Summary
Bu çalışmada, Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden izole edilen kök hücrelerin eksozomlarının dopamin yüklemesi ile bir formülasyon elde etmeyi amaçladık. Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu, elde edilen eksozomlara ilaç yüklemesi ve geliştirilen formülasyonun sitotoksik aktivitesi bu protokolde tanımlanmıştır.
Abstract
Boyutları 40 ila 200 nm arasındaki eksozomlar, hücre dışı veziküllerin en küçük alt grubunu oluşturur. Hücreler tarafından salgılanan bu biyoaktif kesecikler, hücreler arası kargo ve iletişimde etkin rol oynar. Eksozomlar çoğunlukla plazma, beyin omurilik sıvısı, idrar, tükürük, amniyon sıvısı, kolostrum, anne sütü, eklem sıvısı, meni ve plevral asit gibi vücut sıvılarında bulunur. Eksozomların büyüklükleri göz önüne alındığında, kan-beyin bariyerini (BBB) geçebildikleri için merkezi sinir sistemi hastalıklarında önemli rol oynayabilecekleri düşünülmektedir. Bu nedenle, bu çalışma, dopamini Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinden (WJ-MSC'ler) izole edilen eksozomlara kapsülleyerek eksozom tabanlı bir nanotaşıyıcı sistem geliştirmeyi amaçladı. Karakterizasyon sürecinden geçen eksozomlar dopamin ile inkübe edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, inkübasyonun sonunda yeniden karakterize edildi. Dopamin yüklü eksozomlar, ilaç salınımı ve sitotoksisite deneylerinde araştırıldı. Sonuçlar, dopaminin eksozomlar içinde başarılı bir şekilde kapsüllenebildiğini ve dopamin yüklü eksozomların fibroblast canlılığını etkilemediğini gösterdi.
Introduction
Eksozomlar, önemli özelliklere sahip biyoaktif veziküller, boyutları 40 nm ila 200 nm arasında değişir. Eksozomlar hücre zarından kaynaklanır ve endozomlarınsalınması nedeniyle oluşur 1. Bu yapılar hücreden hücreye iletişimciler olarak görev yapar ve aktif moleküllerin transferini kolaylaştırmak için komşu hücrelerle etkileşime girer. Eksozomlar birçok farklı kaynaktan izole edilebilir. Bunlar, plazma, idrar, beyin omurilik sıvısı, tükürük gibi vücut sıvılarının yanı sıra in vitro koşullar altında kültürlenen hücre dizilerini içerir. Eksozomlar, içerdikleri lipitler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyomakromoleküller sayesinde sinir hasarının giderilmesinde önemli bir role sahiptir2. Sinir sisteminin3 destek hücreleri olan glia, proteinleri ve mikro RNA'ları eksozomlar4 aracılığıyla nöronların aksonlarına aktarır.
Sinir iletiminde karakteristik bir özellik olan miyelin kılıfını oluşturan lipitler de eksozomlar 4,5 aracılığıyla oligodendrositlerden salınır. Eksozomlar ayrıca sinaptik plastisite, nöronal stres tepkisi, hücre-hücre iletişimi ve beyindeki nörojenez gibi süreçlerde de rol oynar 6,7. Eksozomların nano boyutlara sahip olması, BBB'den geçmelerini sağlar. Bu zara nüfuz ettikten sonra interstisyel sıvıdan beyin omurilik sıvısına özel bir geçiş yolu vardır8. Eksozomlar, yüzey özellikleri sayesinde bir ilaç dağıtım sistemi olarak hedef hücrelerle verimli bir şekilde etkileşime girebilir ve yüklenen ilaçları aktif olarak iletebilir.
Eksozomların yüzeyindeki çeşitli yapışkan proteinlerin (tetraspaninler ve integrinler) ekspresyonu nedeniyle, bu hücre dışı veziküller, konakçı hücre zarları ile kolayca etkileşime girebilir ve kaynaşabilir9. Eksozomların BBB'ye nüfuz edebilme yetenekleri ve yüzey özellikleri nedeniyle özellikle merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Mezenkimal kök hücre (MSC) kaynaklı eksozomlar, allojenik hücresel tedavilere kıyasla daha düşük immün reddi riskine sahiptir ve bu açıdan hücresiz tedavi uygulamalarının önemli bir bileşeni olabilirler10.
Dopamin, beyindeki eksikliği Parkinson hastalığının (PH) karakteristik özelliği olan ve her geçen gün kötüleşen bir moleküldür11,12,13. PH'nin mezensefalonun substantia nigra'sındaki dopaminerjik nöronların dejenerasyonu ve motor nöron fonksiyonlarının kaybı ile ilişkili olduğu bilinmektedir14,15. Dopaminerjik nöronların ölümü, nörotransmitter dopaminin beyin striatumuna beslenmesini engeller. Bu da PH'ye özgü semptomların ortaya çıkmasına neden olur16. PH'nin bu semptomları bradikinezi, postüral instabilite, rijidite ve özellikle istirahat tremorudur12,13. PH ilk kez iki yüzyıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış olmasına rağmen, hastalığın patolojisini ve etiyolojisini anlamaya yönelik çalışmalar halen devam etmektedir ve günümüzde PH'nin kompleks bir sistemik hastalık olduğu kabul edilmektedir17. Dopamin eksikliğinin ortaya çıktığı ve nöronların %80'inden fazlasının dejenere olduğu klinik PD semptomlarının gözlendiği öngörülmektedir18. Hastalığın tedavisinde motor semptomları azaltmak için eksik dopamin takviyesi tercih edilir. İn vivo çalışmalar, dopaminin beyne doğrudan infüzyonunun hayvanlarda semptomları önemli ölçüde azalttığını göstermiştir19. Klinikte L-DOPA (L-3,4-dihidroksifenilalanin) gibi dopamin öncülleri ve dopamin reseptör ilaçları kullanılmaktadır çünkü insanlarda dopaminin beyne doğrudan infüzyonu mümkün değildir ve sisteme giren dopamin BBB20'yi geçemez. Bu tür ilaçlar zamanla etkinliğini yitirir. Bununla birlikte, PH için hala küratif bir tedavi yaklaşımı yoktur. Bu nedenle, hastalığın patofizyolojisini ortaya koymak ve PH'nin hastalar üzerindeki etkisini azaltmak için yeni terapötik stratejiler ve tedavi modaliteleri geliştirmeye büyük ihtiyaç vardır.
Eksozom temelli çalışmalar son zamanlarda sinir sistemi hastalıklarının hem terapötik yaklaşımları hem de patolojileri hakkında bilgi toplamak açısından dikkat çekmektedir. MSC kaynaklı eksozomların sinir hasarında inflamasyonu azalttığı ve nöronal rejenerasyona katkıda bulunduğu gösterilmiştir21,22,23. Ayrıca MSC kaynaklı eksozom sekretomlarının özellikle dopaminerjik nöronlar üzerinde nörotrofik ve nöroprotektif etkiler göstererek apoptozu azalttığı bildirilmiştir24,25. Eksozomların terapötik ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanıldığı platformlar üzerine yapılan araştırmalar son yıllarda yoğun bir şekilde hızlanmıştır. Çok sayıda çalışmada, ilgili ilaçların eksozomlara kolayca kapsüllenebildiği ve hedef hücrelere, dokulara ve organlara güvenli bir şekilde verilebildiği gözlemlenmiştir26,27. Eksozomlara ilaç yüklemesi için inkübasyon, donma/çözülme döngüleri, sonikasyon ve ekstrüzyon gibi farklı yöntemlerkullanılabilir 28.
Eksozomlar veya eksozom benzeri veziküllerle çakışma, lipofilik küçük moleküllerin bu dağıtım sistemlerine pasif olarak kapsüllenmesine izin verir28,29,30. Özellikle, kurkumin 31, katalaz30, doksorubisin32 ve paklitaksel33 gibi çeşitli moleküller eksozomlara etkili bir şekilde yüklendi. Antioksidan aktiviteye sahip olan katalaz içeren eksozomların beyindeki nöronlarda ve mikroglial hücrelerde verimli bir şekilde biriktiği ve güçlü nöroprotektif aktiviteler sergilediği gözlemlenmiştir30. Aynı çalışmada, yükleme verimliliğini artırmak için kompleks içine eklenen saponinin, inkübasyon sırasında ilaç yükleme yüzdesini arttırdığı bulunmuştur30,34. Bununla birlikte, eksozomlara ilaç yüklemesi için standartları oluşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.
Bu makale, dopaminin WJ-MSC'lerden izole edilen eksozomlara kapsüllenmesiyle bir nanotaşıyıcı sistemin geliştirilmesini açıklamaktadır. WJ-MSC'lerin kültivasyonu, eksozomların izolasyonu ve karakterizasyonu, ilaç yükleme deneyleri, dopamin yüklü eksozomların çeşitli tekniklerle karakterizasyonu ve in vitro sitotoksisite analizi dahil olmak üzere tüm adımlar ayrıntılı olarak anlatılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Wharton'un jöle mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesi ve dondurularak saklanması
- WJ-MSC'leri (ATCC'den) -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamı içeren bir şişeye tohumlayın. % 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin. Hücreleri% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin. Geçirilecek hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
NOT: Tripsin eklemeden önce PBS ile yıkamak, hücrelerin şişe yüzeyinden kolayca ayrılmasını sağlar. - PBS'yi çıkarın ve şişeye 5 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Şişeyi% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Süpernatanı tüpe toplayın ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve pipetleme ile tüpe 1 mL DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyin.
- Hücreleri daha büyük bir şişeye aktarın ve yeterli eksozom elde edilene kadar DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyerek kültüre devam edin35.
NOT: Kültürlenmiş hücreler, %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile 1 milyon/mL yoğunlukta dondurulur ve -80 °C'de saklanır.
2. Wharton Jelly mezenkimal kök hücrelerinden eksozom üretimi
NOT: Eksozomlar, kültürlenmiş WJ-MSC'lerden izole edilir. Eksozom izolasyonu, hücreler şişe yüzeyini kapladığında ve yaklaşık% 80 yoğunluğa ulaştığında gerçekleştirilir.
- % 10 FBS içeren süpernatan ortamı şişeden çıkarın ve hücreleri 5 mL PBS ile yıkayın. PBS ile duruladıktan sonra hücrelere serumsuz DMEM-F12 besiyeri ekleyin. Şişeleri %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 48 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, serumsuz ortamı tüpte toplayın ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: Adım 2.1'de, 180 mL serumsuz ortam toplanır ve -20 °C'de saklanır. Çözüldükten sonra, aşağıda açıklandığı gibi bir toplu santrifüj işlemi başlatılır. - Eksozomların izolasyonu
- Toplanan serumsuz ortamı 300 x g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.
- Toplanan süpernatanı 2.000 × g'da +4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.
- Toplanan süpernatanı +4 °C'de 30 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice geri çekin ve başka bir tüpe aktarın.
- Toplanan süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 130 dakika boyunca 110.000 × g'da ultrasantrifüje aktarın. Süpernatanı yavaşça çıkarın ve pelete 1 mL PBS ekleyin.
- Pelet ve ultrasantrifüjü 110.000 × g'da +4 °C'de 70 dakika vorteksleyin36 (Şekil 1). Süpernatanı yavaşça çıkarın ve pelete 1 mL PBS ekleyin.
NOT: Ultrasantrifüj adımları tamamlandıktan sonra elde edilen eksozomlar -80 °C'de saklanabilir. Elde edilen pelet artık karakterizasyona hazırdır.
Şekil 1: Eksozom izolasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Eksozomların karakterizasyonu
- Nanopartikül İzleme Analizi (NTA)
NOT: İzole edilen eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi yapılır. 1x PBS çözeltisi için kullanılan tabletler pH 7.3-7.5 aralığında olmalıdır. 1x PBS Çözeltisi 10 mM fosfat tamponu, 137 mM sodyum klorür ve 2.7 mM potasyum klorür içerir. Çözelti, 100 mL damıtılmış suya 1 PBS tablet eklenerek hazırlanır. Hazırlanan bu çözelti otoklavlama ile sterilize edilir.- 10 μL eksozoma 990 μL PBS ekleyerek eksozomları 100 kat seyreltin. Seyreltilmiş süspansiyonu tek kullanımlık bir şırıngaya alın.
- NTA aygıtını açın ve bilgisayarı bağlayın. Yazılımı açın.
- Şırıngadaki numuneyi cihazın kaset bölümündeki tüpe enjekte edin. Cihazın kaset kapağını kapatın.
- Açılan yazılımda, Analizi Başlat düğmesine tıklayın. Kaydet düğmesine basarak elde edilen sonuçları kaydedin.
- Dinamik ışık saçılımı analizi
NOT: Zeta potansiyeli ve boyut ölçümü için izole edilen eksozomlar da NTA analizi ile aynı şekilde seyreltilir.- 20 μL eksozomlara 980 μL PBS ekleyin.
- Zeta boyutlandırma cihazını ve bağlı bilgisayarı açın. Yazılımı açın.
- Adım 3.2.1'deki süspansiyonu tek kullanımlık küvete ekleyin. Cihazın kapağını açın, küveti kasete yerleştirin ve kapağı kapatın.
- Cihazın yazılımında küvet tipini seçin. Zeta potansiyeli ve boyutsal analiz için Analizi Başlat butonuna tıklayınız.
NOT: Analizler boyutsal analiz ve zeta potansiyeli için ayrı ayrı yapılır.
4. Eksozomlara dopamin yüklenmesi
NOT: WJ-MSC'lerin eksozomlarının karakterizasyonu tamamlandıktan sonra, ilaç salım sistemi olarak dopamin yüklü eksozomlar elde edildi. Eksozomlara ilaç yüklemesi inkübasyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.
- Adım 2.2.5'ten eksozom süspansiyonuna 3 mL PBS ekleyin. Seyreltilmiş süspansiyonu 0.22 μm filtreler kullanarak filtreleyerek sterilize edin. 500 μL sterilize edilmiş eksozom süspansiyonunu başka bir tüpe aktarın.
- Damıtılmış su ile dopamin çözeltisi (0.5 mg / mL) hazırlayın. Eksozomları içeren tüplere 500 μL dopamin çözeltisi ekleyin.
- Adım 4.2'de süspansiyona saponin ekleyin. Hazırlanan eksozom-dopamin süspansiyonunu 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
NOT: Saponin konsantrasyonu toplam çözeltinin% 0.002'sini geçmemelidir. - Serbest dopamin ve saponini ortamdan uzaklaştırmak için süspansiyonu 70 dakika boyunca 90.000 × g'da ultrasantrifüjleyin. İzole edilmiş eksozomları daha fazla analiz için kullanılana kadar -20 °C'de saklayın37.
NOT: Hazırlanan dopamin çözeltisinin stabilitesi için% 0.02 askorbik asit ekleyin.
5. Dopamin yüklü eksozomların karakterizasyonu
- Nanopartikül izleme analizi (NTA)
NOT: İzole eksozomların boyutunu ve konsantrasyonunu belirlemek için nanopartikül izleme analizi yapılır.- Eksozomları seyreltmek ve NTA gerçekleştirmek için 3.1.1-3.1.4 adımlarını izleyin.
- Dinamik ışık saçılımı analizi
NOT: Zeta potansiyeli ve boyut ölçümü için izole edilen eksozomlar da NTA analizine benzer şekilde seyreltilir.- Eksozomları seyreltmek ve dinamik ışık saçılımı analizi yapmak için 3.2.1-3.2.4 adımlarını izleyin.
NOT: Her çözelti (saponin, dopamin, eksozom-dopamin) için boyut ve zeta potansiyelleri ayrı ayrı analiz edilir.
- Eksozomları seyreltmek ve dinamik ışık saçılımı analizi yapmak için 3.2.1-3.2.4 adımlarını izleyin.
6. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC)
NOT: Eksozomlara yüklenen dopamin miktarları, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yöntemi ile ölçülür. Elde edilen formülasyonda dopamin varlığını tespit etmek için eksozomlar özel bir işlemle patlatılır.
- Formülasyonu buharlaşması için 75 °C'lik bir ısıtıcıya koyun. Süspansiyona asetonitril (50:50 oranı) ekleyin ve girdap yapın. Çözeltiyi 10 dakika boyunca sonikleştirin.
- Çözeltiyi 10.000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
- 30 °C'de 1 mL/dk akış hızında (mobil faz H 2 O / asetonitril) birC18kolonu kullanarak tüm analitleri analiz edin. Absorbansı 230 nm38'de ölçün.
7. İlaç yükleme kapasitesi (DL) ölçümü ve in vitro ilaç salım kinetiği
- İlaç yükleme kapasitesi (DL)
NOT: Eksozomlara yüklenen dopamin miktarı, UV-Vis spektroskopisi kullanılarak ölçülür. Absorbans 280 nm'de okunur. Sentez sırasında toplanan süpernatanlar, boşaltılmış ilaç miktarını ölçmek için kullanılır. Süpernatanttaki dopamin konsantrasyonu, dopamin için standart bir kalibrasyon eğrisi ile belirlenir.- 1 mg / mL dopamin içeren bir stok çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su kullanarak stok çözeltisinden 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg / mL konsantrasyonları hazırlayın.
NOT: Hazırlanan dopamin çözeltisinin stabilitesi için% 0.02 askorbik asit ekleyin. - Bir UV-Spektrofotometrede 280 nm'de her bir dopamin dilüsyonunun absorbansını ölçerek standart bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
- Süpernatantın absorbansını 280 nm'de ölçün.
- Eq (1)39 kullanarak dopamin için ilaç yükleme kapasitesini hesaplayın.
DL (%) =
100 (1)
NOT: Analiz üç nüsha halinde gerçekleştirilir.
- 1 mg / mL dopamin içeren bir stok çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su kullanarak stok çözeltisinden 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg / mL konsantrasyonları hazırlayın.
- İn vitro ilaç salım kinetiği
NOT: Dopamin yüklü eksozomların ilaç salım kinetiği, bir diyaliz membranı kullanılarak gerçekleştirilir. PBS, pH 7.4, fizyolojik bir mikro ortamı simüle etmek için salım ortamı olarak kullanılır.- Diyaliz membranına 1 mL dopamin yüklü eksozom ekleyin. Membranı bir behere yerleştirin. Behere 15 mL PBS ekleyin.
- 0.5, 1, 2, 4, 6 ve 8 saatte bir beherde 1 mL salım ortamı örnekleyin. Her zaman noktasında, numunenin hacmini taze PBS ile değiştirin. Bir UV-Vis spektrometresi kullanarak 280 nm'de belirli aralıklarla alınan numuneleri analiz edin.
- Denklem (2)40 kullanarak sonuçları hesaplayın.
Serbest bırakma (%) =
100 (2)
NOT: İn vitro ilaç salım kinetiğinin belirlenmesi için bir kalibrasyon eğrisi hazırlanır. Dopamin çözeltisi 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 ve 5.0 mg / mL konsantrasyonlarında hazırlanır. Her konsantrasyonun UV absorbans değeri, bir UV-Vis spektrofotometresi ile 280 nm'de belirlenir.
100 (1)
100 (2)8. İn vitro sitotoksisite testi
- Fibroblastların canlandırılması ve kültürü
- Fibroblastları -80 °C dondurucudan çıkarın. Hücreleri DMEM-F12 +% 10 FBS içeren bir şişeye tohumlayın.
- Hücreleri% 5 CO2 içeren bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Kültür ortamını 2 günde bir değiştirin.
- Hücreleri% 80 birleşmeye ulaşana kadar geçirin. 1.3-1.5 adımlarını izleyin. 5 dakika boyunca 1.500 × g'da santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın, 1 mL DMEM-F12 +% 10 FBS ekleyin ve 96 oyuklu bir plakada oyuk başına 10.000 hücre tohumlayın.
- DMEM-F12 ortamı +% 10 FBS ekleyin ve% 5 CO2 içeren bir inkübatörde hücreleri 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka sonunda kuyuların ortamını değiştirin.
- Dopamin yüklü eksozom süspansiyonu stoğunu hazırlayın. 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL ve 1.000 μL/mL konsantrasyonları elde etmek için dopamin yüklü eksozom formülasyonunu ortamla seyreltin.
- Hazırlanan konsantrasyonları 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundaki hücrelere ekleyin. Plakaları 37 °C'de 18 saat boyunca %5 CO241 içeren bir inkübatörde inkübe edin.
- MTT hücre canlılık testi
NOT: İnkübasyon sonunda MTT testi ile hücrelerin canlılık oranları belirlenir.- MTT çözeltisini (5 mg / mL) PBS ile hazırlayın. Her kuyucuğa 10 μL MTT çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.
- İnkübasyonun sonunda, her bir oyuğa 100 μL DMSO ekleyin. Plakaları karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. ELISA okuyucusundaki absorbans değerlerini 570 nm42,43'te ölçün.
NOT: MTT canlılık testi üç kopya halinde gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksozom izolasyonu ve karakterizasyonu
Wharton jöle kök hücreleri kültürlenir ve kültür yeterli yoğunluğa ulaştığında 48 saat boyunca serumsuz bir ortamda inkübe edilir. İnkübasyonun bitiminden sonra, süpernatan -20 ° C'de saklanır. Toplanan süpernatanlar PBS ile seyreltilir ve ultrasantrifüjlemeye tabi tutulur (Şekil 1). Elde edilen çözelti NTA ve DLS analizleri ile analiz edilmiştir. Eksozomlar 0.22 μm'lik bir filtreden geçirilerek sterilize edilir. Elde edilen eksozomların ortalama büyüklüğü 98 nm olarak belirlenmiştir (Video 1). Santrifüj sonunda yaklaşık 10 milyar eksozom parçacığı elde edildi. NTA ve DLS analizleri ile ortaya çıkan nanopartikül sayıları birbirleri ile tutarlıdır. Ayrıca WJ-MSC'lerden kaynaklanan eksozomların zeta potansiyeli -15.7 mV olarak ölçülmüştür (Şekil 2 ve Şekil 3).
Video 1: Wharton Jelly türevi eksozomların nanopartikül izleme analizi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Dopaminin eksozomlara yüklenmesi
NTA analizinde hesaplandığı gibi, Wharton'un jölesinden izole edilen örneklerin 500 μL'sinde yaklaşık 1,5 milyar nanopartikül vardı. Dopamin çözeltisi (5 mg/mL) 500 μL eksozom ile karıştırıldı ve süspansiyon 37 °C'de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyonu takiben, elde edilen çözelti NTA ve DLS analizleri ile karakterize edildi. NTA sonuçlarına göre çözeltinin ortalama partikül büyüklüğü 110 nm olarak bulunmuştur. Eksozomların ve dopamin yüklü eksozomların partikül boyutlarının karşılaştırılması, dopamin yüklü eksozomların boyutlarında önemli bir artış olduğunu ortaya koymaktadır. NTA ve DLS analizleri ile ortaya çıkan nanopartikül sayıları birbirleri ile tutarlıydı. Ayrıca dopamin yüklü eksozomların zeta potansiyeli -17.6 Mv olarak ölçülmüştür (Şekil 2 ve Şekil 3).
Video 2: Dopamin yüklü eksozomların nanopartikül izleme analizi. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek | Zeta potansiyeli |
| Eksozom | -15.7 mV ± 1.1 |
| Saponin | -12 mV ± 0.7 |
| Dopamin | -14.4 mV ± 1.3 |
| Dopamin yüklü eksozom | -17.6 mV ± 0.8 |
Tablo 1: Tüm çözeltilerin zeta potansiyeli.
Dopamin, saponin ve dopamin yüklü eksozom çözeltisinin DSL analizleri, Zeta boyutlandırıcı ve Zeta potansiyel tablosu Tablo 1'de gösterilmektedir.
Şekil 2: Eksozomların nanopartikül izleme analizi. (a) Eksozomlar; (B) dopamin yüklü eksozomlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Zetasizer analizi . (A) Eksozomlar, (B) dopamin yüklü eksozomlar, (C) Saponin, (D) Dopamin. Kısaltma: d = boyut. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Çözeltide dopamin varlığı HPLC analizi ile belirlendi. Dopamin yüklü eksozomlar ultrasantrifüje tabi tutuldu ve serbest dopamini uzaklaştırmak için filtrelendi. İnkübasyon sonunda eksozomlara dopamin yüklemesi başarılı olursa, eksozomların rüptürünü takiben doğrudan dopamin ölçümü ile tespit edilebilir. Bu amaçla, dopamin yüklü eksozom süspansiyonu buharla ısıtıldı, asetonitril eklendi ve süspansiyon sonikasyona tabi tutuldu. Bozulmuş eksozomlardan salınan dopamin miktarlarını değerlendirmek için absorbans 230 nm'de ölçüldü.
Şekil 4: HPLC analizi ile belirlenen formülasyonda dopamin varlığı. Tüm analizler, 30 ° C'de 1 mL / dak akış hızındaH2O / Asetonitril mobil fazına sahip bir C-18 kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Dopamin elüsyonunu izlemek için absorbans 230 nm'de ölçülür. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopamin yüklü eksozomlar. Kısaltma: HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
HPLC analizi sonucunda, dopamin için ortaya çıkan pik 6.45 dakikada gözlendi. Eksozom fragmantasyonundan sonra saponin varlığı da tespit edildi (Şekil 4).
İlaç yükleme kapasitesi ve in vitro ilaç salım kinetiği
Dopamin yükleme kapasitesi UV spektrofotometri ölçümleri ve Eq (1) ve Eq (2) kullanılarak hesaplandı. Yükleme kapasitesi yüzdesi 10.89 ± 0.33 olarak bulunmuştur. Kümülatif ilaç salım profili Şekil 5'te gösterilmektedir. 8 saat boyunca izlenen ilaç salım kinetiği, kapsüllenmiş dopaminin% 74.8'inin ilk 8 saat içinde eksozomlardan salındığını ortaya koydu (Şekil 5).
Şekil 5: Kümülatif ilaç salım profili. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İn vitro sitotoksisite testi
Dopamin yüklü ve serbest eksozomların fibroblastlar üzerindeki sitotoksisitesi araştırıldı. Fibroblastlar farklı konsantrasyonlarda formülasyonlara (100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL ve 1.000 μL/mL) maruz bırakıldı ve 18 saat inkübe edildi. Dopamin yüklü eksozomlar kayda değer bir sitotoksik etki göstermese de, dopaminin kapsüllenmesini artırmak için formülasyona eklenen saponin fibroblast canlılığını azalttı (p < 0.05, Şekil 6). Fibroblastlar 500 μL / mL konsantrasyona kadar dopamin yüklü eksozomlarla tedavi edildiğinde hücre canlılığında bir artış oldu. 18 saatlik inkübasyonun sonunda, hücre canlılığı MTT testi ile belirlendi (Şekil 7). Sonuçların istatistiksel anlamlılığı tek yönlü varyans analizi (ANOVA) yapılarak değerlendirildi.
Şekil 6: Formülasyonun hücrelerle inkübasyonundan sonra mikroskop görüntüleri (10x). (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopamin yüklü eksozomlar 100 μL/mL, (D) Dopamin yüklü eksozomlar 250 μL/mL, (E) Dopamin yüklü eksozomlar 500 μL/mL, (F) Dopamin yüklü eksozomlar 1.000 μL/mL. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Farklı konsantrasyonlarda dopamin, saponin ve dopamin yüklü eksozomlarla 18 saat inkübe edilen hücrelerde MTT canlılık testi sonuçlarının istatistiksel analizi . (A) Sitotoksisite sonuçları, (B,C) İstatistiksel analizler. Kısaltmalar: D = Dopamin; S = Saponin; Ekzo-DA1 = Dopamin yüklü eksozomlar 100 μL/mL; Ekzo-DA2 = Dopamin yüklü eksozomlar 250 μL/mL; Exo-DA 3 Dopamin yüklü eksozomlar 500 μL/mL; Ekzo-DA 4 = Dopamin yüklü eksozomlar 1.000 μL/mL; MTT = 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek olarak, serbest eksozomların benzer konsantrasyonlardaki fibroblastlar üzerindeki sitotoksik etkileri de araştırılmıştır (Şekil 8). Deneyden önce, eksozomlar PBS ile mL başına 60 milyon partiküle seyreltildi. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 10 μL, 25 μL, 50 μL ve 100 μL eksozom süspansiyonu ilave edildi.
Şekil 8: Farklı eksozom konsantrasyonları ile 18 saat inkübe edilen hücrelerde MTT canlılık testi sonuçlarının istatistiksel analizi . (A) Sitotoksisite sonuçları, (B,C) istatistiksel analizler. Kısaltmalar: EXO = eksozomlar; MTT = 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
500 μL/mL dopamin yüklü eksozomlar ve 25 μL/mL serbest eksozomlar ile fibroblast canlılığı diğer konsantrasyonlara göre daha yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte, herhangi bir konsantrasyonda önemli bir sitotoksisite gözlenmemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksozomlar, çoğu hücre tipi, örneğin MSC'ler1 tarafından salgılanan 40-200 nm boyutlarında küçük zar vezikülleridir. Hücreler arasındaki iletişimi sağlayabilen eksozomlar, hücrelere endositoz, fagositoz, mikropinositoz, lipid aracılı içselleştirme ve füzyon gibi farklı yollarla girebilirler33,44. Diğer nanotaşıyıcı sistemlerle karşılaştırıldığında, eksozom yüzeyinde bulunan lipitler ve kolesterol, hem hidrofilik hem de hidrofobik molekülleri taşıma yeteneği verirken, kolesterol uçlarının hidrojen bağı sıkı paketlemeye izin verir45.
Bu çalışmada MSC'den türetilen eksozomların izolasyonu, ilaç yükleme deneyleri ve sitotoksisite deneyleri yapılmıştır. Eksozomların, hücreler arasındaki kargo ve iletişim gibi önemli işlevlerinin yanı sıra özellikle beyinde nörogenezde önemli bir role sahip olduğu bilinmektedir 6,7. Ayrıca, MSC'den türetilen eksozomlar nispeten iyi tolere edilir, doğal terapötik özelliklere sahiptir ve yüksek stabilite ve hedef arama yeteneği gösterir46,47. Son yıllarda, nöronal hasarın neden olduğu bu bozuklukların tedavisi olmadığı için nörodejeneratif hastalıklara karşı alternatif tedaviler olarak eksozom uygulamaları gibi nano ölçekli tedavi yöntemleri üzerine yapılan araştırmalar yoğun ilgi görmektedir. Ek olarak, eksozomların BBB'den geçme yeteneği, onları bir ilaç taşıyıcı sistem olarak mükemmel platformlar haline getirir.
Eksozom izolasyonu için birkaç yöntem bulunmakla birlikte burada en etkili yöntemlerden biri olarak kabul edilen ultrasantrifüj izolasyon yöntemini kullandık. Bu çalışmada, donör hücreler olarak seçilen WJ-MSC'ler, düşük immünojenik potansiyelleri47 ile bilinir ve klinik çalışmalarda bir eksozom kaynağı olarak kullanılır48. Elde edilen eksozomlar daha sonra dopamin çözeltisi ile inkübe edildi ve bu sırada ilaç yükleme başarısını artırmak için çözeltiye saponin eklendi. İnkübasyonun sonunda, serbest dopamin ve saponin ortamdan uzaklaştırıldı. Saponinin, eksozomların zara bağlı kolesterolünü seçici olarak çıkarması ve ekzozomal lipid çift katmanlarında gözenekler oluşturarak dopamin moleküllerinin girişini teşvik etmesi beklenir. Sonuç olarak, eksozomların boyutlarının, muhtemelen dopamin yüklemesi nedeniyle biraz arttığı gözlenmiştir.
Zeta potansiyeli, parçacıklar ve bunların toplanma eğilimleri arasında daha fazla elektrostatik itme gösterir. Elde edilen formülasyonun zeta potansiyeli, önceki çalışmaların sonuçlarıyla uyumluydu49. Kuluçka süresi sonunda yapılan HPLC analizinde, eksozomların parçalanmasından sonra dopamin varlığı tespit edildi. Yukarıda bahsedildiği gibi, saponin dopaminin kapsüllenmesini teşvik eder. İlaç yükleme kapasitesi, absorbans değerleri39 esas alınarak UV-vis spektrofotometrisi ile ölçüldü. İlaç yüklemesi için inkübasyon yöntemi basit ve diğer yöntemlere göre daha ucuz olmasına rağmen, bu yöntemde yükleme etkinliği düşüktür26. Bu çalışmada yükleme kapasitesi yaklaşık %11 olarak gerçekleşmiştir. Saponin, sitoplazmik membran50 için etkili bir geçirgenleştirici ajandır ve eksozomların dopamin ile yükleme kapasitesini arttırdığı görülmektedir.
Gelecekteki çalışmalarda, ekzozomal ilaç yükleme verimliliğini artırmak için sonikasyon yöntemini tercih etmek daha etkili olabilir38. Kümülatif ilaç salım profili, 8 saatlik inkübasyonun sonunda büyük miktarlarda dopamin salındığını ortaya koydu. İn vitro salım çalışmasının ilk 5 saatinde patlayıcı bir salınım gözlendi. Eksozom formülasyonlarının salım profili, ilaç özellikleri, çift tabakalı akışkanlık ve molekül ağırlığı gibi birçok parametreye bağlı olduğundan, birçok çalışmada saatte salınan ilaç miktarlarında farklılıklar gözlenebilmektedir51. Ek olarak, bu çalışmada formülasyonların fibroblastlar üzerinde sitotoksik etkisi gözlenmemiştir. Bununla birlikte, eksozomlara dopamin yüklemesini artırmak için eklenen saponinin fibroblast hücreleri üzerindeki toksik etkisi tespit edildi. Bu verilere göre, eksozomların endojenliği, lipozomlar, mikroküreler, mikroemülsiyonlar ve diğer sentetik ilaç dağıtım sistemleriyle karşılaştırıldığında doğal ve benzersiz bir avantajdır52. Mevcut yöntemin dezavantajlarını azaltmak için, eksozom kaynağı olarak farklı transfeksiyon reaktifleri, elektroporasyon teknikleri veya endojen dopamin üreten hücreler, tercihen genetiği değiştirilmiş MSC'ler kullanılabilir.
Bu protokol ile eksozom izolasyonu yapılmıştır. Ancak izolasyon aşaması oldukça uzun ve zor bir süreçtir. Hücre kültüründen toplanan süpernatantın serumsuz ortamda olmasına dikkat edilmelidir. Ek olarak, bugüne kadar, eksozom miktarları protein konsantrasyonu ile ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, eksozom parçacıklarının sayısının hesaplanması ve uygulanmasının klinik çalışmalarda doğruluğu artırmaya yardımcı olabileceğini öneriyoruz. İzole eksozomların ilaç yüklemesi için kullanılan inkübasyon yöntemi, ilaç yükleme kapasitesi açısından düşük bulunmuştur. Yüksek ilaç yükleme kapasitesine sahip olan sonikasyon yöntemi, daha etkili sonuçlar elde edilmesine yardımcı olabilir.
Bu bulgular, WJ-MSC'den türetilen eksozomların dopamin iletimi için güçlü taşıyıcılar olduğunu gösterdi. BBB'yi geçme yetenekleri ve immünomodülatör özellikleri ile birlikte, Parkinson veya diğer CNS hastalıkları için hedefe yönelik tedaviler, ilaç taşıyan eksozomlarla geliştirilebilir. Ancak çalışmalar in vivo olarak yapılmalı ve klinik çalışmalarla desteklenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çalışma, öncelikle Yıldız Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (TSA-2021-4713) tarafından sağlanan araştırma fonu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
