Summary
Neste manuscrito, demonstramos a preparação de uma biotinta hidrogel biohíbrida contendo grafeno para uso em engenharia de tecidos periféricos. Utilizando este material biohíbrido 3D, é realizado o protocolo de diferenciação neural de células-tronco. Este pode ser um passo importante para trazer biomateriais semelhantes para a clínica.
Abstract
Neuropatias periféricas podem ocorrer como resultado de dano axonal e, ocasionalmente, devido a doenças desmielinizantes. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que ocorre em 1,5%-5% dos pacientes de emergência e pode levar a perdas significativas de empregos. Hoje, as abordagens baseadas em engenharia de tecidos, consistindo em arcabouços, linhagens celulares apropriadas e biossinais, tornaram-se mais aplicáveis com o desenvolvimento de tecnologias de bioimpressão tridimensional (3D). A combinação de vários biomateriais de hidrogel com células-tronco, exossomos ou moléculas de biosinalização é frequentemente estudada para superar os problemas existentes na regeneração de nervos periféricos. Nesse sentido, a produção de sistemas injetáveis, como hidrogéis, ou estruturas de condutos implantáveis formadas por diversos métodos de bioimpressão tem ganhado importância na neuroengenharia periférica. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Estas não são células especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta à lesão. O sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado de nicho de células-tronco. Nas lesões nervosas periféricas, especialmente na neurotmese, esse microambiente não pode ser totalmente resgatado mesmo após a ligação cirúrgica das terminações nervosas cortadas. A abordagem de biomateriais compósitos e terapias celulares combinadas aumenta a funcionalidade e aplicabilidade dos materiais em termos de várias propriedades, como biodegradabilidade, biocompatibilidade e processabilidade. Nesse sentido, este estudo tem como objetivo demonstrar a preparação e o uso de padrões de hidrogel biohíbrido à base de grafeno e examinar a eficiência da diferenciação de células-tronco em células nervosas, o que pode ser uma solução eficaz na regeneração nervosa.
Introduction
O sistema nervoso, que é o mecanismo que faz a ponte entre a estrutura interna do organismo e o ambiente, é dividido em duas partes: o sistema nervoso central e o periférico. A lesão dos nervos periféricos é um problema global que constitui 1,5%-5% dos pacientes que chegam ao pronto-socorro e se desenvolve devido a vários traumas, levando à perda significativa do emprego 1,2,3.
Atualmente, as abordagens celulares da neuroengenharia periférica são de grande interesse. As células-tronco vêm em primeiro lugar entre as células usadas nessas abordagens. Em condições normais, as células-tronco são as células regenerativas do corpo, e seu número e funções não diminuem com o tempo para proteger suas populações; Essas células são especializadas, mas podem se diferenciar mediante estimulação apropriada em resposta àlesão4,5. De acordo com a hipótese das células-tronco, o sistema de células-tronco está sob a influência de seu microambiente, chamado nicho de células-tronco. A preservação e diferenciação das células-tronco são impossíveis sem a presença de seumicroambiente6, que pode ser reconstituído via engenharia tecidual utilizando células e scaffolds7. A engenharia de tecidos é um campo multidisciplinar que inclui princípios de engenharia e biologia. A engenharia tecidual fornece ferramentas para a criação de tecidos artificiais que podem substituir tecidos vivos e podem ser usados na regeneração desses tecidos, removendo os tecidos danificados e fornecendo tecidos funcionais8. Os arcabouços teciduais, um dos três pilares da engenharia de tecidos, são produzidos por diferentes métodos a partir de materiais naturais e sintéticos9. A impressão tridimensional (3D) é uma tecnologia emergente de manufatura aditiva que é amplamente utilizada para substituir ou restaurar tecidos defeituosos através de sua produção simples, mas versátil, de formas complexas usando vários métodos. A bioimpressão é um método de manufatura aditiva que possibilita a coexistência de células e biomateriais, denominados biotintas10. Considerando a interação das células nervosas entre si, os estudos mudaram para candidatos a biomateriais condutores, como o grafeno. As nanoplacas de grafeno, que possuem propriedades como eletrônica flexível, supercapacitores, baterias, óptica, sensores eletroquímicos e armazenamento de energia, são um biomaterial preferido no campo da engenharia de tecidos11. O grafeno tem sido utilizado em estudos onde foi realizada a proliferação e regeneração de tecidos e órgãos lesados12,13.
A engenharia de tecidos consiste em três blocos de construção básicos: arcabouço, células e moléculas de biossíntese. Existem deficiências nos estudos sobre lesão de nervos periféricos em termos de fornecer essas três estruturas completamente. Vários problemas têm sido encontrados nos biomateriais produzidos e utilizados nos estudos, como o de conter apenas células-tronco ou moléculas de biossinais, a falta de uma molécula bioativa que permita a diferenciação com células-tronco, a falta de biocompatibilidade do biomaterial utilizado e o baixo efeito sobre a proliferação de células no nicho tecidual, e, assim, a condução nervosa não sendo totalmente realizada 2,13,14,15,16. Isso requer a otimização da regeneração nervosa, reduzindo a atrofia muscular 17,18 e criando homing necessário19 com fatores de crescimento contra tais problemas. Nesse ponto, a caracterização e análise da neuroatividade de um protótipo de biomaterial cirúrgico, a ser transferido para a clínica, são muito importantes.
Nesse sentido, este estudo investiga a padronização de hidrogel de biotinta com nanoplacas de grafeno formadas por uma bioimpressora 3D e sua eficácia na diferenciação neurogênica das células-tronco que contém. Além disso, os efeitos do grafeno na formação e diferenciação da neuroesfera são investigados.
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Protocol
1. Cultura de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton
- Retire as células-tronco mesenquimais gelatinosas da Wharton (WJ-MSCs, da ATCC) de um freezer de -80 °C. Culturas de CTMs-WJ em meio DMEM-F12 contendo 10% de soro fetal bovino (SFB), 1% de Pen-Strep e 1% de L-glutamina em fluxo laminar estéril à temperatura ambiente, conforme descrito em Yurie et al.20.
- Criopreservar algumas células a 1 x 106 células/mL com meio de congelamento contendo 35% FBS, 55% DMEMF-12 e 10% dimetil sulfóxido (DMSO). Para isso, conte 1 x 106 células em uma lâmina de contagem de células Thoma e adicione a solução de congelamento gota a gota. Transfira rapidamente a lâmina para um recipiente de nitrogênio líquido.
- Quando as células cultivadas estiverem 80% confluentes no frasco, despeje o meio e lave com 5 mL de PBS. Adicionar 5 mL de tripsina a 0,25% e EDTA-4Na 2,21 mM. Incubar numa incubadora a 37 °C durante 5 min.
- Adicionar 10 mL de meio DMEM-F12 com FBS a 10% às células retiradas da incubadora. Suspenda bem, colete o meio e transfira o meio para um tubo centrífugo.
- Centrifugar a uma velocidade de rotação de 101 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente. Eliminar o sobrenadante e resemear as células em frascos novos com meio nutritivo fresco contendo 10% de SFB.
NOTA: As CTMs comerciais marcadas com o gene GFP pelo método de transdução podem ser usadas para melhor visualizar as interações biomaterial-célula a serem produzidas21. Os grupos a serem utilizados nesse método podem ser criados conforme mostrado na Tabela 1.
| Grupos criados | Razões para criar | Número de representantes | ||
| 2D WJ-MSCs (2D-C) | Controle 2D | x 5 | ||
| 2D WJ-MSCs & Grafeno (2D-G) | Determinação da dose tóxica de grafeno em 2D | x 5 repetições para cada uma das diferentes concentrações | ||
| WJ-MSCs estão incluídos em biotintas (3D-B) | Controle 3D | x 3 | ||
| WJ-MSCs & 0,1% Grafeno estão incluídos em biotintas (3D-G) | Grupo Biohíbrido 3D Grafeno-Biotinta | x 3 | ||
| WJ-MSCs estão na forma esferoide nas biotintas (3D-BS) | Controle 3D da Forma Esferoide | x 3 | ||
| WJ-MSCs & 0,1% O grafeno está na forma esferoide nas biotintas (grupo 3D-GS) | Grupo Biohíbrido 3D Grafeno-Biotinta de Forma Esferoide | x3 | ||
| Gota de Biotinta 3D | É produzido para análise de caracterização por MEV e FTIR. | x5 | ||
| Gota de grafeno 3D | É produzido para análise de caracterização por MEV e FTIR. | x5 | ||
| Biotinta 3D com GFP marcada WJ-MSCs & 0,1% | Observação dos movimentos das WJ-MsCs na biotinta contendo a dose adequada de grafeno. | x3 | ||
Tabela 1. Grupos no método. Todos os grupos 2D e 3D no método estão incluídos.
2. Toxicidade do grafeno e imagens 2D
- Preparação de concentrações de grafeno e aplicação em células
OBS: Nanopartículas de grafeno bruto foram adquiridas comercialmente (tipo nanoplacas industriais de grafeno) e também foram doadas. As dimensões das partículas foram de 5-8 nm de espessura, 5 μm de diâmetro e 120-150 m2/g de área superficial.- Pesar o grafeno para criar uma solução a 1% (mg/ml). Faça uma solução-estoque adicionando 10 mL de meio DMEMF-12 com 10% de FBS aos 100 μg de nanopartículas de grafeno pesados e rotule essa solução como solução-estoque. Esterilizar em autoclave a 121 °C sob pressão de 1,5 atm por 20 min.
NOTA: A mistura estéril de grafeno é armazenada no frigorífico a 4 °C até à utilização. Pode não ser adequado para uso a longo prazo (máximo de 1 mês). Nesses casos, a mistura deve ser reconstituída e esterilizada. - Preparar uma mistura de grafeno médio em diferentes concentrações para determinar doses não tóxicas. Defina as diluições iniciais como 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% e 0,0001% grafeno/meio.
- Começando com a solução-estoque a 1%, retire sucessivamente 1 mL de cada concentração e transfira-o para um novo tubo. Adicionar 9 mL de meio DMEMF-12 com FBS a 10% a cada tubo, fazendo cinco amostras diluídas gradualmente, e agitar e agitar as soluções para obter distribuição igual. Utilizar apenas 10 mL de meio DMEMF-12 com SFB a 10% como controle.
NOTA: Os pesados flocos de grafeno precipitam-se e, portanto, precisam ser redistribuídos. - Semeando as CTMs-WJ em placas de 6 poços com 2 mL de meio fresco contendo 10% de SFB a 5 x 105 células por poço. Incubar durante 1 dia a 37 °C. Em seguida, divida as placas em grupos de poços iguais e repetidos. Faça cinco repetições para cada concentração.
- Descarte o meio e, em seguida, substitua o meio por concentrações de meio de grafeno a 2 mL por poço. Use apenas a mídia para o grupo de controle. Incubar as placas a 37 °C durante 24 horas.
- Pesar o grafeno para criar uma solução a 1% (mg/ml). Faça uma solução-estoque adicionando 10 mL de meio DMEMF-12 com 10% de FBS aos 100 μg de nanopartículas de grafeno pesados e rotule essa solução como solução-estoque. Esterilizar em autoclave a 121 °C sob pressão de 1,5 atm por 20 min.
- Determinação de concentrações não tóxicas de grafeno com MTT
- Descarte o meio com grafeno após 24 h. Lave bem cada um com PBS. Adicionar meio DMEMF-12 fresco com 10% de FBS a 2mL por poço.
NOTA: É importante lavar com PBS após a aplicação das concentrações de grafeno na célula, pois as nanopartículas de grafeno, que não são levadas para dentro da célula por endocitose, são removidas do ambiente. Isso torna o teste MTT mais eficiente. - Utilizar o protocolo MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio) para determinar o valor de IC50 indicando 50% de viabilidade celular, conforme descrito em Kose et al.22 e nas etapas 2.2.3.-2.2.6.
- Primeiro, pesar 5 mg/mL de sal MTT e dissolver em PBS. Esterilizar com filtro de 0,45 μm. Embrulhar a solução de MTT, feita em um tubo de centrífuga de 15 mL, com papel alumínio e armazenar a 4 °C.
- Adicionar 10 μL de MTT a todos os poços e incubar a placa durante 4 h a 37 °C. Observar a formação de cristais de formazana em aumento de 10x ao microscópio após a incubação.
- Para dissolver os cristais formados nas células, adicione 100 μL de DMSO a cada poço e misture por pipetagem. Mantenha a placa no escuro à temperatura ambiente durante 30 minutos. Insira a placa no leitor de placas ELISA. Defina um comprimento de onda de 570 nm do programa para medição de absorbância e peça-lhe que leia a placa22.
NOTA: Além disso, enquanto as partículas de grafeno sozinhas são lidas a 270 nm23, o intervalo de leitura de 570 nm24 aqui será apenas para leitura da viabilidade celular. - Realizar análise estatística dos resultados obtidos utilizando ANOVA one-way com teste de Tukey em um programa de análise estatística.
- Descarte o meio com grafeno após 24 h. Lave bem cada um com PBS. Adicionar meio DMEMF-12 fresco com 10% de FBS a 2mL por poço.
- Imagem de pontos
- Para examinar a interação de diferentes concentrações de grafeno com as células, realize um lapso de tempo das células com o método chamado imagem por pontos. Este método cria uma imagem de lapso de tempo usando amostras de imagem tiradas em intervalos regulares sob o microscópio.
- Para fazer isso, ligue o computador primeiro. Ligue a incubadora de imagens de lapso de tempo e configure-a para 37 °C. Coloque a placa MTT no slot da incubadora de lapso de tempo.
- Abra o programa Stitch no computador. Especifique os poços a serem lidos no sistema. Traga o leitor para o primeiro poço e localize e foque a área em 10x de ampliação em luz branca. Inicie o programa.
NOTA: É um programa para criar colagens de fotos múltiplas de alta qualidade de 4 linhas x 5 colunas. O programa combina fotos tiradas uma após a outra em qualidade HD. Quando você pressiona o botão de início do sistema, os poços são lidos automaticamente, e ele tira e costura 4 linhas x 5 colunas várias fotos.
3. Produção de hidrogel biohíbrido de grafeno - Bioink e diferenciação de CTMs-WJ
- Produção de biotintas
NOTA: Os pós de Alginato-Gelatina liofilizados comercialmente disponíveis (3:5) são usados como base de biotintas. O grupo de biotinta de grafeno (3D-G; 3D-GS) e o grupo de biotinta controle sem grafeno (3D-B; 3D-BS) são preparados com o mesmo método (Tabela 1).- Use tubos cônicos de 50 mL para o preparo. Primeiro, pesar 4,5 mg de alginato e 1,5 mg de gelatina e transferir para um tubo de centrífuga. Adicionar meio DMEMF-12 contendo 10% de FBS à mistura para um volume total de 50 mL. Este é o grupo controle (C) sem grafeno.
- Repetir a pesagem de 4,5 mg de alginato e 1,5 mg de gelatina e transferir para um tubo de centrifugação. Em seguida, tome 50 μL do grafeno 0,1% preparado do passo 2.1.3. e adicione-o ao tubo. Adicionar DMEMF-12 com FBS a 10% para um volume total de 50 mL.
- Misture as biotintas primeiro por pipetagem e depois vórtice. Esterilizar em autoclave a 121 °C sob pressão de 1,5 atm por 20 min. Alternativamente, realizar a esterilização por micro-ondas até o ponto de ebulição.
- Após as misturas serem autoclavadas, centrifugar a 280 x g por 2 min em temperatura ambiente para remover as bolhas formadas. Manter as biotintas a 37 °C até que as células estejam preparadas.
- Adição de WJ-MSCs e bioimpressão 3D
- Para a contagem, lavar as células quando houver 80% de confluência com aproximadamente 5 mL de PBS e adicionar 5 mL de tripsina a 0,25% e EDTA 4Na 2,21 mM. Deixe agir por 5 min a 37 °C.
- Adicionar 10 mL de meio DMEM-F12 com FBS a 10% às células após a retirada da incubadora. Suspenda bem, colete o meio e transfira-o para um tubo centrífugo. Centrifugar a 101 x g durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, eliminar o sobrenadante.
- Deixar aproximadamente 250 μL de meio com o pellet. Redissolver o pellet em 1 mL de meio fresco. A 48 μL de meio, adicionar 2 μL de suspensão celular e 50 μL de azul de tripano (0,4 g azul de tripano/100 mL) em um tubo cônico (1,5 mL) para contagem4. Pipetar bem.
- Adicionar aproximadamente 10 mL da suspensão de células coradas preparada a uma câmara de contagem de células Thoma. Calcule o número médio de células caindo nos quadrados em ambos os lados do microscópio de luz.
Calcular a porcentagem de vitalidade (%) = (células viáveis contadas/total de células contadas) x 100
NOTA: A interação célula-biotinta é estudada de duas maneiras: (1) Pode ser impressa adicionando-a às biotintas (3D-B; 3D-G); (2) As células são semeadas nas biotintas após serem prensadas, e as células formam um esferoide (3D-BS; 3D-GS). - Para a interação célula-biotinta, primeiro crie os grupos de biotinta (Tabela 1). O grupo 1 inclui impressão 3D-B e 3D-G com biotinta para bioimpressão. O grupo 2 inclui biotintas 3D-BS e 3D-GS nas quais esferoides foram formados após bioimpressão.
- Conte as células do grupo 1 para que haja aproximadamente 1 x 107 células em 0,5 mL de meio. Adicionar 4,5 mL de biotinta para elevar o volume total para 5 mL. Transfira para os cartuchos no armário estéril com a ajuda de seringas. Instale os cartuchos na seção da extrusora correspondente da bioimpressora.
- Para o segundo grupo, pegue 5 mL de cada um dos grupos de biotinta e transfira-os para cartuchos estéreis com a ajuda de um injetor.
- Use a bioimpressora com duas cabeças de impressão coaxiais e a tecnologia de extrusão acionada pneumática. Ajuste a resolução X/Y/Z por micropasso para 1,25 μm, a largura de extrusão para 400 μm e a altura de extrusão para 200 μm. Uma grade de 20 mm x 20 mm x 5 mm é um dos modelos 3D mais utilizados para trabalhos de bioimpressão 3D.
- Crie os modelos 3D usando programas CAD de código aberto baseados na Web. Antes da bioimpressão, crie modelos 3D simples com uma das plataformas de código aberto (por exemplo, infill). O modelo pode ser linear (como o modelo usado aqui), favo de mel ou em forma de grade. Exporte e baixe no formato .stl depois de criar um quadrado de 5 mm x 20 mm x 20 mm.
- O software da bioimpressora usa arquivos .stl e os converte para o formato .gcode imprimível usando módulos de segmentação de dados. Para obter uma forma de grade imprimível, desative o shell externo no módulo de segmentação de dados. Limpe o dispositivo com etanol 70% antes da operação e, em seguida, esterilize por esterilização UV.
- Para o processo de bioimpressão, transfira os grupos de biotinta para os cartuchos com a ajuda de um injetor. Instale os cartuchos na seção da extrusora correspondente da bioimpressora.
- Ajuste a pressão média da impressora 3D para 7,5 psi e a temperatura do cartucho e da cama para 37 °C. Defina a velocidade para 60% e realize um processo de impressão 3D padrão.
NOTA: O planejamento dos modelos preparados com espaços (como um modelo linear) permite que a cultura celular seja feita nos espaços após a bioimpressão. - Coloque o sistema na posição inicial durante a fase de escrita. Posicione os eixos (X, Y, Z) automaticamente, selecione a extrusora e configure. Inicie o processo de impressão. Após o processo de bioimpressão, pegue a amostra e coloque-a sob um gabinete de fluxo laminar.
- Borrifar as biotintas com solução de CaCl2 0,1 N após a impressão ou adicionar 1 ml da solução com uma pipeta à temperatura ambiente. Aguarde cerca de 10-20 s e lave os padrões impressos 2x com PBS contendo Ca 2+ e Mg2+.
- Adicionar 2 mL de DMEMF-12 com meio FBS a 10% sobre cada um dos grupos de biotinta contendo células. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2. Em seguida, adicionar 2 mL de meio de suspensão contendo 1 x 106 células a cada grupo para formação de esferoides.
- Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2. Após 24 h de incubação, observar a formação esferoide em microscópio invertido.
- Diferenciação de WJ-MSCs para células semelhantes a neurônios
- Observe e fotografe todos os lotes de biotinta após 24 h de incubação. Adicionar 2 mL de meio de diferenciação neurogênica por poço (exceto para o grupo controle) e atualizar a cada 2 dias. Acompanhar por 7 dias para observar a diferenciação neural.
4. Caracterização do hidrogel biohíbrido Grafeno-Biotinta
NOTA: Análises de time-lapse, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT/IR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) são realizadas para a caracterização do hidrogel biohíbrido grafeno-biotinta. As amostras são criadas a partir de grupos de biotintas 3D-B e 3D-G pelo método de gotejamento para análise FT/IR e MEV.
- Análise FT/IR
NOTA: FT/IR é um método analítico químico baseado na transformada matemática de Fourier, indispensável para a caracterização de materiais. Use um dispositivo FT/IR baseado nos princípios do interferômetro Michelson de 28 °C, com uma lâmpada halógena, fonte de luz de mercúrio resfriada a água, proporção de sinal de 4 cm−1, medida por 1 min, a 2.200 cm−1.- Prepare o microscópio FT/IR e certifique-se de que a ótica do instrumento esteja alinhada. Calibre o dispositivo.
- Uma vez que a amostra está em gota, pegue um pedaço de hidrogel de 1-2 mm de espessura e coloque-o com pinça na parte da amostra. Foque na amostra e levante-a até que seja feito um contato próximo. Colete o espectro da amostra iniciando o processo a partir do sistema.
- Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV)
NOTA: A morfologia da superfície, a estrutura interna, a distribuição celular e as interações biotinta-célula podem ser examinadas pela análise de MEV em diferentes dimensões.- Soltar o hidrogel em placas de 6 poços contendo 1 mL de reticulante de CaCl2 usando o método de gotículas de ponta de pipeta (ver Figura 1).
- Lave as placas 2x com aproximadamente 1 mL de PBS para liberar a solução de sais. Em seguida, coloque essas gotas em um tubo de falcão contendo 5 mL de paraformaldeído a 5% com a ajuda de pinças.
- Faça seções finas a partir das biotintas de gota com a ajuda de um bisturi. Cole as amostras no lado pegajoso na placa de metal. Inserir no dispositivo de revestimento onde o paládio de ouro, que passa para a fase de plasma substituindo o ar por gás argônio, cobre a amostra.
- Coloque no microscópio eletrônico (MEV). Abra o programa do microscópio ao qual o MEV está conectado. Execute o dimensionamento e tire imagens de diferentes partes da amostra. Para esse protocolo, foram utilizadas escalas de 5 μm, 10 μm e 200 μm. Foram obtidas 40 imagens para os grupos 3D-B e 3D-G.
- Imagem com lapso de tempo
NOTA: Durante a aquisição de imagens por lapso de tempo, não apenas amostras de biotinta contendo células transformadas no gene GFP foram usadas, mas também biotintas com esferoides são fotografadas por 16 h. A imagem de lapso de tempo é realizada para examinar os efeitos do grafeno nas células-tronco e para monitorar as interações celulares dentro da biotinta.- Adicionar MSCs marcadas com GFP 1 x10 7 comercialmente disponíveis em 5 mL de biotinta e bioimpressão, como na etapa 3.2.11. Adicione 1 mL de reticulador, segure por 20-30 s e lave 2x com PBS.
- Ligue o monitor de lapso de tempo e abra o programa no computador. Defina aproximadamente 16 h no modo Time-Lapse e ajuste a temperatura para 37 °C. Pressione o botão Iniciar . Vídeos na forma de amostras de vídeo time-lapse de 40 s são gravados pelo sistema.
- Focalizar o microscópio em aumento de 10x a cada 2 h. Além disso, visualize os esferoides criados seguindo os mesmos passos.
Figura 1: Grupos de biotintas 3D-B e 3D-G produzidas como gotas para uso na caracterização. (A) Amostras de biotinta (imagem de pré-caracterização) em uma placa com reticulante. (B) Imagem de gota 3D-B de biotinta. (C) Imagem de gota de biotinta 3D-G. O biomaterial a ser caracterizado e as células que ele contém podem passar mais facilmente por processos como goldplating, amostragem, etc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Determinação da diferenciação neurogênica pelo método de imunomarcação
- Colete os esferoides, sem interromper as formas esféricas, e resemeie em novas placas para restain com um método mais fácil, em vez de incorporar em parafina para secção do tecido.
- Cobrir as placas de 48 poços com cerca de 20 mL de solução de gelatina a 0,1% pré-autoclavada e manter em incubadora por pelo menos 1 h. Pipetar aproximadamente 500 μL de gelatina 0,1% preparada em placas de 48 poços. Deixe as placas gelatinosas na incubadora por 10 min.
NOTA: Isso permitirá que a gelatina inche ligeiramente, cobrindo a superfície e criando um ambiente melhor para os esferoides coletados se fixarem. - Colete os esferoides por pipetagem, distribua os esferoides coletados da incubadora nos poços da placa de 48 poços e adicione meio fresco. Em seguida, incubar por 12-24 h.
NOTA: É muito difícil distribuir os esferoides por contagem. Coletar os esferoides em um único tubo e distribuir uniformemente o volume total para os poços. Para este estudo, cada poço continha aproximadamente 4-6 esferoides.
NOTA: Para amostras 2D, a pré-lavagem de manchas é suficiente e não é necessária a substituição de meios. - Retire o meio e lave lentamente as células com PBS, pois os esferoides estarão no topo. Fixar em paraformaldeído a 4% por 2 h.
- Lavar novamente as amostras com PBS e bloquear com cerca de 10 mL de BSA a 2% e TritonX a 0,1% por 30 min. Em seguida, lave com PBS 3x.
- Diluir anticorpos de primer selecionados (N-caderina-coelho e β-III tubulina-camundongo) na proporção de 1:100 com solução de reagente diluente de anticorpos. Adicionar 100 μL de solução de anticorpos a cada uma das amostras e incubar durante a noite a 4 °C.
- Lave as amostras 3x com PBS. Incubar com anti-camundongo IgG-FTIC-coelho para tubulina β-III e anticorpo secundário anti-camundongo IgG-SC2781-cabra para N-Cad diluído a 1:200 à temperatura ambiente por 30 min. Execute todas as operações no escuro.
NOTA: Qualquer que seja a estirpe utilizada como anticorpo primário (por exemplo, ratinho) na coloração dupla, deve ser utilizada uma estirpe diferente (por exemplo, cabra ou coelho) para o anticorpo secundário. - Lavar o anticorpo secundário com PBS 3x e, em seguida, gotejar a solução DAPI (1:1) em cada uma das amostras. Aguarde 15-20 min. Realizar imagens de imunofluorescência.
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Representative Results
Toxicidade do grafeno e imagens 2D
A análise estatística dos resultados obtidos do MTT foi realizada com ANOVA one-way com teste de Tukey em software de análise estatística, e o gráfico obtido encontra-se na Figura 2. A porcentagem de grafeno em relação ao controle apresentou decréscimo significativo apenas para a concentração de grafeno a 0,001% (**p < 0,01). Não houve diferenças significativas entre os demais grupos e o controle (p > 0,05). Portanto, a concentração ótima de grafeno foi determinada como sendo de 0,1%, uma vez que as maiores taxas de viabilidade foram observadas após a exposição a essa concentração, de acordo com os resultados do teste MTT e as imagens de costura.
Figura 2: Investigação do efeito da concentração de grafeno na proliferação celular. A porcentagem de grafeno em relação ao controle apresentou decréscimo significativo apenas para a concentração de grafeno a 0,001% (**p < 0,01, n = 6). Não houve diferenças significativas entre os demais grupos e o controle (p > 0,05; n = 6). A análise estatística dos resultados obtidos do MTT foi realizada com ANOVA one-way com teste de Tukey em software de análise estatística. As barras de erro representam o desvio padrão. Este número foi modificado de28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Esta parte do método apresentado demonstra que a interação células-tronco grafeno pode ser utilizada em estudos futuros. Observou-se que, em cada concentração testada, o grafeno foi tolerado no sistema 2D e captado pelas células por endocitose (Figura 3). Foi determinado que as placas de grafeno se movem ao longo do citoplasma dentro da célula.
Figura 3: As interações célula-grafeno são mostradas em duas dimensões em imagens costuradas. (A) Controle; (B) 0,0001%; (C) 0,001%; (D) 0,01%; (E) 0,1%; e (F) concentrações de 1% de grafeno. Ele é obtido combinando imagens de lapso de tempo com configurações de qualidade de alta definição para obter uma colagem de 4 linhas x 5 colunas de várias fotos. Este número foi modificado de 28. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, neste estudo, observou-se que o efeito grafeno-biotinta não criou nenhum microambiente tóxico no sistema 3D e que as células estavam em interação.
Observou-se também que o uso do grafeno em sistemas 3D não criou nenhum microambiente tóxico. A determinação da dose tóxica para as células é crucial para o uso do grafeno em implantes de conduítes de longa duração ou formas injetáveis de hidrogel. Além disso, como o grafeno é um material eficaz na comunicação neuronal, seu uso em aplicações de engenharia de tecido nervoso tem aumentado amplamente, como documentado na literatura25.
Produção de biomateriais compósitos e bioimpressão 3D
A formação de biotinta à base de gelatina-alginato foi realizada com uma concentração atóxica de grafeno (0,1%). Observou-se que a dose apropriada selecionada de grafeno interage com as células da biotinta.
Imagem com lapso de tempo
As amostras de GFP foram fixadas a 37 °C por aproximadamente 16 h em time-lapse, e fotos e vídeos foram tirados (Vídeo 1). Os sinais de GFP foram perdidos quando a morte celular foi observada. Aqui, detectou-se que as células que sobreviveram no meio de grafeno 3D mantiveram suas vitalidades, uma vez que o brilho da GFP foi observado até o final da incubação.
Vídeo 1. Vídeo de lapso de tempo de WJ-MSCs rotulados com GFP. Observa-se a interação de células-tronco marcadas entre si. Clique aqui para baixar este vídeo.
Caracterização do hidrogel biohíbrido de grafeno-biotinta
MEV e FT/IR foram utilizados para a caracterização dos grupos 3D-B e 3D-G criados pelo método da biotinta gota. As imagens de MEV dos grupos de biotintas 3D-B e 3D-G são apresentadas na Figura 4. Das 40 imagens tiradas na etapa 4.2.5., 4 imagens representativas são mostradas aqui.
Figura 4: Imagens de MEV dos grupos de biotintas 3D-B e 3D-G. (A) Imagem de uma seção de biotinta 3D-B revestida a ouro com microscopia eletrônica. Barra de escala: 200 μm. (B) Imagem de MSC acoplada à superfície interna da biotinta 3D-B. Barra de escala: 5 μm (C) Imagem da superfície interna e externa da biotinta 3D-G. Barra de escala: 200 μm.(D) Imagem de adesão de biotinta 3D-G da célula de superfície interna. Barra de escala: 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Assim, interações biotinta-célula foram demonstradas tanto na superfície quanto internamente. Houve interação célula-biomaterial em ambas as biotintas (3D-B; 3D-G). As células estavam morfologicamente redondas e aderidas ao material. A análise FT/IR da gota de biotinta 3D-B e 3D-G foi comparada com o gráfico da Figura 5.
Figura 5: Análise FT/IR. (A) Biotinta 3D-B. (B) Biotinta 3D-G. Picos como 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 e 1033 cm−1 foram encontrados na literatura em estudos com hidrogel à base de alginato e gelatina26. Além disso, o pico de 1335,46 cm−1 é semelhante aos picos observados em estudos de biomaterial de grafeno27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como a biotinta controle (3D-B) foi baseada em alginato/gelatina, os picos mais proeminentes foram em torno de 1633,41 cm−1, 1552,42 cm−1 e 1033 cm−1 em comparação com estudos semelhantes na literatura com picos observados em 1546 cm−126. Um pico de 1399 cm−1 foi observado no grupo do grafeno (3D-G) e um pico semelhante foi encontrado em 1335,46 cm−1 em um estudo realizado com grafeno27.
Diferenciação neuronal 3D
As imagens dos esferoides nas biotintas após o 7º dia pós-diferenciação estão representadas na Figura 6.
Figura 6: Imagem 2D das CTMs-controle e das amostras do grupo esferoide no 7º dia pós-diferenciação. (A) Tamanho da esfera da biotinta do grupo 3D-BS com diâmetros de 160 μm e 200 μm. (B) Células de controle 2D. Esferoides do grupo (C) 3D-BS e (D) do grupo 3D-GS. Os materiais pretos em (D) são moléculas de grafeno integradas com esferoides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Observou-se que as células mantiveram sua vitalidade tanto em culturas 2D quanto 3D. Considerou-se que as bordas das células esferoides em ambos os grupos (3D-B e 3D-G) eram transparentes e vivas, e os esferoides do grupo grafeno eram relativamente maiores e aprisionavam o grafeno dentro da célula. A diferenciação também foi testada por imunomarcação. Com a dupla coloração aqui utilizada, as atividades das células na transformação neuronal 2D foram comparadas com a cultura 3D (Figura 7).
Figura 7: Imunomarcação de células 2D e 3D. (A,B) Imunomarcação de esferoides cultivados em biotintas 3D-BS. (C,D) imunomanchas esferoides de biotinta 3D-GS. (E) Controle positivo 2D diferenciado WJ-MSCs. (F) Controle negativo 2D indiferenciado WJ-MSCs. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Imagens de imunofluorescência de células cultivadas por 7 dias são mostradas na Figura 7. As amostras foram coradas com anticorpos específicos para N-caderina (verde) e β-III tubulina (vermelho). Adicionalmente, DAPI foi utilizado para visualização do núcleo (azul ou roxo). Assim, as N-caderinas (verde) utilizadas nas amostras 2D e 3D diferiram ao longo de 7 dias, pois desempenham um papel importante nos mecanismos de sinalização e no desenvolvimento dos neurônios. A imagem verde da Figura 7A-E representa estruturas semelhantes a neurônios (Figura 7). A classe III β-tubulina é um dos sete isótipos conhecidos como marcadores neurais no genoma humano. A expressão de N-caderina foi maior nas amostras que foram diferenciadas por 7 dias em relação à tubulina β-III. De acordo com os resultados do presente experimento, estabeleceu-se que os sistemas 3D criaram um microambiente mais adequado para as células sobreviverem e se diferenciarem. A amostra de controle positivo 2D (Figura 7E) expressou menos marcadores de estrutura semelhante a neurônios em comparação com as amostras 3D (Figura 7A-D). Isso nos mostra que o microambiente criado com a estrutura 3D é mais efetivo na diferenciação de células-tronco. Além disso, em vez de terapias celulares isoladas; Os tratamentos combinados biomaterial-célula parecem ser mais influentes e eficazes no dano ao nervo.
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Discussion
As vantagens dos tratamentos aplicados com andaimes 3D projetados em relação aos métodos 2D convencionais estão se tornando cada vez mais perceptíveis a cada dia. Células-tronco usadas isoladamente nessas terapias ou em conjunto com arcabouços produzidos a partir de vários biomateriais com baixa biocompatibilidade e biodegradabilidade são geralmente inadequadas na regeneração de nervos periféricos. As células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ) parecem ser uma linhagem celular candidata adequada, especialmente considerando a otimização dos protocolos de aquisição, sua capacidade de proliferação e sua capacidade de diferenciação29. Neste estudo, examinamos a interação de células-tronco com grafeno em culturas 2D e 3D. Também comparamos a diferenciação neurogênica nos grupos de hidrogéis biohíbridos gerados com o ambiente 2D. Demonstramos a formação de neuroesferas nas biotintas por imunomarcação. Em estudos posteriores, caracterizamos nosso protótipo candidato, que pode ser injetado ou implantado como canal neural, pelos métodos de MEV e FT/IR. Este estudo caracteriza as propriedades do biomaterial produzido, a interação célula-biomaterial e a diferenciação neural das células-tronco na presença do biomaterial. Nas próximas etapas, o efeito sobre a migração será examinado.
Os materiais biohíbridos formados pela combinação de dois ou mais materiais biocompatíveis estão se tornando mais vantajosos em termos de suas propriedades estruturais em relação aos materiais homogêneos30. Em estudo prévio, foi realizado o implante de um canal de tubo neurológico à base de ácido poliglicólico no nervo periférico facial. Células-tronco olfatórias marcadas foram inseridas nesse conduto, resultando no sucesso da regeneração da cirurgia periférica e da terapia com células-tronco injetadas16. Em outro estudo, comparou-se a eficácia da estrutura 3D obtida a partir de múltiplos esferoides celulares desenvolvidos com fibroblastos dérmicos humanos normais e o canal nervoso de silício, frequentemente utilizado na literatura devido à sua característica inerte, na regeneração de lesão do nervo ciático. Foi demonstrado que a estrutura 3D baseada em esferoides aumentou a regeneração tecidual de forma significativa e mais rápida em modelos animais com dano ciático em comparação com materiais homogêneos20. Entretanto, sabe-se que os biomateriais à base de silício, frequentemente utilizados na literatura, apresentam algumas desvantagens importantes, como alto risco de infecção e baixa biocompatibilidade15,30.
No presente estudo, a produção de tecido compósito biohíbrido hidrogel biocompatível e biodegradável com nanoplaquetas de grafeno, sabidamente eficaz na condução nervosa, foi realizada pela técnica de impressão 3D. Existem vários estudos nos quais o grafeno tem sido utilizado como biomaterial para condução nervosa25,30. Além disso, o grafeno é um dos materiais mais finos e leves disponíveis, o que aumenta sua preferência em tecnologias de saúde13. Uma das propriedades mais desejáveis dos biomateriais é a biodegradabilidade. Tecnologias experimentais e de simulação molecular têm sido aplicadas para investigar a biodegradação do grafeno e seus derivados13. Neste ponto, a modificação-funcionalização da superfície ou a produção na forma de biomateriais compósitos pode melhorar ou inibir a biodegradação, dependendo em grande parte das propriedades dos aditivos.
Várias enzimas, como a peroxidase de manganês (MnP), peroxidase de raiz forte (HRP) e mieloperoxidase (MPO), estão disponíveis na literatura para a biodegradação de derivados do grafeno. A enzima MPO, que é uma peroxidase liberada dos neutrófilos que chegam à região dos corpos estranhos e realizam fagocitose, está associada à biodegradação do grafeno, principalmente no pulmão humano13. Os níveis de biodegradabilidade de biomateriais compósitos contendo grafeno em vez de nanotubos de grafeno sozinhos são diferentes entre si. É mais fácil alcançar essa propriedade desejada em materiais compósitos. Além disso, a determinação da dose tóxica de grafeno contribui para o uso de biomateriais clinicamente aplicáveis13.
Uma parte importante da etapa de grafeno do protocolo é esterilizar o grafeno quando ele for usado. Evita-se o risco de contaminação que possa ocorrer durante a fase de interação biohíbrido-célula.
O efeito do padrão biohíbrido de hidrogel de grafeno-biotinta obtido na diferenciação nervosa foi investigado e foi compatível com a literatura que a diferenciação foi maior no sistema 3D. A necessidade de produção de biomateriais com abordagens terapêuticas celulares modificadas em tecidos que possam ser desenvolvidas contra várias doenças neurodegenerativas, como a lesão de nervos periféricos, está aumentando com a inadequação dos tratamentos atuais no dia a dia, enfatizando a importância deste estudo.
Em um estudo anterior, a interação do grafeno com células em meio de cultura celular 2D foi investigada28. Com a experiência adquirida a partir daí, aqui, o grafeno foi adicionado à biotinta alginato-gelatina com a proporção conhecida, e um novo e único protótipo de biomaterial foi produzido por um método de impressão 3D. Esse novo material foi usado para estudar a interação celular de duas maneiras diferentes. A primeira é a coimpressão do biomaterial compósito celular em uma impressora 3D. A segunda é a formação de um esferoide celular a partir do biomaterial. Além disso, a interação de WJ-MSCs contendo o gene marcado GFP com o material também foi observada.
Neste estudo, biotintas biohíbridas foram caracterizadas selecionando métodos de FTIR e MEV. Estes permitem que as esferas de amostra formadas pelo método de gotejamento sejam examinadas durante a fase de caracterização. Especialmente porque podemos examinar uma estrutura dura e seca durante a etapa de chapeamento de ouro por MEV, a MEV fornece a adequação física para obter seções melhores e finas com um bisturi das bolas de biotinta que criamos com este método.
Neste estudo do método, células foram adicionadas ao material biohíbrido de duas maneiras diferentes durante os experimentos: no interior para bioimpressão 3D ou durante a formação de esferoides. Cobrir células com biotintas e usar bioimpressoras 3D permite que os pesquisadores criem qualquer forma 3D desejada para regeneração nervosa. Por outro lado, causa mais estresse nas células devido à pressão de impressão e, portanto, perda de viabilidade celular. No entanto, poderia ser um método mais desejável para aumentar o homing celular quando elas são injetadas ou transplantadas para uma área específica para induzir a regeneração.
A criação de esferoides em biotintas cria uma forma mais utilizável de tecido artificial em termos de interação celular e fornece um nicho melhor para a diferenciação celular. Também é adequado para mimetizar o microambiente natural e, portanto, investigar mecanismos celulares. A baixa adesão dos esferoides às biotintas também permite uma separação mais fácil das biotintas e versatilidade das aplicações.
As N-caderinas utilizadas (mostradas em verde na Figura 7) fazem parte dos mecanismos de sinalização celular e desempenham um papel importante no desenvolvimento dos neurônios32. A classe III β-tubulina é um dos sete isótipos conhecidos como marcadores neurais no genoma humano. Isso mostra que as CTMs-WJ utilizadas neste estudo começam a formar estruturas semelhantes a neurônios. Neste contexto, os sistemas 3D criarão um microambiente mais adequado para que as células mantenham sua viabilidade.
Finalmente, devido ao custo envolvido e à aplicabilidade clínica dos sistemas de diferenciação celular, é muito importante na neuroengenharia desenvolver sistemas com liberação controlada de arcabouços, células e biosinais de diferenciação33 no futuro e adaptá-los às clínicas como terapias combinadas. Portanto, métodos esferoides e de bioimpressão também podem ser usados em estudos posteriores onde o grafeno e outros biossinais são incorporados em hidrogéis e liberados de forma controlada. Os estudos in vitro são um passo importante no caminho para o in vivo. Quando o material, fornecido aqui como protótipo, é produzido de acordo com as normas de Boas Práticas de Laboratório, os padrões de esterilização exigidos para a transferência para a clínica podem ser alcançados.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses. O projeto foi realizado em colaboração com a HD Bioink, desenvolvedora da tecnologia de bioimpressão 3D.
Acknowledgments
O grafeno utilizado neste estudo foi desenvolvido no Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade de Kirklareli. Foi doado pelo Dr. Karabeyoğlu. O teste de toxicidade do grafeno foi financiado pelo projeto intitulado "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Application No: 1139B411802273) concluído no âmbito do TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. A outra parte do estudo foi apoiada pelo fundo de pesquisa fornecido pela Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Células-tronco mesenquimais com GFP usadas na etapa de imagem time-lapse foram doadas pela Virostem Biotechnology. Os autores agradecem ao Darıcı LAB e à equipe do YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB pelas discussões produtivas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
Centrifugal |
Hitachi | Used in cell culture and biomaterial step | |
| 0.1N CaCl2 | HD Bioink | Used for crosslinker | |
| 0.22 µm membrane filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 0.45 µm syringe filter | Aιsιmo | Used for sterilization | |
| 1.5mL conic tube | Eppendorfa | Used for bioink drop | |
| 15mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| 3D Bioprinting | Axolotl Biosystems Bio A2 (Turkey) | Bioprinting Step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 6/24/48/96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used for cell culture | |
| Anti mouse IgG-FTIC-rabbit | Santa Cruz Biotechnology | J1514 | Seconder antibody, used for dye |
| Anti mouse IgG-SC2781-goat | Santa Cruz Biotechnology | C3109 | Seconder antibody, used for dye |
| Au coating device EM ACE600 | Leica | for gold plating of biomaterial section before SEM imaging | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process. | |
| Cell Cultre Cabine | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEM | Quanta | FEG 450 | for SEM |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80°C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | We were used to store cells and the resulting exosomes |
| Gelatine-Alginate bioink powder | HD Bioink | Used for produced bioink step | |
| GFP labelled-WJ-MSCs | Virostem | Used for imaging to cell-bioink interaction | |
| Graphene nanoplatelets (Graphene-IGP2) | Grafen Chemical Industries Co. | Used for production 3D-G bioink | |
| Immunofluorescence antibodies (N-CAD; β-III Tubulin) | Cell Signalling and Santa Cruz | Used for dye | |
| JASCO 6600 | Tetra | for FTIR | |
| MTT Assay | Sigma | Viability testing | |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Thoma slide | Isolab | Used for counting the cell | |
| Time-Lapse Imaging System | Zeiss Axio.Observer.Z1 | Imaging | |
| Tripsin-EDTA | Multicell | The flask was used to remove the cells covering the surface. | |
| Vorteks | Biobase | For produced bioink step | |
| WJ-MSCs | ATCC | Used for the cell culture process |
References
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