هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على مستخلص السم الخام من شقائق النعمان البحرية والكشف عن نشاطه الانحلالي والفوسفوليباز.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد نشاط انحلال الدم والفوسفوليباز في المستخلصات الخام من شقائق النعمان البحرية عن طريق المقايسات الحيوية المباشرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتضمن تكوين سم شقائق النعمان البحرية جزيئات متعددة الببتيد وغير البروتينات. تتمتع مكونات التحلل الخلوي بإمكانات عالية في مجال التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي لتصميم أدوات جزيئية جديدة. يقع سم شقائق النعمان البحرية في الخلايا الغدية من الأديم الخارجي والهياكل دون الخلوية التي تسمى الأكياس الخيطية ، وكلاهما موزع في جميع أنحاء جسم شقائق النعمان في البحر. هذه الخاصية تنطوي على تحديات لأنه يجب تحليل الخلايا والكيس الخيطي لإطلاق مكونات السم مع جزيئات أخرى غير سامة. لذلك ، أولا ، يتم اشتقاق السم من مستخلص خام (خليط من جزيئات مختلفة ومتنوعة وحطام الأنسجة). الخطوة التالية هي الكشف عن الببتيدات المتعددة ذات الأنشطة الحيوية المحددة. هنا ، نصف استراتيجية فعالة للحصول على مستخلص خام شقائق النعمان البحرية والفحص الحيوي لتحديد وجود السيتوليسين. تتضمن الخطوة الأولى تقنيات غير مكلفة ومباشرة (دورة التحريك والتجميد والذوبان) لإطلاق السيتوليسينات. حصلنا على أعلى نشاط تحلل الخلايا والبروتين (~ 500 ملغ من البروتين من 20 غرام من الوزن الجاف). بعد ذلك ، تم تحليل تعقيد الببتيد المتعدد للمستخلص بواسطة SDS-PAGE gel للكشف عن البروتينات ذات الأوزان الجزيئية بين 10 kDa و 250 kDa. في فحص الانحلال ، استخدمنا خلايا الدم الحمراء للأغنام وحددنا HU50 (11.1 ± 0.3 ميكروغرام / مل). في المقابل ، تم تحديد وجود الفوسفوليباز في المستخلص الخام باستخدام صفار البيض كركيزة في وسط صلب مع الأغاروز. بشكل عام ، تستخدم هذه الدراسة بروتوكولا فعالا وغير مكلف لإعداد المستخلص الخام وتطبق مقايسات حيوية قابلة للتكرار لتحديد السيتوليسين ، والجزيئات ذات الاهتمامات التكنولوجية الحيوية والطبية الحيوية.
المقدمة
الحيوانات البحرية هي مصدر غني للمركبات النشطة بيولوجيا. في العقود الأخيرة ، اجتذب تكوين سم شقائق النعمان البحرية اهتماما علميا لأنه يضم مجموعة متنوعة من الببتيدات المتعددة مع الانحلالية ، السامة للخلايا ، الأنزيمية (الفوسفوليباز ، البروتياز ، الكيتيناز) ، والنشاط السام للأعصاب والتأثيرات المثبطة على النشاط البروتيني1. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الببتيدات المتعددة هي مصادر محتملة لتطوير الأدوات الجزيئية في التكنولوجيا الحيوية والاستخدام العلاجي 2,3.
هناك عدد قليل من التقارير حول سم شقائق النعمان البحرية ومكوناته الجزيئية بسبب تعقيد الحصول على السم ، وحتى العزل ، و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم جمع شقائق النعمان البحرية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الوطنية لتربية الأحياء المائية ومصايد الأسماك والأغذية التابعة للحكومة الفيدرالية للمكسيك (رقم التصريح PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا التابعة لمعهد التكنولوجيا الحيوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك على جميع التجارب على شقائق النعمان البحرية. تم شراء عينة دم الأغنام من مركز التدريس العملي والبحوث في الإنتاج الحيواني وصحة الحيوان (CEPIPSA ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك).
1. جمع الكائنات الحية
- جمع شقائق النعمان البحرية A. dowii.
ملاحظة: هنا، تم جمع الكائنات الحية خلال فترات المد المنخفض في منطقة المد ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأظهرت النتائج التمثيلية للبروتوكول المستخدم للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية أن الجمع بين تقنيتين (الإثارة ودورات التجميد والذوبان) أدى إلى تصريف فعال للأكياس الخيطية، وكانت الكمية الإجمالية للبروتين 500 ملغ (8 ملغم/مل) (الشكل 3).
يمكن ملاحظة تعقيد البروتين في المستخلص الخام من 10 كيلو دال وأكبر من 250 كيلو دالتون من خلال الرحلان الكهربائي SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن cytolysins في منطقة الوزن الجزيئي من 15 kDa و 20 kDa ، وهي مجموعة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أدى ارتفاع الطلب على المركبات الجديدة ذات التطبيقات في مختلف مجالات العلوم والصناعة إلى دراسة السم. يمثل السم مصدرا غنيا بالجزيئات التي تعمل كقالب لتوليد أدوات جزيئية جديدة. ومع ذلك ، فإن تعقيد هذه السموم يتطلب تنفيذ والجمع بين الأساليب المختلفة للحصول عليها ودراستها.
هنا ، نعرض طريقة للحصول على وتحليل سم شقائق النعمان البحرية Anthopleura dowii ، Verrill 1869 ، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف سم أنواع شقائق النعمان البحرية الأخرى بدءا من العينات المجففة بالتجميد ، ثم الاستخلاص الخام obt.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة منافسة فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) ، مع رقم منحة IT200819. يعترف المؤلفون لتوم موسلمان ، Rock Paper Editing ، LLC ، للتحقق من قواعد اللغة الإنجليزية لهذه المخطوطة ؛ والمساعدة التقنية المقدمة من سامانتا خيمينيز (CICESE، إنسينادا)، وخوان مانويل باربوسا كاستيلو (معهد العلوم الاجتماعية، بعثة الأمم المتحدة في أفغانستان). كما نشكر الدكتور أوغستو سيزار ليزارازو تشابارو (CEPIPSA) على حصوله على دم الأغنام. ونشكر بصفة خاصة الدكتور خوسيه سانيغر بيزا، من معهد المحاسبين القانونيين المعتمدين - بعثة الأمم المتحدة لتقديم المساعدة إلى أفغانستان، على التسهيلات التي وفرها في مختبره لتسجيل الفيديو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل سعة 15 مل | كورنينج | 430766 | |
| 2-بروموفينول أزرق | سيجما | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 مل أنابيب طرد مركزي مخروطية | كورنينج | 430828 | |
| حمض الخليك الجليدي | JT Baker | 9515-03 | |
| أكريلاميد | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| الأبقار الألبومين الكسر V | Sigma | A3059-100G | |
| برادفورد البروتين فحوصات | Bio-Rad | 5000006 | |
| كلوريد الكالسيوم | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| لوحات زراعة الخلايا 96 جيدا، V-bottom | Corning | 3894 | |
| أجهزة الطرد المركزي | Eppendorf | 5804R | |
| أنابيب الطرد المركزي | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP نظام | Bio-Rad | 1708280 | |
| حامض الستريك | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well | Plates Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | # 1610406 | |
| Coomassie أزرق لامع R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| سكر العنب | JT Baker | 1916-01 | |
| ضميمة بدون مجاري | الهواء Labconco | عمودية | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| جل دوك EZ | Bio Rad. | نظام توثيق الجل | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| مقياس الدم | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (البرنامج) المعاهد | الوطنية للصحة ، الولايات المتحدة | الأمريكية الإصدار 1.53c | |
| حاضنة 211 | Labnet | I5211 DS | |
| ميثانول | JT Baker | 9049-03 | |
| خلية | رباعية بروتينية صغيرةBio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | JT Baker | 3824-01 | |
| NaCl | JT Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4. H2< / sub>O | JT Baker | 3818-05 | |
| برنامج | Origin 9 | لتصميم المؤامرة بتعديلات سيني | |
| Petridish | Falcon 351007 | ||
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| صغير مسبقة الصب | BioRad | 1658004 | |
| البروتين Prestained | Thermo Scientific | 26620 | |
| مثبط البروتياز | روش | 11836153001 | |
| مركز كاشف صبغة فحص البروتين | Bio-Rad | 5000006 | |
| الرودامين 6G | سيجما ألدريتش | 252433 | |
| SDS | سيجما ألدريتش | L4509 | |
| سترات الصوديوم ثنائي هيدرات | جي تي بيكر | 3646-01 | |
| مقياس الطيف الضوئي | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| تريس بيس | سيجما-ألدريتش | 77-86-1 | |
| فولت مزود الطاقة | Hoefer | PS300B |
المراجع
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic u....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
