prestare attenzione quando si procura l'innesto del donatore lasciando un bracciale di tessuto attorno al peduncolo STA. L'arteriotomia e la venotomia dovrebbero essere abbastanza grandi da consentire il flusso sanguigno, ma abbastanza piccole da prevenire perdite. Un numero appropriato di punti di sutura dovrebbe essere usato per le anastomosi per chiudere eventuali spazi vuoti, ma non troppi per occludere i vasi.
Se si ottiene familiarità con le tecniche microchirurgiche, questa procedura può essere eseguita in circa 3 ore. Questo modello di trapianto laringeo può essere eseguito in modo affidabile nei topi e utilizzato per studiare la risposta immunitaria dell'ospite dopo allotrapianto composito vascolarizzato.
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Protocol
Questa ricerca è stata eseguita in conformità con il Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I topi BalbC (10-12 settimane) sono stati utilizzati come donatori e i topi C57 / BL6 (10-12 settimane) sono stati utilizzati come riceventi perché i loro principali complessi di istocompatibilità, H-2Db e H-2Kb, rispettivamente, sono immunologicamente incompatibili e quindi la risposta immunitaria all'innesto può essere ulteriormente studiata. Tutti gli strumenti utilizzati durante l'intervento chirurgico sono stati sterilizzati (vedi Figura supplementare S1 e Figura supplementare S2) e il campo chirurgico è stato mantenuto sterile per tutto il protocollo secondo le istruzioni IACUC.
1. Chirurgia del donatore e acquisizione dell'innesto
- Iniettare al donatore buprenorfina a rilascio prolungato (3,25 mg/kg di peso corporeo per via sottocutanea) 30 minuti prima di iniziare la procedura. Posizionare il topo nella scatola dell'anestesia del roditore per l'induzione dell'anestesia al 3% di isoflurano erogato con 1 L/min O2 flusso. Dopo che l'animale è completamente anestetizzato, trasferire il topo nell'area di rasatura e somministrare isoflurano all'1,5% con flusso di 1 L/min O2 per il mantenimento dell'anestesia. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico di punta.
- Rasare il petto e il collo del topo fino alla mascella e applicare la crema depilatoria. Dopo 30 secondi, pulire la crema con una garza sterile bagnata con acqua e trasferire il mouse nell'area chirurgica.
- Applicare lubrificante per gli occhi del topo. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante supplementare drappeggiata per garantire una corretta temperatura corporea.
- Immobilizzare il topo, preparare l'area chirurgica tre volte con iodio povidone e alcool, quindi drappeggiare il topo.
NOTA: Controllare la profondità dell'anestesia con un pizzico del dito del piede e mantenere l'anestesia all'1,5% di isoflurano e 1 L / min O2 flusso tramite una maschera facciale durante la procedura. - Fai una piccola incisione orizzontale appena superiore alla tacca soprasternale. Usando le forbici sottili, sollevare la pelle bilateralmente attraverso quell'incisione fino alla mandibola. Eliminare un segmento cutaneo a forma di trapezio con conseguente esposizione delle ghiandole salivari bilaterali, dei muscoli sternomastoidei, dei muscoli digastrici e dell'aspetto superiore dello sterno (Figura 2A).
- Eliminare le ghiandole salivari bilaterali usando il cauterizzazione nella parte superiore dove viene visualizzata una piccola vena che viaggia attraverso la ghiandola (Figura 2A).
NOTA: Se non si presta attenzione a cauterizzare la nave prima di rimuovere la ghiandola, in questa fase si può riscontrare un sanguinamento significativo. - Ritrarre delicatamente i tessuti linfoidi e adiposi lateralmente per esporre i muscoli sternomastoidi e cinghia. Sezionare i muscoli sternomastoidei bilaterali dai tessuti circostanti e ritrarli lateralmente usando i divaricatori.
NOTA: Questa manovra esporrà completamente il complesso LTE con i muscoli della cinghia e fornirà uno spazio di lavoro confortevole per la dissezione delle arterie carotidi (Figura 2B). - Fare un'incisione della linea mediana tra i muscoli della cinghia e asportarli bilateralmente, facendo attenzione a non danneggiare la ghiandola tiroidea sottostante e lasciandola sul complesso LTE.
NOTA: Dopo questo passaggio, le arterie carotidi bilaterali dovrebbero essere visibili (Figura 2C). - Sezionare circonferenzialmente le arterie carotidi comuni al livello della clavicola inferiormente e al livello della biforcazione carotidea superiormente. Sezionare il nervo vago e la vena giugulare interna dalle arterie carotidi. Non includerli nell'innesto procurato.
NOTA: L'arteria tiroidea superiore può essere vista appena superiore alla biforcazione che viaggia medialmente. Lasciare intatta la fascia sottile che circonda questo vaso e non tentare di sezionarlo circonferenzialmente. Questa nave fornisce il flusso sanguigno al complesso LTE e fungerà da peduncolo dopo il trapianto. La conservazione di questa nave è della massima importanza. - Sezionare le arterie carotidi interne ed esterne abbastanza in alto da essere in grado di legare e dividere. Se c'è difficoltà con la visualizzazione dei vasi, utilizzare un divaricatore separato per ritrarre i muscoli digastrici lateralmente.
NOTA: Evitare di sezionare l'arteria carotide esterna più vicino alla biforcazione per evitare danni all'arteria tiroidea superiore. In questa fase, l'arteria occipitale, che si dirama dalla carotide esterna e segue parallelamente all'arteria carotide interna, può essere incontrata e non deve essere confusa con l'arteria carotide interna, che è più grande e si trova più in profondità (Figura 2D). - Utilizzo di 8-0 suture di nylon, ligate le arterie carotidi interne da 2 a 3 mm superiori alla biforcazione carotidea. Ligare le arterie carotidi esterne almeno 3 mm superiore al punto di ramificazione dell'arteria tiroidea superiore.
NOTA: Dopo queste legature, il complesso LTE sarà pedicolata attraverso le arterie tiroidee superiori alle arterie carotidi bilaterali. - Ligare le arterie carotidi comuni a livello dello sterno e tagliare bilateralmente tutti i vasi legati. Mantenere i peduncoli vascolari sulla parte superiore del complesso LTE per evitare danni accidentali durante un'ulteriore dissezione. Per evitare perdite di gas o perdita involontaria di anestesia, assicurarsi che l'animale sia scaduto prima di effettuare tagli alle vie aeree.
- Dividere i muscoli infraioidi a livello dello ioide. Creare una faringotomia anteriore appena inferiore allo ioide. Portare l'incisione fino alla fascia prevertebrale per liberare il complesso LTE superiormente.
- Transettare la trachea sotto il quinto anello tracheale e portare l'incisione attraverso l'esofago fino alla fascia prevertebrale per liberare il complesso LTE inferiormente. Liberare la trachea e l'esofago dalla fascia prevertebrale sottostante da una direzione inferiore a superiore.
NOTA: Mantenere i peduncoli vascolari sulla parte superiore del complesso LTE per evitare danni accidentali durante un'ulteriore dissezione. - Creare una faringotomia anteriore appena inferiore allo ioide. Portare l'incisione fino alla fascia prevertebrale per liberare il complesso LTE superiormente. Dividere eventuali attacchi linfoidi o del tessuto connettivo rimanenti tra il complesso LTE e il tessuto circostante. Rimuovere l'innesto.
NOTA: L'innesto contiene la laringe donatrice, la trachea, le ghiandole tiroidee, le ghiandole paratiroidi, l'esofago e i muscoli laringei come unità composita (Figura 2E).
2. Preparazione dell'innesto
- Posizionare l'innesto procurato in una piastra di Petri sterile e lavarlo con soluzione salina normale per eliminare eventuali coaguli di sangue. Utilizzando micro pinze, mungere delicatamente il sangue e coaguli dalle arterie carotidi bilaterali. Dilatare le arterie carotidi bilaterali usando microdilatatori da 1 mm.
- Utilizzando un ago a punta smussata da 30 G, iniettare circa 2 ml di soluzione salina eparinizzata in ciascuna arteria carotide per lavare l'innesto.
NOTA: Il sangue e la soluzione salina possono essere visti fluire fuori dall'arteria carotide controlaterale e piccole estremità dei vasi liberi, che conferma intatte arterie tiroidee superiori. - Eliminare l'avventizia lontano dalle estremità arteriose in modo che abbiano bordi puliti per l'anastomosi.
NOTA: L'innesto può essere lasciato in soluzione salina eparinizzata e una breve pausa può essere presa per un massimo di 3 ore prima di trapiantarlo nel ricevente9.
3. Chirurgia ricevente e anastomosi dei vasi
- Preparare il topo ricevente nello stesso modo descritto per il donatore dopo l'induzione dell'anestesia, la rasatura e le fasi di preparazione chirurgica. Iniettare al topo ricevente un analgesico a rilascio prolungato per via sottocutanea 30 minuti prima dell'inizio dell'intervento.
- Usando un bisturi, fai un'incisione del collo della linea mediana che si estende dalla mascella superiormente allo sterno inferiormente. Sollevare la pelle sul lato sinistro e ritrarla lateralmente.
- Eliminare la ghiandola salivare sinistra, cauterizzando i vasi superiori come descritto in precedenza. Asportare il tessuto adiposo e linfoide dividendo eventuali vasi visibili con cauterizzazione a bassa temperatura, facendo attenzione a non danneggiare la vena giugulare esterna sottostante (Figura 3A).
- Sezionare circonferenzialmente la vena giugulare esterna. Utilizzare almeno 5 mm di lunghezza libera della nave per l'anastomosi. Utilizzare cauterizzazione o ligate a bassa temperatura e dividere eventuali vene relativamente grandi che si diramano dalla vena giugulare.
- Sezionare il muscolo sternomastoideo e ritrarlo lateralmente. Mantenere la vena sezionata protetta dietro il muscolo per evitare il contatto diretto con il divaricatore.
- Eliminare i muscoli della cinghia sinistra per accedere all'arteria carotide ricevente. Sezionare circonferenzialmente l'arteria carotide comune dalla clavicola inferiormente fino alla biforcazione carotidea superiormente (Figura 3B).
- Passare il materiale di fondo sotto la vena giugulare esterna e applicare i morsetti V3 a doppia approssimazione del vaso.
- Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso la parete anteriore della vena giugulare esterna nella posizione della venotomia desiderata e utilizzare questa sutura per tirare anteriormente e tendere la nave.
- Tagliare la sutura con microforbici abbastanza in profondità da creare la venotomia a fessura singola della giusta dimensione e assicurarsi che il taglio sia completamente attraverso la parete venosa.
- Utilizzando un ago a punta smussata da 30 G, lavare l'interno della vena con soluzione salina eparinizzata.
- Posizionare il complesso LTE del donatore tra l'arteria carotide sinistra ricevente e la vena giugulare esterna sinistra. Allineare l'estremità libera dell'arteria carotide sinistra del donatore verso la vena giugulare esterna sinistra del ricevente e smussare le estremità dei vasi con forbici affilate.
- Utilizzando quattro suture interrotte in nylon 10-0, anastomosi l'arteria carotide sinistra del donatore e la vena giugulare esterna sinistra del ricevente in modo end-to-side.
- Far scorrere il materiale di sfondo sotto l'arteria carotide comune ricevente e posizionare i morsetti del vaso A3 a doppia approssimazione sull'arteria carotide comune ricevente. Creare un'arteriotomia allo stesso modo della venotomia.
NOTA: Assicurarsi che l'arteriotomia abbia le stesse dimensioni del lume dell'arteria carotide del donatore. Se è troppo grande, si verificherà un sanguinamento abbondante dopo la rimozione dei morsetti. Se è troppo piccolo, il flusso di sangue all'innesto sarà ostruito. - Anastomosi l'arteria carotide destra del donatore all'arteria carotide sinistra ricevente in modo end-to-side utilizzando sei suture interrotte in nylon 10-0.
NOTA: La corretta tecnica microvascolare deve essere rispettata durante tutta l'anastomosi del vaso. Il passaggio attraverso la parete posteriore provoca un flusso sanguigno notevolmente ristretto, mettendo in pericolo la sopravvivenza dell'innesto. A causa delle piccole dimensioni delle navi, cercare di rifare le suture è molto difficile. - Rimuovere i morsetti sul lato venoso. Se si riscontra sanguinamento, applicare una leggera pressione con punte di cotone.
- Rimuovere i morsetti sull'arteria e applicare immediatamente una leggera pressione con punte di cotone.
NOTA: In questa fase è previsto un certo sanguinamento, che di solito si interrompe dopo 1 minuto con una leggera pressione. - Controllare l'integrità del flusso sanguigno nell'arteria e nella vena.
NOTA: Con il flusso arterioso intatto, di solito si vede la pulsazione dell'arteria carotide del donatore e la ghiandola tiroidea del donatore cambia dal suo colore trasparente arrossato al suo colore rossastro originale. Si può anche osservare la colorazione rossa delle piccole navi sul complesso LTE. - Irrigare il campo chirurgico con soluzione salina eparinizzata e chiudere l'incisione cutanea con una sutura monofilamento 5-0 in modo corrente. Applicare un unguento antibiotico o un adesivo cutaneo sull'incisione.
- Iniettare 1 mL di soluzione salina calda per via sottocutanea per tenere conto della perdita di liquidi durante l'intervento chirurgico.
- Interrompere l'anestesia e trasferire il mouse in una gabbia di recupero. Osservare il mouse su una piastra riscaldante fino a quando non è completamente sveglio per evitare l'ipotermia.
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Representative Results
Conferma del successo del trapianto
Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile valutare il flusso sanguigno al complesso LTE osservando la pulsazione dell'arteria carotide del donatore dopo aver rimosso i morsetti dei vasi. La pulsazione è tipicamente visibile e l'immediata colorazione rossa dell'arteria donatrice conferma il flusso sanguigno attivo (Figura 4A). Se l'anastomosi non è efficace, l'arteria non avrà pulsazione, apparirà parzialmente collassata e sarà di colore pallido (Figura 4B).
Un'altra tecnica per confermare la pervietà arteriosa è cercare il cambiamento di colore sulla ghiandola tiroidea del donatore dopo che i morsetti sono stati rimossi; Il cambiamento di colore della ghiandola tiroidea da pallido a rosso è visibile in pochi minuti. Anche il lobo destro della ghiandola tiroidea del donatore si arrossa con il flusso arterioso. Al contrario, il lobo sinistro, che è più lontano dal lato arterioso, impiega più tempo a ricevere il flusso corretto. Il flusso sanguigno attraverso piccole estremità di vasi liberi sul complesso LTE del donatore può essere visto come un'ulteriore conferma.
Approvvigionamento di complesso laringotracheale trapiantato
Dopo 15 giorni, vengono raccolti i complessi LTE riceventi e trapiantati. La pervietà dell'arteria anastomosica può essere valutata sezionando il complesso LTE libero dal tessuto ricevente circostante e visualizzando l'anastomosi end-to-side (Figura 4A). Il complesso LTE trapiantato è generalmente incapsulato in uno strato di tessuto fibrotico in questo momento. L'allotrapianto asportato non abbinato è solitamente più grande rispetto alla laringe nativa a causa della formazione di capsule fibrotiche (Figura 5A). Nel contesto del rigetto dell'allotrapianto, dopo 15 giorni in assenza di immunosoppressione, i riceventi probabilmente hanno un flusso sanguigno assente all'allotrapianto trapiantato10.
Valutazione istologica della laringe trapiantata
Secondo il sistema di classificazione del rigetto del trapianto laringeo di topo precedentemente sviluppato, il rigetto completo di una laringe trapiantata in assenza di immunosoppressione è tipicamente osservato al giorno 1510. Le cartilagini laringee sono per lo più degradate con una marcata diminuzione della cellularità. La densità delle cellule nucleate è anche diminuita nei tessuti grassi e muscolari. L'infiltrazione linfocitaria può essere vista chiaramente, Mentre i follicoli tiroidei sono assenti nell'allotrapianto trapiantato. La figura supplementare S3 mostra l'istologia della laringe nativa appena asportata rispetto alla laringe trapiantata rifiutata al giorno 15.
Figura 1: La laringe del donatore viene trapiantata in tandem con la laringe ricevente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Anatomia del complesso laringotracheale e fasi di approvvigionamento . (A) Dissezione superficiale del collo che mostra le ghiandole salivari retratte lateralmente e i muscoli della cinghia. (B) La retrazione dei muscoli sternomastoidei destro fornisce un facile accesso ai muscoli della cinghia e al complesso LTE sottostante. (C) Dopo la rimozione dei muscoli della cinghia, sono visibili la laringe, la trachea, le ghiandole tiroidee bilaterali e le strutture della guaina carotidea. (D) L'arteria occipitale destra è vista originarsi dall'arteria carotide esterna e viaggiare posteriormente. (E) Complesso LTE donatore asportato con la laringe, la trachea, le ghiandole tiroidee bilaterali, le arterie carotidi e l'esofago visibili. Abbreviazioni: CCA = arteria carotide comune; Di = muscolo digastrico; ECA = arteria carotide esterna; Eso = esofago; Hy = osso ioide; ICA = arteria carotide interna; IJV = vena giugulare interna; L = laringe; OA = arteria occipitale; S = ghiandola salivare; Sm = muscolo sternomastoideo; St = muscoli della cinghia; STA = arteria tiroidea superiore; T = trachea; Thy = ghiandola tiroidea; V = vasi che viaggiano attraverso la ghiandola salivare; Vg = nervo vago. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Anatomia del collo ricevente e corretta posizione del trapianto . (A) Vena giugulare esterna sinistra esposta dopo dissezione dei tessuti adiposi e linfoidi. (B) L'arteria carotide sinistra sezionata circonferenzialmente è vista con il nervo vago e la vena giugulare interna retratta lateralmente. Abbreviazioni: CCA = arteria carotide comune; EJV = vena giugulare esterna; IJV = vena giugulare interna; L = laringe; S = ghiandola salivare; Sm = muscolo sternomastoideo; St = muscoli della cinghia; T = trachea; Vg = nervo vago. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati delle anastomosi arteriose e venose. (A) Risultato positivo: la laringe del donatore con un'anastomosi arteriosa funzionante, colorazione rosso vivo dell'arteria carotide comune del donatore e nessun collasso delle pareti dei vasi (freccia blu). (B) Risultato negativo: l'arteria carotide comune, con un'anastomosi arteriosa compromessa e nessun flusso sanguigno, è pallida e parzialmente collassata (freccia blu). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Approvvigionamento del complesso LTE trapiantato . (A) Valutazione grossolana dell'anastomosi end-to-side dall'arteria carotide sinistra del donatore all'arteria carotide destra ricevente, 15 giorni dopo l'intervento chirurgico. Immagine dell'anastomosi end-to-side visibile al giorno 15 dopo il trapianto (freccia nera). La laringe trapiantata è visibile anche accanto al divaricatore circondato da una capsula fibrotica (freccia blu). (B) Confronto grossolano dell'allotrapianto complesso LTE trapiantato con la laringe nativa. Sul lato destro c'è la laringe trapiantata in assenza di immunosoppressione al giorno 15 e sul lato sinistro c'è la laringe nativa del ricevente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Strumenti chirurgici del donatore. (1) 8-0 sutura in nylon. (2) Punte sterili di cotone. (3) Divaricatori ricavati da graffette e sterilizzati. (4) Capsula di Petri sterile e monouso da 35 mm. (5) Bende sterili. (6) Cuscinetti di garza sterili. (7) Cauterizzazione micro punta fine a bassa temperatura. (8) Pinza del tessuto Adson. (9) Forbici sottili. (10) Portaaghi. (11) Vannas modello forbice-curvato, tagliente da 7 mm. (12) Forbici avventizia-dritto, tagliente 19 mm. (13) Forbici a molla Vannas curvate, tagliente da 3 mm. (14) Dilatatore del recipiente-diametro 0,1 mm. (15) Micro pinza dritta. (16) Micropinze angolate. (17) Pannello da sezione sterile. (18) Ago di precisione da 25 G. (19) Ago smussato standard da 30 G. (20) Siringa con punta a blocco luer da 3 ml. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Strumenti chirurgici del ricevente. (1) Capsula di Petri sterile monouso da 35 mm. (2) Punte sterili di cotone. (3) Morsetto approssimatore microvascolare-0,4-1 mm diametro del vaso. (4) Morsetti per mini recipienti singoli. (5) Mini colla per la pelle. (6) Cauterizzazione micro punta fine a bassa temperatura. (7) Ago smussato standard da 30 G. (8) Siringa con punta a blocco luer da 3 ml. (9) Sutura monocrile 5-0. (10) Sutura in nylon 10-0. (11) La parte materiale di fondo della visibilità merciana viene tagliata. (12) Bende sterili. (13) Garze sterili. (14) Divaricatori ricavati da graffette e sterilizzati. (15) Pinza DeBakey. (16) Portaaghi. (17) Forbici sottili. (18) Morsetto che applica una pinza. (19)Pinze tissutali. (20) Vannas modello forbice-curvato, 7 mm tagliente. (21) Forbici avventizia-dritto, tagliente 19 mm. (22) Forbici a molla Vannas curvate, tagliente da 3 mm. (23) Micropinze dritte. (24) Dilatatore del recipiente-diametro 0,3 mm. (25) Dilatatore del recipiente-diametro 0,1 mm. (26) Micropinze angolate. (27) Tavola da sezione sterile. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Valutazione istologica delle laringi donatrici e riceventi mediante colorazione H&E, 15 giorni dopo l'intervento. (A) Laringe nativa appena asportata e (B) laringe post-trapianto al giorno 15 a destra. La cartilagine mostra una marcata diminuzione della cellularità (frecce blu). Le cellule muscolari mostrano la perdita di nuclei nel trapianto rispetto ai muscoli nativi (frecce rosse). I follicoli tiroidei facilmente visibili sul tessuto nativo (freccia verde) sono assenti nel tessuto trapiantato. Una marcata infiltrazione linfocitaria intorno ai tessuti trapiantati è visibile sul lato destro (freccia nera). Barre della scala = 500 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'incidenza e la prevalenza del cancro della laringe sono aumentate rispettivamente del 12% e del 24% negli ultimi tre decenni e molti di questi pazienti subiscono una laringectomia per il trattamento10. Questa procedura peggiora significativamente la qualità della vita di una persona e quindi è necessario un trattamento alternativo. L'allotrapianto composito vascolarizzato della laringe può migliorare la capacità del paziente di respirare e parlare; Tuttavia, la ricerca è ancora necessaria prima che questa tecnica possa essere utilizzata clinicamente per questa popolazione di pazienti. Questo documento offre un modello murino economico di trapianto laringeo che può consentire lo studio di vari regimi immunosoppressivi.
Ci sono diversi passaggi critici in questa procedura che possono dettare il successo dell'intervento chirurgico. Per il donatore, è importante tenere la dissezione lontano dall'arteria tiroidea superiore per evitare di danneggiare il peduncolo. Quando si procura la laringe, è anche fondamentale lasciare un bracciale di fascia intorno alle arterie tiroidee superiori per proteggere i peduncoli ed evitare la torsione dei vasi. L'integrità dei peduncoli deve essere controllata quando si lava l'innesto con soluzione salina. Se procurato correttamente, il sangue dovrebbe fluire dall'arteria carotide controlaterale e dai piccoli capillari che coprono l'innesto.
I prossimi passi critici sono la creazione dell'arteriotomia e della venotomia. Quando si passa la sutura attraverso il vaso per tendere la parete del vaso, assicurarsi che entri ed esca attraverso il lume, non solo l'avventizia. In questo modo, l'arteriotomia a fessura singola e la venotomia espongono il lume del vaso e consentono il flusso sanguigno. Quando si effettua l'arteriotomia e la venotomia, l'apertura dovrebbe essere abbastanza grande da consentire il flusso sanguigno ma abbastanza piccola da evitare perdite. Se l'apertura è troppo piccola, può essere dilatata per adattarsi alle dimensioni del lume del vaso donatore.
Infine, eseguire le anastomosi arteriose e venose è la parte più impegnativa ma anche la più critica dell'intervento. L'aspetto più importante è determinare il numero appropriato di punti di sutura da posizionare. È meglio valutarlo prima di posizionare la prima sutura in modo che anche la spaziatura possa essere pianificata di conseguenza. Posizionare troppe suture fa sì che il flusso sanguigno sia ostruito, oltre a causare più danni endoteliali. Posizionare troppo poche suture consente al sangue di fuoriuscire attraverso gli spazi vuoti nel lume. Per le dimensioni dei topi utilizzati in questo studio, generalmente quattro punti di sutura funzionano bene per la vena e sei punti di sutura funzionano bene per l'arteria. L'arteria richiede più punti di sutura a causa del suo flusso sanguigno ad alta pressione.
Diverse modifiche sono state apportate durante lo studio per perfezionare questo intervento chirurgico. Inizialmente, è stata utilizzata un'anestesia iniettabile, che ha comportato un tasso di mortalità più elevato, probabilmente a causa di sovradosaggio anestetico, e un tempo di recupero postoperatorio di circa 3 ore. Il passaggio all'anestesia per via inalatoria ha notevolmente ridotto il tasso di mortalità e ridotto il tempo di recupero postoperatorio a circa 30 minuti. Un altro miglioramento è stato l'uso di un ago smussato per lavare l'innesto. Originariamente, è stato utilizzato un ago smussato, che ha portato a lacrime involontarie nelle arterie carotidi del donatore, causando quindi danni ai vasi e perdite. Infine, in questo protocollo è stato introdotto l'uso di un materiale di sfondo contrastante. L'uso di un materiale di sfondo verde sotto i vasi ha permesso una migliore visualizzazione durante le anastomosi e ha contribuito a elevare i vasi e renderli più facilmente accessibili.
La risoluzione dei problemi durante gli interventi chirurgici iniziali si è concentrata sulla risoluzione del problema dell'assenza di flusso sanguigno arterioso nell'innesto. Ipotizziamo che ciò fosse probabilmente dovuto all'ostruzione del flusso nel sito di anastomosi arteriosa. Per risolvere questo problema, è stata fatta una smussatura più drammatica sull'arteria carotide del donatore per assicurarsi che si trovasse a filo con l'arteria carotide ricevente. Durante la sutura dell'anastomosi, sono state utilizzate il minor numero possibile di suture e sono stati confermati nodi quadrati per impedire ai vasi di ruotare su se stessi.
Quando si utilizza questo modello, ci sono alcune limitazioni tecniche da tenere a mente. Confermare la pulsazione delle arterie o osservare la ricarica iniziale della tiroide dopo il trapianto non garantisce sempre che il complesso LTE abbia un flusso sanguigno continuo. Per verificare la pervietà dell'anastomosi in diversi punti temporali, è necessario utilizzare tecniche più sofisticate come l'ecografia Doppler. Per distinguere meglio tra perdita di flusso sanguigno dovuta al rigetto immunitario e tecnica chirurgica fallita, gli strumenti di monitoraggio continuo del flusso sanguigno potrebbero essere implementati in ulteriori studi. Un'altra limitazione di questo protocollo è che lascia poco spazio agli errori. Se uno dei vasi donatori o riceventi si strappa, non c'è modo di completare la procedura con successo. Inoltre, come trapianto eterotopico, la laringe del donatore non è un organo pienamente funzionante. Questo modello è utile per studiare la risposta immunitaria, ma poiché l'innesto non è effettivamente collegato alle vie aeree e non viene effettuata alcuna reinnervazione, la valutazione funzionale di una laringe trapiantata non può essere eseguita.
Il contributo più significativo di questo protocollo è la riduzione dei costi e una migliore disponibilità di saggi immunologici, anticorpi e dati. Il trapianto laringeo è stato precedentemente pubblicato in ratti, cani e maiali; Tuttavia, questi animali sono più costosi e ci sono meno saggi immunologici e dati disponibili11,12,13. Il tasso di mortalità a 30 giorni di questa procedura nei ratti è risultato essere del 41%11; Nella nostra esperienza con i topi, questo numero si è ridotto al 5%. Infine, l'uso di anestetico per via inalatoria per il trapianto laringeo è unico per questo protocollo, poiché la maggior parte dei modelli animali di trapianto laringeo pubblicati utilizzano un anestetico iniettabile, come il pentobarbital 8,11,14. Un agente anestetico inalato riduce significativamente il tempo di recupero e consente un maggiore controllo sulla profondità dell'anestetico rispetto agli anestetici iniettabili. La maschera di somministrazione anestetica aiuta anche con il corretto posizionamento estendendo il collo.
Ci sono diverse applicazioni per questo modello di trapianto. I più significativi sono la capacità di valutare la risposta immunitaria ad un allotrapianto composito vascolarizzato e di testare vari regimi di immunosoppressione15,16,17. Inoltre, questo modello può essere utilizzato per studiare la vascolarizzazione nel contesto di un'anastomosi arteriosa non funzionante, anastomosi venosa non funzionante o aterosclerosi a causa del rigetto. Questo documento descrive come trapiantare eterotopicamente un complesso LTE da un topo all'altro in ~ 3 ore. Questo modello fattibile e relativamente a basso costo offre un notevole potenziale nello studio del ruolo del sistema immunitario nel rigetto del complesso LTE, offrendo così il potenziale per nuove terapie nel trapianto di organi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Le spese di viaggio e soggiorno di Egehan Salepci per la ricerca sono state finanziate dal Consiglio per la ricerca scientifica e tecnologica della Turchia (TUBITAK).
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Randall Raish per la sua eccellente videografia e assistenza al montaggio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
References
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