Summary
Nosso objetivo foi obter uma formulação por carga de dopamina dos exossomos isolados de células-tronco da geleia mesenquimal de Wharton. O isolamento e caracterização dos exossomos, a carga do fármaco nos exossomos resultantes e a atividade citotóxica da formulação desenvolvida são descritos neste protocolo.
Abstract
Exossomos entre 40 e 200 nm de tamanho constituem o menor subgrupo de vesículas extracelulares. Essas vesículas bioativas secretadas pelas células desempenham um papel ativo na carga intercelular e na comunicação. Os exossomos são encontrados principalmente em fluidos corporais como plasma, líquido cefalorraquidiano, urina, saliva, líquido amniótico, colostro, leite materno, líquido articular, sêmen e ácido pleural. Considerando o tamanho dos exossomos, acredita-se que eles possam desempenhar um papel importante em doenças do sistema nervoso central, pois podem atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver um sistema nanocarreador baseado em exossomos por meio do encapsulamento de dopamina em exossomos isolados de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton (CTMs-WJ). Os exossomos que passaram pelo processo de caracterização foram incubados com dopamina. Os exossomos carregados de dopamina foram recaracterizados ao final da incubação. Exossomos com dopamina foram investigados em ensaios de liberação de fármacos e citotoxicidade. Os resultados mostraram que a dopamina pode ser encapsulada com sucesso dentro dos exossomos e que os exossomos carregados de dopamina não afetaram a viabilidade dos fibroblastos.
Introduction
Os exossomos, vesículas bioativas com características significativas, variam em tamanho de 40 nm a 200 nm. Os exossomos originam-se da membrana celular e são formados devido à liberação dos endossomos1. Essas estruturas servem como comunicadores célula a célula e interagem com células vizinhas para facilitar a transferência de moléculas ativas. Os exossomos podem ser isolados de muitas fontes diferentes. Estes incluem fluidos corporais como plasma, urina, líquido cefalorraquidiano, saliva, bem como linhagens celulares cultivadas em condições in vitro . Os exossomos têm papel importante na eliminação de lesões nervosas, graças às biomacromoléculas que contêm, como lipídios, proteínas e ácidos nucléicos2. A glia, que são as células de suporte do sistema nervoso3, transfere proteínas e micro RNAs para os axônios dos neurônios via exossomos4.
Os lipídios que formam a bainha de mielina, característicos da condução nervosa, também são liberados dos oligodendrócitos via exossomos 4,5. Os exossomos também estão envolvidos em processos como plasticidade sináptica, resposta neuronal ao estresse, comunicação célula-célula e neurogênese no cérebro 6,7. O fato de os exossomos possuírem nanodimensões permite que eles passem pelo BBB. Existe uma rota especial de transição do líquido intersticial para o líquido cefalorraquidiano após a penetração dessa membrana8. Graças às suas propriedades de superfície, os exossomos podem interagir eficientemente com as células-alvo como um sistema de liberação de drogas e entregar ativamente os medicamentos carregados.
Devido à expressão de várias proteínas adesivas (tetraspaninas e integrinas) na superfície dos exossomos, essas vesículas extracelulares podem facilmente interagir e fundir-se com as membranas celulares dohospedeiro9. Acredita-se que os exossomos podem ser usados como um sistema de liberação de drogas, especialmente no tratamento de doenças do sistema nervoso central, devido à sua capacidade de penetrar na BHE e suas propriedades de superfície. Exossomos derivados de células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam menor risco de rejeição imunológica quando comparados às terapias celulares alogênicas e, nesse aspecto, podem ser um componente importante de aplicações de tratamento livre de células10.
A dopamina é uma molécula cuja deficiência no cérebro é a característica da doença de Parkinson (DP), agravando-se a cada dia11,12,13. Sabe-se que a DP está associada à degeneração de neurônios dopaminérgicos na substância negra do mesencéfalo e à perda das funções dos neurônios motores14,15. A morte dos neurônios dopaminérgicos impede o fornecimento do neurotransmissor dopamina para o estriado cerebral. Isso, por sua vez, resulta no surgimento de sintomas específicos da DP16. Esses sintomas da DP são bradicinesia, instabilidade postural, rigidez e, principalmente, tremor de repouso12,13. Embora a DP tenha sido descrita pela primeira vez há mais de dois séculos, estudos para entender a patologia e a etiologia da doença ainda estão em andamento e atualmente é aceito que a DP é uma doença sistêmicacomplexa17. Prevê-se que ocorra deficiência de dopamina, e sintomas clínicos de DP são observados quando mais de 80% dos neurônios degeneram18. No tratamento da doença, a suplementação incompleta de dopamina é preferida para reduzir os sintomas motores. Estudos in vivo demonstraram que a infusão direta de dopamina no cérebro reduz significativamente os sintomas em animais19. Precursores de dopamina como a L-DOPA (L-3,4-dihidroxifenilalanina) e drogas receptoras de dopamina são usados na clínica porque a infusão direta de dopamina no cérebro não é possível em humanos e a dopamina que entra no sistema não pode atravessar a BHE20. Esses tipos de medicamentos perdem sua eficácia com o tempo. No entanto, ainda não existe uma abordagem terapêutica curativa para a DP. Assim, há uma enorme necessidade de desenvolver novas estratégias terapêuticas e modalidades de tratamento para revelar a fisiopatologia da doença e reduzir o impacto da DP nos pacientes.
Estudos baseados em exossomos têm recentemente atraído atenção por reunir informações sobre abordagens terapêuticas e patologias de doenças do sistema nervoso. Exossomos derivados de CTM demonstraram reduzir a inflamação no dano ao nervo e contribuir para a regeneração neuronal21,22,23. Além disso, tem sido relatado que os secretomas do exossomo derivados das CTM reduzem a apoptose por apresentarem efeitos neurotróficos e neuroprotetores, especialmente sobre os neurônios dopaminérgicos24,25. A pesquisa em plataformas nas quais exossomos são usados como sistemas terapêuticos de liberação de fármacos tem acelerado intensamente nos últimos anos. Em numerosos estudos, observou-se que drogas relevantes podem ser facilmente encapsuladas em exossomos e entregues com segurança em células-alvo, tecidos e órgãos26,27. Diferentes métodos como incubação, ciclos de congelamento/descongelamento, sonicação e extrusão podem ser utilizados para o carregamento de fármacos em exossomos28.
A coincubação com exossomos ou vesículas semelhantes a exossomos permite que pequenas moléculas lipofílicas sejam passivamente encapsuladas nesses sistemas de liberação28,29,30. Em particular, várias moléculas como curcumina 31, catalase 30, doxorrubicina32, e paclitaxel33 foram efetivamente carregadas em exossomos. Observou-se que os exossomos contendo catalase, que possuem atividade antioxidante, acumularam-se eficientemente nos neurônios e células da microglia no cérebro e exibiram forte atividade neuroprotetora30. No mesmo estudo, a saponina, adicionada ao complexo para aumentar a eficiência de carga, aumentou a porcentagem de carga do fármaco durante a incubação30,34. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer os padrões para a carga de drogas em exossomos.
Este trabalho descreve o desenvolvimento de um sistema nanocarreador por encapsulamento de dopamina em exossomos isolados de CTMs-WJ. Todas as etapas, incluindo o cultivo de CTMs-WJ, isolamento e caracterização de exossomos, experimentos de carregamento de drogas, caracterização de exossomos carregados de dopamina com várias técnicas e análise de citotoxicidade in vitro são explicadas em detalhes.
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Protocol
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo.
1. Cultura e criopreservação de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton
- Remova os WJ-MSCs (do ATCC) do congelador de -80 °C. Semeando as células em um frasco contendo meio DMEM-F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB). Incubá-los a 37 °C numa incubadora contendo 5% de CO2.
- Troque o meio de cultura a cada 2 dias. Passar as células quando atingirem 80% de confluência. Lavar as células a serem passadas com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: A lavagem com PBS antes da adição de tripsina garante a fácil separação das células da superfície do frasco. - Retirar o PBS e adicionar 5 ml de solução de tripsina-EDTA ao balão. Incubar o balão durante 5 min a 37 °C numa estufa contendo 5% de CO2.
- Recolher o sobrenadante no tubo e centrifugar a 1.500 x g durante 5 min. Após a centrifugação, retirar o sobrenadante e adicionar 1 mL de DMEM-F12 + 10% FBS ao tubo por pipetagem.
- Transferir as células para um frasco maior e continuar a cultura adicionando DMEM-F12 + 10% FBS até obter exossomos suficientes35.
NOTA: As células cultivadas são congeladas a uma densidade de 1 milhão/mL com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenadas a -80 °C.
2. Produção de exossomos a partir de células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton
NOTA: Os exossomos são isolados de cultivadas WJ-MSCs. O isolamento dos exossomos é realizado quando as células cobrem a superfície do frasco e atingem aproximadamente 80% de densidade.
- Retirar do balão o meio sobrenadante contendo FBS a 10% e lavar as células com 5 mL de PBS. Adicionar meio DMEM-F12 sem soro às células após enxágue com PBS. Incubar frascos durante 48 h a 37 °C numa incubadora com CO2 a 5%. Após a incubação, recolher o meio sem soro no tubo e armazenar a -20 °C.
NOTA: Na etapa 2.1, 180 mL de meio sem soro são coletados e armazenados a -20 °C. Após o descongelamento, inicia-se o processo de centrifugação em batelada, conforme descrito abaixo. - Isolamento de exossomos
- Centrifugar o meio sem soro recolhido a 300 x g durante 10 minutos a +4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para outro tubo.
- Centrifugar o sobrenadante recolhido a 2.000 × g durante 10 min a +4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para outro tubo.
- Centrifugar o sobrenadante recolhido a 10.000 × g durante 30 min a +4 °C. Retire cuidadosamente o sobrenadante e transfira-o para outro tubo.
- Transfira o sobrenadante coletado para tubos de ultracentrífuga e ultracentrífuga a 110.000 × g por 130 min. Retire lentamente o sobrenadante e adicione 1 mL de PBS ao pellet.
- Vórtice o pellet e a ultracentrífuga a 110.000 × g por 70 min a +4 °C36 (Figura 1). Retire lentamente o sobrenadante e adicione 1 mL de PBS ao pellet.
NOTA: Após a conclusão das etapas de ultracentrifugação, os exossomos obtidos podem ser armazenados a -80 °C. O pellet obtido já está pronto para caracterização.
Figura 1: Isolamento do exossomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Caracterização dos exossomos
- Análise de Rastreamento de Nanopartículas (NTA)
NOTA: A análise de rastreamento de nanopartículas é realizada para determinar o tamanho e a concentração dos exossomos isolados. Os comprimidos utilizados para 1x solução PBS devem estar na faixa de pH 7,3-7,5. 1x PBS Solution contém 10 mM tampão fosfato, 137 mM cloreto de sódio e 2,7 mM cloreto de potássio. A solução é preparada adicionando 1 comprimido de PBS em 100 mL de água destilada. Esta solução preparada é esterilizada por autoclavagem.- Diluir os exossomos 100 vezes adicionando 990 μL de PBS a 10 μL de exossomos. Leve a suspensão diluída para uma seringa descartável.
- Ligue o dispositivo NTA e conecte o computador. Abra o software.
- Injete a amostra na seringa na tubulação na seção de do dispositivo. Feche a tampa do do dispositivo.
- No software que é aberto, clique no botão Iniciar análise . Salve os resultados obtidos pressionando o botão Gravar .
- Análise dinâmica de espalhamento de luz
NOTA: Os exossomos isolados para medição do potencial zeta e tamanho também são diluídos da mesma maneira que para a análise NTA.- Adicionar 980 μL de PBS a 20 μL dos exossomos.
- Abra o dispositivo de dimensionamento zeta e o computador conectado. Abra o software.
- Adicione a suspensão do passo 3.2.1 à cubeta descartável. Abra a tampa do dispositivo, coloque a cubeta no e feche a tampa.
- Selecione o tipo de cubeta no software do dispositivo. Clique no botão Iniciar análise para análise de potencial zeta e dimensional.
NOTA: As análises são realizadas separadamente para análise dimensional e potencial zeta.
4. Carga de dopamina em exossomos
NOTA: Após a caracterização dos exossomos WJ-MSCs ser concluída, exossomos carregados de dopamina foram obtidos como um sistema de liberação de fármacos. O carregamento do fármaco em exossomos é realizado pelo método de incubação.
- Adicionar 3 ml de PBS à suspensão do exossoma a partir do passo 2.2.5. Esterilizar a suspensão diluída por filtração utilizando filtros de 0,22 μm. Transferir 500 μL da suspensão esterilizada do exossomo para outro tubo.
- Preparar solução de dopamina (0,5 mg/mL) com água destilada. Adicionar 500 μL de solução de dopamina nos tubos que contêm os exossomos.
- Adicionar saponina à suspensão no passo 4.2. Incubar a suspensão preparada de exossomatório-dopamina durante 24 h a 37 °C.
NOTA: A concentração de saponina não deve exceder 0,002% da solução total. - Ultracentrifugar a suspensão a 90.000 × g por 70 min para remover dopamina livre e saponina do meio. Conservar os exossomas isolados a -20 °C até à utilização para análise posterior37.
NOTA: Adicionar ácido ascórbico a 0,02% para a estabilidade da solução de dopamina preparada.
5. Caracterização de exossomos carregados de dopamina
- Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
NOTA: A análise de rastreamento de nanopartículas é realizada para determinar o tamanho e a concentração dos exossomos isolados.- Siga os passos 3.1.1-3.1.4 para diluir os exossomos e realizar NTA.
- Análise dinâmica de espalhamento de luz
NOTA: Os exossomos isolados para medição do potencial zeta e do tamanho também são diluídos de forma semelhante à análise NTA.- Siga os passos 3.2.1-3.2.4 para diluir os exossomos e realizar a análise dinâmica de espalhamento de luz.
NOTA: O tamanho e os potenciais zeta para cada solução (saponina, dopamina, exossomo-dopamina) são analisados separadamente.
- Siga os passos 3.2.1-3.2.4 para diluir os exossomos e realizar a análise dinâmica de espalhamento de luz.
6. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
NOTA: As quantidades de dopamina carregadas em exossomos são medidas pelo método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Para detectar a presença de dopamina dentro da formulação obtida, os exossomos são detonados por um processo especial.
- Coloque a formulação em um aquecedor de 75 °C para evaporar. Adicione acetonitrila (proporção 50:50) à suspensão e ao vórtice. Sonicate a solução por 10 min.
- Centrifugar a solução por 10 min a 10.000 × g. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,22 μm.
- Analisar todos os analitos usando uma coluna C18 a 30 °C a uma taxa de fluxo de 1 mL/min (fase móvel H2O/acetonitrila). Medir a absorbância a 230 nm38.
7. Mensuração da capacidade de carga (LD) e cinética de liberação in vitro do fármaco
- Capacidade de carga de fármacos (CD)
NOTA: A quantidade de dopamina carregada em exossomos é quantificada usando espectroscopia UV-Vis. A absorbância é lida a 280 nm. Os sobrenadantes coletados durante a síntese são usados para medir a quantidade de droga descarregada. A concentração de dopamina no sobrenadante é determinada através de uma curva de calibração padrão para dopamina.- Preparar uma solução-mãe de 1 mg/ml de dopamina. Preparar concentrações de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL da solução-mãe usando água destilada.
NOTA: Adicionar ácido ascórbico a 0,02% para a estabilidade da solução de dopamina preparada. - Gere uma curva de calibração padrão medindo a absorbância de cada diluição de dopamina a 280 nm em um espectrofotômetro UV.
- Medir a absorbância do sobrenadante a 280 nm.
- Calcular a capacidade de carga do fármaco para dopamina utilizando a Eq (1)39.
DL (%) =
100 (1)
OBS: A análise é realizada em triplicata.
- Preparar uma solução-mãe de 1 mg/ml de dopamina. Preparar concentrações de 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL da solução-mãe usando água destilada.
- Cinética de liberação de fármacos in vitro
NOTA: A cinética de liberação de drogas de exossomos carregados de dopamina é realizada usando uma membrana de diálise. PBS, pH 7,4, é usado como meio de liberação para simular um microambiente fisiológico.- Adicionar 1 mL de exossomos carregados de dopamina à membrana de diálise. Coloque a membrana em um copo. Adicionar 15 mL de PBS ao copo.
- Amostra de 1 mL de meio de liberação em copo às 0,5, 1, 2, 4, 6 e 8 h. Em cada ponto de tempo, substitua o volume da amostra por PBS fresco. Analisar as amostras colhidas a intervalos especificados a 280 nm utilizando um espectrómetro UV-Vis.
- Calcule os resultados usando Eq (2)40.
Lançamento (%) =
100 (2)
NOTA: Uma curva de calibração é preparada para a determinação da cinética de liberação de fármacos in vitro . A solução de dopamina é preparada nas concentrações de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 e 5,0 mg/mL. O valor de absorbância UV de cada concentração é determinado a 280 nm com um espectrofotômetro UV-Vis.
100 (1)
100 (2)8. Ensaio de citotoxicidade in vitro
- Revitalização e cultura de fibroblastos
- Retire os fibroblastos do congelador a -80 °C. Semeando as células em um frasco contendo DMEM-F12 + 10% FBS.
- Incubar as células a 37 °C numa estufa contendo 5% de CO2. Troque o meio de cultura a cada 2 dias.
- Passar pelas células até atingirem 80% de confluência. Siga as etapas 1.3-1.5. Após centrifugação a 1.500 × g por 5 min, remova o sobrenadante, adicione 1 mL de DMEM-F12 + 10% FBS e semeie 10.000 células por poço em uma placa de 96 poços.
- Adicionar meio DMEM-F12 + 10% FBS e incubar as células a 37 °C por 18 h em uma incubadora contendo 5% de CO2. Troque o meio dos poços ao final da incubação.
- Prepare o estoque de suspensão de exossomo carregado de dopamina. Diluir a formulação do exossomo dopamina com meio para obter concentrações de 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL e 1.000 μL/mL.
- Adicione as concentrações preparadas nas células dentro de cada poço da placa de 96 poços. Incubar as placas a 37 °C durante 18 h numa estufa contendo 5% de CO241.
- Ensaio de viabilidade celular MTT
NOTA: No final da incubação, as razões de viabilidade das células são determinadas pelo teste MTT.- Preparar a solução de MTT (5 mg/mL) com PBS. Adicionar 10 μL de solução de MTT a cada poço. Incubar durante 4 h a 37 °C.
- Ao final da incubação, adicionar 100 μL de DMSO a cada poço. Incubar as placas durante 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Medir os valores de absorbância no leitor de ELISA a 570 nm42,43.
NOTA: O teste de viabilidade do MTT é realizado em triplicata.
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Representative Results
Isolamento e caracterização de exossomos
As células-tronco da geleia de Wharton são cultivadas e incubadas em meio livre de soro por 48 h quando a cultura atinge densidade suficiente. Após o término da incubação, o sobrenadante é armazenado a -20 °C. Os sobrenadantes coletados são diluídos em PBS e submetidos à ultracentrifugação (Figura 1). A solução obtida é analisada por NTA e DLS. Os exossomos são esterilizados passando por um filtro de 0,22 μm. O tamanho médio dos exossomos obtidos foi determinado em 98 nm (Vídeo 1). Aproximadamente 10 bilhões de partículas de exossomos foram obtidas ao final da centrifugação. Os números de nanopartículas revelados pelas análises de NTA e DLS são consistentes entre si. Além disso, o potencial zeta dos exossomos originários das CTMs-WJ foi medido em -15,7 mV (Figura 2 e Figura 3).
Vídeo 1: Análise de rastreamento de nanopartículas de exossomos derivados da geleia de Wharton. Clique aqui para baixar este vídeo.
Carga de dopamina em exossomos
Conforme calculado na análise NTA, havia aproximadamente 1,5 bilhão de nanopartículas em 500 μL das amostras isoladas da geleia de Wharton. Solução dopaminérgica (5 mg/mL) foi misturada com 500 μL de exossomos, e a suspensão foi incubada por 24 h a 37 °C. Após a incubação, a solução obtida foi caracterizada por análises de NTA e DLS. De acordo com os resultados do NTA, o tamanho médio de partícula da solução foi de 110 nm. Uma comparação dos tamanhos das partículas dos exossomos e dos exossomos carregados de dopamina revela que houve um aumento significativo nas dimensões dos exossomos carregados de dopamina. Os números de nanopartículas revelados pelas análises de NTA e DLS foram consistentes entre si. Além disso, o potencial zeta dos exossomos carregados de dopamina foi medido em -17,6 Mv (Figura 2 e Figura 3).
Vídeo 2: Análise de rastreamento de nanopartículas de exossomos carregados de dopamina. Clique aqui para baixar este vídeo.
| Amostra | Potencial Zeta |
| Exossomo | -15,7 mV ± 1,1 |
| Saponina | -12 mV ± 0,7 |
| Dopamina | -14,4 mV ± 1,3 |
| Exossomo carregado de dopamina | -17,6 mV ± 0,8 |
Tabela 1: Potencial Zeta de todas as soluções.
As análises DSL, o sizer Zeta e a tabela de potencial Zeta da solução de dopamina, saponina e exossomo carregado de dopamina são mostrados na Tabela 1.
Figura 2: Análise de rastreamento de nanopartículas de exossomos. (A) Exossomos; (B) exossomos carregados de dopamina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise do Zetasizer . (A) Exossomos, (B) Exossomos carregados de dopamina, (C) Saponina, (D) Dopamina. Abreviação: d = tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A presença de dopamina na solução foi determinada por análise por HPLC. Exossomos carregados de dopamina foram ultracentrifugados e filtrados para remover dopamina livre. Se a carga de dopamina nos exossomos for bem-sucedida no final da incubação, ela pode ser detectada pela medição direta da dopamina após a ruptura dos exossomos. Para isso, a suspensão do exossomo carregado de dopamina foi aquecida com vapor, adicionada de acetonitrila, e a suspensão foi sonicada. A absorbância foi medida a 230 nm para avaliar as quantidades de dopamina liberadas pelos exossomos interrompidos.
Figura 4: Presença de dopamina na formulação determinada por HPLC. Todas as análises foram realizadas em coluna C-18 com fase móvel de H2O/acetonitrila a uma vazão de 1 mL/min a 30 °C. A absorbância é medida a 230 nm para monitorar a eluição de dopamina. (A) Dopamina, (B) Saponina, (C) Exossomos carregados de dopamina. Abreviação: HPLC = cromatografia líquida de alta eficiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como resultado da análise por HPLC, o pico resultante para dopamina foi observado em 6,45 min. A presença de saponina também foi detectada após fragmentação do exossomo (Figura 4).
Capacidade de carga e cinética de liberação de fármacos in vitro
A capacidade de carga de dopamina foi calculada por espectrofotometria UV e Eq (1) e Eq (2). O percentual de capacidade de carga encontrado foi de 10,89 ± 0,33. O perfil de liberação cumulativa de fármacos é mostrado na Figura 5. A cinética de liberação da droga monitorada por 8 h revelou que 74,8% da dopamina encapsulada foi liberada dos exossomos nas primeiras 8 h (Figura 5).
Figura 5: Perfil cumulativo de liberação de medicamentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ensaio de citotoxicidade in vitro
A citotoxicidade de exossomos livres e carregados de dopamina foi investigada em fibroblastos. Os fibroblastos foram expostos a diferentes concentrações de formulações (100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL e 1.000 μL/mL) e incubados por 18 h. Embora os exossomos carregados de dopamina não tenham demonstrado efeitos citotóxicos marcantes, a saponina adicionada à formulação para aumentar o encapsulamento da dopamina diminuiu a viabilidade dos fibroblastos (p < 0,05, Figura 6). Houve aumento da viabilidade celular quando os fibroblastos foram tratados com exossomos dopaminérgicos até a concentração de 500 μL/mL. Ao final das 18 h de incubação, a viabilidade celular foi determinada pelo teste MTT (Figura 7). A significância estatística dos resultados foi avaliada pela realização de ANOVA one-way.
Figura 6: Imagens do microscópio (10x) após incubação da formulação com as células. (A) Dopamina, (B) Saponina, (C) Exossomos com dopamina 100 μL/mL, (D) Exossomos com dopamina 250 μL/mL, (E) Exossomos com dopamina 500 μL/mL, (F) Exossomos carregados de dopamina 1.000 μL/mL. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise estatística dos resultados do teste de viabilidade do MTT em células incubadas por 18 h com diferentes concentrações de dopamina, saponina e exossomos carregados de dopamina . (A) Resultados de citotoxicidade, (B,C) Análises estatísticas. Abreviações: D = Dopamina; S = saponina; Exo-DA1 = Exossomos com dopamina 100 μL/mL; Exo-DA2 = Exossomos com dopamina 250 μL/mL; Exo-DA 3 Exossomos carregados de dopamina 500 μL/mL; Exo-DA 4 = Exossomos com dopamina 1.000 μL/mL; MTT = brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Adicionalmente, os efeitos citotóxicos dos exossomos livres também foram investigados sobre fibroblastos em concentrações semelhantes (Figura 8). Antes do experimento, os exossomos foram diluídos com PBS a 60 milhões de partículas por mL. Em seguida, 10 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL da suspensão do exossomo foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços.
Figura 8: Análise estatística dos resultados do teste de viabilidade do MTT em células incubadas por 18 h com diferentes concentrações de exossomos . (A) Resultados de citotoxicidade, (B,C) Análises estatísticas. Abreviações: EXO = exossomos; MTT = brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A viabilidade dos fibroblastos foi maior com 500 μL/mL de exossomos carregados de dopamina e 25 μL/mL de exossomos livres em comparação com outras concentrações. No entanto, nenhuma citotoxicidade significativa foi observada em nenhuma concentração.
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Discussion
Exossomos são pequenas vesículas de membrana com dimensões de 40-200 nm secretadas pela maioria dos tipos celulares, por exemplo, CTMs1. Capazes de permitir a comunicação entre as células, os exossomos podem entrar nas células de diferentes maneiras, como endocitose, fagocitose, micropinocitose, internalização mediada por lipídios e fusão33,44. Comparados a outros sistemas nanocarreadores, os lipídios e o colesterol encontrados na superfície do exossomo conferem a capacidade de transportar moléculas hidrofílicas e hidrofóbicas, com a ligação de hidrogênio das extremidades do colesterol permitindo um empacotamento apertado45.
O isolamento de exossomos derivados de CTM, experimentos de carregamento de drogas e ensaios de citotoxicidade foram realizados no presente estudo. Sabe-se que os exossomos têm um papel importante na neurogênese, particularmente no cérebro, além de suas funções significativas, como carga e comunicação entre ascélulas6,7. Além disso, os exossomos derivados das CTM são relativamente bem tolerados, têm propriedades terapêuticas inerentes e apresentam alta estabilidade e capacidade de homing46,47. Nos últimos anos, pesquisas sobre métodos de tratamento em nanoescala, como aplicações de exossomos, têm atraído ampla atenção como tratamentos alternativos contra doenças neurodegenerativas, uma vez que não há cura para esses distúrbios causados por danos neuronais. Além disso, a capacidade dos exossomos de passar pelo BBB os torna excelentes plataformas como um sistema de transporte de drogas.
Embora existam vários métodos para o isolamento do exossomo, neste estudo, utilizamos o método de isolamento por ultracentrífuga, que é aceito como um dos métodos mais eficazes. No presente estudo, as CTMs-WJ, selecionadas como células doadoras, são conhecidas por seu baixo potencial imunogênico47 e utilizadas como fonte de exossomos em ensaios clínicos48. Os exossomos obtidos foram então incubados com solução dopaminérgica, durante a qual saponina é adicionada à solução para aumentar o sucesso da carga da droga. Ao final da incubação, dopamina livre e saponina foram removidas do meio. Espera-se que a saponina remova seletivamente o colesterol ligado à membrana dos exossomos e crie poros nas bicamadas lipídicas exossomais, promovendo a entrada de moléculas de dopamina. Como resultado, observa-se que as dimensões dos exossomos aumentaram ligeiramente, provavelmente devido à carga de dopamina.
O potencial zeta apresenta maior repulsão eletrostática entre partículas e sua tendência a se agregarem. O potencial zeta da formulação obtida foi compatível com os resultados de estudos anteriores49. Na análise por HPLC realizada ao final do período de incubação, a presença de dopamina foi detectada após fragmentação dos exossomos. Como mencionado acima, a saponina promove o encapsulamento da dopamina. A capacidade de carga do fármaco foi medida por espectrofotometria UV-vis baseada em valores de absorbância39. Embora o método de incubação para carregamento de fármacos seja simples e menos dispendioso que outros métodos, a eficiência de carregamento é baixa nesse método26. Neste estudo, a capacidade de carga foi de aproximadamente 11%. A saponina é um agente permeabilizante eficaz para a membrana citoplasmática50 e parece aumentar a capacidade de carga dos exossomos com dopamina.
Em estudos futuros, pode ser mais efetivo preferir o método de sonicação para aumentar a eficiência do carregamento exossomaldo fármaco 38. O perfil de liberação cumulativa da droga revelou que grandes quantidades de dopamina foram liberadas ao final de 8 h de incubação. Uma liberação explosiva foi observada nas primeiras 5 h do estudo de liberação in vitro . Como o perfil de liberação das formulações de exossomos depende de muitos parâmetros, como propriedades do fármaco, fluidez da bicamada e peso molecular, diferenças podem ser observadas nas quantidades de fármacos liberados por hora em muitos estudos51. Além disso, não foram observados efeitos citotóxicos das formulações sobre os fibroblastos neste estudo. No entanto, o efeito tóxico da saponina adicionada para aumentar a carga de dopamina em exossomos foi detectado em células de fibroblastos. De acordo com esses dados, a endogeneidade dos exossomos é uma vantagem natural e única quando comparada a lipossomas, microesferas, microemulsões e outros sistemas de liberação de fármacos sintéticos52. Para reduzir as desvantagens do método atual, diferentes reagentes de transfecção, técnicas de eletroporação ou células endógenas produtoras de dopamina, preferencialmente CTMs geneticamente modificadas, podem ser usados como fonte de exossomos.
O isolamento dos exossomos foi realizado com esse protocolo. No entanto, a etapa de isolamento é um processo muito longo e difícil. Deve-se tomar cuidado para garantir que o sobrenadante coletado da cultura celular esteja no meio livre de soro. Além disso, até o momento, as quantidades de exossomos têm sido associadas à concentração de proteínas. No entanto, propomos que o cálculo e a aplicação do número de partículas do exossomo podem ajudar a aumentar a acurácia em estudos clínicos. O método de incubação utilizado para o carregamento de exossomos isolados mostrou-se baixo em termos de capacidade de carga do fármaco. O método de sonicação, que tem uma alta capacidade de carga de drogas, pode ajudar a obter resultados mais eficazes.
Esses achados mostraram que os exossomos derivados do WJ-MSC são potentes carreadores para a entrega de dopamina. Junto com sua capacidade de passar o BBB e com suas propriedades imunomoduladoras, terapias-alvo para Parkinson ou quaisquer outras doenças do SNC podem ser desenvolvidas com exossomos portadores de drogas. No entanto, os estudos devem ser realizados in vivo e apoiados com ensaios clínicos.
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Disclosures
Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado principalmente por financiamento de pesquisa fornecido por Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
