Summary
Her sigtede vi mod at opnå en formulering ved dopaminindlæsning af de isolerede exosomer af stamceller fra Whartons gelé mesenkymale stamceller. Exosomisolering og karakterisering, lægemiddelbelastning i de resulterende exosomer og den cytotoksiske aktivitet af den udviklede formulering er beskrevet i denne protokol.
Abstract
Exosomer mellem 40 og 200 nm i størrelse udgør den mindste undergruppe af ekstracellulære vesikler. Disse bioaktive vesikler udskilt af celler spiller en aktiv rolle i intercellulær last og kommunikation. Exosomer findes for det meste i kropsvæsker såsom plasma, cerebrospinalvæske, urin, spyt, fostervand, råmælk, modermælk, ledvæske, sæd og pleursyre. I betragtning af størrelsen af exosomer menes det, at de kan spille en vigtig rolle i sygdomme i centralnervesystemet, fordi de kan passere gennem blod-hjerne-barrieren (BBB). Derfor havde denne undersøgelse til formål at udvikle et eksosombaseret nanobærersystem ved at indkapsle dopamin i exosomer isoleret fra Whartons gelémesenkymale stamceller (WJ-MSC'er). Exosomer, der passerede karakteriseringsprocessen, blev inkuberet med dopamin. De dopaminbelastede exosomer blev rekarakteriseret i slutningen af inkubationen. Dopaminbelastede exosomer blev undersøgt i lægemiddelfrigivelse og cytotoksicitetsassays. Resultaterne viste, at dopamin med succes kunne indkapsles i exosomerne, og at de dopaminbelastede exosomer ikke påvirkede fibroblastlevedygtigheden.
Introduction
Exosomer, bioaktive vesikler med væsentlige træk, varierer i størrelse fra 40 nm til 200 nm. Exosomer stammer fra cellemembranen og dannes på grund af frigivelsen af endosomerne1. Disse strukturer tjener som celle-til-celle-kommunikatorer og interagerer med naboceller for at lette overførslen af aktive molekyler. Exosomer kan isoleres fra mange forskellige kilder. Disse omfatter kropsvæsker såsom plasma, urin, cerebrospinalvæske, spyt samt cellelinjer dyrket under in vitro-betingelser . Exosomer har en vigtig rolle i eliminering af nerveskader takket være de biomakromolekyler, de indeholder, såsom lipider, proteiner og nukleinsyrer2. Glia, som er de understøttende celler i nervesystemet3, overfører proteiner og mikro-RNA'er til neuronernes axoner via exosomer4.
Lipider, der danner myelinskeden, som er et karakteristisk træk ved nerveledning, frigives også fra oligodendrocytter via exosomer 4,5. Exosomer er også involveret i processer som synaptisk plasticitet, neuronal stressrespons, celle-celle-kommunikation og neurogenese i hjernen 6,7. Det faktum, at exosomer besidder nanodimensioner, gør det muligt for dem at passere gennem BBB. Der er en særlig overgangsrute fra den interstitielle væske til cerebrospinalvæsken efter at have trængt ind i denne membran8. Takket være deres overfladeegenskaber kan exosomer interagere effektivt med målceller som et lægemiddelafgivelsessystem og aktivt levere de indlæste lægemidler.
På grund af ekspressionen af forskellige klæbende proteiner (tetraspaniner og integriner) på overfladen af exosomer kan disse ekstracellulære vesikler let interagere og smelte sammen med værtscellemembraner9. Det menes, at exosomer kan bruges som et lægemiddelafgivelsessystem, især til behandling af sygdomme i centralnervesystemet på grund af deres evne til at trænge ind i BBB og deres overfladeegenskaber. Mesenkymale stamcelle (MSC)-afledte exosomer har en lavere risiko for immunafstødning sammenlignet med allogene cellulære terapier, og i denne henseende kan de være en vigtig komponent i cellefrie behandlingsapplikationer10.
Dopamin er et molekyle, hvis mangel i hjernen er det karakteristiske træk ved Parkinsons sygdom (PD), forværres dag for dag11,12,13. Det er kendt, at PD er forbundet med degeneration af dopaminerge neuroner i mesencephalons substantia nigra og tab af motorneuronfunktioner14,15. Døden af dopaminerge neuroner forhindrer levering af neurotransmitteren dopamin til hjernens striatum. Dette resulterer igen i fremkomsten af PD-specifikke symptomer16. Disse symptomer på PD er bradykinesi, postural ustabilitet, stivhed og især hvilende tremor12,13. Selvom PD først blev beskrevet for mere end to århundreder siden, er undersøgelser for at forstå sygdommens patologi og ætiologi stadig i gang, og det accepteres i øjeblikket, at PD er en kompleks systemisk sygdom17. Det forudsiges, at dopaminmangel opstår, og kliniske PD-symptomer observeres, når mere end 80% af neuronerne degenererer18. Ved behandling af sygdommen foretrækkes ufuldstændig dopamintilskud for at reducere motoriske symptomer. In vivo-undersøgelser har vist, at direkte infusion af dopamin i hjernen signifikant reducerer symptomer hos dyr19. Dopaminprækursorer såsom L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin) og dopaminreceptorlægemidler anvendes i klinikken, fordi direkte infusion af dopamin i hjernen ikke er mulig hos mennesker, og dopamin, der kommer ind i systemet, kan ikke krydse BBB20. Disse typer af stoffer mister deres effektivitet over tid. Der er dog stadig ingen helbredende behandlingsmetode for PD. Derfor er der et stort behov for at udvikle nye terapeutiske strategier og behandlingsmetoder for at afsløre sygdommens patofysiologi og reducere virkningen af PD på patienter.
Eksosombaserede undersøgelser har for nylig tiltrukket opmærksomhed for at indsamle information om både terapeutiske tilgange og patologier af sygdomme i nervesystemet. MSC-afledte exosomer har vist sig at reducere inflammation i nerveskader og bidrage til neuronal regenerering21,22,23. Derudover er det blevet rapporteret, at MSC-afledte exosomsekretomer reducerer apoptose ved at vise neurotrofiske og neuroprotektive virkninger, især på dopaminerge neuroner24,25. Forskning på platforme, hvor exosomer anvendes som terapeutiske lægemiddelleveringssystemer, er intensivt accelereret i de senere år. I talrige undersøgelser er det blevet observeret, at relevante lægemidler let kan indkapsles i exosomer og leveres sikkert i målceller, væv og organer26,27. Forskellige metoder såsom inkubation, fryse / optøningscyklusser, sonikering og ekstrudering kan anvendes til lægemiddelbelastning i exosomer28.
Coincubation med exosomer eller exosomlignende vesikler gør det muligt passivt at indkapsle lipofile små molekyler i disse leveringssystemer28,29,30. Især blev forskellige molekyler såsom curcumin 31, katalase 30, doxorubicin32 og paclitaxel33 effektivt indlæst i exosomer. Det er blevet observeret, at katalaseholdige eksosomer, som har antioxidantaktivitet, effektivt akkumuleret i neuronerne og mikrogliacellerne i hjernen og udviste stærke neuroprotektive aktiviteter30. I samme undersøgelse viste saponin, tilsat til komplekset for at øge belastningseffektiviteten, at øge lægemiddelbelastningsprocenten under inkubation30,34. Der er imidlertid behov for yderligere undersøgelser for at etablere standarderne for lægemiddelbelastning i exosomer.
Dette papir beskriver udviklingen af et nanobærersystem ved indkapsling af dopamin i exosomer, der blev isoleret fra WJ-MSC'er. Alle trin, herunder dyrkning af WJ-MSC'er, isolering og karakterisering af exosomer, lægemiddelbelastningsforsøg, karakterisering af dopaminbelastede eksosomer med forskellige teknikker og in vitro cytotoksicitetsanalyse forklares detaljeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer og udstyr, der anvendes i denne protokol.
1. Dyrkning og kryopræservering af Whartons gelé mesenkymale stamceller
- Fjern WJ-MSC'erne (fra ATCC) fra -80 °C-fryseren. Frø cellerne i en kolbe indeholdende DMEM-F12-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). De inkuberes ved 37 °C i en inkubator indeholdende 5% CO2.
- Skift kulturmediet hver 2. dag. Passage cellerne, når de når 80% sammenløb. Cellerne, der skal passeres, vaskes med 5 ml fosfatbufret saltvand (PBS).
BEMÆRK: Vask med PBS før tilsætning af trypsin sikrer nem adskillelse af celler fra kolbeoverfladen. - PBS fjernes, og der tilsættes 5 ml trypsin-EDTA-opløsning til kolben. Kolben inkuberes i 5 minutter ved 37 °C i en inkubator indeholdende 5% CO2.
- Supernatanten samles i glasset og centrifugeres ved 1.500 x g i 5 min. Efter centrifugeringen fjernes supernatanten, og der tilsættes 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS til glasset ved pipettering.
- Overfør cellerne til en større kolbe og fortsæt kulturen ved at tilføje DMEM-F12 + 10% FBS, indtil der opnås tilstrækkelige eksosomer35.
BEMÆRK: Dyrkede celler fryses ved en densitet på 1 million / ml med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevares ved -80 ° C.
2. Produktion af exosomer fra Wharton's Jelly mesenkymale stamceller
BEMÆRK: Exosomer isoleres fra dyrkede WJ-MSC'er. Exosomisolering udføres, når celler dækker kolbens overflade og når ca. 80% densitet.
- Supernatantsubstratet indeholdende 10% FBS fjernes fra kolben og cellerne vaskes med 5 ml PBS. Tilsæt serumfrit DMEM-F12-medium til cellerne efter skylning med PBS. Kolberne inkuberes i 48 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator. Efter inkubation opsamles det serumfrie substrat i glasset og opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: I trin 2.1 opsamles 180 ml serumfrit substrat og opbevares ved -20 °C. Efter optøning startes en batchcentrifugeringsproces som beskrevet nedenfor. - Isolering af exosomer
- Det opsamlede serumfrie substrat centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved +4 °C. Supernatanten trækkes forsigtigt op og overføres til et andet glas.
- Den opsamlede supernatant centrifugeres ved 2.000 × g i 10 minutter ved +4 °C. Supernatanten trækkes forsigtigt op og overføres til et andet glas.
- Den opsamlede supernatant centrifugeres ved 10.000 × g i 30 minutter ved +4 °C. Supernatanten trækkes forsigtigt op og overføres til et andet glas.
- Den opsamlede supernatant overføres til ultracentrifugeglas og ultracentrifuge ved 110.000 × g i 130 minutter. Supernatanten fjernes langsomt og tilsættes 1 ml PBS til pelletsen.
- Pellet og ultracentrifugen hvirvel hældes ved 110.000 × g i 70 minutter ved +4 °C36 (figur 1). Supernatanten fjernes langsomt og tilsættes 1 ml PBS til pelletsen.
BEMÆRK: Når ultracentrifugeringstrinnene er afsluttet, kan de opnåede exosomer opbevares ved -80 °C. Den opnåede pellet er nu klar til karakterisering.
Figur 1: Exosomisolering. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Karakterisering af exosomer
- Nanopartikel Tracking Analyse (NTA)
BEMÆRK: Nanopartikelsporingsanalyse udføres for at bestemme størrelsen og koncentrationen af de isolerede exosomer. Tabletter, der anvendes til 1x PBS-opløsning, skal ligge i området pH 7,3-7,5. 1x PBS-opløsning indeholder 10 mM fosfatbuffer, 137 mM natriumchlorid og 2,7 mM kaliumchlorid. Opløsningen fremstilles ved tilsætning af 1 PBS tablet i 100 ml destilleret vand. Denne tilberedte opløsning steriliseres ved autoklavering.- Fortynd exosomerne 100 gange ved at tilsætte 990 μL PBS til 10 μL exosomer. Tag den fortyndede suspension i en engangssprøjte.
- Tænd NTA-enheden, og tilslut computeren. Åbn softwaren.
- Injicer prøven i sprøjten i slangen i kassettesektionen på enheden. Luk kassettedækslet på enheden.
- I softwaren, der åbnes, skal du klikke på knappen Start analyse . Gem de opnåede resultater ved at trykke på knappen Optag .
- Dynamisk lysspredningsanalyse
BEMÆRK: Exosomer isoleret til måling af zetapotentiale og størrelse fortyndes også på samme måde som til NTA-analyse.- Der tilsættes 980 μL PBS til 20 μL exosomer.
- Åbn zeta-størrelsesenheden og den tilsluttede computer. Åbn softwaren.
- Tilsæt suspensionen fra trin 3.2.1 til engangskuvetten. Åbn låget på enheden, læg kuvetten i kassetten, og luk låget.
- Vælg kuvettetypen i enhedens software. Klik på knappen Start analyse for zeta-potentiale og dimensionel analyse.
BEMÆRK: Analyser udføres separat for dimensionel analyse og zetapotentiale.
4. Dopamin indlæses i exosomer
BEMÆRK: Efter karakteriseringen af WJ-MSCs exosomer er afsluttet, blev dopaminbelastede exosomer opnået som et lægemiddelafgivelsessystem. Lægemiddelbelastning i exosomer udføres ved anvendelse af inkubationsmetoden.
- Der tilsættes 3 ml PBS til exosomsuspensionen fra trin 2.2.5. Den fortyndede suspension steriliseres ved filtrering med 0,22 μm filtre. 500 μL af den steriliserede exosomsuspension overføres til et andet rør.
- Forbered dopaminopløsning (0,5 mg / ml) med destilleret vand. Tilsæt 500 μL dopaminopløsning i rørene indeholdende exosomerne.
- Tilsæt saponin til suspensionen i trin 4.2. Den tilberedte exosom-dopaminsuspension inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Saponinkoncentrationen bør ikke overstige 0,002% af den totale opløsning. - Ultracentrifuger suspensionen ved 90.000 × g i 70 minutter for at fjerne fri dopamin og saponin fra mediet. De isolerede exosomer opbevares ved -20 °C, indtil de anvendes til yderligere analyse37.
BEMÆRK: Tilsæt 0,02% ascorbinsyre for stabiliteten af den fremstillede dopaminopløsning.
5. Karakterisering af dopaminbelastede exosomer
- Nanopartikelsporingsanalyse (NTA)
BEMÆRK: Nanopartikelsporingsanalyse udføres for at bestemme størrelsen og koncentrationen af isolerede exosomer.- Følg trin 3.1.1-3.1.4 for at fortynde exosomerne og udføre NTA.
- Dynamisk lysspredningsanalyse
BEMÆRK: Exosomer isoleret til måling af zetapotentiale og størrelse fortyndes også på samme måde som NTA-analyse.- Følg trin 3.2.1-3.2.4 for at fortynde exosomerne og udføre dynamisk lysspredningsanalyse.
BEMÆRK: Størrelse og zeta potentialer for hver opløsning (saponin, dopamin, exosom-dopamin) analyseres separat.
- Følg trin 3.2.1-3.2.4 for at fortynde exosomerne og udføre dynamisk lysspredningsanalyse.
6. Højtydende væskekromatografi (HPLC)
BEMÆRK: Mængderne af dopamin indlæst i exosomer måles ved hjælp af HPLC-metoden (High-Performance Liquid Chromatography). For at detektere tilstedeværelsen af dopamin i den opnåede formulering detoneres eksosomer ved en særlig proces.
- Sæt formuleringen i en 75 °C varmelegeme for at fordampe. Tilsæt acetonitril (50:50 forhold) til suspensionen og hvirvelstrømmen. Sonikere opløsningen i 10 min.
- Centrifuger opløsningen i 10 minutter ved 10.000 × g. Supernatanten filtreres gennem et 0,22 μm filter.
- Alle analysander analyseres ved hjælp af en C18-kolonne ved 30 °C ved en strømningshastighed på 1 ml/min (den mobilefase H2O/acetonitril). Absorbansen måles ved 230 nm38.
7. Måling af lægemiddelbelastningskapacitet (DL) og in vitro-lægemiddelfrigivelseskinetik
- Narkotika belastningskapacitet (DL)
BEMÆRK: Mængden af dopamin, der indlæses i exosomer, kvantificeres ved hjælp af UV-Vis-spektroskopi. Absorbansen aflæses ved 280 nm. De indsamlede supernatanter under syntesen anvendes til at måle mængden af ubelastet lægemiddel. Dopaminkoncentrationen i supernatanten bestemmes ved hjælp af en standardkalibreringskurve for dopamin.- Forbered en stamopløsning af 1 mg/ml dopamin. Forbered koncentrationer på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 mg / ml fra stamopløsningen ved hjælp af destilleret vand.
BEMÆRK: Tilsæt 0,02% ascorbinsyre for stabiliteten af den fremstillede dopaminopløsning. - Der genereres en standardkalibreringskurve ved at måle absorbansen af hver fortynding af dopamin ved 280 nm i et UV-spektrofotometer.
- Supernatantens absorbans måles ved 280 nm.
- Beregn lægemiddelbelastningskapaciteten for dopamin ved hjælp af Eq (1)39.
DL (%) =
100 (1)
BEMÆRK: Analysen udføres i tre eksemplarer.
- Forbered en stamopløsning af 1 mg/ml dopamin. Forbered koncentrationer på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 mg / ml fra stamopløsningen ved hjælp af destilleret vand.
- In vitro lægemiddelfrigivelseskinetik
BEMÆRK: Lægemiddelfrigivelseskinetik af dopaminbelastede eksosomer udføres under anvendelse af en dialysemembran. PBS, pH 7,4, bruges som frigivelsesmedium til at simulere et fysiologisk mikromiljø.- Tilsæt 1 ml dopaminbelastede exosomer til dialysemembranen. Anbring membranen i et bægerglas. Der tilsættes 15 ml PBS til bægerglasset.
- Der udtages prøve af 1 ml frigivelsessubstrat i et bægerglas ved 0,5, 1, 2, 4, 6 og 8 timer. På hvert tidspunkt udskiftes prøvens volumen med frisk PBS. Prøverne udtages med bestemte intervaller ved 280 nm ved hjælp af et UV-Vis-spektrometer.
- Resultaterne beregnes ved hjælp af Eq (2)40.
Frigivelse (%) =
100 (2)
BEMÆRK: Der udarbejdes en kalibreringskurve til bestemmelse af in vitro lægemiddelfrigivelseskinetikke. Dopaminopløsning fremstilles ved koncentrationerne 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 og 5,0 mg/ml. UV-absorbansværdien for hver koncentration bestemmes ved 280 nm med et UV-Vis-spektrofotometer.
100 (1)
100 (2)8. In vitro cytotoksicitetstest
- Revitalisering og kultur af fibroblaster
- Fibroblasterne fjernes fra -80 °C fryseren. Frø cellerne i en kolbe indeholdende DMEM-F12 + 10% FBS.
- Cellerne inkuberes ved 37 °C i en inkubator indeholdende 5% CO2. Skift kulturmediet hver 2. dag.
- Gennemgå cellerne, indtil de når 80% sammenløb. Følg trin 1.3-1.5. Efter centrifugering ved 1.500 × g i 5 minutter fjernes supernatanten, der tilsættes 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS, og der frøes 10.000 celler pr. hul i en 96 brøndplade.
- Der tilsættes DMEM-F12-medium + 10% FBS og inkuberes cellerne ved 37 °C i 18 timer i en inkubator indeholdende 5% CO2. Skift substratet af brøndene i slutningen af inkubationen.
- Forbered bestanden af dopaminbelastet exosomsuspension. Fortynd den dopaminbelastede exosomformulering med medium for at opnå koncentrationer på 100 μL / ml, 250 μL / ml, 500 μL / ml og 1.000 μL / ml.
- De fremstillede koncentrationer tilsættes til cellerne i hver brønd i 96-brøndpladen. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 18 timer i en inkubator indeholdende 5 % CO241.
- MTT-celle levedygtighed assay
BEMÆRK: Ved afslutningen af inkubationen bestemmes levedygtighedsforholdene for celler ved MTT-testen.- Forbered MTT-opløsningen (5 mg/ml) med PBS. Der tilsættes 10 μL MTT-opløsning til hvert hul. Der inkuberes i 4 timer ved 37 °C.
- Ved afslutningen af inkubationen tilsættes 100 μL DMSO til hver brønd. Inkuber pladerne i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Absorbansværdierne måles i ELISA-læser ved 570 nm42,43.
BEMÆRK: MTT-levedygtighedstesten udføres i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exosom isolering og karakterisering
Wharton geléstamceller dyrkes og inkuberes i et serumfrit medium i 48 timer, når kulturen når tilstrækkelig densitet. Efter inkubationens afslutning opbevares supernatanten ved -20 °C. De opsamlede supernatanter fortyndes med PBS og ultracentrifugeres (figur 1). Den opnåede opløsning analyseres ved NTA- og DLS-analyser. Exosomerne steriliseres ved at passere gennem et 0,22 μm filter. Den gennemsnitlige størrelse af de opnåede exosomer blev bestemt til at være 98 nm (Video 1). Ca. 10 milliarder exosompartikler blev opnået ved afslutningen af centrifugeringen. Antallet af nanopartikler, der afsløres af NTA- og DLS-analyser, stemmer overens med hinanden. Derudover blev zetapotentialet for exosomer, der stammer fra WJ-MSC'er, målt til -15,7 mV (figur 2 og figur 3).
Video 1: Nanopartikelsporingsanalyse af Wharton Jelly-afledte exosomer. Klik her for at downloade denne video.
Indlæsning af dopamin i exosomer
Som beregnet i NTA-analyse var der ca. 1,5 milliarder nanopartikler i 500 μL af de isolerede prøver fra Whartons gelé. Dopaminopløsning (5 mg/ml) blev blandet med 500 μL exosomer, og suspensionen blev inkuberet i 24 timer ved 37 °C. Efter inkubation blev den opnåede opløsning karakteriseret ved NTA- og DLS-analyser. Ifølge NTA-resultaterne viste den gennemsnitlige partikelstørrelse af opløsningen sig at være 110 nm. En sammenligning af partikelstørrelserne af exosomer og dopaminbelastede exosomer afslører, at der var en signifikant stigning i dimensionerne af de dopaminbelastede exosomer. Antallet af nanopartikler afsløret af NTA- og DLS-analyser var i overensstemmelse med hinanden. Derudover blev zetapotentialet for dopaminbelastede exosomer målt til -17,6 Mv (figur 2 og figur 3).
Video 2: Nanopartikelsporingsanalyse af dopaminbelastede exosomer. Klik her for at downloade denne video.
| Prøve | Zeta potentiale |
| Exosom | -15,7 mV ± 1,1 |
| Saponin | -12 mV ± 0,7 |
| Dopamin | -14,4 mV ± 1,3 |
| Dopaminbelastet exosom | -17,6 mV ± 0,8 |
Tabel 1: Zeta-potentialet for alle løsninger.
DSL-analyser, Zeta sizer og Zeta potentielle tabel over dopamin, saponin og dopaminbelastet exosomopløsning er vist i tabel 1.
Figur 2: Nanopartikelsporingsanalyse af exosomer. a) eksosomer (B) dopaminbelastede exosomer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Zetasizer analyse . (A) Exosomer, (B) dopaminbelastede exosomer, (C) Saponin, (D) Dopamin. Forkortelse: d = størrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tilstedeværelsen af dopamin i opløsningen blev bestemt ved HPLC-analyse. Dopaminbelastede exosomer blev ultracentrifugeret og filtreret for at fjerne fri dopamin. Hvis dopaminindlæsning i exosomer er vellykket i slutningen af inkubationen, kan det påvises ved direkte måling af dopamin efter brud på exosomerne. Til dette formål blev den dopaminbelastede exosomsuspension opvarmet med damp, acetonitril tilsat, og suspensionen blev sonikeret. Absorbansen blev målt ved 230 nm for at vurdere mængden af dopamin frigivet fra de forstyrrede exosomer.
Figur 4: Tilstedeværelse af dopamin i formuleringen bestemt ved HPLC-analyse. Alle analyser blev udført ved hjælp af en C-18-kolonne med en mobil fase afH2O/acetonitril ved en strømningshastighed på 1 ml/min ved 30 °C. Absorbansen måles ved 230 nm for at overvåge elueringen af dopamin. (A) dopamin, (b) saponin, (c) dopaminbelastede exosomer. Forkortelse: HPLC = højtydende væskekromatografi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Som et resultat af HPLC-analyse blev den resulterende top for dopamin observeret ved 6,45 min. Tilstedeværelsen af saponin blev også påvist efter exosomfragmentering (figur 4).
Lægemiddelbelastningskapacitet og in vitro-lægemiddelfrigivelseskinetik
Dopaminbelastningskapaciteten blev beregnet ved hjælp af UV-spektrofotometrimålinger og Eq (1) og Eq (2). Lastekapacitetsprocenten viste sig at være 10,89 ± 0,33. Den kumulative lægemiddelfrigivelsesprofil er vist i figur 5. Lægemiddelfrigivelseskinetik overvåget i 8 timer afslørede, at 74,8% af indkapslet dopamin blev frigivet fra exosomer inden for de første 8 timer (figur 5).
Figur 5: Kumulativ lægemiddelfrigivelsesprofil. Klik her for at se en større version af denne figur.
In vitro cytotoksicitetstest
Cytotoksiciteten af dopaminbelastede og frie exosomer blev undersøgt på fibroblaster. Fibroblaster blev udsat for forskellige koncentrationer af formuleringer (100 μL / ml, 250 μL / ml, 500 μL / ml og 1.000 μL / ml) og inkuberet i 18 timer. Selvom dopaminbelastede exosomer ikke viste nogen bemærkelsesværdige cytotoksiske virkninger, tilføjede saponin til formuleringen for at øge indkapslingen af dopamin nedsat fibroblastlevedygtighed (p < 0,05, figur 6). Der var en stigning i cellelevedygtigheden, når fibroblasterne blev behandlet med dopaminbelastede exosomer op til 500 μL / ml koncentration. Ved afslutningen af 18 timers inkubationen blev cellelevedygtigheden bestemt ved MTT-testen (figur 7). Den statistiske signifikans af resultaterne blev evalueret ved at udføre envejs ANOVA.
Figur 6: Mikroskopbilleder (10x) efter inkubation af formuleringen med cellerne. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopaminbelastede exosomer 100 μL / ml, (D) Dopaminbelastede exosomer 250 μL / ml, (E) Dopaminbelastede exosomer 500 μL / ml, (F) Dopaminbelastede exosomer 1.000 μL / ml. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Statistisk analyse af MTT-levedygtighedstestresultater i celler inkuberet i 18 timer med forskellige koncentrationer af dopamin, saponin og dopaminbelastede exosomer . (A) Cytotoksicitetsresultater, (B,C) Statistiske analyser. Forkortelser: D = dopamin; S = Saponin; Exo-DA1 = dopaminbelastede exosomer 100 μL / ml; Exo-DA2 = dopaminbelastede exosomer 250 μL / ml; Exo-DA 3 dopaminbelastede exosomer 500 μL / ml; Exo-DA 4 = dopaminbelastede exosomer 1.000 μL / ml; MTT = 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Derudover blev de cytotoksiske virkninger af frie exosomer også undersøgt på fibroblaster i lignende koncentrationer (figur 8). Før eksperimentet blev exosomer fortyndet med PBS til 60 millioner partikler pr. ml. Derefter blev 10 μL, 25 μL, 50 μL og 100 μL af exosomsuspensionen tilsat til hver brønd i en 96-brøndplade.
Figur 8: Statistisk analyse af MTT-levedygtighedstestresultater i celler inkuberet i 18 timer med forskellige koncentrationer af exosomer . (A) Cytotoksicitetsresultater, (B,C) statistiske analyser. Forkortelser: EXO = exosomer; MTT = 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Fibroblast levedygtighed viste sig at være højere med 500 μL / ml dopaminbelastede exosomer og 25 μL / ml frie exosomer sammenlignet med andre koncentrationer. Der blev imidlertid ikke observeret signifikant cytotoksicitet ved nogen koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exosomer er små membranvesikler med dimensioner på 40-200 nm udskilt af de fleste celletyper, fx MSC'er1. I stand til at muliggøre kommunikation mellem celler kan eksosomer komme ind i celler på forskellige måder, såsom endocytose, fagocytose, mikropinocytose, lipidmedieret internalisering og fusion33,44. Sammenlignet med andre nanocarrier-systemer giver lipiderne og kolesterolet, der findes på exosomoverfladen, evnen til at bære både hydrofile og hydrofobe molekyler, hvor hydrogenbindingen af kolesterolenderne tillader tæt emballage45.
Isoleringen af MSC-afledte exosomer, lægemiddelbelastningseksperimenter og cytotoksicitetsassays blev udført i denne undersøgelse. Det er kendt, at exosomer har en vigtig rolle i neurogenese, især i hjernen, ud over deres betydelige funktioner såsom last og kommunikation mellem celler 6,7. Desuden tolereres MSC-afledte exosomer relativt godt, har iboende terapeutiske egenskaber og viser høj stabilitet og homing evne46,47. I de senere år har forskning i nanoskala behandlingsmetoder såsom exosomapplikationer tiltrukket sig stor opmærksomhed som alternative behandlinger mod neurodegenerative sygdomme, da der ikke er nogen kur mod disse lidelser forårsaget af neuronal skade. Derudover gør exosomernes evne til at passere gennem BBB dem fremragende platforme som et lægemiddelbærersystem.
Selvom der er flere metoder til exosomisolering, brugte vi heri ultracentrifugeisoleringsmetoden, som accepteres som en af de mest effektive metoder. I den aktuelle undersøgelse er WJ-MSC'er, udvalgt som donorceller, kendt for deres lave immunogene potentiale47 og bruges som kilde til exosomer i kliniske forsøg48. De opnåede exosomer blev derefter inkuberet med dopaminopløsning, hvorunder saponin tilsættes til opløsningen for at øge succesen med lægemiddelbelastning. Ved afslutningen af inkubationen blev fri dopamin og saponin fjernet fra mediet. Saponin forventes selektivt at fjerne det membranbundne kolesterol i exosomer og skabe porer i de exosomale lipiddobbeltlag, hvilket fremmer indtrængen af dopaminmolekyler. Som følge heraf observeres det, at eksosomernes dimensioner steg lidt, sandsynligvis på grund af dopaminbelastning.
Zeta-potentialet viser større elektrostatisk frastødning mellem partikler og deres tendens til at aggregere. Zetapotentialet i den opnåede formulering var foreneligt med resultaterne af tidligere undersøgelser49. I HPLC-analysen udført i slutningen af inkubationsperioden blev tilstedeværelsen af dopamin detekteret efter fragmentering af eksosomerne. Som nævnt ovenfor fremmer saponin indkapsling af dopamin. Lægemidlets belastningsevne blev målt ved UV-vis-spektrofotometri baseret på absorbansværdier39. Selvom inkubationsmetoden til lægemiddelbelastning er enkel og billigere end andre metoder, er belastningseffektiviteten lav i denne metode26. I denne undersøgelse var lastekapaciteten ca. 11%. Saponin er et effektivt permeabiliserende middel til den cytoplasmatiske membran50 og synes at øge belastningskapaciteten af exosomer med dopamin.
I fremtidige undersøgelser kan det være mere effektivt at foretrække sonikeringsmetoden for at forbedre exosomal lægemiddelbelastningseffektivitet38. Den kumulative lægemiddelfrigivelsesprofil afslørede, at store mængder dopamin blev frigivet i slutningen af 8 timers inkubation. Der blev observeret en eksplosiv frigivelse i de første 5 timer af in vitro-frigivelsesstudiet. Da frigivelsesprofilen for exosomformuleringer afhænger af mange parametre såsom lægemiddelegenskaber, tolags fluiditet og molekylvægt, kan forskelle observeres i mængderne af frigivne lægemidler i timen i mange undersøgelser51. Derudover blev der ikke observeret cytotoksiske virkninger af formuleringerne på fibroblaster i denne undersøgelse. Imidlertid blev den toksiske virkning af saponin tilsat for at øge dopaminbelastningen i exosomer påvist på fibroblastceller. Ifølge disse data er endogeniteten af exosomer en naturlig og unik fordel sammenlignet med liposomer, mikrosfærer, mikroemulsioner og andre syntetiske lægemiddelleveringssystemer52. For at reducere ulemperne ved den nuværende metode kan forskellige transfektionsreagenser, elektroporationsteknikker eller endogene dopaminproducerende celler, fortrinsvis genetisk modificerede MSC'er, anvendes som kilde til exosomer.
Exosomisolering blev udført med denne protokol. Isolationstrinnet er imidlertid en meget lang og vanskelig proces. Der bør drages omsorg for, at supernatanten opsamlet fra cellekultur befinder sig i det serumfrie substrat. Derudover har mængderne af exosomer hidtil været forbundet med proteinkoncentration. Vi foreslår dog, at beregning og anvendelse af antallet af exosompartikler kan hjælpe med at øge nøjagtigheden i kliniske undersøgelser. Inkubationsmetoden, der blev anvendt til lægemiddelbelastning af isolerede exosomer, viste sig at være lav med hensyn til lægemiddelbelastningskapacitet. Sonikeringsmetoden, som har en høj lægemiddelbelastningskapacitet, kan hjælpe med at opnå mere effektive resultater.
Disse resultater viste, at WJ-MSC-afledte exosomer er kraftfulde bærere af dopaminlevering. Sammen med deres evne til at passere BBB og med deres immunmodulerende egenskaber kan målrettede terapier til Parkinsons eller andre CNS-sygdomme udvikles med lægemiddelbærende exosomer. Undersøgelser bør dog udføres in vivo og understøttes af kliniske forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev primært støttet af forskningsmidler fra Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
