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Bioengineering

परिधीय न्यूरोइंजीनियरिंग के लिए ग्राफीन-आधारित 3 डी बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल बायोइंक की तैयारी और लक्षण वर्णन

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63622
Automatic Translation
1,2,4, 3,4,5, 2,4,6, 2, 2,5, 4, 2,7, 2,7, 3,4,5,8
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Summary

इस पांडुलिपि में, हम परिधीय ऊतक इंजीनियरिंग में उपयोग के लिए ग्राफीन युक्त बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल बायोइंक की तैयारी का प्रदर्शन करते हैं। इस 3 डी बायोहाइब्रिड सामग्री का उपयोग करके, स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाता है। क्लिनिक में समान बायोमैटेरियल्स लाने में यह एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है।

Abstract

परिधीय न्यूरोपैथी अक्षीय क्षति के परिणामस्वरूप हो सकती है, और कभी-कभी डिमाइलेटिंग रोगों के कारण हो सकती है। परिधीय तंत्रिका क्षति एक वैश्विक समस्या है जो 1.5% -5% आपातकालीन रोगियों में होती है और इससे महत्वपूर्ण नौकरी का नुकसान हो सकता है। आज, ऊतक इंजीनियरिंग-आधारित दृष्टिकोण, जिसमें मचान, उपयुक्त सेल लाइनें और बायोसिग्नल शामिल हैं, त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग प्रौद्योगिकियों के विकास के साथ अधिक लागू हो गए हैं। परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन में मौजूदा समस्याओं को दूर करने के लिए स्टेम कोशिकाओं, एक्सोसोम, या बायो-सिग्नलिंग अणुओं के साथ विभिन्न हाइड्रोगेल बायोमैटेरियल्स के संयोजन का अक्सर अध्ययन किया जाता है। तदनुसार, विभिन्न बायोप्रिंटिंग विधियों द्वारा गठित इंजेक्टेबल सिस्टम, जैसे हाइड्रोगेल, या इम्प्लांटेबल नाली संरचनाओं के उत्पादन ने परिधीय न्यूरो-इंजीनियरिंग में महत्व प्राप्त किया है। सामान्य परिस्थितियों में, स्टेम सेल शरीर की पुनर्योजी कोशिकाएं हैं, और उनकी आबादी की रक्षा के लिए समय के साथ उनकी संख्या और कार्य कम नहीं होते हैं; ये विशेष कोशिकाएं नहीं हैं, लेकिन चोट के जवाब में उचित उत्तेजना पर अंतर कर सकती हैं। स्टेम सेल सिस्टम अपने माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव में है, जिसे स्टेम सेल आला कहा जाता है। परिधीय तंत्रिका चोटों में, विशेष रूप से न्यूरोटमेसिस में, इस माइक्रोएन्वायरमेंट को शल्य चिकित्सा द्वारा अलग किए गए तंत्रिका अंत को एक साथ बांधने के बाद भी पूरी तरह से बचाया नहीं जा सकता है। समग्र बायोमैटेरियल्स और संयुक्त सेलुलर थेरेपी दृष्टिकोण विभिन्न गुणों जैसे बायोडिग्रेडेबिलिटी, बायोकम्पैटिबिलिटी और प्रोसेसेबिलिटी के संदर्भ में सामग्री की कार्यक्षमता और प्रयोज्यता को बढ़ाता है। तदनुसार, इस अध्ययन का उद्देश्य ग्राफीन-आधारित बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल पैटर्निंग की तैयारी और उपयोग को प्रदर्शित करना और तंत्रिका कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं की विभेदन दक्षता की जांच करना है, जो तंत्रिका पुनर्जनन में एक प्रभावी समाधान हो सकता है।

Introduction

तंत्रिका तंत्र, जो तंत्र है जो जीव और पर्यावरण की आंतरिक संरचना को पुल करता है, को दो भागों में विभाजित किया गया है: केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र। परिधीय तंत्रिका क्षति एक वैश्विक समस्या है जो आपातकालीन विभाग में उपस्थित होने वाले रोगियों का 1.5% -5% है और विभिन्न आघातों के कारण विकसित होती है, जिससे महत्वपूर्ण नौकरी का नुकसानहोता है 1,2,3।

आज, परिधीय न्यूरो-इंजीनियरिंग के लिए सेलुलर दृष्टिकोण बहुत रुचि रखते हैं। स्टेम सेल इन दृष्टिकोणों में उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं में पहले आते हैं। सामान्य परिस्थितियों में, स्टेम सेल शरीर की पुनर्योजी कोशिकाएं हैं, और उनकी आबादी की रक्षा के लिए समय के साथ उनकी संख्या और कार्य कम नहीं होते हैं; ये कोशिकाएं विशिष्ट हैं लेकिन चोट 4,5 के जवाब में उचित उत्तेजना पर अंतर कर सकती हैं। स्टेम सेल परिकल्पना के अनुसार, स्टेम सेल सिस्टम अपने माइक्रोएन्वायरमेंट के प्रभाव में है, जिसे स्टेम सेल आला कहा जाता है। स्टेम कोशिकाओं का संरक्षण और भेदभाव उनके माइक्रोएन्वायरमेंट 6 की उपस्थिति के बिना असंभव है, जिसे कोशिकाओं औरमचानों का उपयोग करके ऊतक इंजीनियरिंग के माध्यम से पुनर्गठित किया जा सकताहै। ऊतक इंजीनियरिंग एक बहु-विषयक क्षेत्र है जिसमें इंजीनियरिंग और जीव विज्ञान दोनों सिद्धांत शामिल हैं। ऊतक इंजीनियरिंग कृत्रिम ऊतकों के निर्माण के लिए उपकरण प्रदान करता है जो जीवित ऊतकों को प्रतिस्थापित कर सकते हैं और क्षतिग्रस्त ऊतकों को हटाकर और कार्यात्मक ऊतक प्रदान करके इन ऊतकों के पुनर्जनन में उपयोग किया जा सकताहै। ऊतक मचान, ऊतक इंजीनियरिंग के तीन आधारशिलाओं में से एक, प्राकृतिक और सिंथेटिक सामग्री से विभिन्न तरीकों का उपयोग करके उत्पादित किया जाताहै। त्रि-आयामी (3 डी) प्रिंटिंग एक उभरती हुई योजक विनिर्माण तकनीक है जिसका व्यापक रूप से विभिन्न तरीकों का उपयोग करके जटिल आकृतियों के सरल लेकिन बहुमुखी उत्पादन के माध्यम से दोषपूर्ण ऊतकों को बदलने या पुनर्स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है। बायोप्रिंटिंग एक योजक विनिर्माण विधि है जो कोशिकाओं और बायोमैटेरियल्स के सह-अस्तित्व को सक्षम बनाती है, जिसे बायोइंक्स10 कहा जाता है। एक दूसरे के साथ तंत्रिका कोशिकाओं की बातचीत को ध्यान में रखते हुए, अध्ययन ग्राफीन जैसे प्रवाहकीय जैव सामग्री उम्मीदवारों में स्थानांतरित हो गए हैं। ग्राफीन नैनोप्लेट, जिसमें लचीले इलेक्ट्रॉनिक्स, सुपरकैपेसिटर, बैटरी, ऑप्टिक्स, इलेक्ट्रोकेमिकल सेंसर और ऊर्जा भंडारण जैसे गुण होते हैं, ऊतक इंजीनियरिंग11 के क्षेत्र में एक पसंदीदा बायोमटेरियल हैं। ग्राफीन का उपयोग उन अध्ययनों में किया गया है जहां क्षतिग्रस्त ऊतकों और अंगों का प्रसार और पुनर्जनन किया गया था।

ऊतक इंजीनियरिंग में तीन बुनियादी निर्माण खंड होते हैं: पाड़, कोशिकाएं और बायोसिग्नल अणु। इन तीन संरचनाओं को पूरी तरह से प्रदान करने के संदर्भ में परिधीय तंत्रिका क्षति पर अध्ययन में कमियां हैं। अध्ययनों में उत्पादित और उपयोग किए जाने वाले बायोमैटेरियल्स में विभिन्न समस्याओं का सामना करना पड़ा है, जैसे कि उनमें केवल स्टेम सेल या बायोसिग्नल अणु होते हैं, एक बायोएक्टिव अणु की कमी जो स्टेम सेल भेदभाव को सक्षम करेगी, उपयोग किए जाने वाले बायोमटेरियल की जैव-रासायनिकता की कमी, और ऊतक आला में कोशिकाओं के प्रसार पर कम प्रभाव, और, इस प्रकार, तंत्रिका चालन पूरी तरह से महसूस नहीं किया जा रहाहै 2,13,14,15,16। इसके लिए तंत्रिका पुनर्जनन के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, मांसपेशियों के शोष को कम करना17,18, और ऐसी समस्याओं के खिलाफ विकास कारकों के साथ आवश्यक होमिंग19 बनाना। इस बिंदु पर, एक सर्जिकल बायोमटेरियल प्रोटोटाइप की न्यूरो-गतिविधि का लक्षण वर्णन और विश्लेषण, क्लिनिक में स्थानांतरित होने के लिए, बहुत महत्वपूर्ण हैं।

तदनुसार, यह विधि अध्ययन 3 डी बायोप्रिंटर द्वारा गठित ग्राफीन नैनोप्लेट के साथ बायोइंक हाइड्रोगेल पैटर्निंग और स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोजेनिक भेदभाव पर इसकी प्रभावशीलता की जांच करता है। इसके अलावा, न्यूरोस्फीयर गठन और भेदभाव पर ग्राफीन के प्रभावों की जांच की जाती है।

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Protocol

1. व्हार्टन के जेली मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं की खेती

  1. व्हार्टन के जेली मेसेनकाइमल स्टेम सेल (डब्ल्यूजे-एमएससी, एटीसीसी से) को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से बाहर निकालें। डीएमईएम-एफ 12 माध्यम में संस्कृति डब्ल्यूजे-एमएससी जिसमें कमरे के तापमान पर बाँझ लैमिनार प्रवाह में 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफबीएस), 1% पेन-स्ट्रेप और 1% एल-ग्लूटामाइन होता है, जैसा कि यूरी एट अल.20 में वर्णित है।
  2. क्रायोप 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर कुछ कोशिकाओं को फ्रीजिंग माध्यम के साथ आरक्षित करता है जिसमें 35% एफबीएस, 55% डीएमईएमएफ -12 और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) होता है। इसके लिए, थोमा सेल काउंटिंग स्लाइड पर 1 x 106 कोशिकाओं की गिनती करें और फ्रीजिंग समाधान को ड्रॉपवाइज जोड़ें। स्लाइड को जल्दी से तरल नाइट्रोजन कंटेनर में स्थानांतरित करें।
  3. जब फ्लास्क में सुसंस्कृत कोशिकाएं 80% कंफ्लुएंट होती हैं, तो माध्यम को बाहर निकालें और 5 एमएल पीबीएस के साथ धो लें। 0.25% ट्रिप्सिन और 2.21 एमएम ईडीटीए -4 एनए के 5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  4. इनक्यूबेटर से निकाली गई कोशिकाओं में 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम-एफ 12 माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। इसे अच्छी तरह से निलंबित करें, माध्यम एकत्र करें, और माध्यम को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 101 x g की घूर्णी गति पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनैटेंट को त्याग दें और 10% एफबीएस युक्त ताजा पोषक तत्व माध्यम के साथ नए फ्लास्क में कोशिकाओं को फिर से बीज दें।
    नोट: ट्रांसडक्शन विधि द्वारा जीएफपी जीन के साथ लेबल किए गए वाणिज्यिक डब्ल्यूजे-एमएससी काउपयोग उत्पादित होने वाले बायोमटेरियल-सेल इंटरैक्शन को बेहतर ढंग से देखने के लिए किया जा सकता है। इस विधि में उपयोग किए जाने वाले समूहों को तालिका 1 में दिखाए अनुसार बनाया जा सकता है।

बनाए गए समूह बनाने के कारण प्रतिनिधियों की संख्या
2 डी डब्ल्यूजे-एमएससी (2 डी-सी) 2 डी नियंत्रण x 5
2 डी डब्ल्यूजे-एमएससी और ग्राफीन (2 डी-जी) 2 डी में ग्राफीन विषाक्त खुराक निर्धारण x 5 विभिन्न सांद्रता में से प्रत्येक के लिए प्रतिनिधि
डब्ल्यूजे-एमएससी बायोइंक (3 डी-बी) में शामिल हैं 3 डी नियंत्रण x 3
डब्ल्यूजे-एमएससी और 0.1% ग्राफीन बायोइंक (3 डी-जी) में शामिल हैं 3 डी ग्राफीन-बायोइंक बायोहाइब्रिड समूह x 3
डब्ल्यूजे-एमएससी बायोइंक (3 डी-बीएस) पर स्फेरॉइड रूप में हैं स्फेरॉइड फॉर्म का 3 डी नियंत्रण x 3
डब्ल्यूजे-एमएससी और 0.1% ग्राफीन बायोइंक (3 डी-जीएस समूह) पर स्फेरॉइड रूप में हैं 3 डी ग्राफीन-बायोइंक बायोहाइब्रिड ग्रुप ऑफ स्फेरॉइड फॉर्म x3
3 डी बायोइंक ड्रॉप यह एसईएम और एफटीआईआर लक्षण वर्णन विश्लेषण के लिए उत्पादित किया गया है। x5
3 डी ग्राफीन ड्रॉप यह एसईएम और एफटीआईआर लक्षण वर्णन विश्लेषण के लिए उत्पादित किया गया है। x5
डब्ल्यूजे-एमएससी लेबल वाले जीएफपी के साथ 3 डी बायोइंक और 0.1% "ग्राफीन की उचित खुराक युक्त बायोइंक में डब्ल्यूजे-एमएससी के आंदोलनों का अवलोकन"। x3

तालिका 1. विधि में समूह। विधि में सभी 2 डी और 3 डी समूह शामिल हैं।

2. ग्राफीन विषाक्तता और 2 डी इमेजिंग

  1. ग्रेफेन सांद्रता की तैयारी और कोशिकाओं के लिए आवेदन
    नोट: कच्चे ग्राफीन नैनोकणों को व्यावसायिक रूप से खरीदा गया था (औद्योगिक ग्राफीन नैनोप्लेट प्रकार) और दान भी किया गया था। कणों के आयाम मोटाई में 5-8 एनएम, व्यास में 5 μm और सतह क्षेत्र में 120-150 मीटर2 / g थे।
    1. 1% समाधान (मिलीग्राम / एमएल) बनाने के लिए ग्राफीन का वजन करें। ग्राफीन नैनोकणों के वजन वाले 100 μg में 10% FBS के साथ DMEMF-12 माध्यम के 10 एमएल जोड़कर स्टॉक समाधान बनाएं और इस समाधान को स्टॉक समाधान के रूप में लेबल करें। 20 मिनट के लिए 1.5 एटीएम दबाव के तहत 121 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑटोक्लेव में निष्फल करें।
      नोट: बाँझ ग्राफीन मिश्रण को उपयोग होने तक रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। यह दीर्घकालिक उपयोग (अधिकतम 1 महीने) के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। इन मामलों में, मिश्रण को पुनर्गठित और निष्फल किया जाना चाहिए।
    2. गैर विषैले खुराक निर्धारित करने के लिए विभिन्न सांद्रता में मध्यम ग्राफीन का मिश्रण तैयार करें। प्रारंभिक कमजोर पड़ने को 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, और 0.0001% ग्राफीन / मीडिया के रूप में सेट करें।
    3. 1% स्टॉक समाधान से शुरू करते हुए, प्रत्येक एकाग्रता से क्रमिक रूप से 1 एमएल लें और इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्यूब में 10% एफबीएस के साथ 9 एमएल डीएमईएमएफ -12 माध्यम जोड़ें, पांच धीरे-धीरे पतला नमूने बनाएं, और समान वितरण प्राप्त करने के लिए समाधान हिलाएं और भंवर करें। नियंत्रण के रूप में 10% एफबीएस के साथ डीएमईएमएफ -12 माध्यम के केवल 10 एमएल का उपयोग करें।
      नोट: ग्राफीन के भारी गुच्छे अवक्षेपित होते हैं और इसलिए, पुनर्वितरित करने की आवश्यकता होती है।
    4. डब्ल्यूजे-एमएससी को 6-वेल प्लेटों में 2 एमएल ताजे माध्यम के साथ बीज दें जिसमें 5 x 105 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से 10% एफबीएस होता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, प्लेटों को समान और दोहराए गए कुओं के समूहों में विभाजित करें। प्रत्येक एकाग्रता के लिए पांच पुनरावृत्ति करें।
    5. माध्यम को छोड़ दें और फिर माध्यम को 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से ग्राफीन माध्यम सांद्रता के साथ बदलें। नियंत्रण समूह के लिए केवल माध्यम का उपयोग करें. प्लेटों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. एमटीटी के साथ ग्राफीन की गैर विषैले सांद्रता का निर्धारण
    1. 24 घंटे के बाद ग्राफीन के साथ मीडिया को छोड़ दें। प्रत्येक को पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धो लें। 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से 10% एफबीएस के साथ ताजा डीएमईएमएफ -12 माध्यम जोड़ें।
      नोट: सेल पर ग्राफीन सांद्रता के आवेदन के बाद पीबीएस के साथ धोना महत्वपूर्ण है क्योंकि ग्राफीन नैनोकणों, जिन्हें एंडोसाइटोसिस द्वारा सेल में नहीं लिया जाता है, पर्यावरण से हटा दिया जाता है। यह एमटीटी परीक्षण को अधिक कुशल बनाता है।
    2. आईसी 50 मान को इंगित करने के लिए एमटीटी (3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल)-2,5-डिफेनिल-टेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड) प्रोटोकॉल का उपयोग करें, जो 50% सेल व्यवहार्यता को दर्शाता है, जैसा कि कोसे एट अल.22 और चरण 2.2.3.-2.2.6 में वर्णित है।
    3. सबसे पहले, एमटीटी नमक के 5 मिलीग्राम / एमएल का वजन करें और पीबीएस में घुल जाएं। 0.45 μm फ़िल्टर का उपयोग करके निष्फल करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बने एमटीटी समाधान को लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. सभी कुओं में 10 μL MTT जोड़ें और प्लेट को 37 °C पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद माइक्रोस्कोप के तहत 10x आवर्धन पर फॉर्माज़ान क्रिस्टल के गठन का निरीक्षण करें।
    5. कोशिकाओं में बनने वाले क्रिस्टल को भंग करने के लिए, प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ का 100 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा मिलाएं। प्लेट को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखें। प्लेट को एलिसा प्लेट रीडर में डालें। अवशोषण माप के लिए कार्यक्रम से 570 एनएम की तरंग दैर्ध्य सेट करें और इसे प्लेट22 पढ़ें।
      नोट: इसके अलावा, जबकि अकेले ग्राफीन कणों को 270 एनएम23 पर पढ़ा जाता है, यहां 570 एनएम24 की पठन सीमा केवल सेल व्यवहार्यता को पढ़ने के लिए होगी।
    6. एक सांख्यिकीय विश्लेषण कार्यक्रम में टुकी के परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके प्राप्त परिणामों पर सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
  3. स्टिच इमेजिंग
    1. कोशिकाओं के साथ विभिन्न ग्राफीन सांद्रता की बातचीत की जांच करने के लिए, स्टिच इमेजिंग नामक विधि के साथ कोशिकाओं की समय-चूक करें। यह विधि माइक्रोस्कोप के तहत नियमित अंतराल पर लिए गए छवि नमूनों का उपयोग करके एक टाइम-लैप्स छवि बनाती है।
    2. ऐसा करने के लिए, पहले कंप्यूटर चालू करें। टाइम-लैप्स इमेजिंग इनक्यूबेटर चालू करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। एमटीटी प्लेट को टाइम-लैप्स इनक्यूबेटर स्लॉट में रखें।
    3. कंप्यूटर पर स्टिच प्रोग्राम खोलें। सिस्टम में पढ़े जाने वाले कुओं को निर्दिष्ट करें। पाठक को पहले कुएं में लाएं और सफेद प्रकाश में 10x आवर्धन पर क्षेत्र का पता लगाएं और ध्यान केंद्रित करें। प्रोग्राम प्रारंभ करें।
      नोट: यह उच्च गुणवत्ता वाली 4 पंक्तियों x 5 कॉलम एकाधिक फोटो कोलाज बनाने के लिए एक प्रोग्राम है। कार्यक्रम एचडी गुणवत्ता में एक के बाद एक ली गई तस्वीरों को जोड़ता है। जब आप सिस्टम स्टार्ट बटन दबाते हैं, तो कुएं स्वचालित रूप से पढ़े जाते हैं, और यह 4 पंक्तियों x 5 कॉलम कई तस्वीरें लेता है और टांके लगाता है।

3. ग्राफीन - बायोइंक बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल उत्पादन और डब्ल्यूजे-एमएससी भेदभाव

  1. बायोइंक का उत्पादन
    नोट: लियोफिलाइज्ड व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल्गिनेट-जिलेटिन (3: 5) पाउडर का उपयोग बायोइंक के आधार के रूप में किया जाता है। ग्राफीन बायोइंक समूह (3 डी-जी; 3 डी-जीएस) और ग्राफीन-मुक्त नियंत्रण बायोइंक समूह (3 डी-बी; 3 डी-बीएस) एक ही विधि के साथ तैयार किए जाते हैं (तालिका 1)।
    1. तैयारी के लिए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग करें। सबसे पहले, 4.5 मिलीग्राम एल्गिनेट और 1.5 मिलीग्राम जिलेटिन का वजन करें और एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 50 एमएल की कुल मात्रा में मिश्रण में 10% एफबीएस युक्त डीएमईएमएफ -12 माध्यम जोड़ें। यह ग्राफीन के बिना नियंत्रण (सी) समूह है।
    2. 4.5 मिलीग्राम एल्गिनेट और 1.5 मिलीग्राम जिलेटिन का वजन दोहराएं और एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर, चरण 2.1.3 से तैयार 0.1% ग्राफीन का 50 μL लें। और इसे ट्यूब में जोड़ें। 50 एमएल की कुल मात्रा में 10% एफबीएस के साथ डीएमईएमएफ -12 जोड़ें।
    3. बायोइंक को पहले पिपेटिंग और फिर भंवर द्वारा मिलाएं। 20 मिनट के लिए 1.5 एटीएम दबाव के तहत 121 डिग्री सेल्सियस पर एक ऑटोक्लेव में निष्फल करें। वैकल्पिक रूप से, क्वथनांक तक माइक्रोवेविंग द्वारा नसबंदी करें।
    4. मिश्रण को आटोक्लेव करने के बाद, गठित बुलबुले को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 280 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। कोशिकाओं के तैयार होने तक बायोइंक को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. डब्ल्यूजे-एमएससी और 3 डी बायोप्रिंटिंग को जोड़ना
    1. गिनती के लिए, लगभग 5 एमएल पीबीएस के साथ 80% संगम होने पर कोशिकाओं को धोएं, और 0.25% ट्रिप्सिन और 2.21 एमएम ईडीटीए 4 एनए के 5 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
    2. इनक्यूबेटर से हटाने के बाद कोशिकाओं में 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम-एफ 12 माध्यम का 10 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह से निलंबित करें, माध्यम एकत्र करें, और इसे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 101 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और फिर सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    3. गोली के साथ लगभग 250 μL मध्यम छोड़ दें। 1 एमएल ताजा माध्यम में गोली को फिर से हल करें। 4की गिनती के लिए शंक्वाकार ट्यूब (1.5 एमएल) में 48 μL सेल सस्पेंशन और 50 μL ट्रिपैन ब्लू (0.4 ग्राम ट्रिपैन ब्लू / 100 एमएल) जोड़ें। इसे अच्छी तरह से समझें।
    4. थोमा सेल गिनती कक्ष में तैयार दाग वाले सेल निलंबन के लगभग 10 एमएल जोड़ें। प्रकाश माइक्रोस्कोप के दोनों किनारों पर वर्गों में गिरने वाली कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना करें।
      जीवन शक्ति प्रतिशत (%) की गणना करें = (गणना व्यवहार्य कोशिकाएं / कुल कोशिकाओं की गणना) x 100
      नोट: सेल-बायोइंक इंटरैक्शन का अध्ययन दो तरीकों से किया जाता है: (1) इसे बायोइंक (3 डी-बी; 3 डी-जी) में जोड़कर मुद्रित किया जा सकता है; (2) कोशिकाओं को दबाने के बाद बायोइंक पर बीज दिया जाता है, और कोशिकाएं एक स्फेरॉइड (3 डी-बीएस; 3 डी-जीएस) बनाती हैं।
    5. सेल-बायोइंक इंटरैक्शन के लिए, पहले बायोइंक समूह बनाएं (तालिका 1)। समूह 1 में बायोप्रिंटिंग के लिए बायोइंक के साथ मुद्रित 3 डी-बी और 3 डी-जी शामिल हैं। समूह 2 में 3 डी-बीएस और 3 डी-जीएस बायोइंक शामिल हैं जिन पर बायोप्रिंटिंग के बाद स्फेरॉइड का गठन किया गया था।
    6. समूह 1 के लिए कोशिकाओं की गणना करें ताकि 0.5 एमएल माध्यम में लगभग 1 x 107 कोशिकाएं हों। कुल मात्रा को 5 एमएल तक लाने के लिए 4.5 एमएल बायोइंक जोड़ें। इसे सिरिंज की मदद से बाँझ कैबिनेट में कारतूस में स्थानांतरित करें। बायोप्रिंटर के संबंधित एक्सट्रूडर अनुभाग में कारतूस स्थापित करें।
    7. दूसरे समूह के लिए, प्रत्येक बायोइंक समूहों से 5 एमएल लें और उन्हें इंजेक्टर की मदद से बाँझ कारतूस में स्थानांतरित करें।
    8. दो समाक्षीय प्रिंटहेड और वायवीय-संचालित एक्सट्रूज़न तकनीक के साथ बायोप्रिंटर का उपयोग करें। एक्स/वाई/जेड रिज़ॉल्यूशन प्रति माइक्रोस्टेप 1.25 μm, एक्सट्रूज़न चौड़ाई 400 μm और एक्सट्रूज़न ऊंचाई 200 μm पर सेट करें। एक 20 मिमी x 20 मिमी x 5 मिमी ग्रिड 3 डी बायोप्रिंटिंग काम के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले 3 डी मॉडल में से एक है।
    9. ओपन-सोर्स, वेब-आधारित सीएडी प्रोग्राम का उपयोग करके 3 डी मॉडल बनाएं। बायोप्रिंटिंग से पहले, ओपन-सोर्स प्लेटफार्मों (जैसे, इनफिल) में से एक के साथ सरल 3 डी मॉडल बनाएं। मॉडल रैखिक (यहां उपयोग किए जाने वाले मॉडल की तरह), मधुकोश, या ग्रिड के आकार का हो सकता है। 5 मिमी x 20 मिमी x 20 मिमी वर्ग बनाने के बाद .stl प्रारूप में निर्यात और डाउनलोड करें।
    10. बायोप्रिंटर सॉफ्टवेयर .stl फ़ाइलों का उपयोग करता है और स्लाइसर मॉड्यूल का उपयोग करके उन्हें मुद्रण योग्य .gcode प्रारूप में परिवर्तित करता है। प्रिंट करने योग्य ग्रिड आकार प्राप्त करने के लिए, स्लाइसर मॉड्यूल में बाहरी शेल को अक्षम करें। ऑपरेशन से पहले डिवाइस को 70% इथेनॉल के साथ पोंछें और फिर यूवी नसबंदी द्वारा निष्फल करें।
    11. बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के लिए, इंजेक्टर की मदद से बायोइंक समूहों को कारतूस में स्थानांतरित करें। बायोप्रिंटर के संबंधित एक्सट्रूडर अनुभाग में कारतूस स्थापित करें।
    12. 3 डी प्रिंटर का औसत दबाव 7.5 पीएसआई और कारतूस और बिस्तर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। गति को 60% तक सेट करें और एक मानक 3 डी प्रिंटिंग प्रक्रिया करें।
      नोट: रिक्त स्थान (एक रैखिक मॉडल की तरह) के साथ तैयार मॉडल की योजना बनाने से बायोप्रिंटिंग के बाद रिक्त स्थान में सेल संस्कृति की अनुमति मिलती है।
    13. लेखन चरण के दौरान सिस्टम को होम पोजीशन में रखें। अक्षों (X, Y, Z) को स्वचालित रूप से रखें, एक्सट्रूडर का चयन करें, और सेट करें। मुद्रण प्रक्रिया प्रारंभ करें। बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के बाद, नमूना लें और इसे एक लामिनार प्रवाह कैबिनेट के तहत रखें।
    14. मुद्रण के बाद 0.1 एन सीएसीएल2 समाधान के साथ बायोइंक स्प्रे करें या कमरे के तापमान पर पिपेट के साथ घोल के 1 एमएल जोड़ें। लगभग 10-20 सेकंड तक प्रतीक्षा करें और सीए 2 + और एमजी 2 + युक्त पीबीएस के साथ मुद्रित पैटर्न2x कोधोएं।
    15. प्रत्येक सेल युक्त बायोइंक समूहों के शीर्ष पर 10% एफबीएस माध्यम के साथ डीएमईएमएफ -12 के 2 एमएल जोड़ें। प्लेटों को 5% CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेट करें। बाद में, स्फेरॉइड गठन के लिए प्रत्येक समूह में 1 x 106 कोशिकाओं वाले 2 एमएल निलंबन माध्यम जोड़ें।
    16. प्लेटों को 5% CO2 के साथ 37 °C पर इनक्यूबेट करें। 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत स्फेरॉइड गठन का निरीक्षण करें।
  3. डब्ल्यूजे-एमएससी न्यूरॉन जैसी कोशिकाओं में भेदभाव
    1. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद बायोइंक के सभी बैचों का निरीक्षण करें और फोटोग्राफ करें। प्रति अच्छी तरह से न्यूरोजेनिक भेदभाव माध्यम के 2 एमएल जोड़ें (नियंत्रण समूह को छोड़कर) और हर 2 दिनों में ताज़ा करें। तंत्रिका भेदभाव का निरीक्षण करने के लिए 7 दिनों के लिए पालन करें।

4. ग्राफीन-बायोइंक बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल लक्षण वर्णन

नोट: ग्रेफेन-बायोइंक बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल के लक्षण वर्णन के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग, फूरियर ट्रांसफॉर्म इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफटी / आईआर), और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) विश्लेषण किए जाते हैं। नमूने एफटी/आईआर और एसईएम विश्लेषण के लिए ड्रिप विधि द्वारा 3 डी-बी और 3 डी-जी बायोइंक समूहों से बनाए गए हैं।

  1. FT/IR विश्लेषण
    आईआर गणितीय फूरियर ट्रांसफॉर्म पर आधारित एक रासायनिक विश्लेषणात्मक विधि है, जो सामग्री लक्षण वर्णन के लिए अपरिहार्य है। 28 डिग्री सेल्सियस मिशेलसन इंटरफेरोमीटर सिद्धांतों पर आधारित एफटी / आईआर डिवाइस का उपयोग करें, जिसमें एक हलोजन लैंप, वाटर-कूल्ड पारा प्रकाश स्रोत, 4 सेमी -1 का सिग्नल पहलू अनुपात, 1 मिनट के लिए मापा जाता है, 2,200 सेमी -1 पर।
    1. आईआर माइक्रोस्कोप तैयार करें और सुनिश्चित करें कि उपकरण के प्रकाशिकी संरेखित हैं। डिवाइस को कैलिब्रेट करें।
    2. चूंकि नमूना एक बूंद में है, इसलिए 1-2 मिमी मोटी हाइड्रोगेल का एक टुकड़ा लें और इसे नमूना भाग पर बल के साथ रखें। नमूने पर ध्यान केंद्रित करें और इसे तब तक उठाएं जब तक कि निकट संपर्क न हो जाए। सिस्टम से प्रक्रिया शुरू करके नमूना स्पेक्ट्रम एकत्र करें।
  2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) विश्लेषण
    नोट: सतह आकृति विज्ञान, आंतरिक संरचना, सेल वितरण, और बायोइंक-सेल इंटरैक्शन की जांच विभिन्न आयामों में एसईएम विश्लेषण द्वारा की जा सकती है।
    1. पिपेट टिप ड्रॉपलेट विधि का उपयोग करके हाइड्रोजेल को 6-वेल प्लेटों में छोड़ दें जिसमें 1 एमएल सीएसीएल2 क्रॉसलिंकर होता है ( चित्रा 1 देखें)।
    2. लवण के घोल को मुक्त करने के लिए प्लेटों को लगभग 1 एमएल पीबीएस के साथ 2x धोएं। फिर, इन बूंदों को एक फाल्कन ट्यूब में डालें जिसमें फोर्सप्स की मदद से 5% पैराफॉर्मलडिहाइड का 5 एमएल होता है।
    3. स्केलपेल की मदद से ड्रॉप बायोइंक से पतले खंड बनाएं। धातु की प्लेट पर चिपचिपे पक्ष पर नमूने चिपकाएं। कोटिंग डिवाइस में डालें जहां गोल्ड पैलेडियम, जो आर्गन गैस के साथ हवा को बदलकर प्लाज्मा चरण में गुजरता है, नमूने को कवर करता है।
    4. इसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) में रखें। माइक्रोस्कोप प्रोग्राम खोलें जिससे एसईएम जुड़ा हुआ है। स्केलिंग करें और नमूने के विभिन्न हिस्सों की छवियां लें। इस प्रोटोकॉल के लिए, 5 μm, 10 μm, और 200 μm स्केल का उपयोग किया गया था। 3 डी-बी और 3 डी-जी समूहों के लिए कुल 40 चित्र लिए गए थे।
  3. टाइम-लैप्स इमेजिंग
    नोट: टाइम-लैप्स इमेजिंग के दौरान, न केवल जीएफपी जीन रूपांतरित कोशिकाओं वाले बायोइंक नमूनों का उपयोग किया गया था, बल्कि स्फेरॉइड के साथ बायोइंक को 16 घंटे के लिए चित्रित किया गया था। स्टेम कोशिकाओं पर ग्राफीन के प्रभावों की जांच करने और बायोइंक के भीतर सेल इंटरैक्शन की निगरानी करने के लिए टाइम-लैप्स इमेजिंग की जाती है।
    1. चरण 3.2.11 में 5 एमएल बायोइंक और बायोप्रिंट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 1 x 107 जीएफपी-लेबल एमएससी जोड़ें। क्रॉसलिंकर का 1 एमएल जोड़ें, 20-30 सेकंड के लिए पकड़ें, और पीबीएस के साथ 2 एक्स धोएं।
    2. टाइम-लैप्स मॉनिटर चालू करें और कंप्यूटर पर प्रोग्राम खोलें। टाइम-लैप्स मोड में लगभग 16 घंटे सेट करें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। प्रारंभ करें बटन दबाएँ । सिस्टम द्वारा 40 सेकंड टाइम-लैप्स वीडियो नमूने के रूप में वीडियो रिकॉर्ड किए जाते हैं।
    3. माइक्रोस्कोप को हर 2 घंटे में 10x आवर्धन पर केंद्रित करें। इसके अलावा, समान चरणों का पालन करके बनाए गए स्फेरॉइड की कल्पना करें।

Figure 1
चित्र 1: 3D-B और 3D-G बायोइंक समूह लक्षण वर्णन में उपयोग के लिए बूंदों के रूप में उत्पादित होते हैं। (A) क्रॉसलिंकर वाली प्लेट पर बायोइंक नमूने (पूर्व-लक्षण वर्णन छवि)। (बी) बायोइंक की 3 डी-बी ड्रॉप छवि। (सी) 3 डी-जी बायोइंक ड्रॉप छवि। विशेषता वाले बायोमटेरियल और इसमें शामिल कोशिकाएं सोने की परत चढ़ाना, नमूनाकरण आदि जैसी प्रक्रियाओं से अधिक आसानी से जा सकती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. इम्यूनोस्टेनिंग विधि द्वारा न्यूरोजेनिक भेदभाव का निर्धारण

  1. गोले के रूपों को बाधित किए बिना, स्फेरॉइड एकत्र करें, और ऊतक अनुभागन के लिए पैराफिन में एम्बेड करने के बजाय, एक आसान विधि के साथ पुन: पेंट करने के लिए नई प्लेटों में फिर से बीज करें।
  2. लगभग 20 एमएल प्री-ऑटोक्लेव 0.1% जिलेटिन समाधान के साथ 48-वेल प्लेटों को कवर करें और कम से कम 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखें। पिपेट ने 48-वेल प्लेटों में लगभग 500 μL 0.1% जिलेटिन तैयार किया। जिलेटिनस प्लेटों को इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए छोड़ दें।
    नोट: यह जिलेटिन को थोड़ा सूजने की अनुमति देगा, सतह को कवर करेगा और एकत्रित स्फेरॉइड को संलग्न करने के लिए एक बेहतर वातावरण बनाएगा।
  3. पाइपिंग द्वारा स्फेरॉइड इकट्ठा करें, इनक्यूबेटर से एकत्रित स्फेरॉइड को 48-वेल प्लेट के कुओं में वितरित करें, और ताजा माध्यम जोड़ें। फिर, 12-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: गिनती द्वारा स्फेरॉइड को वितरित करना काफी मुश्किल है। स्फेरॉइड को एक ट्यूब में इकट्ठा करें और समान रूप से कुल मात्रा को कुओं में वितरित करें। इस अध्ययन के लिए, प्रत्येक कुएं में लगभग 4-6 स्फेरॉइड शामिल थे।
    नोट: 2 डी नमूने के लिए, प्री-स्टेन वॉशिंग पर्याप्त है, और कोई मीडिया प्रतिस्थापन की आवश्यकता नहीं है।
  4. माध्यम को हटा दें और धीरे-धीरे पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं क्योंकि स्फेरॉइड शीर्ष पर होंगे। 2 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में फिक्स करें।
  5. नमूने को फिर से पीबीएस के साथ धोएं और 30 मिनट के लिए 2% बीएसए और 0.1% ट्राइटनएक्स के लगभग 10 एमएल के साथ ब्लॉक करें। फिर, पीबीएस 3 एक्स के साथ धो लें।
  6. एंटीबॉडी डिल्युएंट अभिकर्मक समाधान के साथ 1: 100 अनुपात में चयनित प्राइमर एंटीबॉडी (एन-कैडरिन-खरगोश और β-III ट्यूबुलिन-माउस) को पतला करें। प्रत्येक नमूने में 100 μL एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. नमूने को पीबीएस के साथ 3x धोएं। β-III ट्यूबुलिन के लिए एंटी-माउस आईजीजी-एफटीआईसी-खरगोश और एन-कैड के लिए एंटी-माउस आईजीजी-एससी 2781-बकरी द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें, जो 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1:200 तक पतला हो जाता है। अंधेरे में सभी ऑपरेशन करें।
    नोट: डबल स्टेनिंग में प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, माउस) के रूप में जो भी तनाव का उपयोग किया जाता है, द्वितीयक एंटीबॉडी के लिए एक अलग तनाव (जैसे, बकरी या खरगोश) का उपयोग किया जाना चाहिए।
  8. पीबीएस 3 एक्स के साथ द्वितीयक एंटीबॉडी को धोएं और फिर प्रत्येक नमूने में डीएपीआई समाधान (1: 1) को ड्रिप करें। 15-20 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग करें।

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Representative Results

ग्राफीन विषाक्तता और 2 डी इमेजिंग
प्राप्त एमटीटी परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में टुकी के परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा के साथ आयोजित किया गया था, और प्राप्त ग्राफ को चित्रा 2 में दिखाया गया है। नियंत्रण की तुलना में ग्राफीन प्रतिशत ने केवल 0.001% ग्राफीन एकाग्रता (*पी < 0.01) के लिए महत्वपूर्ण कमी दिखाई। अन्य समूहों और नियंत्रण (पी > 0.05) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे। इसलिए, इष्टतम ग्राफीन एकाग्रता 0.1% निर्धारित की गई थी क्योंकि एमटीटी परीक्षण परिणामों और सिलाई छवियों के अनुसार इस एकाग्रता के संपर्क में आने के बाद उच्चतम व्यवहार्यता दर देखी गई थी।

Figure 2
चित्रा 2: सेल प्रसार पर ग्राफीन एकाग्रता के प्रभाव की जांच। नियंत्रण की तुलना में ग्राफीन प्रतिशत ने केवल 0.001% ग्राफीन एकाग्रता (*पी < 0.01, एन = 6) के लिए महत्वपूर्ण कमी दिखाई। अन्य समूहों और नियंत्रण के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं थे (पी > 0.05; एन = 6)। प्राप्त एमटीटी परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में टुकी के परीक्षण के साथ एक तरफ़ा एनोवा के साथ आयोजित किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. इस आंकड़े को28 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रस्तुत विधि का यह हिस्सा दर्शाता है कि भविष्य के अध्ययनों में स्टेम सेल-ग्राफीन इंटरैक्शन का उपयोग किया जा सकता है। यह देखा गया कि, प्रत्येक परीक्षण एकाग्रता में, ग्राफीन को 2 डी प्रणाली में सहन किया गया था और एंडोसाइटोसिस (चित्रा 3) के माध्यम से कोशिकाओं द्वारा उठाया गया था। यह निर्धारित किया गया है कि ग्रेफेन प्लेटें कोशिका के अंदर साइटोप्लाज्म के साथ चलती हैं।

Figure 3
चित्र 3: सेल-ग्राफीन इंटरैक्शन सिले हुए चित्रों में दो आयामों में दिखाए जाते हैं। (ए) नियंत्रण; (बी) 0.0001%; (ग) 0001%; (डी) 0.01%; (ई) 0.1%; और (एफ) ग्राफीन की 1% सांद्रता। यह कई तस्वीरों के 4 पंक्तियों x 5 कॉलम कोलाज प्राप्त करने के लिए उच्च परिभाषा गुणवत्ता सेटिंग्स के साथ टाइम-लैप्स इमेजिंग के संयोजन से प्राप्त किया जाता है। इस आंकड़े को 28 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके अलावा, इस अध्ययन में, यह देखा गया कि ग्राफीन-बायोइंक प्रभाव ने 3 डी प्रणाली में कोई विषाक्त माइक्रोएन्वायरमेंट नहीं बनाया और कोशिकाएं बातचीत में थीं।

यह भी देखा गया है कि 3 डी सिस्टम में ग्राफीन के उपयोग ने कोई विषाक्त माइक्रोएन्वायरमेंट नहीं बनाया। कोशिकाओं के लिए विषाक्त खुराक का निर्धारण दीर्घकालिक नाली प्रत्यारोपण या इंजेक्शन हाइड्रोगेल रूपों में ग्राफीन के उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, चूंकि ग्राफीन न्यूरोनल संचार में एक प्रभावी सामग्री है, इसलिए तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में इसका उपयोग व्यापक रूप से बढ़ गया है, जैसा कि साहित्य25 में प्रलेखित है।

मिश्रित बायोमैटेरियल्स और 3 डी बायोप्रिंटिंग का उत्पादन
जिलेटिन-एल्गिनेट-आधारित बायोइंक बायोहाइब्रिड पैटर्निंग का गठन ग्राफीन (0.1%) की गैर विषैले एकाग्रता के साथ किया गया था। यह देखा गया है कि ग्राफीन की चयनित उपयुक्त खुराक बायोइंक में कोशिकाओं के साथ बातचीत करती है।

टाइम-लैप्स इमेजिंग
जीएफपी नमूने समय-अंतराल में लगभग 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए थे, और तस्वीरें और वीडियो लिए गए थे (वीडियो 1)। कोशिका मृत्यु देखे जाने पर जीएफपी सिग्नल खो गए थे। यहां, यह पता चला कि 3 डी ग्राफीन माध्यम में जीवित रहने वाली कोशिकाओं ने अपनी जीवन शक्ति को बनाए रखा क्योंकि जीएफपी चमक इनक्यूबेशन के अंत तक देखी गई थी।

वीडियो 1. जीएफपी-लेबल डब्ल्यूजे-एमएससी का टाइम-लैप्स वीडियो। एक दूसरे के साथ लेबल स्टेम कोशिकाओं की बातचीत देखी जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्राफीन-बायोइंक बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल लक्षण वर्णन
एसईएम और एफटी / आईआर का उपयोग ड्रॉप बायोइंक विधि द्वारा बनाए गए 3 डी-बी और 3 डी-जी समूहों के लक्षण वर्णन के लिए किया गया था। 3 डी-बी और 3 डी-जी बायोइंक समूहों की एसईएम छवियां चित्रा 4 में दी गई हैं। चरण 4.2.5 पर ली गई 40 छवियों में से, 4 प्रतिनिधि छवियां यहां दिखाई गई हैं।

Figure 4
चित्रा 4: 3 डी-बी और 3 डी-जी बायोइंक समूहों की एसईएम छवियां। (ए) इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ सोने-लेपित 3 डी-बी बायोइंक खंड की छवि। स्केल बार: 200 μm. (B) 3D-B बायोइंक आंतरिक सतह से जुड़े एमएससी की छवि। स्केल बार: 5 μm (C) 3D-G बायोइंक आंतरिक और बाहरी सतह की छवि। स्केल बार: 200 μm.(D) आंतरिक सतह सेल 3D-G बायोइंक आसंजन छवि। स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

तदनुसार, बायोइंक-सेल इंटरैक्शन को सतह पर और आंतरिक रूप से प्रदर्शित किया गया था। दोनों बायोइंक (3 डी-बी; 3 डी-जी) में एक सेल-बायोमटेरियल इंटरैक्शन था। कोशिकाएं रूपात्मक रूप से गोल थीं और सामग्री से जुड़ी हुई थीं। 3 डी-बी और 3 डी-जी बायोइंक ड्रॉप के एफटी / आईआर विश्लेषण की तुलना चित्रा 5 में ग्राफ के साथ की गई थी।

Figure 5
चित्रा 5: एफटी / आईआर विश्लेषण। (ए) 3 डी-बी बायोइंक। (बी) 3 डी-जी बायोइंक। साहित्य 26 में एल्गिनेट-जिलेटिन-आधारित हाइड्रोगेल अध्ययनों में 1633.41 सेमी-1, 1552.42 सेमी-1 और 1033 सेमी-1 जैसी चोटियां पाई गई हैं। इसके अलावा, 1335.46 सेमी -1 शिखर ग्राफीन बायोमैटेरियल अध्ययन27 में देखी गई चोटियों के समान है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चूंकि नियंत्रण बायोइंक (3 डी-बी) एल्गिनेट / जिलेटिन पर आधारित था, इसलिए सबसे प्रमुख चोटियां 1546 सेमी -1 26 पर देखी गई चोटियों के साथ साहित्य में इसी तरह के अध्ययनों की तुलना में 1633.41 सेमी -1, 1552.42 सेमी -1 और 1033 सेमी -1 के आसपास थीं। ग्राफीन समूह (3 डी-जी) में 1399 सेमी -1 का शिखर देखा गया था और ग्राफीन27 के साथ किए गए एक अध्ययन में 1335.46 सेमी -1 पर एक समान शिखर पाया गया था। 

3 डी न्यूरोनल भेदभाव
7 वें दिन के पोस्ट भेदभाव के बाद बायोइंक पर स्फेरॉइड की छवियों को चित्रा 6 में दर्शाया गया है।

Figure 6
चित्रा 6: नियंत्रण WJ-MSCs और स्फेरॉइड समूह के नमूनों की 2D छवि 7 दिन विभेदन के बाद। (A) 3D-BS समूह बायोइंक से गोले का आकार जिसमें व्यास 160 μm और 200 μm है। (B) 2D नियंत्रण कोशिकाएं। (सी) 3 डी-बीएस समूह और (डी) 3 डी-जीएस समूह से स्फेरॉइड। (डी) में काली सामग्री ग्रेफेन अणु हैं जो स्फेरॉइड के साथ एकीकृत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह देखा गया कि कोशिकाओं ने 2 डी और 3 डी दोनों संस्कृतियों में अपनी जीवन शक्ति बनाए रखी। यह माना जाता था कि दोनों समूहों (3 डी-बी और 3 डी-जी) में स्फेरॉइड कोशिकाओं की सीमाएं पारदर्शी और जीवंत थीं, और ग्राफीन समूह में स्फेरॉइड अपेक्षाकृत बड़े थे और सेल के अंदर ग्राफीन को फंसाते थे। विभेदन का परीक्षण इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा भी किया गया था। यहां उपयोग किए जाने वाले डबल स्टेनिंग के साथ, 2 डी न्यूरोनल परिवर्तन में कोशिकाओं की गतिविधियों की तुलना 3 डी संस्कृति (चित्रा 7) से की गई थी।

Figure 7
चित्रा 7: 2 डी और 3 डी कोशिकाओं का इम्यूनोस्टेनिंग। (ए, बी) 3 डी-बीएस बायोइंक पर सुसंस्कृत स्फेरॉइड का इम्यूनोस्टेनिंग। (सी, डी) 3 डी-जीएस बायोइंक स्फेरॉइड इम्यूनोस्टेन। (E) विभेदित 2D सकारात्मक नियंत्रण WJ-MSCs. (F) उदासीन 2D नकारात्मक नियंत्रण WJ-MSCs. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

7 दिनों के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां चित्रा 7 में दिखाई गई हैं। नमूने एन-कैडरिन (हरे) और β-III ट्यूबुलिन (लाल) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी से दाग दिए गए थे। इसके अतिरिक्त, DAPI का उपयोग नाभिक (नीले या बैंगनी) के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए किया गया था। तदनुसार, 2 डी और 3 डी नमूनों में उपयोग किए जाने वाले एन-कैडरिन (हरे) 7 दिनों में भिन्न होते हैं क्योंकि यह सिग्नलिंग तंत्र और न्यूरॉन्स के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। चित्रा 7 ए-ई में हरी छवि न्यूरॉन जैसी संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करती है (चित्रा 7)। कक्षा III β-ट्यूबुलिन मानव जीनोम में न्यूरॉन मार्करों के रूप में जाने जाने वाले सात आइसोटाइप में से एक है। β-III ट्यूबुलिन की तुलना में 7 दिनों के लिए विभेदित नमूनों में एन-कैडरिन अभिव्यक्ति अधिक पाई गई। वर्तमान प्रयोग के परिणामों के अनुसार, यह स्थापित किया गया था कि 3 डी सिस्टम ने कोशिकाओं के जीवित रहने और अंतर करने के लिए एक अधिक उपयुक्त माइक्रोएन्वायरमेंट बनाया। 2 डी सकारात्मक नियंत्रण नमूना (चित्रा 7 ई) ने 3 डी नमूने (चित्रा 7 ए-डी) की तुलना में कम न्यूरॉन जैसी संरचना मार्कर व्यक्त किए। इससे हमें पता चलता है कि 3 डी संरचना के साथ बनाया गया माइक्रोएन्वायरमेंट स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव में अधिक प्रभावी है। इसके अलावा, अकेले सेल थेरेपी के बजाय; बायोमटेरियल-सेल संयुक्त उपचार तंत्रिका क्षति में अधिक प्रभावशाली और प्रभावी प्रतीत होते हैं।

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Discussion

पारंपरिक 2 डी विधियों पर इंजीनियर 3 डी मचानों के साथ लागू उपचार के फायदे हर दिन अधिक से अधिक ध्यान देने योग्य होते जा रहे हैं। इन उपचारों में अकेले उपयोग की जाने वाली स्टेम कोशिकाएं या कम जैव-अनुकूलता और बायोडिग्रेडेबिलिटी के साथ विभिन्न बायोमैटेरियल्स से उत्पादित मचानों के साथ आमतौर पर परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन में अपर्याप्त होती हैं। व्हार्टन की जेली मेसेनकाइमल स्टेम सेल (डब्ल्यूजे-एमएससी) एक उपयुक्त उम्मीदवार सेल लाइन प्रतीत होती है, विशेष रूप से अधिग्रहण के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन, उनकी प्रसार क्षमता और उनकी भेदभाव क्षमता29 पर विचार करते हुए। इस अध्ययन में, हमने 2 डी और 3 डी दोनों संस्कृतियों में ग्राफीन के साथ स्टेम कोशिकाओं की बातचीत की जांच की। हमने 2 डी वातावरण के साथ उत्पन्न बायोहाइब्रिड हाइड्रोगेल समूहों में न्यूरोजेनिक भेदभाव की तुलना भी की। हमने इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा बायोइंक पर न्यूरोस्फीयर गठन का प्रदर्शन किया। आगे के अध्ययनों में, हमने अपने उम्मीदवार प्रोटोटाइप की विशेषता बताई, जिसे एसईएम और एफटी / आईआर विधियों द्वारा तंत्रिका चैनल के रूप में इंजेक्ट या प्रत्यारोपित किया जा सकता है। यह अध्ययन उत्पादित बायोमटेरियल के गुणों, सेल-बायोमटेरियल इंटरैक्शन और बायोमटेरियल की उपस्थिति में स्टेम कोशिकाओं के तंत्रिका भेदभाव को दर्शाता है। अगले चरणों में, माइग्रेशन पर प्रभाव की जांच की जाएगी।

दो या दो से अधिक बायोकम्पैटिबल सामग्रियों के संयोजन से गठित बायोहाइब्रिड सामग्रीसजातीय सामग्री की तुलना में उनके संरचनात्मक गुणों के संदर्भ में अधिक फायदेमंद हो रही है। पिछले अध्ययन में, चेहरे के परिधीय तंत्रिका में पॉलीग्लाइकोलिक एसिड-आधारित न्यूरो ट्यूब चैनल का आरोपण किया गया था। लेबल किए गए घ्राण स्टेम कोशिकाओं को इस नाली में डाला गया था, जिसके परिणामस्वरूप परिधीय सर्जरी का सफल पुनर्जनन हुआ और स्टेम सेल थेरेपी16 को इंजेक्ट किया गया। एक अन्य अध्ययन में, मानव सामान्य त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट और सिलिकॉन तंत्रिका नहर का उपयोग करके विकसित कई सेलुलर स्फेरॉइड से प्राप्त 3 डी संरचना की प्रभावशीलता, जो अक्सर इसकी निष्क्रिय विशेषता के कारण साहित्य में उपयोग की जाती है, की तुलना साइटिक तंत्रिका क्षति के उत्थान में की गई थी। यह दिखाया गया था कि स्फेरॉइड-आधारित 3 डी संरचना ने समरूप सामग्री20 की तुलना में साइटिक क्षति वाले पशु मॉडल में ऊतक पुनर्जनन में काफी और अधिक तेजी से वृद्धि की। हालांकि, यह ज्ञात है कि सिलिकॉन-आधारित बायोमैटेरियल्स, जो अक्सर साहित्य में उपयोग किए जाते हैं, के कुछ महत्वपूर्ण नुकसान हैं, जैसे कि उच्च संक्रमण जोखिम और कम जैव-रासायनिकता15,30।

वर्तमान अध्ययन में, ग्राफीन नैनोप्लेटलेट्स के साथ बायोकंपैटिबल, बायोडिग्रेडेबल हाइड्रोगेल बायोहाइब्रिड मिश्रित ऊतक का उत्पादन, जो तंत्रिका चालन में प्रभावी होने के लिए जाना जाता है, एक 3 डी प्रिंटिंग तकनीक द्वारा किया गया था। ऐसे विभिन्न अध्ययन हैं जिनमें ग्राफीन का उपयोग तंत्रिका चालन25,30 के लिए बायोमटेरियल के रूप में किया गया है। इसके अलावा, ग्राफीन उपलब्ध सबसे पतली और सबसे हल्की सामग्री में से एक है, जो स्वास्थ्य प्रौद्योगिकियों में इसकी प्राथमिकता को बढ़ाताहै। बायोमैटेरियल्स के सबसे वांछनीय गुणों में से एक बायोडिग्रेडेबिलिटी है। ग्राफीन और इसके डेरिवेटिव13 के बायोडिग्रेडेशन की जांच के लिए प्रयोगात्मक और आणविक सिमुलेशन प्रौद्योगिकियों को लागू किया गया है। इस बिंदु पर, समग्र बायोमैटेरियल्स के रूप में सतह संशोधन-कार्यात्मकता या उत्पादन बायोडिग्रेडेशन में सुधार या रोक सकता है, बड़े पैमाने पर एडिटिव्स के गुणों के आधार पर।

विभिन्न एंजाइम, जैसे मैंगनीज पेरोक्सीडेज (एमएनपी), हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी), और मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ), ग्राफीन डेरिवेटिव के बायोडिग्रेडेशन के लिए साहित्य में उपलब्ध हैं। एमपीओ एंजाइम, जो न्यूट्रोफिल से जारी एक पेरोक्सीडेज है जो विदेशी निकायों के क्षेत्र में आता है और फागोसाइटोसिस करता है, ग्राफीन बायोडिग्रेडेशन से जुड़ा हुआ है, खासकर मानवफेफड़ों में 13। अकेले ग्राफीन नैनोट्यूब के बजाय ग्राफीन युक्त समग्र बायोमैटेरियल्स के बायोडिग्रेडेबिलिटी स्तर एक दूसरे से अलग हैं। मिश्रित सामग्री में इस वांछित संपत्ति को प्राप्त करना आसान है। इसके अलावा, ग्राफीन की विषाक्त खुराक का निर्धारण चिकित्सकीय रूप से लागू बायोमैटेरियल्स13 के उपयोग में योगदान देता है।

प्रोटोकॉल के ग्राफीन चरण का एक महत्वपूर्ण हिस्सा ग्राफीन को स्टरलाइज़ करना है जब इसका उपयोग किया जाना है। बायोहाइब्रिड-सेल इंटरैक्शन चरण के दौरान होने वाले संदूषण के जोखिम से बचा जाता है।

तंत्रिका भेदभाव पर प्राप्त बायोहाइब्रिड ग्राफीन-बायोइंक हाइड्रोगेल पैटर्निंग के प्रभाव की जांच की गई और यह साहित्य के साथ संगत था कि 3 डी प्रणाली में भेदभाव अधिक था। ऊतक-इंजीनियर सेलुलर-आधारित चिकित्सीय दृष्टिकोण के साथ बायोमैटेरियल्स के उत्पादन की आवश्यकता जो परिधीय तंत्रिका क्षति जैसे विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के खिलाफ विकसित की जा सकती है, इस अध्ययन के महत्व पर जोर देते हुए दिन-प्रतिदिन वर्तमान उपचारों की अपर्याप्तता के साथ बढ़ रही है।

पिछले अध्ययन में, 2 डी सेल कल्चर माध्यम में कोशिकाओं के साथ ग्राफीनकी बातचीत की जांच की गई थी। वहां से प्राप्त अनुभव के साथ, यहां, ग्राफीन को ज्ञात अनुपात के साथ एल्गिनेट-जिलेटिन बायोइंक में जोड़ा गया था, और 3 डी प्रिंटिंग विधि द्वारा एक नया और अद्वितीय बायोमटेरियल प्रोटोटाइप का उत्पादन किया गया था। इस नई सामग्री का उपयोग दो अलग-अलग तरीकों से सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए किया गया था। पहला 3 डी प्रिंटर पर सेल-कम्पोजिट बायोमटेरियल का सह-मुद्रण है। दूसरा बायोमटेरियल से एक सेलुलर स्फेरॉइड का गठन है। इसके अलावा, सामग्री के साथ टैग किए गए जीएफपी जीन वाले डब्ल्यूजे-एमएससी की बातचीत भी देखी गई।

इस अध्ययन में, बायोहाइब्रिड बायोइंक को एफटीआईआर और एसईएम विधियों का चयन करके विशेषता दी गई थी। ये ड्रिप विधि द्वारा गठित नमूना गेंदों को लक्षण वर्णन चरण के दौरान जांच करने में सक्षम बनाते हैं। विशेष रूप से जब से हम एसईएम गोल्ड प्लेटिंग चरण के दौरान एक कठोर और सूखी संरचना की जांच कर सकते हैं, एसईएम इस विधि के साथ हमारे द्वारा बनाई गई बायोइंक गेंदों से स्केलपेल के साथ बेहतर, पतले वर्गों को प्राप्त करने के लिए भौतिक उपयुक्तता प्रदान करता है।

इस विधि अध्ययन में, प्रयोगों के दौरान कोशिकाओं को दो अलग-अलग तरीकों से बायोहाइब्रिड सामग्री में जोड़ा गया था: 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए या स्फेरॉइड गठन के दौरान। बायोइंक के साथ कोशिकाओं को कवर करना और 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग करना शोधकर्ताओं को तंत्रिका पुनर्जनन के लिए किसी भी वांछित 3 डी आकार बनाने की अनुमति देता है। दूसरी ओर, यह मुद्रण दबाव के कारण कोशिकाओं पर अधिक तनाव का कारण बनता है और इसलिए, सेल व्यवहार्यता का नुकसान होता है। हालांकि, यह सेल होमिंग को बढ़ाने के लिए एक अधिक वांछनीय तरीका हो सकता है जब उन्हें पुनर्जनन को प्रेरित करने के लिए एक विशिष्ट क्षेत्र में इंजेक्शन या प्रत्यारोपित किया जाता है।

बायोइंक पर स्फेरॉइड का निर्माण सेल इंटरैक्शन के मामले में कृत्रिम ऊतक का अधिक उपयोग करने योग्य रूप बनाता है और सेल भेदभाव के लिए एक बेहतर जगह प्रदान करता है। यह प्राकृतिक माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल करने और इसलिए, सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए भी उपयुक्त है। बायोइंक के लिए स्फेरॉइड का कम आसंजन भी बायोइंक और अनुप्रयोगों की बहुमुखी प्रतिभा से आसानी से पृथक्करण की अनुमति देता है।

उपयोग किए गए एन-कैडरिन ( चित्रा 7 में हरे रंग में दिखाए गए) सेल सिग्नलिंग तंत्र का हिस्सा हैं और न्यूरॉन्स32 के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कक्षा III β-ट्यूबुलिन मानव जीनोम में न्यूरॉन मार्करों के रूप में जाने जाने वाले सात आइसोटाइप में से एक है। यह दर्शाता है कि इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले डब्ल्यूजे-एमएससी न्यूरॉन जैसी संरचनाओं का निर्माण शुरू करते हैं। इस संदर्भ में, 3 डी सिस्टम कोशिकाओं के लिए उनकी व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए अधिक पर्याप्त माइक्रोएन्वायरमेंट बनाएगा।

अंत में, इसमें शामिल व्यय और सेल भेदभाव प्रणालियों की नैदानिक प्रयोज्यता के कारण, न्यूरो-इंजीनियरिंग में भविष्य में मचानों, कोशिकाओं और विभेदन बायोसिग्नल33 की नियंत्रित रिहाई के साथ सिस्टम विकसित करना और इन्हें संयुक्त उपचार के रूप में क्लीनिकों में अनुकूलित करना बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, स्फेरॉइड और बायोप्रिंटिंग विधियों का उपयोग आगे के अध्ययनों में भी किया जा सकता है जहां ग्राफीन और अन्य जैव-संकेत हाइड्रोगेल में एम्बेडेड होते हैं और नियंत्रित तरीके से जारी किए जाते हैं। इन विट्रो अध्ययन विवो में सड़क पर एक महत्वपूर्ण कदम है। जब एक प्रोटोटाइप के रूप में यहां प्रदान की गई सामग्री का उत्पादन अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास मानकों के अनुसार किया जाता है, तो क्लिनिक में स्थानांतरण के लिए आवश्यक नसबंदी मानकों को प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है। यह परियोजना 3 डी बायोप्रिंटिंग तकनीक के डेवलपर एचडी बायोइंक के सहयोग से की गई थी।

Acknowledgments

इस अध्ययन में इस्तेमाल ग्राफीन को किर्क्लेरेली विश्वविद्यालय, मैकेनिकल इंजीनियरिंग विभाग में विकसित किया गया था। यह डॉ कराबेयोग्लू द्वारा दान किया गया था। ग्राफीन विषाक्तता परीक्षण को "ग्राफीन डोप्ड बायोइंक्स के साथ 3 डी बायोप्रिंटर पर मेसेनकाइमल स्टेम सेल का मुद्रण और विभेदन" (आवेदन संख्या: 1139 बी 411802273) नामक परियोजना द्वारा वित्तपोषित किया गया था, जो टीयूबीआईटीके 2209-बी-उद्योग-उन्मुख स्नातक थीसिस समर्थन कार्यक्रम के दायरे में पूरा हुआ था। अध्ययन का दूसरा हिस्सा यिल्दिज़ तकनीकी विश्वविद्यालय वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजनाओं (टीएसए-2021-4713) द्वारा प्रदान किए गए अनुसंधान निधि द्वारा समर्थित था। टाइम-लैप्स इमेजिंग चरण में उपयोग किए जाने वाले जीएफपी के साथ मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को विरोस्टेम बायोटेक्नोलॉजी द्वारा दान किया गया था। लेखक उत्पादक चर्चाओं के लिए डारिसी एलएबी और वाईटीयू सेल संस्कृति और ऊतक इंजीनियरिंग एलएबी टीम को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Centrifugal		 Hitachi Used in cell culture and biomaterial step
0.1N CaCl2 HD Bioink Used for crosslinker
0.22 µm membrane filter Aιsιmo Used for sterilization
0.45 µm syringe filter Aιsιmo Used for sterilization
1.5mL conic tube Eppendorfa Used for bioink drop
15mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used for cell culture
3D Bioprinting Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) Bioprinting Step
50 mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) Merck Millipore Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used for cell culture
Anti mouse IgG-FTIC-rabbit Santa Cruz Biotechnology J1514 Seconder antibody, used for dye
Anti mouse IgG-SC2781-goat Santa Cruz Biotechnology C3109 Seconder antibody, used for dye
Au coating device EM ACE600 Leica for gold plating of biomaterial section before SEM imaging
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process.
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process.
Cell Cultre Cabine Hera Safe KS Used for the cell culture process
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 Sigma RNBJ7249 Used as cell culture medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM Quanta FEG 450 for SEM
Fetal Bovine Serum-FBS Capricorn FBS-16A It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80°C Panasonic MDF-U5386S-PE We were used to store cells and the resulting exosomes
Gelatine-Alginate bioink powder HD Bioink Used for produced bioink step
GFP labelled-WJ-MSCs Virostem Used for imaging to cell-bioink interaction
Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) Grafen Chemical Industries Co. Used for production 3D-G bioink
Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) Cell Signalling and Santa Cruz Used for dye
JASCO 6600 Tetra for FTIR
MTT Assay Sigma Viability testing
Penicilin/Streptomycin Solution Capricorn PB-S It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Thoma slide Isolab Used for counting the cell
Time-Lapse Imaging System Zeiss Axio.Observer.Z1 Imaging
Tripsin-EDTA Multicell The flask was used to remove the cells covering the surface.
Vorteks Biobase For produced bioink step
WJ-MSCs ATCC Used for the cell culture process

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